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松材线虫Bursaphelenchus xylophilus是公认的检疫性有害生物，破坏性地危害欧亚地区的松林资源[1]。松材线虫的生活史分为2个阶段：繁殖阶段和扩散阶段[2]。在温度适宜的夏季和秋季，松材线虫进入繁殖阶段，在树体内经过卵、繁殖型幼虫(J1~J4)，再发育为成虫。在不良环境条件下，松材线虫进入扩散阶段，即滞育型周期，繁殖型J2会转型发育为扩散型J3幼虫和扩散型J4幼虫，在此过程中体内脂滴数量增加，并发生脂滴融合现象，形成超大脂滴或者块状脂肪[3]。扩散型J4幼虫口针退化不取食，依靠消耗体内超大脂滴作为能量侵染新的寄主植物。因此，脂滴对于松材线虫的生存和传播都具有重要作用。中性脂肪(甘油三酯和胆固醇)在线虫中主要以脂滴的形式存在，是松材线虫体内脂肪的主要储存形式[4-6]。松材线虫的肠道是脂类物质沉积的主要场所。由于线虫虫体是透明的，可在显微镜下清楚地看到从头部到尾部的整个肠道，是研究脂肪沉积的一种理想模型[7]。模式线虫秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans可采用染料苏丹黑B、尼罗红和油红O等方法检测脂肪储存和代谢，不同染色方法下脂肪含量的表征呈现一定程度的差异。利用脂溶性的染料苏丹黑B来着色脂滴，脂滴在肠和皮下组织中可见。荧光染料尼罗红和油红O可将脂滴染成红色[8]。目前在松材线虫中尚无相关脂滴染色研究报道，因此，本研究使用不同的染料标记松材线虫体内的脂滴分布，通过使用ImageJ软件测量线虫脂滴的平均像素强度，来表征脂肪含量，确定适合松材线虫脂滴染色的方法[9]。
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松材线虫NXY61虫株为中国林业科学院森林保护研究所从浙江省宁波市罹病马尾松Pinus massoniana中分离获得。使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养的灰葡萄孢Botrytis cinerea来培养繁殖型松材线虫[2]。混合龄期的繁殖型线虫置于PDA培养基上生长3 d，在加入灭菌双蒸水(ddH2O)的贝尔曼漏斗中将线虫从培养基上洗下来，3 000 r·min−1离心3 min，清除上清液。扩散型3龄幼虫从当年采集的疫木中分离，扩散型4龄幼虫从媒介昆虫松墨天牛Monochamus alternatus体内分离。
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将松材线虫用M9缓冲液(3.00 g KH2PO4, 6.00 g Na2HPO4, 5.00 g NaCl, 1 mL 1 mol·L−1 MgSO4，加入蒸馏水定容至1 L)洗涤离心3次(3 000 r·min−1，1 min)；将线虫置于含体积分数为1%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)的M9缓冲液中，4 ℃过夜；−80 ℃冰箱冻融3次；将M9洗涤固定的线虫经梯度体积分数乙醇(25%，50%和70%)分级脱水，每级5 min；随后，在溶于体积分数为70%乙醇的苏丹黑B溶液中进行染色[10]。显微镜观察和拍摄染色后的线虫，并对皮下和肠道内染色的脂滴像素统计。
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将线虫用体积分数为1%多聚甲醛溶液固定，使线虫细胞和亚细胞结构保持稳定状态[9]。线虫和多聚甲醛溶液混合，并于室温摇动2~3 h后，静置使线虫沉降；在−80 ℃冰箱冻融3次，固定后的线虫逐级脱水；在M9缓冲液的线虫沉淀中加入1 mL尼罗红(1 mg·L−1)，在避光的环境下混匀并染色25~30 min，染色期间轻轻翻转离心管，使得虫体均匀接触染料；用1×PBS(8.00 g NaCl，0.20 g KCl，1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，溶于800 mL蒸馏水，用HCl调节溶液pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L)清洗1次，去除线虫表面的染料，然后使线虫自然沉降。最后用显微镜观察拍照。
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用M9缓冲液将松材线虫洗至离心管中，在体积分数为1%多聚甲醛室温或4 ℃固定15~30 min；然后置于−80 ℃冰箱中冷冻15 min，在43 ℃水浴中迅速解冻；低速离心1 min，弃上清；用1×PBS冲洗3次，弃去PBS；用体积分数为1%Triton X-100、异丙醇油红O溶液浸泡30 min；用1×PBS冲洗3次。用异丙醇置于载玻片上，显微镜下观察拍照[11]。
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使用改良的后置油红O染色方案[12]。将油红O溶于异丙醇，制成质量浓度为5.00 g·L−1原液。采用混合法制备油红O工作液(60%的原液和40%的水)。油红O工作液静置后用0.22 mm自旋过滤器过滤。将线虫用体积分数为1%多聚甲醛/PBS在室温下固定摇动30 min；然后立即将样品在冰箱中冷冻干燥15 min，并在自来水中溶解，共3次；低速离心1 min，弃上清；用1×PBS洗涤样品3次，用体积分数为60%异丙醇脱水2 min；用1 mL油红O工作液摇动1 h进行染色。染色后的样品用1×PBS洗涤3次，再水合1×PBS，并安装在琼脂填充的载玻片上，显微镜观察拍照。
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用徕卡荧光正置显微镜(DM4B)使用40×物镜观察固定的尼罗红、油红O和苏丹黑B染色的线虫，用CCD相机(DFC7000T)拍摄16位图像，并用ImageJ(V2.1.4.7)进行图像处理分析。
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将固定后的虫体置于显微镜下观察，与未染色线虫相比，苏丹黑B染色线虫的肠道普遍被染成蓝色(图1)。在实验过程中，用苏丹黑B原溶液染色线虫如图1A~B，显微镜下观察到的脂滴边界不清晰，整条成虫呈现深蓝色；将苏丹黑B稀释60%，染色观察如图1C~D，幼虫和成虫脂滴边界尚清楚，但仍会影响观察松材线虫的脂滴动态变化。
图 1 苏丹黑B、尼罗河红染色线虫中相同脂滴
Figure 1. Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets
尼罗红与苏丹黑B共同标记了肠道周围的脂滴。尼罗红染色线虫在显微镜下观察到部分脂滴呈浅红色(图1E~H)。将配置的母液染料稀释500倍，染色时间30 min，显微成像效果不佳(图1E~F)，大部分虫体脂滴染色不均，其中成虫的色泽较浅。当提高工作液浓度，仅将母液稀释了100倍，为5 mg·L−1, 并将染色时间增加为1 h (图1G~J)，可以分辨分布在成虫肠道周围的圆形大脂滴，而幼虫的脂滴边界相对比较模糊，不便于测量松材线虫脂滴的大小和脂肪存储量。
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在用油红O与后置油红O染色线虫时，培养的同步发育繁殖型线虫和野外采集的扩散型线虫都呈现明显的红色脂滴(图2)。油红O染色如图2A~D，可以观察到，当虫体内出现较多脂滴时，单个脂滴未能良好分离，会影响测量松材线虫脂肪储存量化及繁殖型与扩散型松材线虫的脂滴大小的变化。用后置油红O方法染色线虫结果如图2E~J，在显微镜下观察到脂滴边界清晰，其中J2和J3幼虫大部分较小的脂滴分布在肠道和表皮，并能观察到从幼虫J4到成虫出现小脂滴聚集成大脂滴的现象。扩散型J3较大的脂肪块与扩散型J4脂质小滴之间的脂滴大小变化十分明显。
图 2 油红O、后置油红O染色线虫中相同脂滴
Figure 2. Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus
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通过光学显微镜捕获的苏丹黑B、尼罗红、油红O染色松材线虫脂滴图片，用ImageJ进行图像处理，计算线虫脂滴图片的平均像素强度。图3结果显示：苏丹黑B和后置油红O染色松材线虫脂滴的平均像素强度明显高于尼罗红和油红O染色，其中苏丹黑B染色后整条虫呈现蓝色，所以脂滴平均像素强度最高，而尼罗红的最低，因为颜色较浅。这就说明脂滴平均像素强度偏高或偏低都会影响表征脂肪。经ImageJ图像处理比较分析，后置油红O染色脂滴经计算转换与原始图像的一致，具有单个脂滴的良好分离(图4)。
图 3 使用苏丹黑B、尼罗红、油红O和后置油红O染色的松材线虫脂滴平均像素的ImageJ图像分析结果
Figure 3. ImageJ image analysis results of average pixels of B. xylophilus lipid droplets stained with Sudan black B, Nile red, oil red O, and post-fix oil red O
图 4 后置油红O染色的松材线虫脂滴的图像处理
Figure 4. Image processing of post-fix oil red O stained adipocytes in B. xylophilus
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如表1所示：综合考虑染色方法的简易性、染色时间的长短[11]、染色的观察效果，后置油红O染色方法在4种染色方法中的染色时间相对较短，脂滴呈现的效果比较清晰，能实现脂滴的单个分离，方法步骤比较简单，认为后置油红O染色方法是松材线虫脂滴的最佳染色方法。
表 1 不同染料标记和方法的比较
Table 1. Comparison of different dyestuff markers and methods
染料 储备溶液 脱水步骤 染色时间/min 输出颜色 实现单个脂滴分离 油红O 5 g·L−1异丙醇 30 红色 否 苏丹黑B 体积分数为70%乙醇 乙醇系列 360 深蓝色 否 尼罗红 丙酮 乙醇系列 30 浅红色 否 后置油红O 5 g·L−1异丙醇 体积分数为60%异丙醇 60 红色 是 -
本研究通过使用染料标记的不同测定法来探索松材线虫的最佳脂滴染色方法。在染色前，需要先对虫体进行有效固定，多聚甲醛可很好地保存生物体组织的细微结构特征。固定以后，组织中的各种物质会沉淀和凝固，产生不同的折射率，促使产生光学差异，方便染色后观察。
油红O、苏丹黑B、尼罗红染色一般都能观察到线虫体内脂肪储存，但在本研究中呈现不同显色效果。苏丹黑B作为一种经典的染料，在固定过程中经乙醇的洗涤，无法标记线虫中脂肪储存[9]。本研究也发现：苏丹黑B染色松材线虫脂滴观察效果不佳，染色时间也比较长。尼罗红是一种由尼古蓝衍生的脂类染料，在疏水环境时发荧光，既可染色脂滴，又可检查完整活体动物的脂肪含量[13-15]，经常被作为秀丽隐杆线虫的脂肪酸代谢研究的染料标记。最近研究还发现，鲜活的线虫经尼罗红染色没有显示染色模式的差异[12]。当线虫被喂食尼罗红时，染料会在与溶酶体有关的细胞器中积聚[16]，固定尼罗红比喂食尼罗红更能显示脂肪储存情况。本研究初期观察到的脂滴色泽非常浅，甚至整条线虫未被染色，呈透明状态，经过多步实验探索，线虫中脂滴有部分染色，但仍有染色不完整的脂滴。而且由于尼罗红是亲水性染料，可能会染色脂褐素，导致固定染色不能将中性脂肪存储区与脂褐素区分开，影响结果[17]。油红O是一种油溶性偶氮染料，溶于乙醇和丙酮，在脂肪内能高度溶解，从而染色，颜色比较鲜红，染色效果相对于前面2种染料要好。后置油红O染色用体积分数为1%多聚甲醛的固定液在分子杂交炉中室温条件摇动30 min，通过摇动，使线虫充分接触固定液。将样品放在−80 ℃冰箱中冻融3次，并在自来水中溶解，相比于油红O染色(在43 ℃水浴中迅速解冻)，可增加线虫的缓冲性。在后置油红O染色过程中，异丙醇脱水使线虫显微成像时观察到的组织结构更清晰，用自旋过滤器过滤油红O工作液，可以减少沉淀杂质的产生。用琼脂填充幻灯片成像，可以防止线虫干死，也可以更好地固定已染色的线虫。经过多次实验探究，油红O染色之后，观察到的大小脂滴聚集，脂滴边界未能体现，红色会成片区域出现，当测量脂滴大小变化、脂滴数量时，会加大实验数据误差；后置油红O染色方法经过改良，线虫在室温下用体积分数为1%多聚甲醛摇动，并经多次冻融以后用体积分数为60%的异丙醇脱水，染色效果比较理想，可直接观察脂滴大小变化。综上所述，后置油红O染色方法是最佳松材线虫脂滴染色方法。
Comparison of four lipid droplets staining methods in Bursaphelenchus xylophilus
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摘要:
目的 从4种脂滴染色方法中筛选最适合松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的脂滴染色方法。 方法 采用苏丹黑B染色、尼罗红染色、油红O染色和后置油红O染色等4种染色方法来固定和表征松材线虫体内脂滴的分布，对染色后的线虫进行显微观察和拍摄，并用ImageJ软件对皮下和肠道内染色的脂滴像素进行统计。 结果 4种脂滴染色方法对松材线虫的脂滴都有一定的染色效果。显微拍照后观察脂滴与ImageJ软件图像处理后像素强度比较结果显示：苏丹黑B染色脂滴像素为200.00×1017 m2，尼罗红染色脂滴像素41.64×1012 m2，油红O染色脂滴像素52.12×1017 m2，后置油红O染色脂滴像素83.85×1017 m2。苏丹黑B染色脂滴平均像素强度最高，尼罗红染色脂滴平均像素强度最低，而后置油红O法染色脂滴经计算转换产生了与原始图像一致的表征，实现单个脂滴的良好分离。 结论 综合染色方法的简易、染色时间的长短和染色后的效果，改良后的后置油红O法是最佳的松材线虫脂滴染色方法，能清晰显示脂滴大小及分布。图4表1参17 Abstract:Objective With a comparison of the four commonly used methods for staining Caenorhabditis elegans lipid droplets, this study is aimed to figure out the most suitable dyeing method for Bursaphelenchus xylophilus lipid droplets. Method Four were used to fix and characterize After the distribution of lipid droplets in B. xylophilus was defined with its features revealed employ four dyeing methods including Sudan black B staining, Nile red staining, oil red O staining, and post-fix oil red O staining, the stained nematodes were observed and photographed microscopically, and then ImageJ software was used to count the subcutaneous and intestinal lipid droplet pixels. Result 1) The four dyeing methods have a certain dyeing effect on the lipid droplets of B. xylophilus. 2) Upon the observation of the lipid droplets after microphotographing and the comparison of the pixel intensity after image processing by ImageJ software, the stained lipid droplets pixels with Sudan black B, Nile red, oil red O and post-fix oil red O are 200×1017 m2, 41.64×1012 m2, 52.12×1017 m2, and 83.85×1017 m2 respectively. 3) Lipid droplets stained by Sudan black have the highest average pixel intensity, and lipid droplets stained by Nile red have the lowest average pixel intensity, whereas the lipid droplets stained by post-fix oil red O, after calculation and conversion, produced a consistent characterization with the original image, with a favorable separation of individual lipid droplet. Conclusion In conclusion, in light of the simplicity of the dyeing method, the length of dyeing time and the effect of dyeing, the improved post-fix oil red O method is the optimal method for dyeing lipid droplets in B. xylophilus, with the size and distribution of lipid droplets clearly shown. [Ch, 4 fig. 1 tab. 17 ref.] -
Key words:
- Bursaphelenchus xylophilus /
- lipid droplets staining /
- Nile red /
- oil red O /
- Sudan black /
- post-fix oil red O
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竹材和竹制品的环保特性已成为竹产业的标志属性。毛竹Phyllostachys edulis的微观结构是由维管束纤维与基体组成的两相复合材料，维管束纤维是影响毛竹宏观力学性能的关键。现有竹纤维分离方法可分为高温蒸煮和机械冲击摩擦2类，如蒸汽爆破、碾压捶打、机械梳解、化学分离等[1−8]。以上分离方法关注的焦点均在于所得纤维产品的性能优劣，而忽视了维管束与薄壁组织的分离效果评价。在分离过程中，常存在纤维热损伤、比强度降低、生产效率低、纤维尺寸一致性差等问题。
数控加工中心可通过数控程序精确控制刀具路径和切削方向，并通过合理设置刀具路径和铣削条件精确控制纤维形状。杨永福等[9]分析了不同刀具前角、切削速度以及进给量等切削参数对竹片平面直角自由切削过程中切削力的影响；郭莹洁等[10−11]研究了铣削加工参数的改变对竹片表面质量及超前劈裂的影响。OGAWA等[12−13]通过设定合适的加工中心切削参数，切削提取得到了长度均匀、无热损伤的竹纤维。上述研究主要围绕竹制品的切削特性和切削提取原竹纤维的加工条件展开，并未深入探讨天然竹维管束纤维制取过程中切削力及切削特性等变化。
为揭示天然毛竹维管束纤维提取过程中铣削参数对切削力及维管束纤维形态的影响，本研究以切削加工三要素为变量，使用双刃直槽硬质合金木工雕刻刀对竹板开展单向顺铣正交切削试验，运用极差、方差分析方法，验证分析铣削参数对切削力的影响，并建立切削力经验公式；基于瞬态切削几何模型和单因素试验，探究切削速度(Vc)、切削深度(Ap)和每齿进给量(fz)对维管束纤维提取质量的影响，以期为合理选取切削参数，高效获取优质竹纤维提供理论以及技术指导。
1. 试验条件及方法
1.1 试验条件
选取浙江湖州5年生毛竹，并截取直径约110 mm，竹壁厚度约10 mm的竹段作为试材。去除竹节后放入烘箱中，在70~80 ℃下烘烤8 h。然后，用破竹器将每段试材分成8根竹条，并去除0.8 mm厚度的竹青表皮，最后对竹条进行切割，得到高度分别为36、40和44 mm的竹板毛坯。加工机床采用宁波其锐达机械有限公司生产的KMD-80120型三轴高速雕铣机，主轴最高转速达到12 000 r·min−1；试验刀具为直径10 mm的双刃直槽硬质合金木工雕刻刀。在试验过程中，刀刃径向跳动调整在6 μm以下。切削力测量系统为宁波灵元测控工程有限公司生产的压电晶体测力仪。
1.2 试验方法
对于纤维增强复合材料，具有大长径比的纤维是理想的[14−17]，因此本研究以纤维长度、纤维直径和纵横比评判维管束纤维质量。设计正交切削试验并获取各参数下的切削力数据，再基于切削力数据分析切削参数对切削力及维管束纤维质量的影响规律。
参考以往研究[18−20]，本研究将竹壁沿径向划分为图1所示的内、中、外3层，其中外部维管束纤维呈半开放型，纤维长轴平均长度为0.39 mm，短轴平均长度为0.23 mm。经测量，竹壁外部维管束纤维在水平方向的平均间隙为0.2~0.4 mm。切削过程中，为得到尽可能完整的维管束纤维，切削步进距(Ae)设置为0.4 mm。在以上加工参数的基础上，将切削速度、每齿进给量及切削深度分别定义为因素A、B、C，制定正交试验方案(表1)。试验采用刀刃平行于维管束纤维，沿X轴单向顺铣，干式切削方式进行，对每个试件连续切削3个步距，每组参数重复切削5个试件。通过以上正交试验，可得到135组切削力数据。
表 1 正交试验及切削力Table 1 Forces of orthogonal experimental cutting序号 切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mm切削力/N 序号 切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mm切削力/N Fx Fy Fx Fy 1 62.8 0.2 4 23.70 −8.89 6 125.7 0.4 4 34.78 −10.86 2 62.8 0.3 12 81.04 −25.87 7 188.5 0.2 8 37.22 −24.62 3 62.8 0.4 8 69.56 −23.88 8 188.5 0.3 4 27.01 −15.82 4 125.7 0.2 12 55.84 −19.59 9 188.5 0.4 12 85.16 −42.63 5 125.7 0.3 8 51.97 −16.12 在切削速度为62.8 m·min−1，每齿进给量为0.2 mm，切削深度为4 mm，切削步进距为0.4 mm条件下，对高度为36 mm的竹块毛坯进行切削试验，每个切削刃的部分切削分力(Fx、Fy、Fz)的动态分布曲线如图2所示。切削力呈周期性变化。由于竹壁维管束纤维呈错列排布，铣削过程中维管束纤维的切削厚度不尽相同，因此加工过程中切削力的最大值变化显著。1个切削周期内，Fx先增后减，且为正值，表明在切削过程中，切削刃始终沿进给方向对竹板产生拉力，且随着切削厚度增至最大，切削力也增至最大；Fy向切削刃始终对竹板产生挤压作用，且顺铣时切削刃切出工件侧面过程中，切削厚度逐渐减小为0，故Fy始终为负值。此外，不同于螺旋铣刀，双刃直槽硬质合金木工雕刻刀在切削过程中对材板无Z轴方向作用力，但机床系统振动会导致Z轴方向作用力产生如图2C所示的微小波动[21]，因此本研究忽略Z轴方向作用力的影响[22−23]。为保证试验数据的一致性，均在切削力曲线中选取重复频率较高、数值较大的切削力数值进行记录。每组试验参数记录15组切削力数据，并计算其平均值作为该组正交试验参数的切削力，正交试验方案及切削力如表1所示。
图3为维管束纤维切削瞬态几何模型[24]。定义纤维纵横比为α=L/amax，用以标定维管束纤维的长度和窄度，其中L为切割弧长，amax为最大纤维切削厚度。amax与L可根据下式得到：
$$ \mathit{a} _{ \mathrm{\max }} \mathrm= \mathit{f} _{ \mathrm{z}} \mathrm{sin} \mathit{\varphi } _{ \mathrm{0}} \mathrm{\text{；}} $$ (1) $$ \mathit{L} \mathrm{=2{\text{π}} } \mathit{R\varphi } _{ \mathrm{0}} \mathrm{/360。} $$ (2) 式(1)~(2)中：fz为每齿进给量，φ0为最大接触角，R为刀具半径。定义维管束纤维理论直径为De=(L+amax)/2。从每组试验中随机选取的100根维管束纤维，使用游标卡尺分别测量纤维厚度、切割弧长和纤维长度(L0)，并分别以各自平均值作为对应参数的最终数据。
2. 结果与讨论
2.1 切削速度对切削力及竹纤维质量的影响
在每齿进给量为0.4 mm，切削深度为12 mm，切削步进距为0.4 mm条件下，切削速度与切削力平均值的关系如图4所示。切削过程中，Fx为正值，为主要切削力。Fy为负值，切削刃对工件产生挤压作用。随着切削速度的增加，刀具单次切削竹维管束的体积减小，单次切削功率也随之减小，因此Fx随切削速度的增加而减小；Fy在−40 N附近轻微波动。由此可见：切削速度的变化对Fy方向的切削力影响不大，其轻微波动主要由切削系统共振造成。
在每齿进给量为0.4 mm，切削深度为12 mm, 切削步进距为0.4 mm条件下，切削速度对维管束纤维形态的影响如图5所示。随着切削速度的增加，维管束纤维直径(D0)先减小后增大，且数值只有维管束纤维理论直径的0.5~0.7倍(图5A)。这是因为理论切割弧长大于维管束纤维直径，即使维管束纤维被完整切割也无法达到理论值。各参数铣削获得的维管束纤维长度比较稳定，且与理论值的误差极小(图5B)。维管束纤维纵横比随着切削速度的增大而增大，且当切削速度大于125.7 m·min−1时，纤维纵横比有较明显的提高(图5C)。由纤维直径、纤维长度及纤维纵横比的变异系数(CV)可知(图5D)：随着切削速度的变化，纤维长度并未产生明显的变化，纤维直径和纤维纵横比均在切削速度为160.0~188.5 m·min−1时出现最小值且变化幅度较小。综上，提高切削速度有助于获得尺寸稳定且有较大纵横比和直径的维管束纤维。
2.2 每齿进给量对切削力及竹纤维质量的影响
在切削速度为125.7 m·min−1，切削深度为12 mm，切削步进距为0.4 mm条件下，每齿进给量与切削力平均值的关系如图6所示。随着每齿进给量增加，单位时间内切下切屑的体积增大，切削功率也随之增大，因此随着每齿进给量的增加，Fx呈近似线性增大，Fy呈近似线性减小。
在切削速度为125.7 m·min−1，切削深度为12 mm, 切削步进距为0.4 mm条件下，每齿进给量对维管束纤维形态的影响如图7所示。不同每齿进给量下获得维管束纤维直径先减小后增大，且当每齿进给量为0.2 mm时出现最大值(图7A)；各参数铣削获得的维管束纤维长度比较稳定，且与理论值接近(图7B)；纤维纵横比随着每齿进给量增加，呈先下降后上升再下降的趋势，且当每齿进给量为0.2 mm时出现最大值(图7C)；纤维长度、纤维直径和纤维纵横比随每齿进给量变化而产生明显的变化，但均在每齿进给量为0.2 mm时获得最优维管束纤维(图7D)。综上，减小每齿进给量有利于获得较高质量的维管束纤维。
2.3 切削深度对切削力及竹纤维质量的影响
在切削速度为188.5 m·min−1，每齿进给量为0.3 mm，切削步进距为0.4 mm条件下，切削深度与切削力平均值的关系如图8所示。随着切削深度增加，单位时间内切下切屑的体积增大，切削功率也随之增大，因此Fx随切削深度的增加而增大，而Fy随切削深度的增加而减小。
在切削速度为188.5 m·min−1，每齿进给量为0.3 mm, 切削步进距为0.4 mm条件下，切削深度对维管束纤维形态的影响如图9所示。不同切削深度下获得维管束纤维直径变化不大，且为理论值的一半左右(图9A)；维管束纤维长度随切削深度增加而增加，且曲线斜率为1，表明纤维长度与理论值保持一致(图9B)；纤维纵横比随着切削深度增加，呈先下降后上升的趋势(图9C)；图9D为切削深度对纤维形态变异系数的影响，其中纤维长度和纤维直径的变异系数基本保持恒定，纤维纵横比的变异系数先降低后升高且在切削深度大于10 mm后基本保持恒定。综上，增加切削深度有利于获得较高质量的维管束纤维。
2.4 分析总结
对切削力正交试验结果进行极差分析，结果如表2所示。由表2可知：切削深度(C)对Fx和Fy的影响最大，切削速度(A)和每齿进给量(B)分别对Fx和Fy的影响最小。因此，可以得到对Fx和Fy影响最小的最优加工参数方案为A2B1C1。
表 2 切削力正交试验极差Table 2 Range of cutting force orthogonal experiment切削力 参数 切削参数 切削力 参数 切削参数 切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mm切削速度(A)/
(m·min−1)每齿进给量(B)/
mm切削深度(C)/
mmFx K1 174.301 116.764 85.497 Fy K1 −58.638 −53.102 −35.573 K2 142.582 160.022 158.749 K2 −46.577 −57.819 −64.624 K3 149.399 189.497 222.037 K3 −83.078 −77.373 −88.096 k1 58.100 38.921 28.499 k1 −19.546 −17.701 −11.858 k2 47.527 53.341 52.916 k2 −15.526 −19.273 −21.541 k3 49.800 63.166 74.012 k3 −27.693 −25.791 −29.365 R 10.573 24.244 45.514 R 12.167 8.090 17.507 主次因素 Ap ＞ fz ＞ Vc 主次因素 Ap ＞ Vc ＞ fz 最优方案 A2B1C1 最优方案 A2B1C1 说明：Ki. 满足要求的单元格求和；ki. Ki的算术平均值；R. 极差。 对切削力数据进行方差分析，结果如表3所示。在单向顺铣过程中，切削深度对Fx影响极显著(P＜0.01)，对Fy影响显著(P＜0.05)。每齿进给量对Fx影响显著(P＜0.05)，对Fy影响不显著。切削速度对Fx和Fy切削力影响均不显著。因此，单向顺铣过程中，切削深度是影响切削力的最主要因素，每齿进给量对切削力的影响大于切削速度。方差分析结果与极差分析结果一致，表明正交试验设计的有效性。
表 3 切削力方差分析Table 3 Variance analysis of cutting force方差来源 离差平方和 均方 F值 显著性 方差来源 离差平方和 均方 F值 显著性 Fx Vc 245.647 122.823 14.032 0.067 Fy Vc 230.558 115.279 18.291 0.052 fz 860.307 430.153 49.144 0.020* fz 110.412 55.206 8.760 0.102 Ap 3 125.755 1 562.877 178.556 0.006** Ap 461.497 230.748 36.613 0.027* 误差 17.506 8.753 误差 12.605 6.302 说明：*. 差异显著(P＜0.05)，**. 差异极显著(P＜0.01)。 对不同切削状态下的切削数据进行多元非线性回归分析[25−26]。Fx非线性回归方程决定系数(R2)为0.956，说明对应模型能解释95.6%的变异，模型拟合效果很好。Fy非线性回归方程R2为0.697，说明对应模型仅能解释69.7%的变异。
$$ {F}_{x}=37.818\;3{{A}_{\mathrm{p}}}^{0.865}{{f}_{\mathrm{z}}}^{0.688}{{V}_{\mathrm{c}}}^{-0.135}{\text{，}}{R}^{2}=0.956{\text{；}} $$ (3) $$ {F}_{y}=1.832\;4{{A}_{\mathrm{p}}}^{0.842}{{f}_{\mathrm{z}}}^{0.65}{{V}_{\mathrm{c}}}^{0.312}{\text{，}}{R}^{2}=0.697\mathrm{。} $$ (4) 式(3)~(4)中：Fx和Fy为切削分力；Ap为切削深度度；fz为每齿进给量；Vc为切削速度；R2为决定系数。正交试验与回归方程预测的对比结果如表4所示。Fx的预测值与试验值的误差为±6%左右，说明回归方程具有较高的可靠性。Fy的预测值与试验值的偏差较大，是因为切削刃对竹板反复产生挤压作用，导致切削系统振动。但对比Fy的试验值与预测值可知，预测值与理论值之间的差值在±5 N以内，且Fy的切削力数值相对较小，因此Fy的回归模型能够一定程度上反映其实际切削状态。
表 4 正交试验参数回归方程预测值检验Table 4 Test of predicted value of regression equation of orthogonal experimental parameters序号 Fx/N Fy/N 序号 Fx/N Fy/N 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 1 24.31 23.70 −2.57 −8.89 −7.53 −18.06 6 33.16 34.78 4.66 −10.86 −14.66 25.92 2 77.81 81.04 3.99 −25.87 −24.71 −4.69 7 37.25 37.22 −0.08 −24.62 −19.01 −29.51 3 73.81 69.56 −6.11 −23.88 −21.17 −12.80 8 25.41 27.01 5.92 −15.82 −13.80 −14.64 4 57.63 55.84 −3.21 −19.59 −23.57 16.89 9 84.00 85.16 1.36 −42.63 −41.97 −1.57 5 49.00 51.97 5.71 −16.12 −21.80 26.06 为进一步验证回归模型的可靠性，设计各切削要素条件下的非正交试验，试验结果如表5所示。回归方程对各参数的切削力预测与上述非正交试验结果基本一致，说明回归方程具有较高的可靠性。
表 5 非正交试验参数回归方程预测值检验Table 5 Test of predicted values of regression equations of non-orthogonal experimental parameters序号 切削速度/(m·min−1) 每齿进给量/mm 切削深度/mm Fx/N Fy/N 试验值 预测值 误差/% 试验值 预测值 误差/% 1 62.8 0.3 4 31.33 32.72 4.25 −9.80 −13.73 28.62 2 62.8 0.4 12 98.78 104.34 5.33 −29.79 −35.13 15.20 3 125.7 0.2 4 21.59 22.24 2.92 −9.35 −8.35 −11.98 4 125.7 0.2 8 39.32 39.29 −0.08 −16.75 −14.65 −14.33 5 125.7 0.3 12 73.80 73.09 −0.97 −30.67 −29.17 −5.14 6 125.7 0.4 8 63.34 62.86 −0.76 −26.29 −20.00 −31.45 7 125.7 0.4 12 89.95 90.53 0.64 −36.98 −37.37 1.04 8 188.5 0.2 12 52.86 56.42 6.31 −26.75 −37.78 29.20 9 188.5 0.3 8 49.20 46.38 −6.08 −24.74 −22.04 −12.25 3. 结论
切削深度对维管束纤维切削力的影响最大，平行于刀具进给方向受力主要为切削力，每齿进给量相对于切削速度对切削力的影响更明显，垂直于刀具进给方向主要受挤压力作用，切削速度比每齿进给量对切削力的影响大。对不同切削状态下的切削数据进行多元非线性回归分析，得到切削力非线性回归模型。试验值与模型预测值的对比结果显示：该模型可以较为准确地计算各方向的切削力。
采用铣削方法可提取长度一致性好的维管束纤维，且可通过控制铣刀的切削深度，得到不同长度的维管束纤维。采用较高切削速度、较大切削深度和较小每齿进给量有助于获得较大长径比和直径的维管束纤维。
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图 1 苏丹黑B、尼罗河红染色线虫中相同脂滴
Figure 1 Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets
图 2 油红O、后置油红O染色线虫中相同脂滴
Figure 2 Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus
图 3 使用苏丹黑B、尼罗红、油红O和后置油红O染色的松材线虫脂滴平均像素的ImageJ图像分析结果
Figure 3 ImageJ image analysis results of average pixels of B. xylophilus lipid droplets stained with Sudan black B, Nile red, oil red O, and post-fix oil red O
图 4 后置油红O染色的松材线虫脂滴的图像处理
Figure 4 Image processing of post-fix oil red O stained adipocytes in B. xylophilus
表 1 不同染料标记和方法的比较
Table 1. Comparison of different dyestuff markers and methods
染料 储备溶液 脱水步骤 染色时间/min 输出颜色 实现单个脂滴分离 油红O 5 g·L−1异丙醇 30 红色 否 苏丹黑B 体积分数为70%乙醇 乙醇系列 360 深蓝色 否 尼罗红 丙酮 乙醇系列 30 浅红色 否 后置油红O 5 g·L−1异丙醇 体积分数为60%异丙醇 60 红色 是 
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200674
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