Orthogonal experiments and analysis on cellulose nano-crystals extracted from Miscanthus floridulus

五节芒（来自浙江省开化县）晒干后粉碎；冰乙酸（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；亚氯酸钠（80%，阿拉丁试剂公司）；硫酸（分析纯，杭州大方化学试剂厂）；无水乙醇（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；氢氧化钾（分析纯，西陇化工股份有限公司）。

恒温磁力搅拌油浴锅DF-II（中国金坛市杰瑞尔电器有限公司）；循环水多用真空泵SHZ-D（III）（中国海予英仪器有限公司）；TG16G离心机（中国湖南凯达科学仪器有限公司）；超声波细胞粉碎机JY98-III DN（中国宁波新芝生物科技股份有限公司）；ZetaPALS（美国Brookhaven公司）；透析袋MD44，截留分子8 000~14 000 g·moL^-1，Solarbio。

按文献[5, 7]实验步骤，从五节芒中提取纤维素。主要步骤如下：称取30.0 g五节芒粉末置于1 000 mL烧杯中，倒入蒸馏水直至浸没，磁力搅拌下在70 ℃恒温水浴浸泡至蒸馏水明显发黄变色，用蒸馏水洗涤抽滤，以除去水溶性杂质。将所得固体与600 mL的氢氧化钾溶液（0.90 mol·L^-1）充分混合，在水浴中加热至90 ℃并搅拌反应4 h，以降解半纤维素，抽滤，并用大量去离子水洗涤至滤液为中性，得到黄色絮状产物。将黄色絮状产物放入烧杯，用无水乙醇浸没，磁力搅拌4 h，除去蜡层，使更易抽滤。抽滤后将得到的产物浸入1 000 mL亚氯酸钠溶液（0.15 mol·L^-1），用醋酸调节到pH 3~4，在70 ℃下水浴搅拌5 h，抽滤，并用大量去离子水淋洗至滤液呈中性，得到白色固体，此步骤目的为除去五节芒中的木质素。将上述白色固体在60 ℃烘箱中烘干后得到纤维素，称量并计算出五节芒的纤维素比率为44.7%。

称取烘干的五节芒纤维素2.0 g，置于20 mL硫酸溶液中，用正交分析法考察硫酸质量分数、酸解时间、酸解温度对CNC产率、形态和悬浮液稳定性的影响，正交因子见表 1。酸解后，将样品用10倍质量的去离子水稀释，并在5 000 r·min^-1下离心10 min，除去大量的酸；然后将得到的离心胶体置于透析膜中透析至中性；最后，用超声波细胞粉碎机超声15 min，得五节芒CNC悬浮液。

用日本JEOL公司JEM-1200EX透射电子显微镜（TEM）观察CNC形貌。用滴管吸取1滴待测CNC悬浮液（0.5 g·L^-1），滴在电镜铜网上，用20.0 g·L^-1 醋酸双氧铀染色，干燥2 min，随后用TEM进行观察。

称取m1 g五节芒CNC悬浮液，置于60 ℃烘箱中干燥至恒量，称量为m₂ g，由式（1）得CNC悬浮液的浓度c，再由式（2）算得CNC产率（x）。

式（1）和式（2）中，m₃为酸解得到的CNC悬浮液总质量；m₄为酸解所用纤维素的质量。

采用ZetaPALS的Zeta电位测试模式表征CNC悬浮液的Zeta电位，测试条件为25 ℃，测试5个循环，取平均值。

采用ZetaPALS的粒径测试模式表征CNC悬浮液的颗粒尺寸，测试条件：25 ℃，持续时间6 min，测试3次，取平均值。

图 1为不同酸解工艺条件下制备的CNC的TEM照片，其中，图 1a的工艺条件为硫酸质量分数62%，45 ℃，45 min，CNC长度约180 nm，直径为5~15 nm；图 1b的工艺条件为硫酸质量分数62%，50 ℃，60 min，CNC长度约160 nm，直径为5~15 nm；图 1c为硫酸质量分数65%，45 ℃，60 min，CNC长度约90 nm，直径为5~10 nm。由图 1可知：用硫酸酸解法可从五节芒中成功制得CNC，制得的CNC为刚性棒状结构，而其形貌尺寸强烈依赖于工艺条件（硫酸质量分数、酸解温度和时间）。

Figure 1.  TEM photographs of Miscanthus floridulus CNC

表 1是硫酸质量分数、酸解时间及温度对CNC产率的正交分析结果。由表 1可知：CNC产率为25%~50%。根据极差（R）的大小顺序，硫酸酸解法制备五节芒CNC的3个工艺参数对产率的影响依次为硫酸质量分数、酸解时间、酸解温度。根据方差分析，硫酸质量分数、酸解时间、酸解温度的P值分别为0.03，0.06和0.35，表明：硫酸质量分数、酸解时间和酸解温度对CNC产率的影响分别为显著、不显著和不显著。因素平均值（k）分析表明，随着硫酸质量分数增加，CNC产率先升高后降低，在62%时出现最大值，主要是由于硫酸质量分数较低时纤维素不完全酸解和硫酸质量分数过高时纤维素的过度酸解引起的。另外，实验结果表明：当硫酸质量分数超过70％，五节芒纤维素将发生炭化，无法制得CNC。延长酸解时间，产率也出现先升高后降低，最佳时间为45 min。主要原因是硫酸酸解通过破坏纤维素无定型部分获得CNC，因此，酸解存在最佳时间。当反应时间小于最佳时间，酸解不完全，产率不高；反应时间超过最佳时间，则酸解过度，纤维素晶体部分也参与反应，CNC产率降低。酸解温度升高与酸解时间延长等效，也存在最佳反应温度，但温度对产率的影响较小。因此，CNC产率最高的生产工艺为：硫酸质量分数62%，酸解时间45 min，酸解温度45 ℃，CNC的得率为51.17%。此正交试验结果与唐丽荣等^[14]用微晶纤维素制备CNC和刘志明等^[15]芦苇浆制备CNC的结果基本吻合，都是硫酸质量分数对CNC 得率的影响最大，其最佳条件和产率的细微差异可能是由于纤维素原料的不同而造成的。

Zeta电位可用于评价悬浮液的稳定性，Zeta电位绝对值大于30.00 mV，表明体系比较稳定，Zeta电位绝对值越大，体系越稳定。本研究通过硫酸酸解法制备五节芒CNC，在酸解过程中，纤维素表面会与硫酸反应带有磺酸根负离子，CNC表面带有负电荷，所测定的Zeta电位为负值。不同工艺条件得到CNC悬浮液的Zeta电位列于表 2。由表 2可知：五节芒CNC的Zeta电位基本都在-30.00 mV以下，最低可达-54.55 mV，表明酸解得到的CNC悬浮液非常稳定。P值分析表明3个工艺条件对悬浮液稳定性的影响均不显著。R值分析可知：3个工艺参数对其稳定性的影响依次为硫酸质量分数、酸解时间和反应温度。其中，CNC的稳定性随着硫酸质量分数升高、酸解时间延长和反应温度升高而提高，这主要是硫酸质量分数越高，酸解时间越长，温度越高，反应程度越高，CNC表面生成的磺酸基团含量越高引起的。CNC悬浮液稳定性最高的实验条件为硫酸质量分数65%，酸解时间60 min，反应温度50 ℃。

动态光散射法（DLS）可测定分散于液体中颗粒的流体力学直径，虽然不能直接给出CNC的真实长度，但其结果可作为酸解CNC尺寸大小的合理参考依据。表 3给出了由DLS测定的各组CNC流体力学直径。与TEM得到的结果相比较，可发现用DLS得到的CNC长度略小于TEM的观察结果。另外，硫酸酸解法制备CNC的3个工艺参数对其流体力学直径的影响依次为硫酸质量分数、反应温度和酸解时间。k值表明：硫酸质量分数与反应温度越高，CNC流体力学直径越小；酸解时间对CNC尺寸的影响较小。P值表明：硫酸质量分数对CNC尺寸影响显著，反应温度与酸解时间对CNC尺寸影响不显著。

用硫酸酸解法可制得五节芒纤维素纳米晶体（CNC），其形态为刚性棒状结构，CNC悬浮液非常稳定，酸解工艺条件会显著影响CNC形态尺寸。

正交实验分析表明：3个工艺参数对CNC产率的影响依次为硫酸质量分数（P＝0.03），酸解时间（P＝0.06），反应温度（P＝0.35）；对CNC流体力学直径的影响依次为硫酸质量分数（P＝0.03），反应温度（P＝0.22）和酸解时间（P＝0.38）；对CNC悬浮液稳定性的影响均不显著。