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松材线虫Bursaphelenchus xylophilus是公认的检疫性有害生物，破坏性地危害欧亚地区的松林资源[1]。松材线虫的生活史分为2个阶段：繁殖阶段和扩散阶段[2]。在温度适宜的夏季和秋季，松材线虫进入繁殖阶段，在树体内经过卵、繁殖型幼虫(J1~J4)，再发育为成虫。在不良环境条件下，松材线虫进入扩散阶段，即滞育型周期，繁殖型J2会转型发育为扩散型J3幼虫和扩散型J4幼虫，在此过程中体内脂滴数量增加，并发生脂滴融合现象，形成超大脂滴或者块状脂肪[3]。扩散型J4幼虫口针退化不取食，依靠消耗体内超大脂滴作为能量侵染新的寄主植物。因此，脂滴对于松材线虫的生存和传播都具有重要作用。中性脂肪(甘油三酯和胆固醇)在线虫中主要以脂滴的形式存在，是松材线虫体内脂肪的主要储存形式[4-6]。松材线虫的肠道是脂类物质沉积的主要场所。由于线虫虫体是透明的，可在显微镜下清楚地看到从头部到尾部的整个肠道，是研究脂肪沉积的一种理想模型[7]。模式线虫秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans可采用染料苏丹黑B、尼罗红和油红O等方法检测脂肪储存和代谢，不同染色方法下脂肪含量的表征呈现一定程度的差异。利用脂溶性的染料苏丹黑B来着色脂滴，脂滴在肠和皮下组织中可见。荧光染料尼罗红和油红O可将脂滴染成红色[8]。目前在松材线虫中尚无相关脂滴染色研究报道，因此，本研究使用不同的染料标记松材线虫体内的脂滴分布，通过使用ImageJ软件测量线虫脂滴的平均像素强度，来表征脂肪含量，确定适合松材线虫脂滴染色的方法[9]。
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松材线虫NXY61虫株为中国林业科学院森林保护研究所从浙江省宁波市罹病马尾松Pinus massoniana中分离获得。使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养的灰葡萄孢Botrytis cinerea来培养繁殖型松材线虫[2]。混合龄期的繁殖型线虫置于PDA培养基上生长3 d，在加入灭菌双蒸水(ddH2O)的贝尔曼漏斗中将线虫从培养基上洗下来，3 000 r·min−1离心3 min，清除上清液。扩散型3龄幼虫从当年采集的疫木中分离，扩散型4龄幼虫从媒介昆虫松墨天牛Monochamus alternatus体内分离。
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将松材线虫用M9缓冲液(3.00 g KH2PO4, 6.00 g Na2HPO4, 5.00 g NaCl, 1 mL 1 mol·L−1 MgSO4，加入蒸馏水定容至1 L)洗涤离心3次(3 000 r·min−1，1 min)；将线虫置于含体积分数为1%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)的M9缓冲液中，4 ℃过夜；−80 ℃冰箱冻融3次；将M9洗涤固定的线虫经梯度体积分数乙醇(25%，50%和70%)分级脱水，每级5 min；随后，在溶于体积分数为70%乙醇的苏丹黑B溶液中进行染色[10]。显微镜观察和拍摄染色后的线虫，并对皮下和肠道内染色的脂滴像素统计。
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将线虫用体积分数为1%多聚甲醛溶液固定，使线虫细胞和亚细胞结构保持稳定状态[9]。线虫和多聚甲醛溶液混合，并于室温摇动2~3 h后，静置使线虫沉降；在−80 ℃冰箱冻融3次，固定后的线虫逐级脱水；在M9缓冲液的线虫沉淀中加入1 mL尼罗红(1 mg·L−1)，在避光的环境下混匀并染色25~30 min，染色期间轻轻翻转离心管，使得虫体均匀接触染料；用1×PBS(8.00 g NaCl，0.20 g KCl，1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，溶于800 mL蒸馏水，用HCl调节溶液pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L)清洗1次，去除线虫表面的染料，然后使线虫自然沉降。最后用显微镜观察拍照。
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用M9缓冲液将松材线虫洗至离心管中，在体积分数为1%多聚甲醛室温或4 ℃固定15~30 min；然后置于−80 ℃冰箱中冷冻15 min，在43 ℃水浴中迅速解冻；低速离心1 min，弃上清；用1×PBS冲洗3次，弃去PBS；用体积分数为1%Triton X-100、异丙醇油红O溶液浸泡30 min；用1×PBS冲洗3次。用异丙醇置于载玻片上，显微镜下观察拍照[11]。
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使用改良的后置油红O染色方案[12]。将油红O溶于异丙醇，制成质量浓度为5.00 g·L−1原液。采用混合法制备油红O工作液(60%的原液和40%的水)。油红O工作液静置后用0.22 mm自旋过滤器过滤。将线虫用体积分数为1%多聚甲醛/PBS在室温下固定摇动30 min；然后立即将样品在冰箱中冷冻干燥15 min，并在自来水中溶解，共3次；低速离心1 min，弃上清；用1×PBS洗涤样品3次，用体积分数为60%异丙醇脱水2 min；用1 mL油红O工作液摇动1 h进行染色。染色后的样品用1×PBS洗涤3次，再水合1×PBS，并安装在琼脂填充的载玻片上，显微镜观察拍照。
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用徕卡荧光正置显微镜(DM4B)使用40×物镜观察固定的尼罗红、油红O和苏丹黑B染色的线虫，用CCD相机(DFC7000T)拍摄16位图像，并用ImageJ(V2.1.4.7)进行图像处理分析。
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将固定后的虫体置于显微镜下观察，与未染色线虫相比，苏丹黑B染色线虫的肠道普遍被染成蓝色(图1)。在实验过程中，用苏丹黑B原溶液染色线虫如图1A~B，显微镜下观察到的脂滴边界不清晰，整条成虫呈现深蓝色；将苏丹黑B稀释60%，染色观察如图1C~D，幼虫和成虫脂滴边界尚清楚，但仍会影响观察松材线虫的脂滴动态变化。
图 1 苏丹黑B、尼罗河红染色线虫中相同脂滴
Figure 1. Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets
尼罗红与苏丹黑B共同标记了肠道周围的脂滴。尼罗红染色线虫在显微镜下观察到部分脂滴呈浅红色(图1E~H)。将配置的母液染料稀释500倍，染色时间30 min，显微成像效果不佳(图1E~F)，大部分虫体脂滴染色不均，其中成虫的色泽较浅。当提高工作液浓度，仅将母液稀释了100倍，为5 mg·L−1, 并将染色时间增加为1 h (图1G~J)，可以分辨分布在成虫肠道周围的圆形大脂滴，而幼虫的脂滴边界相对比较模糊，不便于测量松材线虫脂滴的大小和脂肪存储量。
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在用油红O与后置油红O染色线虫时，培养的同步发育繁殖型线虫和野外采集的扩散型线虫都呈现明显的红色脂滴(图2)。油红O染色如图2A~D，可以观察到，当虫体内出现较多脂滴时，单个脂滴未能良好分离，会影响测量松材线虫脂肪储存量化及繁殖型与扩散型松材线虫的脂滴大小的变化。用后置油红O方法染色线虫结果如图2E~J，在显微镜下观察到脂滴边界清晰，其中J2和J3幼虫大部分较小的脂滴分布在肠道和表皮，并能观察到从幼虫J4到成虫出现小脂滴聚集成大脂滴的现象。扩散型J3较大的脂肪块与扩散型J4脂质小滴之间的脂滴大小变化十分明显。
图 2 油红O、后置油红O染色线虫中相同脂滴
Figure 2. Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus
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通过光学显微镜捕获的苏丹黑B、尼罗红、油红O染色松材线虫脂滴图片，用ImageJ进行图像处理，计算线虫脂滴图片的平均像素强度。图3结果显示：苏丹黑B和后置油红O染色松材线虫脂滴的平均像素强度明显高于尼罗红和油红O染色，其中苏丹黑B染色后整条虫呈现蓝色，所以脂滴平均像素强度最高，而尼罗红的最低，因为颜色较浅。这就说明脂滴平均像素强度偏高或偏低都会影响表征脂肪。经ImageJ图像处理比较分析，后置油红O染色脂滴经计算转换与原始图像的一致，具有单个脂滴的良好分离(图4)。
图 3 使用苏丹黑B、尼罗红、油红O和后置油红O染色的松材线虫脂滴平均像素的ImageJ图像分析结果
Figure 3. ImageJ image analysis results of average pixels of B. xylophilus lipid droplets stained with Sudan black B, Nile red, oil red O, and post-fix oil red O
图 4 后置油红O染色的松材线虫脂滴的图像处理
Figure 4. Image processing of post-fix oil red O stained adipocytes in B. xylophilus
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如表1所示：综合考虑染色方法的简易性、染色时间的长短[11]、染色的观察效果，后置油红O染色方法在4种染色方法中的染色时间相对较短，脂滴呈现的效果比较清晰，能实现脂滴的单个分离，方法步骤比较简单，认为后置油红O染色方法是松材线虫脂滴的最佳染色方法。
表 1 不同染料标记和方法的比较
Table 1. Comparison of different dyestuff markers and methods
染料 储备溶液 脱水步骤 染色时间/min 输出颜色 实现单个脂滴分离 油红O 5 g·L−1异丙醇 30 红色 否 苏丹黑B 体积分数为70%乙醇 乙醇系列 360 深蓝色 否 尼罗红 丙酮 乙醇系列 30 浅红色 否 后置油红O 5 g·L−1异丙醇 体积分数为60%异丙醇 60 红色 是 -
本研究通过使用染料标记的不同测定法来探索松材线虫的最佳脂滴染色方法。在染色前，需要先对虫体进行有效固定，多聚甲醛可很好地保存生物体组织的细微结构特征。固定以后，组织中的各种物质会沉淀和凝固，产生不同的折射率，促使产生光学差异，方便染色后观察。
油红O、苏丹黑B、尼罗红染色一般都能观察到线虫体内脂肪储存，但在本研究中呈现不同显色效果。苏丹黑B作为一种经典的染料，在固定过程中经乙醇的洗涤，无法标记线虫中脂肪储存[9]。本研究也发现：苏丹黑B染色松材线虫脂滴观察效果不佳，染色时间也比较长。尼罗红是一种由尼古蓝衍生的脂类染料，在疏水环境时发荧光，既可染色脂滴，又可检查完整活体动物的脂肪含量[13-15]，经常被作为秀丽隐杆线虫的脂肪酸代谢研究的染料标记。最近研究还发现，鲜活的线虫经尼罗红染色没有显示染色模式的差异[12]。当线虫被喂食尼罗红时，染料会在与溶酶体有关的细胞器中积聚[16]，固定尼罗红比喂食尼罗红更能显示脂肪储存情况。本研究初期观察到的脂滴色泽非常浅，甚至整条线虫未被染色，呈透明状态，经过多步实验探索，线虫中脂滴有部分染色，但仍有染色不完整的脂滴。而且由于尼罗红是亲水性染料，可能会染色脂褐素，导致固定染色不能将中性脂肪存储区与脂褐素区分开，影响结果[17]。油红O是一种油溶性偶氮染料，溶于乙醇和丙酮，在脂肪内能高度溶解，从而染色，颜色比较鲜红，染色效果相对于前面2种染料要好。后置油红O染色用体积分数为1%多聚甲醛的固定液在分子杂交炉中室温条件摇动30 min，通过摇动，使线虫充分接触固定液。将样品放在−80 ℃冰箱中冻融3次，并在自来水中溶解，相比于油红O染色(在43 ℃水浴中迅速解冻)，可增加线虫的缓冲性。在后置油红O染色过程中，异丙醇脱水使线虫显微成像时观察到的组织结构更清晰，用自旋过滤器过滤油红O工作液，可以减少沉淀杂质的产生。用琼脂填充幻灯片成像，可以防止线虫干死，也可以更好地固定已染色的线虫。经过多次实验探究，油红O染色之后，观察到的大小脂滴聚集，脂滴边界未能体现，红色会成片区域出现，当测量脂滴大小变化、脂滴数量时，会加大实验数据误差；后置油红O染色方法经过改良，线虫在室温下用体积分数为1%多聚甲醛摇动，并经多次冻融以后用体积分数为60%的异丙醇脱水，染色效果比较理想，可直接观察脂滴大小变化。综上所述，后置油红O染色方法是最佳松材线虫脂滴染色方法。
Comparison of four lipid droplets staining methods in Bursaphelenchus xylophilus
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摘要:
目的 从4种脂滴染色方法中筛选最适合松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的脂滴染色方法。 方法 采用苏丹黑B染色、尼罗红染色、油红O染色和后置油红O染色等4种染色方法来固定和表征松材线虫体内脂滴的分布，对染色后的线虫进行显微观察和拍摄，并用ImageJ软件对皮下和肠道内染色的脂滴像素进行统计。 结果 4种脂滴染色方法对松材线虫的脂滴都有一定的染色效果。显微拍照后观察脂滴与ImageJ软件图像处理后像素强度比较结果显示：苏丹黑B染色脂滴像素为200.00×1017 m2，尼罗红染色脂滴像素41.64×1012 m2，油红O染色脂滴像素52.12×1017 m2，后置油红O染色脂滴像素83.85×1017 m2。苏丹黑B染色脂滴平均像素强度最高，尼罗红染色脂滴平均像素强度最低，而后置油红O法染色脂滴经计算转换产生了与原始图像一致的表征，实现单个脂滴的良好分离。 结论 综合染色方法的简易、染色时间的长短和染色后的效果，改良后的后置油红O法是最佳的松材线虫脂滴染色方法，能清晰显示脂滴大小及分布。图4表1参17 Abstract:Objective With a comparison of the four commonly used methods for staining Caenorhabditis elegans lipid droplets, this study is aimed to figure out the most suitable dyeing method for Bursaphelenchus xylophilus lipid droplets. Method Four were used to fix and characterize After the distribution of lipid droplets in B. xylophilus was defined with its features revealed employ four dyeing methods including Sudan black B staining, Nile red staining, oil red O staining, and post-fix oil red O staining, the stained nematodes were observed and photographed microscopically, and then ImageJ software was used to count the subcutaneous and intestinal lipid droplet pixels. Result 1) The four dyeing methods have a certain dyeing effect on the lipid droplets of B. xylophilus. 2) Upon the observation of the lipid droplets after microphotographing and the comparison of the pixel intensity after image processing by ImageJ software, the stained lipid droplets pixels with Sudan black B, Nile red, oil red O and post-fix oil red O are 200×1017 m2, 41.64×1012 m2, 52.12×1017 m2, and 83.85×1017 m2 respectively. 3) Lipid droplets stained by Sudan black have the highest average pixel intensity, and lipid droplets stained by Nile red have the lowest average pixel intensity, whereas the lipid droplets stained by post-fix oil red O, after calculation and conversion, produced a consistent characterization with the original image, with a favorable separation of individual lipid droplet. Conclusion In conclusion, in light of the simplicity of the dyeing method, the length of dyeing time and the effect of dyeing, the improved post-fix oil red O method is the optimal method for dyeing lipid droplets in B. xylophilus, with the size and distribution of lipid droplets clearly shown. [Ch, 4 fig. 1 tab. 17 ref.] -
Key words:
- Bursaphelenchus xylophilus /
- lipid droplets staining /
- Nile red /
- oil red O /
- Sudan black /
- post-fix oil red O
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除黑龙江、吉林、内蒙古和新疆4省(区)外，中国其余省(区、市)都有竹类生长和分布。据第8次(2009−2013年)森林资源清查，中国竹林面积达601 万hm2，占中国森林面积的3%，占世界竹林面积约20%[1]。在廊道旁、公园、古寺庙、风景区等地方种植竹子以增加景观优质性，是园林配置的一部分。竹林分布广，面积大，因此需要考虑竹林保护与防火等问题。有些竹种具有一定的防火能力，被作为防火植物使用，如毛竹Phyllostachys edulis、雷竹Ph. praecox等[2-3]。对于竹子的燃烧性能方面国内外研究较少，但是在森林可燃物的燃烧性和抗火性方面，国内外都进行了大量研究[4-9]。李树华等[10]认为：在火灾危险带种植刚竹Ph. sulphurea等植物可以减缓火势蔓延。钟安建等[11]对南昌城区15种园林树种的抗火性进行研究，认为珊瑚树Viburnum odoratissimum抗火性能最强，桂花Osmanthus fragrans抗火性能最差。金钱荣等[12]将木荷Schima superba选为防火功能较强的行道绿化树种。李世友等[13]对20种园林绿化植物的鲜枝叶进行燃烧试验及燃烧性排序。何忠华等[14]对12种园林树种的抗火性进行了综合评价，认为乐昌含笑Michelia chapensis抗火性最强。森林植物叶燃烧性研究方法可以为竹叶研究提供借鉴。张雨瑶等[15]对11种园林木本植物的新叶片和2种对比植物老活叶片进行了垂直燃烧实验，认为鹅掌楸Liriodendron chinense等燃烧性较强。氧指数试验法主要用于测定聚合材料的阻燃性能，如对于各种纺织品[16]、玻璃纤维增强塑料[17]、聚氯乙烯(PVC)管[18]、橡胶[19]等阻燃性能的测定，在森林可燃物研究方面的应用较少。本研究对17种园林竹鲜叶进行燃烧性比较，旨在分析园林竹鲜叶的易燃性差异，为竹林保护与防火提供依据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
以17种园林竹为研究对象(括号中数字为样品代号)，车筒竹Bambusa sinospinosa (1)、慈竹Neosinocalamus affinis (2)、灰金竹Phyllostachys nigra var. henonis (3)、灰香竹Chimonocalamus pallens (4)、料慈竹B. distegia (5)、龙竹Dendrocalamus giganteus (6)、绵竹B. intermedia (7)、青皮竹B. textilis (8)、沙罗单竹Schizostachyum funghomii (9)、秀叶箭竹Fargesia yuanjiangensis (10)、小佛肚竹B. ventricosa (11)、孝顺竹B. multiplex (12)、野龙竹D. semiscandens (13)、椅子竹D. bambusoides (14)、油竹B. surrecta (15)、云南甜龙竹D. hamiltonii (16)、紫竹Ph. nigra (17)。以5种常见易燃园林绿化用木本植物的老叶作对比，即阴香Cinnamomum burmanni (18)、桂花Osmanthus fragrans (19)、滇润楠Machilus yunnanensis (20)、蓝桉Eucalyptus globulus (21)、云南樟C. glanduliferum (22)。所有植物均栽植于西南林业大学校园内。由于新叶含水率呈动态变化，而老叶含水率相对稳定且易燃，故选老叶为实验样品。取叶时，选多株、不同枝条上外形和大小相似、质量相近的多片竹叶，于防火期采集健康的完整分枝，立刻带回实验室。
1.2 实验方法
采集同枝条上的老叶，分为2组，分别进行燃烧实验和含水率测定。燃烧实验前测定鲜叶质量、叶脉长度并在白纸上勾绘出鲜叶外形，实验在高浓度医用氧条件下进行，点火气体为丙烷气。将竹叶叶尖朝上、叶柄朝下放入试件夹中，点火器火焰长度为10~15 mm，从上朝下点火，用秒表记录竹叶燃烧时间。每种鲜叶重复6次实验。含水率(H)测定采用105 ℃烘干恒量法，取相对含水率。实验采用JF-3型氧指数测定仪进行。
1.3 数据获取及计算方法
叶片单位面积质量(W)、绝对线速率(V1)、绝对面积损失速率(V2)、绝对质量损失速率(V3)、相对线速率(V4)、相对面积损失速率(V5)和相对质量损失速率(V6)参照李世友等[6]、张雨瑶等[15]、郑永波等[20]和苏文静等[21]方法进行。
1.4 数据处理
运用SPSS 18.0软件，以平均V1、V2、V3、V4、V5、V6等6个指标进行因子分析，得到22种植物鲜叶的燃烧性能得分并排序。根据燃烧性能得分，应用聚类分析法划分等级。采用因子分析法对数据进行标准化处理，通过KMO值和Bartlett球体检验提取公因子，利用旋转法使因子变量更具有可解释性，计算因子变量得分。
2. 结果与分析
2.1 含水率、单位面积质量及燃烧速率
由表1可知：22种植物鲜叶的含水率和单位面积质量均差别较大，5种木本植物鲜叶单位面积质量均大于竹叶。单位面积质量最小、含水率较小的秀叶箭竹，燃烧速率最大。单位面积质量最大、含水率较大的云南樟，燃烧速率最小。含水率最大、单位面积质量较小的椅子竹，燃烧速率较小。含水率最小、单位面积质量中等的车筒竹，燃烧速率接近最大值。由此可见：鲜叶燃烧速率与单位面积质量、平均含水率有关。
表 1 22种植物鲜叶的含水率、单位面积质量及燃烧速率Table 1 Moisture content, mass per unit area and burning rate of fresh leaves of 22 plants speices代号 H/% W/(g·m−2) 绝对燃烧速率 相对燃烧速率 V1/(cm·s−1) V2/(cm2·s−1) V3/(g·s−1) V4/(%·s−1) V5/(%·s−1) V6/(%·s−1) 1 40.51 146 1.079 0.863 0.012 8.667 8.667 8.667 2 56.99 56 1.349 2.087 0.012 8.566 8.566 8.566 3 51.86 104 0.552 0.541 0.005 6.882 6.882 6.882 4 55.12 104 0.697 0.402 0.004 6.954 6.954 6.954 5 43.84 116 0.642 1.283 0.014 3.140 3.140 3.140 6 58.91 96 0.421 1.320 0.012 2.140 2.140 2.140 7 53.07 92 0.425 0.644 0.006 3.450 3.450 3.450 8 56.73 58 0.981 1.316 0.008 6.820 6.820 6.820 9 42.93 66 1.245 1.486 0.010 7.600 7.600 7.600 10 44.08 53 1.194 1.058 0.006 9.450 9.450 9.450 11 44.27 87 1.171 1.885 0.016 7.583 7.583 7.583 12 46.07 70 0.849 1.040 0.007 7.040 7.040 7.040 13 56.83 70 0.858 2.177 0.016 4.200 4.200 4.200 14 58.97 72 0.520 0.737 0.005 4.700 4.700 4.700 15 55.34 102 0.216 0.345 0.004 1.500 1.500 1.500 16 58.79 84 0.546 1.579 0.013 2.660 2.660 2.660 17 43.15 94 0.521 0.604 0.006 5.140 5.140 5.140 18 52.36 190 0.330 0.977 0.018 2.967 2.967 2.967 19 47.55 322 0.316 0.747 0.037 4.200 3.020 4.400 20 49.12 230 0.173 0.486 0.011 1.767 1.767 1.767 21 46.93 483 0.146 0.228 0.011 0.883 0.883 0.883 22 52.21 185 0.118 0.544 0.010 0.983 1.000 0.983 2.2 数据的标准化处理
由于所获得数据数值不同，单位不同，无法进行比较和计算，因此需要进行无量纲化处理。使用SPSS软件对数据进行标准化处理，结果如表2所示。
表 2 22种植物鲜叶燃烧性评价指标无量纲化后得分Table 2 Fresh leaf combustibility of 22 plants species evaluation index dimensionless points代号 V1 V2 V3 V4 V5 V6 1 1.108 53 −0.270 53 0.134 17 1.396 29 1.403 15 1.393 99 2 1.809 85 1.895 67 0.134 17 1.359 08 1.366 27 1.356 76 3 −0.260 34 −0.840 40 −0.849 73 0.738 69 0.751 40 0.735 89 4 0.116 30 −1.086 40 −0.990 29 0.765 21 0.777 69 0.762 44 5 −0.026 57 0.472 77 0.415 28 −0.639 89 −0.614 88 −0.643 72 6 −0.600 61 0.538 25 0.134 17 −1.008 29 −0.980 00 −1.012 41 7 −0.590 22 −0.658 11 −0.709 17 −0.525 68 −0.501 69 −0.529 43 8 0.853 98 0.531 17 −0.428 06 0.715 85 0.728 77 0.713 03 9 1.539 71 0.832 03 −0.146 95 1.003 20 1.013 56 1.000 61 10 1.407 24 0.074 57 −0.709 17 1.684 76 1.689 04 1.682 67 11 1.347 50 1.538 17 0.696 40 0.996 94 1.007 35 0.994 34 12 0.511 11 0.042 72 −0.568 62 0.796 90 0.809 09 0.794 14 13 0.534 49 2.054 95 0.696 40 −0.249 38 −0.227 85 −0.252 92 14 −0.343 46 −0.493 52 −0.849 73 −0.065 17 −0.045 29 −0.068 58 15 −1.133 09 −1.187 28 −0.990 29 −1.244 07 −1.213 68 −1.248 36 16 −0.275 92 0.996 62 0.274 72 −0.816 72 −0.790 14 −0.820 69 17 −0.340 86 −0.728 90 −0.709 17 0.096 92 0.115 36 0.093 65 18 −0.836 98 −0.068 78 0.977 51 −0.703 62 −0.678 05 −0.707 50 19 −0.873 34 −0.475 83 3.648 09 −0.249 38 −0.658 70 −0.179 18 20 −1.244 78 −0.937 74 −0.006 39 −1.145 71 −1.116 19 −1.149 92 21 −1.314 91 −1.394 34 −0.006 39 −1.471 38 −1.438 96 −1.475 84 22 −1.387 64 −0.835 09 −0.146 95 −1.434 54 −1.396 24 −1.438 97 2.3 KMO值和Bartlett球体检验
因子分析法并不能适用于任何情况，只有当样品数量大于评价指标数量时，才能得出KMO值和Bartlett球体检验结果，判断原始数据是否能够进行因子分析。对标准化后的数据进行KMO值和Bartlett球体检验，结果KMO值为0.625＞0.500，Bartlett检验接近0，说明指标具有相关性，适合做因子分析。
2.4 公因子提取
由表3可知：特征值大于1的公因子有2个，累积方差贡献率达到了89.623%，因此可用来描述22种园林植物鲜叶的燃烧性。
表 3 解释的总方差表Table 3 Interpretation of the total variance table成分 初始特征值 提取载荷平方和 旋转载荷平方和 总计 方差百分比/% 累积/% 总计 方差百分比/% 累积/% 总计 方差百分比/% 累积/% 1 4.114 68.567 68.567 4.114 68.567 68.567 4.084 68.070 68.070 2 1.263 21.056 89.623 1.263 21.056 89.623 1.293 21.553 89.623 3 0.591 9.843 99.466 4 0.031 0.515 99.981 5 0.001 0.019 100.000 6 1.887×10−8 3.145×10−7 100.000 2.5 因子旋转
采用最大方差法(varimax)进行因子旋转，目的是使公因子的相对负荷的方差之和最大，且保持原公共因子的正交性和公共方差总和不变。使每个因子的最大载荷变量数量最小，以简化对因子的解释。利用SPSS软件进行旋转，得到表4因子载荷矩阵。主成分1在绝对线速率(V1)、相对线速率(V4)、相对面积损失速率(V5)、相对质量损失速率(V6)上的载荷系数较大，体现了燃烧性能(f1)。主成分2在绝对面积损失速率(V2)、绝对质量损失速率(V3)的载荷系数较大，体现了燃烧性能(f2)。
表 4 旋转后因子载荷矩阵Table 4 Rotated factor load matrix评价指标 主成分 评价指标 主成分 1 2 1 2 V1 0.949 0.227 V4 0.981 −0.014 V2 0.480 0.718 V5 0.990 −0.600 V3 −0.224 0.850 V6 0.979 −0.007 2.6 计算因子得分
运用SPSS软件得出因子得分系数矩阵(表5)，因子得分模型可表示为：
表 5 因子得分系数矩阵Table 5 Component score coefficient matrix评价指标 主成分 评价指标 主成分 1 2 1 2 V1 0.224 0.125 V4 0.245 −0.066 V2 0.079 0.538 V5 0.250 −0.102 V3 −0.103 0.680 V6 0.244 −0.060 f1=0.224x1+0.079x2−0.103x3+0.245x4+0.250x5+0.244x6；
f2=0.125x1+0.538x2+0.680x3−0.066x4−0.102x5−0.060x6。
其中：xi为V1~V6的数值标准化后的数据，将表2的相关变量相应的代入上式中即得到22种植物鲜叶燃烧性公因子得分。再以各公因子的方差百分比作为权数计算22种植物鲜叶燃烧性综合评价得分。计算公式为：
F= λ1f1+ λ2f2=0.685 67f1+0.210 56f2。
其中：F为22种植物鲜叶的燃烧性能得分，λi为第i个公因子的方差百分比。得分大于0，说明该植物鲜叶的燃烧性能大于22种植物鲜叶燃烧性能的平均水平，反之则比较差；得分越高代表燃烧性能越好。
各植物鲜叶燃烧性能的最后得分及排名如表6所示。由表6可知：5种木本植物得分均小于0，且有2种燃烧性能得分排名最后，说明5种木本植物鲜叶的燃烧性能均低于平均水平。22种植物鲜叶的燃烧性能从大到小的顺序依次为慈竹、小佛肚竹、秀叶箭竹、沙罗单竹、车筒竹、青皮竹、孝顺竹、野龙竹、灰香竹、灰金竹、桂花、料慈竹、紫竹、椅子竹、云南甜龙竹、阴香、龙竹、绵竹、滇润楠、油竹、云南樟、蓝桉。其中，慈竹得分最高，说明最易燃，油竹得分最低，说明最难燃，但较云南樟、蓝桉易燃。具体来看，油竹的含水率较大、单位面积质量较大，在17种竹类中得分最低。秀叶箭竹含水率较小、单位面积质量最小，得分排在前列。蓝桉含水率较大、单位面积质量最大，得分排在最后。进一步说明了鲜叶的燃烧速率与单位面积质量、平均含水率有关。
表 6 22种植物鲜叶的燃烧性能得分及排序Table 6 Combustibility property score and rank of fresh leaves of 22 plants species代号 f1 f2 F 排序 代号 f1 f2 F 排序 1 1.245 11 −0.234 50 0.804 5 12 0.767 30 −0.482 73 0.424 7 2 1.546 36 1.026 31 1.276 1 13 0.031 05 1.700 27 0.379 8 3 0.510 85 −1.232 08 0.091 10 14 −0.072 37 −0.873 29 −0.233 14 4 0.609 57 −1.418 80 0.119 9 15 −1.157 88 −1.172 78 −1.041 20 5 −0.478 60 0.676 99 −0.186 12 16 −0.608 56 0.871 97 −0.234 15 6 −0.844 15 0.532 83 −0.467 17 17 0.014 46 −0.940 74 −0.188 13 7 −0.494 31 −0.792 39 −0.506 18 18 −0.807 66 0.681 30 −0.410 16 8 0.808 52 −0.063 17 0.541 6 19 −0.878 34 2.210 90 −0.137 11 9 1.168 40 0.310 35 0.866 4 20 −1.192 01 −0.405 70 −0.903 19 10 1.638 70 −0.650 80 0.987 3 21 −1.483 82 −0.585 92 −1.141 22 11 1.089 91 1.240 98 1.009 2 22 −1.412 53 −0.399 00 −1.053 21 2.7 聚类分析
应用SPSS软件对17种竹叶的燃烧性能得分进行聚类分析，由图1所示：17种园林竹鲜叶的燃烧性划为易燃和较易燃2个等级。其中，慈竹、小佛肚竹、秀叶箭竹、沙罗单竹、车筒竹、青皮竹、孝顺竹、野龙竹、灰香竹、灰金竹等易燃；料慈竹、紫竹、椅子竹、云南甜龙竹、龙竹、绵竹、油竹等较易燃。
3. 结论与讨论
对17种园林竹和5种易燃木本植物鲜叶燃烧性6个指标的因子分析可知：各植物得分差距较大，最高分与最低分之间相差2.417，说明22种植物鲜叶的燃烧性差距较大。与5种园林木本植物相比，竹叶均为易燃叶。料慈竹、椅子竹、云南甜龙竹、龙竹、紫竹、绵竹和油竹的鲜叶燃烧性能相对较低，尤其是油竹，比桂花、阴香和滇润楠还难燃。绝对线速率(V1)、相对线速率(V4)、相对面积损失速率(V5)和相对质量损失速率(V6)对其燃烧性影响较大。基于17种竹的燃烧性能得分，SPSS聚类分析将其划为易燃和较易燃2个等级，其中易燃竹种10种，较易燃竹种7种。
鲜叶的燃烧性受自身理化性质和生态学、生物学特性等多因素的综合影响。昆明地区旱季降雨稀少，园林竹浇水较为频繁，浇水周期、浇水量和浇水次数对竹叶的含水率造成一定影响。施肥也会影响竹子生理性能。研究表明施氮肥会提高大豆Glycine max的脂肪含量[22-23]；不同磷含量培养液处理下植株幼苗的株高、茎叶生物量和总生物量差异极其显著[24]；不同磷源处理下云南松Pinus yunnanensis幼苗体内磷含量明显不同[25]。施肥对植物化学成份的影响一定程度上也影响其燃烧性。本研究中的竹叶样品采自竹下较低部位；竹子受自身生长因素及光照等外部因素影响，不同空间部位的竹叶生长发育不均衡，也会导致竹叶不同的理化性质和生态学特性。以后的研究中，要尽量减少人工经营措施对实验取样的干扰，并且考虑不同空间部位对竹叶的作用，使样品更具有代表性。本研究根据竹叶的燃烧速率来分析燃烧性，而没有分析理化性质、生态学特性等对燃烧性的影响。因此，以上鲜叶的燃烧性排序及分类是在特定条件下得出的，能否适用于其他条件还需要进一步验证。
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图 1 苏丹黑B、尼罗河红染色线虫中相同脂滴
Figure 1 Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets
图 2 油红O、后置油红O染色线虫中相同脂滴
Figure 2 Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus
图 3 使用苏丹黑B、尼罗红、油红O和后置油红O染色的松材线虫脂滴平均像素的ImageJ图像分析结果
Figure 3 ImageJ image analysis results of average pixels of B. xylophilus lipid droplets stained with Sudan black B, Nile red, oil red O, and post-fix oil red O
图 4 后置油红O染色的松材线虫脂滴的图像处理
Figure 4 Image processing of post-fix oil red O stained adipocytes in B. xylophilus
表 1 不同染料标记和方法的比较
Table 1. Comparison of different dyestuff markers and methods
染料 储备溶液 脱水步骤 染色时间/min 输出颜色 实现单个脂滴分离 油红O 5 g·L−1异丙醇 30 红色 否 苏丹黑B 体积分数为70%乙醇 乙醇系列 360 深蓝色 否 尼罗红 丙酮 乙醇系列 30 浅红色 否 后置油红O 5 g·L−1异丙醇 体积分数为60%异丙醇 60 红色 是 
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200674
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