Advances in plant cell ion flux with salt stress:a review

钠离子（Na⁺）是盐胁迫的主要毒害离子，其吸收、运输和区域化储存决定了植物能否在盐胁迫下生存。植物除了抑制钠离子（Na⁺）吸收外，还可通过质膜上的Na⁺/H⁺反向运输体（sos1）排出或通过液泡膜上的Na⁺/H⁺反向运输体（AtNHX）转运至液泡^{[2, 4]}，从而降低细胞质中钠离子（Na⁺）浓度。

sos1位于细胞质膜上，是植物盐过敏感调控途径[salt overly sensitive（SOS）signal-transduction pathway]中的反向Na⁺/H⁺运输体，在植物抵抗盐胁迫中具有重要的钠离子（Na⁺）排出作用^[8-10]。拟南芥Arabidopsis thaliana sos1突变体与野生型植株相比，在氯化钠（NaCl）胁迫下细胞内会积累较多钠离子（Na⁺），其抗盐性明显降低^[11]：而过表达sos1拟南芥植株则具有较高的钠离子（Na⁺）排出能力，其抗盐性明显提高^[12]。在高羊茅Festuca arundinacea同一植株中转入拟南芥sos1，sos2和sos3等3种基因，其钠离子（Na⁺）排出速率显著提高，抗盐性明显增强^[13]。

大豆Glycine max叶肉细胞在氯化钠（NaCl）胁迫后，钠离子（Na⁺）迅速内流，然而几分钟后钠离子（Na⁺）内流显著降低，并且表现出钠离子（Na⁺）外流^[14]。胡杨Pobulus eubhratica根在50 mmol·L^-1氯化钠（NaCl）短时间（24 h）胁迫和100 mmol·L^-1氯化钠（NaCl）长期（15 d）胁迫后均具有很高的钠离子（Na⁺）排出能力，同时其原生质体在短期盐胁迫中也具有明显的钠离子（Na⁺）排出能力^[6]。由此可见，sos1可在短时间被氯化钠（NaCl）胁迫所诱导激活，同时其钠离子（Na⁺）排出能力可长期保持。sos1的激活可能存在多种方式，其中最主要的是钙离子（Ca²⁺）所介导的信号途径。钠离子（Na⁺）胁迫诱导胞内钙离子（Ca²⁺）浓度升高，从而活化具有类似于钙离子（Ca²⁺）依赖型磷酸酶特性的sos3，sos3再与sos2结合进而激活sos1（图 1）^[8]。Bose等^[15]通过在拟南芥中过表达血红素氧化酶研究表明，活性氧可能具有激活sos1的能力。此外，sos1还有可能被钠离子（Na⁺）直接激活（图 1），然而目前尚缺乏此方面的直接证据^[8]。

Figure 1.  SOS signal-transduction pathway

NHX蛋白家族是位于液泡膜上的Na⁺/H⁺反向运输体，其转录水平可为脱落酸（ABA）和盐胁迫所调控^[16]。小麦Triticum aestivum耐盐品种‘Kharchia 65’在盐胁迫下sos1和NHX1活性及其基因转录水平均明显提高，因此，钠离子（Na⁺）可有效地排出细胞和排入液泡，从而降低细胞质中钠离子（Na⁺）浓度以提高耐盐性^[17]。在多种植物中转入拟南芥NHX1基因以及在拟南芥中过表达液泡膜上的H⁺-焦磷酸酶基因均能有效提高植物抗盐性。这表明在盐胁迫下钠离子（Na⁺）可通过NHX流入液泡，同时在此过程中需要水解ATP提供能量^{[18, 19]}。对拟南芥sos1，sos2和sos3突变体植株进行盐胁迫处理，其NHX1表达量未受影响，这表明NHX1的表达与SOS途径无关^[16]。

在盐胁迫下，胞外氢离子（H⁺）顺着质子动力势内流从而驱动钠离子（Na⁺）通过sos1排出，而质子动力势的形成则需要质膜上H⁺-ATP酶水解三磷酸腺苷（ATP）将胞内氢离子（H⁺）泵到胞外^{[10, 12]}。蚕豆Vacia faba叶肉组织在氯化钠（NaCl）胁迫后氢离子（H⁺）外流明显增加，采用原钒酸盐抑制质膜H⁺-ATP酶后，其氢离子（H⁺）外流的增加量也被明显抑制。这表明氯化钠（NaCl）胁迫可诱导质膜H⁺-ATP活化，从而促进氢离子（H⁺）外流以参与植物细胞对盐胁迫的应答反应^[14]。胡杨是抗盐碱植物，其根尖在低盐胁迫下发生明显的氢离子（H⁺）外流，而不抗盐碱的群众杨Populus popularis则无此现象：随着盐胁迫时间延长，氢离子（H⁺）从胡杨根尖和原生质体外流明显增加，而群众杨则无明显变化^[6]。胡杨细胞经低盐胁迫后再用50 mmol·L^-1氯化钠（NaCl）进行胁迫处理，氢离子（H⁺）内流增加，同时此内流现象可为原钒酸盐和阿米洛利（sos1抑制剂）所抑制，这可能是由于高浓度盐胁迫需要更多的氢离子（H⁺）内流以驱动钠离子（Na⁺）外流，因此，氢离子（H⁺）内流增加^[6]。Guoa等^[20]研究发现，氯化钠（NaCl）处理15 min后，拟南芥sos1突变体根分生区氢离子（H⁺）外流，细胞碱性化：而sos2和sos3突变体以及野生型植株则表现为氢离子（H⁺）内流，细胞微弱酸化。这与Shabala等^[8]的研究结果相一致，sos1突变体由于缺失Na⁺/H⁺反向运输体，被H⁺-ATP酶泵到胞外的氢离子（H⁺）不能迅速回流，因此表现为外流：而sos2和sos3突变体以及野生型植株具有Na⁺/H⁺反向运输体，泵到胞外的氢离子（H⁺）驱动钠离子（Na⁺）外排而发生内流。

植物在受到盐胁迫后，大量的钠离子（Na⁺）进入细胞，而细胞内的钾离子（K⁺）则发生外流，并且此种外流现象不仅存在于根中，同时也存在于叶片之中^[21-23]。钾离子（K⁺）外流与质膜去极化密切相关^[24]，盐胁迫下进入细胞内的钠离子（Na⁺）会中和膜内负电荷使质膜发生去极化，进而活化外向钾离子（K⁺）通道（KORC）使钾离子（K⁺）外流^{[8, 25-26]}。耐盐大麦Hordeum vulgare在氯化钠（NaCl）胁迫下能保持很高的膜负电位，从而抑制质膜发生去极化，进而抑制KORC以阻止钾离子（K⁺）外流^[27]。与盐胁迫不同，在渗透胁迫下K⁺发生内流。采用90 mmol·L^-1氯化钠（NaCl）处理大豆叶肉细胞，其细胞内钾离子（K⁺）发生明显外流：而采用甘露醇进行等渗胁迫，胞外的钾离子（K⁺）则发生明显内流^[14]。这表明植物在感知和响应盐胁迫与渗透胁迫上存在明显差异。除高等植物外，在大肠埃希菌Escherichia coli中也有此现象存在^[28]。

在盐胁迫条件下，外源物质可通过抑制外向钾离子（K⁺）通道而阻止钾离子（K⁺）外流。Cuin等^[24]测定了26种氨基酸对氯化钠（NaCl）诱导大麦根表皮细胞钾离子（K⁺）流的作用，其中21种氨基酸能明显缓解钾离子（K⁺）外流。采用多胺（精胺、亚精胺、腐胺）处理玉米Zea may和拟南芥根后再进行氯化钠（NaCl）胁迫，根成熟区钾离子（K⁺）外流被明显抑制^[29]，其原因可能是多胺通过影响非选择性阳离子通道（NSCCs）而阻止了钾离子（K⁺）外流^[30]。水杨酸处理可降低氯化钠（NaCl）胁迫引起的质膜去极化，从而抑制KORC活化，因此在短期胁迫后（1 h）可以减少钾离子（K⁺）外流，而在长期胁迫后（14 d）可提高细胞内钾离子（K⁺）浓度^[31]。Shabala等^[23]采用膜片钳技术研究发现拟南芥细胞质膜上存在2种对钙离子（Ca²⁺）敏感的K⁺通道，外施钙离子（Ca²⁺）可直接或间接[降低氯化钠（NaCl）诱导的质膜去极化]调控K⁺外流通道，从而减少细胞内钾离子（K⁺）外流。硫化氢（H₂S）是重要的信号物质，参与植物体内多种生理过程的调控^[32-34]。采用其处理胡杨和群众杨根后，在氯化钠（NaCl）胁迫条件下钾离子（K⁺）外流被明显抑制，其原因可能为硫化氢（H₂S）通过上调sos1，从而促进钠离子（Na⁺）外流，阻止质膜去极化，因此，抑制了KORC活化和钾离子（K⁺）外流^[35]。

盐胁迫除了诱导钾离子（K⁺）外流外，还会降低细胞对钾离子（K⁺）的吸收，这可能与钾离子（K⁺）和钠离子（Na⁺）竞争细胞膜上的吸收位点有关^[36-38]。钾离子（K⁺）外流增加、内流减少将会大大降低细胞内钾离子（K⁺）含量，改变细胞内适宜的K⁺/Na⁺比值，从而使植物受到盐胁迫伤害。Chen等^[39]通过对70个品种的大麦进行研究发现，大麦幼苗根的净钾离子（K⁺）流[氯化钠（NaCl）处理40 min]与氯化钠（NaCl）胁迫1个月后植株的生理响应[生长速率、生物量、净二氧化碳（CO₂）同化速率、叶绿素荧光等]之间密切相关（R＞0.8）。在氯化钠（NaCl）胁迫下，耐盐和敏感大麦钾离子（K⁺）外流量之间存在明显差异，其中敏感植株钾离子（K⁺）外流现象明显^[39-40]。在烟草Nicotiana tabacum植株内转入动物抗凋亡基因CED-9后，可通过抑制钾离子（K⁺）外流来提高其耐盐和抗氧化胁迫能力。这可能与CDE-9调控KORC和NSCCs等2种钾离子（K⁺）通道有关^[41]。耐盐植物通过减少钾离子（K⁺）外流以维持细胞内较高的钾离子（K⁺）含量和K⁺/Na⁺，从而维持正常的细胞代谢，进而提高其抵抗盐胁迫的能力^[42-43]。

钙离子（Ca²⁺）是植物细胞内重要的信号物质，在植物抵抗盐胁迫中具有重要的调控作用（图 1）：①钙离子（Ca²⁺）通过调控钠离子（Na⁺）进入细胞的主要通道NSCCs从而抑制钠离子（Na⁺）内流^{[37, 44-45]}，并且此种调控作用与胞外钙离子（Ca²⁺）和钠离子（Na⁺）的比率无关，而与胞外钙离子（Ca²⁺）浓度有关^[46-48]：②通过抑制KORC而阻止钾离子（K⁺）外流^[23]：③启动SOS信号转导途径^[49-50]。在氯化钠（NaCl）胁迫下，胞外钙离子（Ca²⁺）向细胞内流动，从而使胞内钙离子（Ca²⁺）浓度呈线性增加^[51]。虽然渗透胁迫也会引起细胞质内钙离子（Ca²⁺）浓度升高，但是其来源于细胞内钙库释放，因此，其升高机制与盐胁迫不同^[52]。Ma等^[13]采用氯化钠（NaCl）处理转拟南芥SOS1+SOS2+SOS3基因的高羊茅植株发现，野生型和转基因植株均发生钙离子（Ca²⁺）内流现象，并且转基因植株钙离子（Ca²⁺）内流速率较高，其原因可能为转基因植株含有较多的SOS3蛋白，需要有较多的钙离子（Ca²⁺）进行活化，因此，钙离子（Ca²⁺）内流量明显高于野生型植株。

钙离子（Ca²⁺）内流与质膜上的钙离子（Ca²⁺）内流通道和羟自由基（OH·）密切相关，盐胁迫下质膜上的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶在将电子传递给氧（O₂）时会在胞外产生大量超氧阴离子自由基（O₂^-·），这些O₂^-·迅速转化为过氧化氢（H₂O₂）和OH·，其中OH·可活化质膜上的钙离子（Ca²⁺）内流通道，从而使胞外钙离子（Ca²⁺）通过其流入胞内^{[7, 53]}。Sun等^[54]研究表明，过氧化氢（H₂O₂）活化了质膜上的钙离子（Ca²⁺）内流通道，从而使胞外钙离子（Ca²⁺）流入胞内（图 2）。由此可见：活性氧在钙离子（Ca²⁺）+内流过程中具有重要的调控作用。采用二磷酸腺苷（ADP）处理拟南芥根后，钙离子（Ca²⁺）发生内流，胞内钙离子（Ca²⁺）浓度升高，同时此内流现象可在极短时间内（1 s）发生：三磷酸腺苷（ATP）处理则会引起钙离子（Ca²⁺）外流，因此，在植物细胞膜上可能存在有ADP与ATP调控的钙离子（Ca²⁺）通道，然而此通道在氯化钠（NaCl）胁迫后如何转运钙离子（Ca²⁺）目前尚无相关报道^[55]。

Figure 2.  Plant cellular ion flux in response to NaCl stress

在木本植物中，氯离子（Cl^-）的毒害作用比钠离子（Na⁺）更为严重^{[2, 56]}，然而目前对氯离子（Cl^-）流响应盐胁迫的研究则相对较少。在氯化钠（NaCl）胁迫下，大豆叶肉细胞^[14]、拟南芥^[57]和胡杨根细胞^{[6, 58]}内的氯离子（Cl^-）会发生明显外流，并且随着氯化钠（NaCl）胁迫时间的延长，胡杨根细胞内氯离子（Cl^-）外流逐渐增加^[58-59]。Lorenzen等^[55]推测氯离子（Cl^-）外流可能与钠离子（Na⁺）外流相偶联，然而氯离子（Cl^-）通过何种机制发生跨膜流动尚不清楚。采用甘露醇和山梨醇对拟南芥进行渗透胁迫，其根表皮细胞外的氯离子（Cl^-）向胞内流动^[60]。在高渗胁迫时胡杨根外的氯离子（Cl^-）内流，其中在距根尖700~1 200 μm处内流最为明显^[6]。由此可见，植物细胞氯离子（Cl^-）流对盐胁迫和渗透胁迫的响应机制存在明显差异。

在氯化钠（NaCl）胁迫下，细胞质膜发生去极化，进而活化KORC和NSCCs使钾离子（K⁺）发生外流。通过质膜上NADPH氧化酶产生的活性氧（H₂O₂和OH·）可活化钙离子（Ca²⁺）通道引起钙离子（Ca²⁺）内流，从而使胞内钙离子（Ca²⁺）浓度升高以激活SOS信号途径，进而通过Na⁺/H⁺反向运输体排出钠离子（Na⁺）。胞内H₂O₂可诱导依赖于钙离子（Ca²⁺）的H⁺-ATP酶活化，使胞内氢离子（H⁺）外流，从而促进Na⁺/H⁺反向运输体运转。氢离子（H⁺）外流还可阻止质膜去极化，抑制钾离子（K⁺）通过KORC和NSCCs外流（图 2）^[54]。在此过程中，植物细胞通过减少钾离子（K⁺）外流和促进钠离子（Na⁺）外流以维持胞内K⁺/Na⁺平衡，然而离子的跨膜流动是一个复杂的响应过程，除了已知的几种通道外，是否还有其他通道参与离子跨膜流动，尤其是氯离子（Cl^-）通道尚不清楚，同时这些通道如何进行调控亦不明确，这些都需要进行深入研究。离子再平衡后对植物相关基因表达和细胞器有何影响、以及此过程如何调控尚不清楚。对这些问题进行系统研究，对揭示盐胁迫如何诱导植物进行迅速响应具有重要价值，同时对提高植物抗盐性研究也具有重要意义。