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薄壳山核桃Carya illinoensis属于胡桃科Juglandaceae山核桃属Carya，原产于北美密西西比河流域[1]，集坚果、油料、用材于一体，树形高大挺秀，株型紧凑[2]，极具经济价值。中国引种薄壳山核桃的历史始于19世纪末[3]，随着种植规模的不断扩大，薄壳山核桃病害的发生越来越多，已报道的约21种，包括叶部病害11种，其中，薄壳山核桃黑斑病、褐斑病及白粉病[4]等叶部病害较为严重，影响薄壳山核桃产量和品质[5]。薄壳山核桃叶部黑斑病及褐斑病病害统称为叶斑病[6]。INGRAM[7]认为：炭疽菌Colletorichum spp.是引起薄壳山核桃黑斑病的主要菌种，邓蕾等[8]认为山核桃黑斑病病原为小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora，2种菌都被证实对叶片和果实具有侵染性。杨莉等[9]对四川的核桃褐斑病进行柯赫氏法则的验证，明确其病原为链格孢属的Alternaria alternata。
前期从薄壳山核桃叶斑病组织中分离鉴定出4种病原菌分别是共享镰孢菌Fusarium commune、暗球腔菌属Phaeosphaeria的P. fuckelii、茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和灰葡萄孢Botrytis cinerea[6]。这4种菌已被确认为植物病原菌且寄主多样化，共享镰孢菌有报道可引起龙牙百合Lilium brownii var. viridulum枯萎病[10]和烟草Nicotiana tabacum根腐病[11]；暗球腔菌属Phaeosphaeria spp.对淡竹Phyllostachys glauca、桂竹Phyllostachys reticulata和香蕉Musa spp.[12−13]具有较大危害；茶藨子葡萄座腔菌寄生性较广，可以侵染山核桃Carya cathayensis、杨树Populus spp.、桉树Eucalyptus spp.等经济树种并对其造成严重危害[14−15]；灰葡萄孢可引起草莓灰霉病等[16]。
目前这4种病原菌的相关生物学特性和农药毒力测定的研究较浅。由于同种病原不同菌株因环境差异而导致敏感性不同，因此有必要对该4种致病菌株进行生物学测定。化学防治仍然是植物病害防治的主要手段，合理使用农药可以降低病原菌的抗药性，增加防治效果[17]。本研究对4种病原菌的生物学特性进行研究，并用5种化学试剂进行室内毒力测定，旨在为薄壳山核桃叶斑病的防控提供可靠的理论依据。
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薄壳山核桃叶斑病病原菌共享镰孢、P. fuckelii、 茶藨子葡萄座腔菌和灰葡萄孢在南京六合区、镇江句容市、安徽省滁州市采集感病薄壳山核桃叶片分离纯化获得。
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5种供试药剂包括250 g·L−1吡唑醚菌酯悬浮剂(河北中保绿农作物科技有限公司)、450 g·L−1咪鲜胺水乳剂(湖南新长山农业发展股份有限公司)、400 g·L−1百菌清悬浮液(天津艾格福农药科技有限公司)、250 g·L−1氰烯菌酯悬浮剂(江苏省农药研究所股份有限公司)、300 g·L−1丙硫菌唑悬浮剂(安徽久易股份有限公司)。
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将4种致病菌株用无菌打孔器打成直径5 mm的菌块，接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养基上，设置5、10、15、20、25、30、35 ℃等7个温度处理，每个处理设置3次重复，采用十字交叉法分别测量培养7 和14 d的菌落直径，计算生长速率。
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以马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)为基本培养基，用l mol·L−1的HCl溶液和l mol·L−1的NaOH溶液调整PDA培养基的pH值，设4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等7个处理，将5 mm的菌块接入不同pH的培养基，27 ℃恒温培养，每个处理设置3次重复。除P. fuckelii分别于培养7 和14 d测量直径外，其余3种分别于培养3 和7 d时测量供试菌株直径，计算生长速率。
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以基础培养基(0.25 g·L−1硫酸镁，0.30 g·L−1磷酸二氢钾，2.00 g·L−1硝酸钾，30.00 g·L−1葡萄糖，20.00 g·L−1琼脂， 1 000 mL水)为供试培养基。保持其他试剂不变，分别以30.00 g·L−1葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉作为不同碳源，进行碳源试验；保持其他试剂不变，分别以2.00 g·L−1硝酸钾、硫酸铵、尿素、牛肉浸膏、胰蛋白胨作为不同氮源，进行氮源试验。将5 mm菌块接入培养基，27 ℃恒温培养，每个处理设置3次重复，测量方法同1.2.2，计算生长速率。
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采用生长速率法测定不同杀菌剂对薄壳山核桃叶斑病病原菌的抑菌作用。将5种药剂加入无菌水中，按照一定比例稀释设置5个质量浓度梯度(表1)，再将稀释后的制剂与融化的PDA培养基以体积比1∶99混合均匀，配置出不同质量浓度的含药培养基并计算含药培养基中原药的质量浓度，含药培养基原药质量浓度=药剂体积×药剂中有效成分质量浓度/含药培养基体积。每种药剂每个质量浓度梯度设置3个重复，设置不含药剂的PDA培养基为空白对照。将5 mm的菌块移入培养基中，27 ℃恒温培养，每个处理3次重复，培养3~7 d后，采用十字交叉法测量供试菌株的菌落直径。抑制率=(对照菌落直径—处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。将5种药剂5个质量浓度梯度下菌落生长的抑菌率的值换算成抑制几率值，作为因变量(y)，药剂质量浓度的自然对数值作为自变量(x)，利用最小二乘法建立“浓度对数—几率值”直线方程[18]。用Excel和DPS软件求出相关系数(r)、抑制中浓度(EC50)及毒力回归方程(y=ax+b)，比较不同药剂对病原菌的毒力效果。
表 1 药剂稀释质量浓度
Table 1. Dilution mass concentration of reagents
病菌 稀释质量浓度/(mg·L−1) 吡唑醚菌酯 咪鲜胺 百菌清 氰烯菌酯 丙硫菌唑 共享镰刀菌 1 000.0、100.0、10.0、1.0、0.2 10.0、2.0、1.0、0.2、0.1 10.0、2.0、1.0、0.2、0.1 100.0、10.0、1.0、0.2、0.1 1 000、100、10、2、1 P. fuckelii 10 000、100、10、2、1 10.0、2.0、1.0、0.2、0.1 100、10、4、2、1 10 000、100、40、20、10 100、10、4、2、1 茶藨子葡萄座腔菌 10 000、100、10、2、1 100.0、10.0、1.0、0.2、0.1 10 000、100、10、2、1 10 000、100、40、20、10 1 000、100、10、2、1 灰葡萄孢 10 000、1 000、400、200、100 1.00、0.20、0.10、0.02、0.01 10 000、100、10、2、1 10 000、100、40、20、10 1.00、0.20、0.10、0.02、0.01 -
如图1所示：共享镰孢菌在10~35 ℃下均能生长，最适生长温度为25 ℃，菌落的生长速率为10.76 mm·d−1，温度在10 ℃以下时，菌落受到抑制；P. fuckelii菌丝在10~30 ℃下均能生长，最适生长温度为25 ℃，菌落的生长速率为5.00 mm·d−1，温度在5和35 ℃时生长速率为0；茶藨子葡萄座腔菌在10~35 ℃下均能生长，最适生长温度为30 ℃，菌落的生长速率为21.76 mm·d−1，温度在5 ℃及以下时生长受到抑制；灰葡萄孢在5~25 ℃下均能生长，最适生长温度为20 ℃，菌落的生长速率为14.95 mm·d−1，温度在30 ℃及以上生长受到抑制。
图 1 不同温度对菌株菌丝生长速率的影响
Figure 1. Effect of different temperature on mycelial growth rate of strains
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如图2所示：共享镰孢菌在pH为4.0~10.0的条件下均可生长，最适宜菌丝生长的pH为8.0，菌丝生长速率为9.40 mm·d−1，在pH 4.0的条件下，菌丝生长受限；P. fuckelii在pH 4.0~10.0的条件下均可生长，最适宜菌丝生长的pH为7.0，菌丝生长速率为5.90 mm·d−1，在pH 4.0的条件下，菌丝生长受限；茶藨子葡萄座腔菌在pH 4.0~10.0的条件下均可生长，最适宜菌丝生长的pH为7.0，该病原菌适于中性环境下生长，菌丝生长速率为18.74 mm·d−1，茶藨子葡萄座腔菌在pH 4.0~10.0的条件下无明显被抑制的现象，pH的波动对其生长影响不大；灰葡萄孢在pH 4.0~10.0的条件下均可生长，最适宜菌丝生长的pH为6.0，菌丝生长速率为10.69 mm·d−1。
图 2 不同pH对菌株菌丝生长速率的影响
Figure 2. Effect of different pH on mycelial growth rate of strains
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如图3所示：共享镰孢菌在含葡萄糖的培养基上菌丝生长最快，生长速率为11.89 mm·d−1，但共享镰孢菌对这5种碳源的利用效果差异不显著；P. fuckelii对可溶性淀粉的碳源利用效果最好，菌丝生长速率为4.32 mm·d−1，P. fuckelii利用效果最差的碳源为乳糖，菌丝生长速率为2.87 mm·d−1；茶藨子葡萄座腔菌利用效果最差的碳源为麦芽糖，菌丝生长速率为8.11 mm·d−1；灰葡萄孢对可溶性淀粉的碳源利用效果最好，菌丝生长速率为10.79 mm·d−1，灰葡萄孢利用效果最差的碳源为麦芽糖，菌丝生长速率为8.7 mm·d−1。
图 3 不同碳源对菌株菌丝生长速率的影响
Figure 3. Effect of different carbon source on mycelial growth rate of strains
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如图4所示：共享镰孢菌在5种不同氮源上均可以生长，其中利用效果最好的是硝酸钾，菌丝生长速率为13.11 mm·d−1，与其他氮源差异显著，在硫酸铵中生长最慢，菌丝生长速率为7.00 mm·d−1；P. fuckelli氮源利用效果最好的是胰蛋白胨，其菌丝生长速率为2.57 mm·d−1，在硫酸铵中生长最慢，生长速率为0.66 mm·d−1；茶藨子葡萄座腔菌氮源利用效果最好的是尿素，其菌丝生长速率为14.77 mm·d−1，利用效果最差的氮源为硫酸铵，菌丝生长速率为7.54 mm·d−1；灰葡萄孢在除尿素外的4种不同氮源上均可以生长，其中该病原菌利用效果最好的是胰蛋白胨，其菌丝生长速率为10.43 mm·d−1，与其他氮源差异显著，在尿素中该菌不生长。
图 4 不同氮源对菌株菌丝生长速率的影响
Figure 4. Effect of different nitrogen source on mycelial growth rate of strains
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由表2可知：5种杀菌剂对共享镰孢菌的EC50由小到大依次为咪鲜胺、氰烯菌酯、百菌清、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯。因此，咪鲜胺对共享镰孢菌室内毒力最强，氰烯菌酯次之，吡唑醚菌酯最弱。5种杀菌剂对P. fuckelii的EC50由小到大依次为吡唑醚菌酯、咪鲜胺、丙硫菌唑、百菌清、氰烯菌酯。因此，吡唑醚菌酯对P. fuckelii室内毒力最强，咪鲜胺次之，氰烯菌酯最弱。5种杀菌剂对茶藨子葡萄座腔菌的EC50由小到大依次为咪鲜胺、吡唑醚菌酯、百菌清、丙硫菌唑、氰烯菌酯。因此，咪鲜胺对 茶藨子葡萄座腔室内毒力最强，吡唑醚菌酯次之，氰烯菌酯最弱。5种杀菌剂对灰葡萄孢的EC50由小到大依次为咪鲜胺、丙硫菌唑、百菌清、氰烯菌酯、吡唑醚菌酯。因此，咪鲜胺对灰葡萄孢室内毒力最强，丙硫菌唑次之，吡唑醚菌酯最弱。
表 2 5种药剂对4个病菌的室内毒力测定
Table 2. Toxicity test of 5 chemicals against 4 pathogens
药剂 共享镰孢菌 P. fuckelii 茶藨子葡萄座腔菌 灰葡萄孢 毒力回归
方程r EC50/
(mg·L−1)毒力回归
方程r EC50/
(mg·L−1)毒力回归
方程r EC50/
(mg·L−1)毒力回归
方程r EC50/
(mg·L−1)吡唑醚菌酯 y=0.15x+4.76 0.97 39.222 9 y=0.14x+5.34 0.99 0.0041 y=0.47x+5.20 0.90 0.367 5 y=0.45x+3.91 0.93 275.052 7 咪鲜胺 y=0.68x+6.34 0.97 0.010 8 y=0.47x+6.12 0.97 0.0043 y=0.69x+5.72 0.87 0.091 5 y=0.64x+6.07 0.97 0.021 0 百菌清 y=0.55x+4.96 0.99 1.178 9 y=0.57x+4.96 0.96 1.1676 y=0.57x+5.00 0.96 0.990 4 y=0.28x+4.74 0.98 8.238 0 氰烯菌酯 y=0.72x+5.38 0.75 0.294 7 y=0.88x+3.40 0.92 65.7059 y=0.79x+3.66 0.94 50.702 6 y=0.80x+3.34 0.95 118.136 7 丙硫菌唑 y=0.73x+4.00 0.97 23.363 3 y=0.31x+5.14 0.95 0.3582 y=0.60x+4.43 0.97 8.845 4 y=0.73x+5.64 0.98 0.134 1 说明：y为抑制几率值，x为药剂质量浓度的对数值。 -
本研究对共享镰孢菌、P. fuckelii、茶藨子葡萄座腔菌和灰葡萄孢进行生物学特性测定和室内药剂的毒力测定，探究其最适生长环境，筛选最佳防治药剂。共享镰孢菌对温度、pH等适应范围广，在10~35 ℃，pH 4.0~10.0时菌丝均能生长，其中最适温度为25 ℃，在pH 8时菌丝生长最快，此结论与曾莉莎等[19]研究结果相似。其最适碳源为葡萄糖，最适氮源为硝酸钾，与李润根等[10]的研究结果差异较大，这可能与共享镰孢菌所侵染的寄主不同有关[20]。目前对P. fuckelii生物学特性的研究尚且未见报道，本研究中P. fuckelii最适生长温度为25 ℃和最适生长pH为7.0，P. fuckelii适宜在较温暖且酸碱度呈中性的环境中生长。最适碳源为可溶性淀粉，最适氮源为胰蛋白胨。茶藨子葡萄座腔菌菌丝生长温度范围为10~35 ℃，最适生长温度为30 ℃，最适pH为7，在pH 4.0~10.0生长速率差别不大，与刘琪等[21]的研究结果一致。最适碳源为蔗糖，与李诚等[22]的研究结果相似，最适氮源为尿素，与何靖柳等[23]的研究结果差别较大，其原因可能在于菌株取自不同植物寄主，其对营养物质的利用方式略有差异。灰葡萄孢菌丝生长温度范围为5~25 ℃，最适温度为20 ℃，最适pH为6.0，与殷辉等[24]的研究结果相同。在本研究中，灰葡萄孢菌丝生长最适碳源为可溶性淀粉，最适氮源为胰蛋白胨，与来自其他寄主的灰葡萄孢生物学特性基本相同[25]。4种致病菌在以硫酸铵为氮源的培养基上生长缓慢且菌丝稀疏，生产种植上可选择用硫酸铵作为氮肥，以达到减缓病害发生的目的。
本研究5种药剂对4种致病菌抑菌效果和室内毒力作用存在差异，其中，咪鲜胺对共享镰刀菌抑菌效果最好，与周鑫钰等[26]研究结果相似。咪鲜胺作为一种咪唑类杀菌剂，其作用机制在于抑制生物体麦角甾醇的合成，破坏细胞膜功能[27]，对包括镰孢属Fusarium等多种子囊菌和半知菌有显著的作用[28]；对P. fuckelii来说，吡唑醚菌酯抑菌效果最好，据周英等[29]报道，25%咪鲜胺对葡萄座腔菌抑菌效果较好，其EC50为0.08 mg·L−1，与本研究结论相似；姜莉莉等[16]在对草莓灰霉病病原菌灰葡萄孢的室内药剂毒力测定中发现咪鲜胺的EC50为0.99 mg·L−1，毒力作用较强，本研究得出的结论与前者相似，咪鲜胺对灰葡萄孢抑菌效果最好，吡唑醚菌酯最弱。田间的药剂防治效果受多种因素影响，需后期进一步田间试验证实。目前有研究报道复配药剂比单剂防治效果更佳[30−31]。本研究的5种杀菌剂复配是否具有增效作用有待后续研究。
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综上，对这4种病原菌来说，在室内温度为20~30 ℃，pH 6.0~8.0的环境中都可以生长得较好。这4种病原菌在以葡萄糖和可溶性淀粉为碳源，以尿素、硝酸钾和胰蛋白胨为氮源的环境下生长旺盛。咪鲜胺的杀菌效果在5种杀菌剂中最好，EC50均在0.10 mg·L−1以下，对病原菌具有很强的毒力作用，因此咪鲜胺是防治薄壳山核桃叶斑病的首选药剂，另外，吡唑醚菌酯也具有较好的抑菌作用。在今后的薄壳山核桃叶斑病防治中，为了防止长期使用单一药剂产生抗药性，可交替或混合使用咪鲜胺与吡唑醚菌酯，以达到良好的防治效果。
Biological characteristics and toxicity test of the pathogen of Carya illinoinensis leaf spot
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摘要:
目的 对薄壳山核桃Carya illinoinensis叶斑病4种病原菌，包括共享镰孢菌Fusarium commune、暗球腔菌属Phaeosphaeri 1种P. fuckelii、茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和灰葡萄孢Botrytis cinerea进行生物学特性测定和不同化学药剂的室内毒力测定，探究其最适生长环境，并筛选最佳防治药剂。 方法 采用菌丝生长速率法测量病原菌在不同培养条件下的生长速率以及不同化学药剂对病原菌的抑菌率，用DPS计算抑制中浓度(EC50)。 结果 共享镰孢菌、P. fuckelii、茶藨子葡萄座腔菌和灰葡萄孢最适生长温度分别是25、25、30和20 ℃；最适pH值分别是8.0、7.0、7.0和6.0；最适碳源分别为葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖和可溶性淀粉；最适氮源分别为硝酸钾、胰蛋白胨、尿素和胰蛋白胨。5种杀菌剂中450 g·L−1咪鲜胺对共享镰孢菌、茶藨子葡萄座腔菌和灰葡萄孢的毒力最强， EC50分别为0.010 8、0.091 5和0.021 0 mg·L−1，250 g·L−1吡唑醚菌酯对P. fuckelii的毒力最强，EC50值为0.004 1 mg·L−1。 结论 4种病原菌在含葡萄糖和可溶性淀粉的碳源环境下以及含尿素、硝酸钾和胰蛋白胨的氮源环境下生长旺盛，咪鲜胺与吡唑醚菌酯对该病具有很好的防治作用。图4表2参31 Abstract:Objective This study aimed to determine the biological characteristics and toxicity of four pathogens, namely Fusarium commune, Phaeosphaeria fuckelii, Botryosphaeria dothidea, and Botrytis cinerea, that cause leaf spot in Carya illinoinensis and explore the optimal growth conditions for these pathogens and effective control agents. Method The mycelium growth rate method was utilized to measure the growth rates of the pathogens under different culture conditions and the inhibition rates of 5 chemical fungicides on the pathogens. The EC50 was calculated using DPS. Result F. commune and P. fuckelii grew optimally at 25 ℃, while Botryosphaeria dothidea and Botrytis cinerea grew optimally at 30 ℃ and 20 ℃, respectively. The optimal pH for growth were 8.0, 7.0, 7.0, and 6.0 for F. commune, P. fuckelii, Botryosphaeria dothidea and Botrytis cinerea, respectively. Glucose, soluble starch, sucrose, and soluble starch were the optimal carbon sources, respectively. Similarly, potassium nitrate, tryptone, urea, and tryptone were the optimal nitrogen sources for these four fungal species, respectively. Of the five fungicides tested, 450 g·L−1 prochloraz exhibited the highest level of toxicity to F. commune, Botryosphaeria dothidea, and Botrytis cinerea, with EC50 of 0.010 8, 0.091 5, and 0.021 0 mg·L−1, respectively. Additionally, the 250 g·L−1 pyrazolyl ester demonstrated the strongest toxicity to P. fuckelii, with EC50 of 0.004 1 mg·L−1. Conclusion The four types of pathogenic fungi growed well in carbon sources with elevated levels of glucose and soluble starch, as well as nitrogen sources that contain urea, potassium nitrate, and tryptone. Prochloraz and pyrazolyl ester can effectively controll the disease. [Ch, 4 fig. 2 tab. 31 ref. ] -
Key words:
- Carya illinoinensis /
- pathogen of leaf spot /
- biological characteristics /
- virulence test
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桑Morus是一种重要的木本植物，具有28条染色体[1]，不仅可以作为家蚕的重要食物，还具有一定的经济、药用及生态价值。但是桑葚在成熟的过程中易脱落，使得桑葚变软变黑，影响其产业价值，因此，如何采用有效的手段对桑葚脱落进行调控十分重要。
果实脱落是植物正常发育过程中的一种常见现象，但是，在一定程度上会限制果树的产量。果实脱落主要受环境因素、酶、生理代谢共同调控[2]，其中，环境因素主要包括生物胁迫(如病虫害[3])和非生物胁迫(温度胁迫[4]、水分胁迫[5]、光胁迫[6]等)；生理代谢则包括一些激素代谢(如脱落酸[7]、乙烯[8]等植物激素)和糖代谢[9]；由于纤维素和果胶是植物细胞壁的主要组成成分，因此纤维素酶、果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶[10]等与果实脱落相关[11]。
目前，桑葚脱落的分子机制还未见报道。本研究以白桑Morus alba为供试材料，对其进行转录组测序分析，探究桑葚在脱落过程中的生化成分代谢的分子机制，旨在为进一步了解桑葚果实脱落的分子机制提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
2021年4月在西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室桑树资源种质基地，选取无病害、健康状况较好的白桑幼果果柄。以落果果柄 (YD) 为实验组，取6个果柄为1份，设3个生物学重复，标记为YD1、YD2、YD3。正常果果柄 (YN) 为对照组，同样取6个果柄为1份，设3个生物学重复，标记为YN1、YN2、YN3。取材后立即在液氮中速冻并储存于−80 ℃冰箱保存。
1.2 冷冻切片的制作
将正常果和脱落果果柄组织清洗后用质量分数为4%的多聚甲醛过夜固定，用包埋剂包埋材料。待包埋剂彻底凝固后进行冷冻切片。切片厚度为5 μm，将切片后的材料吸附于阳离子载玻片上，室温干燥30 min后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤样品，去除包埋剂后置于显微镜下观察。
1.3 RNA提取
采用TRIzol法提取落果果柄和正常果果柄的总RNA，用分光光度计检测RNA样品的浓度和纯度，以保证是否可以进行下一步测序分析。
1.4 转录组测序与分析
样品由华大基因进行测序及分析，利用华大智造测序平台BGISEQ测序，所得的原始数据为raw reads。过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，过滤后的数据称为clean reads。将clean reads比对到参考基因组上，再进行后续分析。
1.5 测序原始数据的公开
将测序所得原始数据提交到美国国家生物技术信息中心(NCBI)的SRA数据库中，检索号为: PRJNA811258。
1.6 差异表达基因的筛选和富集分析
使用DEseq2方法检测样品之间的差异表达基因(DEG)[12]。根据基因本体论数据库(GO)和京都基因与基金组百科全书(KEGG)注释结果以及官方分类，将差异基因进行功能分类，同时使用R软件中的phyper函数进行富集分析。详细说明见Wiki网站
https://en.wikipedia.org/wiki/Hypergeometric_distribution 。校正后的P≤0.05为显著富集。1.7 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)验证
将桑葚幼果的落果果柄与正常果果柄RNA用PrimesciptTM RT reagent kit with gDNA Eraser (Takara)反转录，在primer premier 5.0软件设计定量引物(表1)，内参基因为 Actin，利用NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus(novoprotein) 试剂盒进行荧光定量PCR。反应程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。用2−ΔΔCt算法处理数据，利用GraphPad Prism 8.0.2软件作图。
表 1 转录组数据RT-qPCR验证引物序列Table 1 Primer sequences used in RT-qPCR validation of transcriptome data基因ID 基因名 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) XM_010096892.1 GH3.6 ACACTAACTACACCAGCCCAAA ACTTAATAGCACGAATGAACCC XM_010102492.2 bHLH78 TATTACCTTCGTCGTCCCCTCCTA ACCACTCTTTTCGTTTCCTTCACC XM_010113436.1 SAUR15 TGAAGAAGCCGAGAAGGAGTA GGTGGTAGGAGAAGGGATAAC XM_024169608.1 PHO1 GCCAATAACGACAGGAAA AACAACCCGTGAACAAAC 2. 结果与分析
2.1 果柄离区切片观察
桑果是带果柄脱落，为了研究桑树正常果柄和脱落果柄的差异，对其进行冷冻切片并观察显微结构。从图1可知：正常幼果果柄与枝干相连的区域内细胞规则，形态一致，而脱落幼果果柄与枝干相连处细胞小且致密。
图 1 落果与正常果果柄纵切面显微结构图Figure 1 Longitudinal section microscopic structures of abscised and normal surviving young fruit peduncles2.2 转录组测序结果质量分析
基于BGISEQ对桑葚幼果的落果与正常果果柄离区进行转录组测序，6个样品获得262.92 Mb的原始序列。原始测序数据经一系列质量控制后，每个样本获得超过6.3 Gb的高质量纯净测序数据量，每项碱基质量大于20的碱基数量占总碱基数量的比例 (Q20) 均大于96%，每项碱基质量大于30 的碱基数量占总碱基数量的比例 (Q30) 均大于91%。将每个样本的高质量纯净序列与测序并组装的桑树基因组序列进行比对，比对率均高于59%(表2)，表明本研究转录组测序数据质量较高，可用于后续的分析。
表 2 测序数据统计Table 2 Statistics of sequencing data样本
名称原始序列
数/Mb纯净序列
数/Mb纯净碱基
数/GbQ20/% Q30/% YD1 43.82 42.48 6.37 96.50 91.31 YD2 43.82 42.74 6.41 96.53 91.34 YD3 43.82 42.58 6.39 96.53 91.39 YN1 43.82 42.61 6.39 96.46 91.19 YN2 43.82 42.58 6.39 96.55 91.38 YN3 43.82 42.65 6.40 96.55 91.39 2.3 落果与正常果果柄的差异表达基因
用每2个样品之间的Pearson相关系数以反映样本间基因表达的相关性(图2)。结果发现：Pearson相关系数为0.69~1.00，说明各样本间重复性和相关性较好。
图 2 落果与正常果果柄的相关性热图Figure 2 Correlation heatmap of abscised and normal surviving young fruit peduncles在桑葚幼果果柄组织中，共鉴定到25 293个基因(图3A)。其中，共表达的基因有23 203个，占91.7%。正常果果柄特有基因为1 164个，占4.6%，落果果柄组特有基因为926个，占3.7%。由此可见，落果果柄基因较正常果果柄基因少。根据差异筛选标准，在2组中共筛选到10 481个差异表达基因(图3B)，其中，5 239个差异表达基因上调表达，5 242个差异表达基因下调表达。
图 3 落果与正常果果柄的表达基因和差异表达基因Figure 3 Expressed genes and differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles2.4 差异表达基因的GO富集分析
本研究对差异表达基因进行GO功能富集分析，共发现37个显著性GO条目。生物过程共富集到7 064个基因，显著富集到19个条目，涉及生物调节、细胞过程、代谢过程、对刺激的反应等，其中富集到生物过程中最多的差异表达基因为细胞过程和代谢过程基因；细胞组分共富集到6 857个基因，显著富集到6个条目，涉及细胞解剖实体、细胞内、其他有机部分、含蛋白质复合物、病毒粒子等，富集到细胞组分最多的差异表达基因为细胞解剖实体和细胞内基因；分子功能共富集到9 842个基因，显著富集到12个条目，涉及催化活性、转运蛋白活性、转录调节活性、分子功能调节剂等，富集到分子功能最多的差异表达基因为催化活性和结合基因(图4)。
图 4 落果与正常果果柄的差异表达基因GO分类柱状图Figure 4 Histogram of GO classification of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit pedunclesGO富集分析结果显示：大多数差异基因集中在催化活性、膜的组成成分、氧化还原酶活性、膜的内在成分，分别为4 623、2 774、777、1 781个基因(图5)。其中，具催化活性的基因最多，说明在桑葚的落果过程中可能有很多重要的酶参与，从而发生一系列的催化反应。
图 5 落果与正常果果柄的差异表达基因GO富集气泡图Figure 5 GO enrichment bubble chart of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles2.5 差异表达基因的KEGG代谢通路富集分析
在本研究中，细胞过程富集的基因为380个，富集到1个条目，为运输和分解代谢；环境信息处理共富集到653个基因，富集到2个条目，为膜运输和信号转导；遗传信息处理共富集到1 558个基因，包含4个条目，为折叠分类和降解、复制和修复、转录、翻译；代谢通路富集到5 315个基因，包含11个条目，为氨基酸代谢、其他次生代谢物的生物合成、碳水化合物代谢、能量代谢等；有机系统共富集到427个基因，含1个条目(图6)。分析发现：代谢通路富集的基因最多，说明桑葚在脱落过程中代谢反应尤为明显。
图 6 落果与正常果果柄的差异表达基因KEGG分类柱状图Figure 6 Histogram of KEGG classification of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit pedunclesKEGG通路富集分析结果显示：大多数差异表达基因集中在MAPK信号通路、黄酮类生物合成、柠檬酸循环、植物激素信号转导、氨基酸的生物合成通路，分别含293、102、55、318、251个基因(图7)。其中，植物激素信号转导途径的差异表达基因数量最多，说明在桑葚果实脱落过程中植物激素起到了十分重要的作用。
图 7 落果与正常果果柄的差异表达基因的KEGG富集气泡图Figure 7 KEGG enrichment bubble diagram of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles在桑树的代谢通路中，植物激素信号转导途径的差异表达基因数量最多，为318个基因，其中，落果果柄中有51.9% (156个)的差异表达基因的表达量高于正常果果柄(图8A)；在黄酮类生物合成途径中，有102个差异基因富集，其中有73.5% (75个)的差异基因在落果果柄中表达量高(图8B)；在氨基酸生物合成通路中，共有251个差异表达基因富集，其中有59.8% (150个)的差异表达基因在落果果柄中表达量更高(图8C)；在柠檬酸循环中，有55个差异表达基因富集，其中有74.5% (41个)的差异表达基因在落果果柄中表达量更高(图8D)。不难发现，落果果柄有超过一半的差异表达基因表达量高于正常果果柄。说明植物激素、黄酮类等次生代谢物以及柠檬酸等物质在桑葚脱落过程中发挥了重要的作用。
图 8 落果与正常果果柄的代谢途径的差异表达基因热图Figure 8 Heat map of differentially expressed genes in metabolic pathways of abscised and normal surviving carpopodium2.6 转录组测序数据的RT-qPCR验证
由于植物激素对于落花落果以及保花保果都具有十分重要的作用，于是在植物激素信号转导途径中筛选4个差异十分显著的基因，分别为GH3.6 (XM_010096892.1)、bHLH78 (XM_010102492.2)、SAUR15 (XM_010113436.1)、PHO1 (XM_024169608.1)。将这4个基因的每千个碱基转录每百万映射读取的碎片值(FPKM)绘制直方图，GH3.6在落果组中的表达水平是正常果组的20多倍，bHLH78在落果组中的表达水平约为正常果组20倍，PHO1(磷转运蛋白)在落果组中的表达水平是正常果组的30多倍，SAUR15在落果组中的表达水平是正常果组的100多倍(图9A)。由此推测，这4个基因均参与了桑葚的果实脱落。为了验证转录组数据的准确性，对这4个基因进行RT-qPCR验证，结果发现：4个差异表达基因的荧光定量相对表达量的变化趋势与转录组表达趋势一致，说明该转录组数据可靠(图9B)。
图 9 4个差异表达基因的RT-qPCR验证Figure 9 RT-qPCR validation of four differentially expressed genes3. 讨论
近年来，为了提高果树产量，越来越多果实脱落的相关研究被报道，如番茄Lycopersicon esculentum[13]、荔枝Litchi chinensis[14]、扁桃Amygdalus communis[15]等。桑树作为一种具有重要经济价值的植物，其生理落果引起学者们的关注。2021年，有研究者对不同种类的长果桑Morus macroura的生理落果进行研究，发现高浓度的脱落酸(ABA)和乙烯(ETH)能够促进落果，而高浓度的赤霉素(GA3)和生长素(IAA)抑制落果[16]。但是，关于桑树果实脱落的分子机制还尚不清楚。
植物激素是植物生长发育过程中十分重要的物质，参与植物的落花落果，与落花落果常见的相关植物激素有IAA、GA3、细胞分裂素、ETH、ABA[17]。
IAA主要是促进植物的生长发育，抑制果实的脱落，如果生长素在运输途径中受到阻碍则会导致植物果实的脱落[18−19]。GH3.6是吲哚乙酸酰胺合成酶的基因，能够催化IAA氨基化，使生长素失活[20]，这与本研究的结论一致。Small auxin-up RNA (SAUR) 基因是一类生长素早期响应基因，SAUR15能够调控植物的生长发育并参与环境胁迫响应[21]。在本研究中，SAUR15的表达水平在落果组高于正常果组100多倍，说明SAUR15基因可能参与桑葚果实脱落；ABA主要是促进果实脱落[7]，这是由于ABA能够增加纤维素酶的活性进而促进果实脱落[22]。有学者通过研究无核荔枝ABA合成关键酶LcNCED与生理落果的关系，验证了ABA对于落果的作用[14]；GA主要是通过作用于IAA影响果实脱落[23]；ETH主要促进果实的成熟、衰老、脱落，这在多种植物中被报道，如番茄[13]等；细胞分裂素能够促进坐果，延迟果实的脱落[24]。
此外，在对落果的研究中还发现了大量的基因和转录因子的调控，如JOINTLESS[25]、LATERAL SUPPRESSOR(LS)[26]、MACROCALYX[27]主要调控离区的形成，MYB[28]、WRKY[29]、bHLH[30]、bZIP[31]等转录因子能参与植物的器官脱落。bHLH78属于bHLH转录因子，参与植物生长和代谢[32]，调节花青素的生物合成[33]。本研究中，bHLH78的表达水平在落果组较高，说明其可能参与桑葚的脱落。此外，还有一些重要的酶及蛋白调控植物的器官脱落，如纤维素酶、果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、扩展蛋白等[34]。在本研究中，磷转运蛋白(PHO1)在落果果柄组的表达水平是正常果柄组的30多倍。此前研究表明：ABA调控依赖于PHO1的表达[35]，说明PHO1基因可能参与桑葚的脱落。
4. 结论
本研究GO富集分析结果显示：有4 623个基因具有催化活性，说明在果实脱落过程中，有多种重要的酶发挥催化效应；KEGG通路富集分析结果显示：大多数差异表达基因集中在黄酮类生物合成、柠檬酸循环、植物激素信号转导、氨基酸的生物合成等通路中，说明在果实脱落过程中，植物激素、糖类、次生代谢物质等发挥了重要的作用，从而调控果实的脱落。本研究筛选了4个显著的差异表达基因，均在桑葚脱落过程中参与反应，可为今后进一步研究桑树的果实脱落提供参考。
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图 1 不同温度对菌株菌丝生长速率的影响
Figure 1 Effect of different temperature on mycelial growth rate of strains
图 2 不同pH对菌株菌丝生长速率的影响
Figure 2 Effect of different pH on mycelial growth rate of strains
图 3 不同碳源对菌株菌丝生长速率的影响
Figure 3 Effect of different carbon source on mycelial growth rate of strains
图 4 不同氮源对菌株菌丝生长速率的影响
Figure 4 Effect of different nitrogen source on mycelial growth rate of strains
表 1 药剂稀释质量浓度
Table 1. Dilution mass concentration of reagents
病菌 稀释质量浓度/(mg·L−1) 吡唑醚菌酯 咪鲜胺 百菌清 氰烯菌酯 丙硫菌唑 共享镰刀菌 1 000.0、100.0、10.0、1.0、0.2 10.0、2.0、1.0、0.2、0.1 10.0、2.0、1.0、0.2、0.1 100.0、10.0、1.0、0.2、0.1 1 000、100、10、2、1 P. fuckelii 10 000、100、10、2、1 10.0、2.0、1.0、0.2、0.1 100、10、4、2、1 10 000、100、40、20、10 100、10、4、2、1 茶藨子葡萄座腔菌 10 000、100、10、2、1 100.0、10.0、1.0、0.2、0.1 10 000、100、10、2、1 10 000、100、40、20、10 1 000、100、10、2、1 灰葡萄孢 10 000、1 000、400、200、100 1.00、0.20、0.10、0.02、0.01 10 000、100、10、2、1 10 000、100、40、20、10 1.00、0.20、0.10、0.02、0.01 
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表 2 5种药剂对4个病菌的室内毒力测定
Table 2. Toxicity test of 5 chemicals against 4 pathogens
药剂 共享镰孢菌 P. fuckelii 茶藨子葡萄座腔菌 灰葡萄孢 毒力回归
方程r EC50/
(mg·L−1)毒力回归
方程r EC50/
(mg·L−1)毒力回归
方程r EC50/
(mg·L−1)毒力回归
方程r EC50/
(mg·L−1)吡唑醚菌酯 y=0.15x+4.76 0.97 39.222 9 y=0.14x+5.34 0.99 0.0041 y=0.47x+5.20 0.90 0.367 5 y=0.45x+3.91 0.93 275.052 7 咪鲜胺 y=0.68x+6.34 0.97 0.010 8 y=0.47x+6.12 0.97 0.0043 y=0.69x+5.72 0.87 0.091 5 y=0.64x+6.07 0.97 0.021 0 百菌清 y=0.55x+4.96 0.99 1.178 9 y=0.57x+4.96 0.96 1.1676 y=0.57x+5.00 0.96 0.990 4 y=0.28x+4.74 0.98 8.238 0 氰烯菌酯 y=0.72x+5.38 0.75 0.294 7 y=0.88x+3.40 0.92 65.7059 y=0.79x+3.66 0.94 50.702 6 y=0.80x+3.34 0.95 118.136 7 丙硫菌唑 y=0.73x+4.00 0.97 23.363 3 y=0.31x+5.14 0.95 0.3582 y=0.60x+4.43 0.97 8.845 4 y=0.73x+5.64 0.98 0.134 1 说明：y为抑制几率值，x为药剂质量浓度的对数值。
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