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研究植物与其环境之间的相互关系是目前林业研究的热点问题之一[1]。植物在个体水平上表现出的生理、形态或物候等方面的属性，被称为植物功能性状[2]。植物的功能性状是植物不断适应环境条件的变化而演化的结果，可以直观地反映植物对环境变化的适应能力[3]。植物叶性状与植物个体、群落、生态系统功能的基本行为和功能具有密切相关性, 可反映植物适应环境变化所形成的生存对策[4]。植物叶功能性状指标中的叶面积与氮、磷、钾元素质量分数是植物功能性状的重要表征指标[5]，氮磷比可以指示植物的氮、磷限制[6]，而比叶面积和干鲜比能够综合反映植物利用资源的能力[7−8]。
生活型是植物在长期适应环境中，所表现出的外部形态、结构、性状的分类类型。不同生活型的植物对光合作用的需求和利用效率存在差异，这一差异与物种自身的生物学特性及生态适应能力有关[9]。如落叶和常绿植物中，落叶物种具有喜光不耐阴的特性，而常绿物种具有较高的耐阴性，因此落叶物种更容易受到光资源的限制[10]。相关研究表明，落叶树种的叶面积、比叶面积大于常绿树种，但叶干物质质量小于常绿树种[11]。与灌木相比，乔木对环境中氮、磷、钾等养分的吸收和储存能力更强[12]。乔木和灌木之间的叶氮质量分数和比叶面积存在显著差异。通常情况下，乔木的叶氮质量分数、比叶面积均高于灌木[13]，但也有研究发现，灌木的比叶面积大于乔木[14]。影响植物功能性状的因素还包括环境因素(气候、纬度、海拔、水热条件等)和自身因素(生长情况、健康程度、寿命等)[15]。上述研究有助于理解不同生活型植物适应其所处的生态环境的规律，以及所处森林生态系统的健康状况和对环境变化的响应。然而，随着气候变化的加剧，特殊生存环境内不同生活型树种的叶功能性状特征及其差异规律尚不清楚，因此，研究气候过渡区不同生活型树种叶功能性状及其耦合关系尤为重要。
河南省连康山国家级自然保护区位于大别山北麓，属于中国北亚热带北缘过渡区。该保护区的主要保护对象为北亚热带森林生态系统以及亚热带北部边缘常绿阔叶植被类型。大别山北缘森林群落呈现复杂的结构和丰富的物种多样性，其林冠郁闭度较高。因此，研究该生态系统中叶功能性状之间的关系具有重要意义。本研究旨在通过对连康山国家级自然保护区森林群落木本植物叶功能性状的测定，分析其功能性状之间的关系，揭示大别山北缘森林植物叶功能性状的变化规律，以更好地解释植物对所处环境的响应机制，并为连康山国家自然保护区森林的保护和管理提供科学依据。
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研究区位于连康山国家级自然保护区新县林场，处于河南省南部的新县境内，豫、鄂两省交界处的大别山腹地(31°33′~31°43′N， 114°43′~114°52′E)。研究区地处北亚热带，是北亚热带向暖温带过渡的季风气候湿润区。年均气温为15.1 ℃，极端最低温为−17.3 ℃，极端最高温为42.5 ℃；日照时数为1 900.8 h，≥10 ℃的活动积温为4 769.5 ℃，年均太阳总辐射为4 720.0 MJ·m−2，无霜期为227.0 d；年均降水量为1 248.0 mm，相对湿度为76%。境内山峦起伏，沟壑纵横，地貌奇特，相对高差为100~700 m。复杂的地貌特征和特殊的气候条件，构成了各种不同的生态小环境，孕育了丰富的生物资源。研究区内森林植被为北亚热带常绿、落叶阔叶林类型，属北亚热带向暖温带过渡带的森林生态系统，乔木植物主要有青冈Cyclobalanopsis glauca、枫香Liquidambar formosana、马尾松Pinus massoniana、白檀Symplocos paniculata和野漆Toxicodendron succedaneum等，林下灌木植物主要有檵木Loropetalum chinense、柃木Eurya japonica、毛樱桃Cerasus tomentosa等。
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样地设置于连康山国家级自然保护区常绿次生林分布区，位于连康河两岸，其中河岸北侧的群落主要分布在阳坡，河岸南侧的群落主要分布在阴坡。利用全站仪(南方测绘)在河岸南侧连续建立34个监测样地，在河岸北侧连续建立16个监测样地。利用全站仪，采用等角测量的方式构建50个20 m×20 m样地，通过网格法将样地划分为4个10 m×10 m的样方和16个5 m×5 m的小样方，对每个10 m×10 m小样方中胸径≥1 cm且树高≥1.3 m的木本植物进行记录调查，记录植物名称、胸径、树高，相对坐标(X, Y)以及样地中心点全球定位系统(GPS)坐标。
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样地内共30种木本植物(表1)。对样地内所有木本植物进行样品采集和处理，同时分为常绿树种(9种)和落叶树种(21种)、乔木树种(26种)和灌木树种(4种)等不同生活型。利用高枝剪和测高仪分别进行叶片取样和树高测量，并在植株冠层采集5~10枚完整且无病虫害的成熟叶片样本，然后选取2枚完整、健康且大小相似的叶片，擦拭叶片表面的灰尘和污渍后装入密封袋，以便进行相关指标的测定。
表 1 样地内的木本植物种类
Table 1. Species of woody plants in the sample plots
植物种 科名 生活型 缩写 植物种 科名 生活型 缩写 白蜡树Fraxinus chinensis 木樨科Oleaceae 落叶乔木 Frc 柃木Eurya japonica 五列木科Pentaphylacaceae 常绿灌木 Euj 白檀Symplocos paniculata 山矾科Symplocaceae 落叶乔木 Syp 毛八角枫Alangium kurzii 八角枫科Cornaceae 落叶乔木 Alk 豹皮樟Litsea coreana var. sinensis 樟科Lauraceae 常绿乔木 Lis 毛樱桃Cerasus tomentosa 蔷薇科Rosaceae 落叶灌木 Cet 冬青Ilex chinensis 冬青科Aquifoliaceae 常绿乔木 Ilc 茅栗Castanea seguinii 壳斗科Fagaceae 落叶乔木 Cas 杜鹃Rhododendron simsii 杜鹃花科Ericaceae 落叶灌木 Rhs 南烛Vaccinium bracteatum 杜鹃花科Ericaceae 常绿乔木 Vab 短柄枹栎Quercus serrata 壳斗科Fagaceae 落叶乔木 Qub 青冈Cyclobalanopsis glauca 壳斗科Fagaceae 常绿乔木 Cyg 枫香Liquidambar formosana 蕈树科Altingiaceae 落叶乔木 Lif 青皮木Schoepfia chinensis 青皮木科Schoepfiaceae 落叶乔木 Scc 海桐Pittosporum tobira 海桐科Pittosporaceae 常绿乔木 Pit 山矾Symplocos sumuntia 山矾科Symplocaceae 常绿乔木 Sys 合欢Albizia julibrissin 豆科Fabaceae 落叶乔木 Alj 山胡椒Lindera glauca 樟科Lauraceae 落叶乔木 Lig 化香树Platycarya strobilacea 胡桃科Juglandaceae 落叶乔木 Pls 石栎Lithocarpus glaber 壳斗科Fagaceae 常绿乔木 Litg 黄连木Pistacia chinensis 漆树科Anacardiaceae 落叶乔木 Pic 五角枫Acer pictum 无患子科Sapindaceae 落叶乔木 Acp 黄檀Dalbergia hupeana 豆科Fabaceae 落叶乔木 Dah 杨桐Adinandra millettii 五列木科Pentaphylacaceae 常绿乔木 Adm 檵木Loropetalum chinense 金缕梅科Hamamelidaceae 落叶灌木 Loc 野茉莉Styrax japonicus 安息香科Styracaceae 落叶乔木 Stj 君迁子Diospyros lotus 柿科Ebenaceae 落叶乔木 Dil 野桐Mallotus japonicuss 大戟科Euphorbiaceae 落叶乔木 Maj 苦木Picrasma quassioides 苦木科Simaroubaceae 落叶乔木 Piq 野鸦椿Euscaphis japonica 省沽油科Staphyleaceae 落叶乔木 Euj -
选取与植物生长、光合、养分留存等特征有关的8项叶功能性状进行测定，包括比叶面积(m2·kg−1)、叶面积(mm2)、干鲜比、叶绿素含量、氮质量分数(g·kg−1)、磷质量分数(g·kg−1)、钾质量分数(g·kg−1)和氮磷比。比叶面积是单叶面积与其干质量的比值，干鲜比为叶干质量与鲜质量的比值[16]。因为植物叶片叶绿素含量与SPAD值呈正相关，故采用叶片SPAD值表示叶绿素含量。
对采摘的新鲜叶片用剪刀除去叶柄后，用电子天平称取叶片鲜质量(精度0.000 1 g)，用叶面积仪(Yaxin-
1241 )测量叶片的长度、宽度以及叶面积，用叶绿素计(SPAD-502 Plus)测定SPAD值。将叶片放置于80 ℃烘箱中经48 h烘干至恒量后，用电子天平称其干质量，叶片烘干后进行氮、磷、钾的测定。氮由半微量凯氏定氮仪测定，磷通过钼锑抗比色法测定，钾通过火焰分光光度法测定[17]。 -
使用Excel 2022对原始数据进行对数转换的预处理，使其符合数据的正态性。对转换后的数据使用单因素方差分析和最小显著差异法(LSD)，分析不同生活型木本植物叶功能性状指标的差异；采用Pearson相关系数检验叶功能性状之间的相关关系；采用主成分分析法(PCA)分析不同生活型木本植物叶功能性状的主成分。所有统计分析均在Origin 2022和SPSS 27.0中完成。
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由图1可知：常绿树种的SPAD显著高于落叶树种(41.12)(P＜0.05)；落叶树种的叶氮、磷、钾质量分数均分别显著高于常绿树种(P＜0.05)；落叶树种的叶面积和比叶面积均分别显著高于常绿树种(P＜0.05)，而常绿树种和落叶树种的平均干鲜比与氮磷比之间均无显著差异。可见，常绿树种的叶片具有较低氮、磷、钾质量分数及较小的叶面积与比叶面积，还具有较高的叶绿素含量。
图 1 常绿树种与落叶树种叶功能性状差异比较
Figure 1. Comparison of differences in leaf functional traits between evergreen and deciduous tree species
由图2可知，乔木树种与灌木树种的SPAD与比叶面积无显著差异。乔木树种的叶面积以及叶氮、磷、钾质量分数均分别显著大于灌木树种(P＜0.05)。此外，灌木树种叶干鲜比和叶氮磷比均分别显著大于乔木树种(P＜0.05)。上述结果表明：乔木树种具有较大的叶面积和氮、磷、钾质量分数，以及较小的干鲜比与氮磷比。说明乔木树种相对于灌木树种更容易从环境中获取氮、磷、钾等资源，在与灌木树种的竞争中处于绝对优势。与此相反，灌木树种叶片具有较大的干鲜比与氮磷比，表明灌木树种在有限资源下更注重保障自身生长发育，在叶片中合成更多的有机物。
图 2 乔木树种与灌木树种叶功能性状差异比较
Figure 2. Comparison of differences in leaf functional traits between tree and shrub species
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由图3可知：叶氮、磷质量分数与钾质量分数均呈显著正相关(P＜0.05) ，而叶氮磷比与氮、磷、钾质量分数均呈显著负相关(P＜0.05)。这表明叶氮、磷、钾元素在植物生长过程中具有协调作用。另外，叶SPAD与叶氮磷比呈显著正相关(P＜0.05) ，而与叶氮、磷质量分数均呈负相关(P＜0.05) ；叶面积与比叶面积均分别与叶氮、磷、钾质量分数呈正相关(P＜0.05)，而分别与叶SPAD、干鲜比、氮磷比呈负相关(P＜0.05)。表明植物通过增加叶干物质质量和叶面积的方式，增加光合速率，提高其对于环境中氮、磷、钾元素的吸收效率。
图 3 不同生活型木本植物叶功能性状的相关性
Figure 3. Correlations among leaf functional traits of woody plants with different life forms
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如图4所示：主成分分析将30种木本植物的8个叶功能性状划分为2个主成分，其中第1主成分对植物叶功能性状变异的贡献率为55.2%，该主成分相关度最高的是叶磷质量分数，其次为叶氮和钾质量分数、比叶面积，而叶面积的相关度最低。第2主成分的贡献率为12.8%，其中叶氮磷比的相关度最高，其次为SPAD，最低为干鲜比。主成分分析将叶功能性状指标归为4个功能组类型，其中第1组具有较大的叶氮磷比、SPAD、干鲜比，表明该组植物具有较高的光合速率并且合成了更多有机物，对该组叶功能性状贡献较大的树种有石栎、杨桐等树种；第2组具有较大的叶面积、叶氮、叶磷、叶钾质量分数，说明该组植物充分利用资源，通过增加叶面积的方式，进而提高叶片对阳光的利用效率，对该组叶功能性状贡献较大的树种有黄檀、毛八角枫等树种；第3组植物具有较大的比叶面积，说明该组植物具有较强的资源获取能力，对该组叶功能性状贡献较大的树种有豹皮樟、南烛等树种；第4组的叶功能性状指标无明显的规律性，该组物种包括檵木、青冈等树种。
图 4 不同生活型木本植物叶功能性状主成分分析
Figure 4. Principal component analysis (PCA) of leaf functional traits in different life forms of woody plants
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不同生活型的叶功能性状往往存在一定的差别，这既是植物适应环境的结果，也是衡量叶片的能值水平及水分对植物的影响的判断依据。对不同生活型的叶功能性状进行研究，有助于在森林经营或保护过程中，有针对性地降低或阻止性状表现不好的物种竞争资源[18]。本研究发现：不同生活型植物叶氮、叶磷质量分数存在显著差异，其中落叶树种的叶氮、叶磷质量分数均显著大于常绿树种，这与已有研究结果[19]基本一致。相比于落叶树种，常绿植物在叶片凋落前转移了更多的养分，且常绿乔木具有较高的叶片厚度、叶干鲜比、叶面积以及较低的叶磷质量分数、比叶面积[20]。
在本研究中，常绿物种的叶钾质量分数低于落叶物种，这可能是因为钾元素在落叶植物体内不形成化合物，始终以离子游离状态存在，通常不断地向代谢旺盛的部位转移，间接反映了该地区落叶树种的叶片代谢可能较常绿乔木更为旺盛[21]。此外，本研究发现：落叶树种的比叶面积高于常绿树种，这可能是由于落叶树种叶片寿命较短，仅在生长期内进行光合作用，与已有研究结果一致[22]。落叶树种需要采取提高潜在回报能力、降低叶片构造成本的策略来最大程度提供光合产物，从而导致落叶树种相较于常绿树种有较高的光合速率和较高的比叶面积。本研究还发现：灌木为了在有限的光照条件下生存，表现出相对较低的叶氮、叶磷、叶钾质量分数，以及较高的叶干鲜比和氮磷比，与相关研究结论一致[23]。
植物的生命活动以及功能表达并不是单一的，大部分植物通过性状组合，以适应和响应环境变化[24]。植物功能性状之间存在显著相关性，其中促进和制约关系存在于不同功能性状之间，体现了相同生境中不同植物的趋同适应特征[25]。相关研究表明，比叶面积、叶氮和叶磷质量分数之间均呈正相关[26]；叶干鲜比与比叶面积之间呈显著负相关[27]；叶氮和叶磷质量分数呈显著正相关，同时它们与比叶面积呈显著正相关[28]，与上述研究结果相似。本研究发现，叶面积与比叶面积均分别与叶氮、叶磷、叶钾质量分数呈显著正相关，而与叶绿素含量(SPAD)、叶干鲜比、叶氮磷比均呈显著负相关。
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本研究区内不同生活型木本植物叶功能性状存在着差异，其中常绿树种相对于落叶树种，具有较低叶氮、叶磷、叶钾质量分数及较小的叶面积与比叶面积，而乔木树种的叶干鲜比与叶氮磷比低于灌木树种。叶功能性状指标之间的相关分析结果表明：叶氮、叶磷、叶钾在研究区木本植物生长过程中具有协调作用，且研究区内木本植物通过增加叶片组织密度和叶面积的方式，增加叶片光合速率，进而提高植物对环境中氮、磷、钾元素的吸收效率。
Leaf functional traits and their coupling relationships of woody plants with different life forms in the northern Dabie Mountains
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摘要:
目的 探讨大别山北缘不同生活型木本植物叶功能性状变异，研究叶功能性状指标之间的耦合关系，为解析植物对气候变化的响应机制提供依据。 方法 采集大别山北缘连康山国家级自然保护区30种常见的不同生活型木本植物(常绿、落叶、乔木、灌木)的叶片，测定其叶绿素含量(以SPAD表示)、干鲜比、氮质量分数、磷质量分数、钾质量分数、氮磷比、叶面积、比叶面积共8个叶功能性状指标，分析了不同生活型木本植物叶功能性状及其相关性。 结果 不同生活型木本植物叶功能性状指标具有一定的差异性，其中常绿和落叶树种的叶片SPAD、氮质量分数、磷质量分数、钾质量分数、叶面积和比叶面积之间差异显著(P＜0.05)；乔木与灌木树种的叶面积、氮质量分数、磷质量分数、钾质量分数、干鲜比与氮磷比差异显著(P＜0.05)。部分叶功能性状指标之间存在一定的相关性，叶片氮、磷质量分数与钾质量分数呈显著正相关(P＜0.05)，叶片氮质量分数与磷质量分数呈显著正相关(P＜0.05)；叶面积与叶片氮、磷、钾质量分数呈显著正相关(P＜0.05)，比叶面积与叶片氮、磷、钾质量分数呈显著正相关(P＜0.05)。主成分分析结果表明：叶片磷、氮、钾质量分数是较为重要的叶功能性状指示指标，可将30种木本植物归为4个功能组，且第1和第2主成分对植物叶功能性状变异的贡献率分别为55.2%和12.8%。 结论 叶功能性状指标在不同生活型木本植物之间存在一定差异，其中叶磷、氮、钾质量分数是指示性指标，且与叶面积显著正相关。图4表1参28 Abstract:Objective This study aim to explore the variation of leaf functional traits among different life forms of woody plants on the northern edge of the Dabie Mountains, investigate the coupling relationship between indicators of leaf functional traits, and provide a basis for deciphering the response mechanisms of plants to climate change. Method Leaf functional traits of 30 common woody plants with different life forms (evergreen, deciduous, arbor, shrub) in Liankangshan National Nature Reserve on the northern edge of the Dabie Mountains were collected, and eight leaf functional traits including chlorophyll content, dry/fresh ratio, nitrogen content, phosphorus content, potassium content, nitrogen/phosphorus ratio, leaf area, and specific leaf area were determined. The leaf functional traits and their correlations of different life forms of woody plants were analyzed. Result There were certain differences in leaf functional traits among different life forms of woody plants, among which the average chlorophyll content, nitrogen content, phosphorus content, potassium content, leaf area, and specific leaf area of evergreen and deciduous trees showed significant differences (P＜0.05). The average leaf area, nitrogen content, phosphorus content, potassium content, dry/fresh ratio, and nitrogen/phosphorus ratio of arbor and shrub showed significant differences (P＜ 0.05). There were certain correlations between some leaf functional traits, such as positive correlation between leaf nitrogen and phosphorus content and potassium content (P＜ 0.05), significant positive correlation between leaf nitrogen content and phosphorus content (P＜0.05), positive correlation between leaf area and leaf nitrogen, phosphorus, potassium content (P＜0.05), and positive correlation between specific leaf area and leaf nitrogen, phosphorus, potassium content (P＜ 0.05). The principal component analysis results showed that the leaf phosphorus, nitrogen, and potassium contents were important indicators of leaf functional traits, and the 30 woody plants could be classified into four functional groups based on the first and second principal components, with the contribution rates of 55.2% and 12.8% to the variation of plant leaf functional traits respectively. Conclusion There exists a certain pattern of variation in leaf functional trait indicators among different life forms of woody plants. Among them, leaf phosphorus, nitrogen, and potassium mass fractions are indicative indicators, and they are significantly positively correlated with leaf area. [Ch, 4 fig. 1 tab. 28 ref.] -
Key words:
- woody plants /
- leaf functional traits /
- life form /
- northern Dabie Mountains
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低温是限制植物生长和发育的主要逆境因子。较低的温度会损伤植物细胞的膜结构，抑制酶活性，诱导活性氧产生，破坏代谢平衡等，引起植物生长受阻、早衰甚至死亡[1]。世界上只有三分之一的陆地面积温度在冰点以上，却有42%的陆地会经历−20 ℃以下的低温，因此低温也是限制植物地理分布的重要因素[2]。为了应对低温胁迫，植物在长期进化过程中逐渐形成了低温适应机制，用来提高植物耐受低温逆境的能力，降低低温胁迫伤害。在代谢层面上，植物可以通过提高可溶性糖、游离脯氨酸等小分子渗透调节物，以及抗氧化酶过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等的活性来增加对低温的耐受力[3]。分子层面上，低温下植物细胞膜的流动性降低，膜蛋白的构象发生改变，进而使膜刚性增加，细胞膜的这些物理变化为膜上低温受体对低温的感受提供了基础。植物细胞的受体感受低温信号后，通过提高细胞质中的钙离子(Ca2+)水平，并与Ca2+结合蛋白结合，作为二级信号激活抗寒相关转录因子，调控耐寒相关基因，实现低温胁迫响应[4]。目前，低温响应的分子调控途径中，ICE1-CBF-COR途经被认为是植物响应耐寒胁迫的主要途径[5]。低温通过Ca2+信号引发蛋白激酶磷酸化脱落酸(ABA)信号调控途径中的蛋白激酶OST1 (open stomata1，气孔开放1)/SnRK2.1 (SNF1-related protein kinase 2.1，SNF1相关蛋白激酶2.1)，磷酸化的OST1与bHLH类转录因子ICE1结合并将其磷酸化，稳定ICE1的活性，使其稳定结合在CBF (C-repeat binding factor，C-重复结合因子)基因上，激活它们的表达。CBF转录因子会进一步启动冷响应相关基因CORs (cold responsive，低温响应)，如编码渗透调节物质合成酶以及低温保护蛋白COR、LT1 (low temperature 1，低温1)和CIN (cold-induced，冷诱导)基因等，提高植物的低温适应性[6-7]。除此之外，植物激素[8]和ROS (reactive oxygen species，活性氧)[9]也参与了植物低温响应的调控。
植物细胞中，低温的响应和调控主要发生在细胞质和细胞核中，但叶绿体在低温响应中也发挥了重要作用。叶绿体不仅是低温响应二级信号分子ROS产生的主要场所[10]，还参与水杨酸(SA)[11]、茉莉酸(JA)[12]、ABA[13]以及脯氨酸[14]等的生物合成。这些物质在植物低温响应中都产生了积极效应。因此，参与叶绿体生物活性的相关基因在低温逆境响应中也发挥了重要的功能。近年来，研究者发现叶绿体产生的ROS等信号分子可以通过逆行性信号传递途径进入细胞核来调控核基因的表达，以实现植物对环境的适应[15]。但叶绿体参与低温胁迫响应的具体分子机制大多不清楚。随着人们对植物逆境生物学研究重视程度的提高，越来越多参与植物非生物逆境响应的基因被挖掘出来，这些基因中有些响应特异逆境，也有些能够响应多种逆境，表明植物响应逆境的分子机制非常复杂的。尽管已经确定了相当数量逆境响应基因的功能，但仍有很多功能未知的基因响应非生物逆境胁迫[16]。
桉Eucalyptus树是世界上生长最快的木本植物之一，作为重要的用材树种广受欢迎，但大部分桉树对低温的耐受程度比较差。以桉树为材料研究它们的耐低温分子机制，深入挖掘低温胁迫响应相关的基因资源，对桉树的栽培和育种都有促进作用[17]。EgrCIN1 (cold induced 1)是一个随低温处理时间延长表达不断增强的基因。亚细胞定位表明其表达的蛋白定位在巨桉Eucalyptus grandis叶绿体中。本研究通过对该基因及其编码蛋白序列特征的分析和在拟南芥Arabidopsis thaliana中异源过表达后转基因株系对低温的响应等实验，分析该基因响应低温胁迫的功能。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
巨桉为保存于浙江农林大学苗圃的G5扦插无性系材料。拟南芥野生型为哥伦比亚生态型，生长于浙江农林大学智能实验楼拟南芥生长室，生长条件为25 ℃ 16 h光照/22 ℃ 8 h黑暗，相对湿度为65%，光照强度为100 µmol·m−2·s−1。
1.2 EgrCIN1基因、编码蛋白序列及启动子顺式作用元件分析
根据EgrCIN1的编号(Eucgr.B02882)在phytozome (
https://phytozome-next.jgi.doe.gov )中获取其基因、蛋白序列。使用ProtParam (http://web.expasy.Org/protparam/ )分析EgrCIN1蛋白的相对分子量、理论等电点；使用PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/?disopred=1 )在线预测其二级结构；使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )进行跨膜结构预测；利用Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/ )对EgrCIN1在细胞中的表达位置进行预测；同时截取EgrCIN1基因起始密码子ATG上游1 500 bp的序列作为其启动子，使用在线分析网站Plant Care (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )分析EgrCIN1基因启动子上的顺式作用元件。1.3 定量分析实验设置
1.3.1 4 ℃低温不同处理时间下的表达分析
取6个月苗龄的巨桉G5无性系幼苗，于低温生长箱(Snijder，荷兰)中进行0.5、2.0、6.0、12.0、24.0、48.0 h的4 ℃低温处理。8 h光照/16 h黑暗，相对湿度为60%，光照强度为150 µmol·m−2·s−1。同时分别以正常温度(白天26 ℃，晚上22 ℃，湿度、光照与处理相同)条件下生长的G5无性系幼苗为对照(ck)。3株幼苗为1个处理组，设置3次重复。处理结束后，取叶片置于液氮速冻。
1.3.2 组织特异性分析
分别取6个月苗龄的巨桉G5无性系幼苗根、茎、嫩叶(顶端新生叶片)以及成熟叶片各100 mg，置于液氮速冻，待测。
1.3.3 干旱、高盐、ABA、茉莉酸甲酯(MeJA)处理下的表达分析
选取长势一致、6个月苗龄的巨桉G5无性系幼苗，分别进行干旱、高盐、ABA、MeJA等4种胁迫处理。干旱、高盐处理：干旱组不浇水即可；高盐处理组每次浇灌300 mmol·L−1氯化钠(NaCl)溶液200 mL，间隔12 h续浇1次；对照组浇灌等量清水，连续处理1周。ABA、MeJA处理：分别配制浓度为100 μmol·L−1的ABA和MeJA溶液，均匀喷洒在幼苗叶片上，对照组喷施等量清水，12 h处理1次，共处理24 h。每个处理3个植株，重复3次。处理结束后选择相同叶位的成熟叶片取样。
1.3.4 RNA提取
使用TIANGEN总RNA提取试剂盒(DP432)，利用PrimerScript TM RT reagent Kit (TaKaRa，日本)试剂盒将RNA反转录为cDNA。设计引物(表1)，以EgrACTIN为内参，用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa，日本)进行EgrCIN1基因表达的实时荧光定量PCR (RT-qPCR)实验，分析EgrCIN1在巨桉不同组织中及不同逆境处理后的表达情况。
表 1 引物列表Table 1 Primers用途 引物名称 引物序列(5′→3′) 35S::EgrCIN1载体构建 35S::EgrCIN1-F cgggggtaccATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA 35S::EgrCIN1-R gctctagaTCATCGGACATGGGGAATTACA 35S::EgrCIN1::GFP载体构建 EgrCIN1::GFP-F gctctagaATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA EgrCIN1::GFP-R cgggggtaccTCGGACATGGGGAATTACA 半定量PCR EgrCIN1-F AGCCTATGCTTGTACTCCACCA EgrCIN1-R TTGCCGCCCTCGGCGCGGATGA AtACTIN-F TAGGCCAAGACATCATGGTGTCAT AtACTIN-R GTTGTACGACCACTGGCGTACAAG RT-qPCR EgrACTIN-F CCCGCTATGTATGTCGC EgrACTIN-R AAGGTCAAGACGGAGGAT qEgrCIN1-F ATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA qEgrCIN1-R TCATCGGACATGGGGAATTACA 说明：引物前小写字母为酶切位点及保护碱基 1.4 EgrCIN1蛋白亚细胞定位
以改造过的pCAMbia1300-GFP载体为骨架，在phytozome上获得EgrCIN1的转录本序列，去掉终止密码子后使用Primer Premier 5设计上下游引物并在引物2端分别添加Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点及保护碱基(表1)，基因克隆后进行EgrCIN1::GFP融合载体构建。重组的阳性克隆提取质粒后，利用电转法转入农杆菌Agrobacterium tumetacie GV3101中。瞬时转化烟草Nicotiana tabacum叶片，共培养2 d后用激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM510，德国)观察并拍照。GFP荧光观察激发光波长设置为488 nm，吸收光波长为500~525 nm；观察叶绿素荧光时激发光波长设置为552 nm，吸收光波长则为620~650 nm。
1.5 EgrCIN1超表达载体构建及拟南芥异源转化
以含35S启动子的pCAMBIA1301为载体骨架，选取多克隆位点处的Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ作为酶切位点，设计EgrCIN1带酶切位点的全长基因引物(表1)，PCR扩增，鉴定后进行35S::EgrCIN1载体构建。电击转化农杆菌GV3101，蘸花法侵染拟南芥。种子收获后，在含25 μg·mL−1潮霉素B (Hygromycin B，罗氏，瑞士)的1/2 MS培养基进行阳性株系筛选，获得的阳性株系培养一段时间后，提取叶片基因组DNA，利用EgrCIN1基因特异引物(表1)进行分子鉴定。阳性株系继续繁殖、筛选，直至获得T3代转基因纯合株系。
1.6 转基因拟南芥株系中EgrCIN1的表达
经筛选获得3个超表达EgrCIN1转基因纯合株系，纯合株系植株种植10 d后，提取叶片RNA，反转录为cDNA，设计引物(表1)，以AtACTIN为内参，进行半定量PCR实验。
1.7 EgrCIN1拟南芥过表达转基因株系低温和ABA处理
野生型和EgrCIN1过表达株系种子经体积分数为75%乙醇消毒后，播种在1/2 MS培养基上，4 ℃春化处理2 d。低温处理：培养基上培养1周后的野生型和转基因株系幼苗分别移栽至育苗盆中，每盆中野生型和1个转基因株系各移栽4株。生长2周后，在低温培养箱中−6 ℃处理12 h后移至正常生长条件下恢复1周，观察表型并拍照。每个株系处理3盆，重复3次。实验结束后统计野生型(COL)和各株系的存活率。ABA处理：野生型和3个过表达株系分别播于含0.5 μmol·L−1 ABA的培养基上，生长10 d后，观察表型并拍照。
1.8 数据处理
定量结果采用2－ΔΔCt[18]方法计算；作图软件为GraphPad Prism ver 6.01；使用SPSS 16.0进行显著性检验，分析方法选择单因素方差分析，默认置信区间95%。
2. 结果与分析
2.1 EgrCIN1基因的筛选及在4 ℃低温不同处理时间下的表达分析
课题组前期从巨桉4 ℃低温处理2 h的转录组中筛选到1个表达受到低温强烈诱导的基因，将其命名为EgrCIN1 (cold induced 1)。Phytozome数据库中该基因的序列号为Eucgr.B02882。为进一步了解EgrCIN1对低温的响应，利用RT-qPCR技术对4 ℃不同处理时间(0.5、2.0、6.0、12.0、24.0、48.0 h)的巨桉无性系幼苗进行EgrCIN1表达特性分析。结果表明(图1)：除了处理0.5 h的植株中EgrCIN1基因的表达水平与未处理植株(对照)相比没有显著差异外，随处理时间的延长，EgrCIN1的表达水平逐渐升高，处理48.0 h时，其表达水平已经达到了对照的48.6倍。48.0 h后，叶片萎蔫严重，明显受到低温生理伤害，故未进一步取样分析。可见，EgrCIN1表达明显受低温诱导，且随处理时间的延长表达有增强的趋势。
图 1 4 ℃低温处理不同时间下EgrCIN1的定量表达Figure 1 Relative expression of EgrCIN1 gene under 4 ℃ low temperature treatment for different time2.2 EgrCIN1基因、蛋白序列分析
根据巨桉数据库获取信息和相关分析可知：该基因开放阅读框全长579 bp，不含内含子。编码含有192个氨基酸的蛋白，等电点为6.98，相对分子量为20.80 kDa。该基因编码的蛋白既没有旁系同源物，也没有直系同源物，是巨桉中特有且唯一的蛋白。
利用PSIPRED对EgrCIN1编码的蛋白的二级结构预测表明：该蛋白含有2个β转角和7个ɑ螺旋，其余部分则为无规则卷曲(图2A)。利用TMHMM对EgrCIN1蛋白序列跨膜结构的预测则表明：序列中所有氨基酸序列位点的跨膜概率均小于0.02，没有明显跨膜区域(图2B)，说明其不是膜蛋白。亚细胞定位预测结果显示：EgrCIN1编码的蛋白可能在叶绿体、线粒体、细胞质及细胞核中都能表达。
图 2 EgrCIN1蛋白二级结构(A)和跨膜结构(B)预测Figure 2 Prediction of EgrCIN1 protein secondary structure (A) and transmembrane structure (B)2.3 EgrCIN1基因启动子顺式作用元件分析
对EgrCIN1的启动子上分布的顺式作用元件进行了分析，发现在EgrCIN1启动子上分布着多个与植物非生物逆境胁迫响应密切相关的顺式作用元件(表2)，其中脱落酸应答元件(ABA response element, ABRE) 2个，乙烯响应元件(ethylene response element, ERE) 1个，低温响应元件(low temperature response element, LTR) 1个，植物转录因子MYB识别序列(MYB recongnition site)、MYC结合序列均为干旱和ABA响应元件，分别有4和6个。表明该基因的表达可能受到逆境胁迫的调控。
表 2 EgrCIN1基因启动子上的顺式作用元件Table 2 Cis-elemtents in the promoter of EgrCIN1名称 位置 基序(5′→3′) 数量 功能 ABRE 1 165−、1 165+ GTGCAC 2 ABA响应元件 ERE 706+ ATTTAAA 1 乙烯响应元件 LTR 420− AAAGCC 1 低温响应元件 MYB 1 378+、1 152−、1 330+、1 378+ TAACCA 4 干旱、ABA响应元件 MYC 104−、935−、630−、622+、1 015−、668+ CATTTG 6 干旱、ABA响应元件 W-box 1 012−、1 280−、1 149− TTGACC 3 真菌诱导反应元件 说明：+表示正义链，−表示反义链 2.4 EgrCIN1组织特异性表达分析
通过RT-qPCR分析EgrCIN1在不同组织中的表达情况，结果表明：EgrCIN1在嫩叶、成熟叶和茎中都有表达，且在茎中的表达量最高，而在根中却没有表达(图3)。
图 3 EgrCIN1在巨桉不同组织中的定量表达Figure 3 Quantitative expression of EgrCIN1 in different tissues of E. grandis2.5 EgrCIN1蛋白亚细胞定位
由于EgrCIN1为巨桉特有的基因，尚无其功能信息的研究，本研究构建了EgrCIN1::GFP表达载体，针对其编码蛋白在细胞中发挥功能的位置进行了亚细胞定位分析。结果表明：EgrCIN1蛋白与烟草叶片中的叶绿体具有共定位效应，表明EgrCIN1是在叶绿体中发挥作用的蛋白(图4)。
图 4 EgrCIN1蛋白在烟草表皮细胞中的表达(标尺为50 μm)Figure 4 Expression of EgrCIN1 protein in tobacco epidermis cell(the bar is 50 μm)2.6 拟南芥过表达转基因株系中EgrCIN1的表达
通过遗传转化后，从中筛选获得3个转基因株系：EgrCIN1-OE3、EgrCIN1-OE7和EgrCIN1-OE9。利用RT-qPCR技术对这3个株系中EgrCIN1的基因表达情况进行分析，结果表明：EgrCIN1在3个株系中都有明显的表达(图5)。
图 5 野生型和EgrCIN1过表达转基因株系中EgrCIN1的半定量PCRFigure 5 Semi-quantitative PCR of EgrCIN1 in wild type and EgrCIN1 overexpression transgenic lines2.7 低温处理下EgrCIN1过表达转基因株系的表型分析
对3个拟南芥过表达转基因株系进行−6 ℃低温处理12 h，随后置于正常生长条件下生长1周。结果发现：−6 ℃低温处理对转基因株系和野生型都会造成低温伤害，但转基因株系的恢复情况明显好于野生型(图6A)。统计不同株系的存活率发现，野生型存活率为30.53%，而EgrCIN1-OE3、EgrCIN1-OE7和EgrCIN1-OE9等3个转基因株系分别达到了77.77%、86.07%和88.83% (图6B)，表明EgrCIN1的超表达在一定程度上可以提高植株的抗寒性。
图 6 野生型和EgrCIN1转基因株系低温处理后的表型(A)和存活率(B)Figure 6 Phenotype (A) and survival (B) of wild-type and EgrCIN1 transgenic lines after cold treatment2.8 ABA处理下EgrCIN1过表达转基因株系的表型分析
植物低温响应分子调控途径有ABA依赖型和ABA非依赖型。针对EgrCIN1参与的抗寒性途径是否有ABA参与的这一问题，对转基因株系进行了ABA处理。结果表明：在0.5 μmol·L−1 ABA处理10 d后，3个转基因株系受到的ABA抑制作用明显强于野生型(图7)，说明ABA也参与了EgrCIN1功能的发挥。
图 7 野生型和EgrCIN1过表达株系0.5 μmol·L−1 ABA处理10 d后的表型Figure 7 Phenotypes of wild-type and EgrCIN1 overexpression lines treated with 0.5 μmol·L−1 ABA after 10 days2.9 干旱、高盐、ABA和MeJA等其他非生物逆境处理下EgrCIN1的表达分析
由于不同非生物逆境因子之间往往存在相互作用，为了进一步了解其他非生物逆境因子对EgrCIN1的影响，分别分析了EgrCIN1在巨桉幼苗干旱、高盐、ABA和MeJA处理下的表达情况。结果表明：干旱和高盐处理都能诱导EgrCIN1的表达，干旱处理下EgrCIN1的表达量是对照的35.1倍；300 mmol·L−1 NaCl处理下EgrCIN1表达量则上调了16.4倍(图8A)。但EgrCIN1的拟南芥过表达转基因株系在干旱和高盐处理下与野生型相比没有显著的表型差异。此外，外源喷施ABA也能促进EgrCIN1的表达，而100 μmol·L−1 MeJA处理下，和对照相比EgrCIN1的表达并未发生显著变化(图8B)。
图 8 巨桉幼苗高盐、干旱(A)和ABA、MeJA(B)处理下EgrCIN1的定量表达Figure 8 Quantitative expression of EgrCIN1 in E. grandis seedlings under high salt, drought (A) and ABA, MeJA (B) treatments3. 讨论
EgrCIN1是巨桉中一个受低温诱导的未知功能的基因，本研究表明：它随着低温处理时间的延长，表达水平不断提高，显示其参与了巨桉的低温胁迫响应。基因、蛋白质序列的结构特征分析，以及多序列比对和可能功能域的搜索结果都表明该基因是巨桉中一个特有的新基因。启动子上顺式作用元件的预测也表明其表达可能受低温相关因素和信号的影响。组织特异性表达分析则表明该基因主要在巨桉茎和叶中表达，而根中没有表达。显示其可能主要在植株地上部分发挥作用。对于EgrCIN1功能的进一步研究有可能为揭示桉树低温适应性新机制提供基础。
叶绿体在植物低温响应过程中处于中心枢纽的位置，一方面植物抵抗低温的能力取决于低温下的叶片光合活性。另一方面，叶绿体中参与光合作用的光反应中心酶活性受到抑制，进而引发PSⅡ的光能溢出效应，导致ROS积累，产生控制核基因表达的逆行性信号，调控低温响应基因表达，提高植株适应性[19]。在一定程度上，叶绿体的抗低温程度与整体植株的抗寒性密切相关。因此，叶绿体冷诱导相关的基因受到了极大的关注和重视。很多冷诱导基因在叶绿体中表达，并参与植物的低温逆境响应。针叶福禄考Phlox subulata中PsCor413im1蛋白在叶绿体膜上表达，超表达PsCor413im1的拟南芥株系在低温和冷冻逆境下，存活率和种子发芽率都有较大程度的提高[20]。拟南芥中的NAC102在叶绿体中作为抑制因子参与叶绿体基因的表达，并介导ROS对低温响应基因ZAT6、ZAT10和ZAT12等的调控[21-22]；冷调控蛋白COR15A和COR15B在低温条件下也可以通过结构的改变稳定叶绿体的膜结构，实现拟南芥对低温的适应性[23]。这些结果表明：叶绿体中表达的低温诱导基因有可能成为植物低温驯化的重要靶标。尽管利用生物信息学软件预测EgrCIN1编码蛋白在叶绿体、线粒体、细胞质以及细胞核中都可能存在，但亚细胞定位结果表明其可能仅在叶绿体中表达。因此被低温强烈诱导的EgrCIN1基因表达的蛋白也定位在叶绿体中，表明其在桉树中同样有可能是叶绿体中参与低温耐受性提高的重要候选基因。拟南芥中过表达EgrCIN1株系低温处理下的结果说明了该基因的确参与了植物的低温胁迫响应，能够提高植株对低温的耐受程度。另外，该基因在不同叶绿体中表达的强度有所差异，同时并非所有叶绿体中都有该基因的表达。这可能与瞬时表达过程中该基因在不同叶绿体中表达的强度不同有关，也可能是该基因在叶绿体不同发育阶段表达模式不同。
ABA在植物低温响应中也发挥了重要作用[24-25]，包含叶绿体在内的质体是ABA生物合成开始的场所[13]。ABA在叶绿体中与逆境胁迫相关基因表达的蛋白互作调控植物对逆境的适应性。如小立碗藓Physcomitrella patens中，ABA介导了叶绿体蛋白PpCOR413im对植物低温逆境适应性的调控[26]。拟南芥中过表达匍匐剪股颖Agrostis stolonifera叶绿体定位蛋白AsHSP26.8a，可以通过调控ABA信号途径提高转基因植株对低温的抗性水平[27]。EgrCIN1的过表达株系对外源ABA表现出敏感性提高的表型，同时转基因植株对低温的抗性也得到了增强，这与AsHSP26.8a作用相似。暗示ABA合成或者信号途径可能也参与了EgrCIN1对低温逆境响应的调控。同时，在巨桉中，ABA的处理也能在一定程度上诱导EgrCIN1的表达，表明ABA合成或者信号途径可能也参与了EgrCIN1功能发挥的调控。因此，EgrCIN1一方面可能受到低温等非生物逆境信号诱导而参与ABA生物合成或者信号转导对逆境响应的调控；另一方面，ABA也极可能直接影响EgrCIN1的表达，参与其功能的调控。另外，干旱、高盐也能强烈诱导EgrCIN1的表达，但实验过程中EgrCIN1拟南芥过表达转基因株系并未表现出明显的耐旱、耐盐表型，显示EgrCIN1在拟南芥和巨桉的非生物逆境响应中发挥的功能可能不同，同时也表明EgrCIN1在植物非生物逆境响应中发挥的功能比较复杂，需要进一步研究以揭示其在巨桉低温等非生物逆境响应中的功能。
本研究表明：EgrCIN1是巨桉中特有的一个基因，受低温强烈诱导，在叶绿体中表达。其拟南芥过表达转基因株系提高了对低温的耐受性，同时对ABA的敏感程度也被增强。这表明EgrCIN1有可能是存在叶绿体中，通过与ABA互作，以ABA依赖形式的途径参与了植物对低温逆境的响应。但仍有很多问题需要进一步深入研究，如EgrCIN1是否与叶绿体的发育有关系，与ABA采用什么样的互作方式共同参与植物对低温逆境适应性的调控，在干旱、高盐等其他非生物逆境响应中的作用等。
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图 1 常绿树种与落叶树种叶功能性状差异比较
Figure 1 Comparison of differences in leaf functional traits between evergreen and deciduous tree species
图 2 乔木树种与灌木树种叶功能性状差异比较
Figure 2 Comparison of differences in leaf functional traits between tree and shrub species
图 3 不同生活型木本植物叶功能性状的相关性
Figure 3 Correlations among leaf functional traits of woody plants with different life forms
图 4 不同生活型木本植物叶功能性状主成分分析
Figure 4 Principal component analysis (PCA) of leaf functional traits in different life forms of woody plants
表 1 样地内的木本植物种类
Table 1. Species of woody plants in the sample plots
植物种 科名 生活型 缩写 植物种 科名 生活型 缩写 白蜡树Fraxinus chinensis 木樨科Oleaceae 落叶乔木 Frc 柃木Eurya japonica 五列木科Pentaphylacaceae 常绿灌木 Euj 白檀Symplocos paniculata 山矾科Symplocaceae 落叶乔木 Syp 毛八角枫Alangium kurzii 八角枫科Cornaceae 落叶乔木 Alk 豹皮樟Litsea coreana var. sinensis 樟科Lauraceae 常绿乔木 Lis 毛樱桃Cerasus tomentosa 蔷薇科Rosaceae 落叶灌木 Cet 冬青Ilex chinensis 冬青科Aquifoliaceae 常绿乔木 Ilc 茅栗Castanea seguinii 壳斗科Fagaceae 落叶乔木 Cas 杜鹃Rhododendron simsii 杜鹃花科Ericaceae 落叶灌木 Rhs 南烛Vaccinium bracteatum 杜鹃花科Ericaceae 常绿乔木 Vab 短柄枹栎Quercus serrata 壳斗科Fagaceae 落叶乔木 Qub 青冈Cyclobalanopsis glauca 壳斗科Fagaceae 常绿乔木 Cyg 枫香Liquidambar formosana 蕈树科Altingiaceae 落叶乔木 Lif 青皮木Schoepfia chinensis 青皮木科Schoepfiaceae 落叶乔木 Scc 海桐Pittosporum tobira 海桐科Pittosporaceae 常绿乔木 Pit 山矾Symplocos sumuntia 山矾科Symplocaceae 常绿乔木 Sys 合欢Albizia julibrissin 豆科Fabaceae 落叶乔木 Alj 山胡椒Lindera glauca 樟科Lauraceae 落叶乔木 Lig 化香树Platycarya strobilacea 胡桃科Juglandaceae 落叶乔木 Pls 石栎Lithocarpus glaber 壳斗科Fagaceae 常绿乔木 Litg 黄连木Pistacia chinensis 漆树科Anacardiaceae 落叶乔木 Pic 五角枫Acer pictum 无患子科Sapindaceae 落叶乔木 Acp 黄檀Dalbergia hupeana 豆科Fabaceae 落叶乔木 Dah 杨桐Adinandra millettii 五列木科Pentaphylacaceae 常绿乔木 Adm 檵木Loropetalum chinense 金缕梅科Hamamelidaceae 落叶灌木 Loc 野茉莉Styrax japonicus 安息香科Styracaceae 落叶乔木 Stj 君迁子Diospyros lotus 柿科Ebenaceae 落叶乔木 Dil 野桐Mallotus japonicuss 大戟科Euphorbiaceae 落叶乔木 Maj 苦木Picrasma quassioides 苦木科Simaroubaceae 落叶乔木 Piq 野鸦椿Euscaphis japonica 省沽油科Staphyleaceae 落叶乔木 Euj 
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