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鹅掌楸Liriodendron chinense是属于木兰科Magnoliaceae鹅掌楸属Liriodendron的中国特有植物，常被用于行道树和园林绿化树种，为世界最珍贵的树种之一[1]。该树种是优良的建造材料，同时具有一定的药用价值，目前已被列为国家二级珍稀濒危保护植物[2]。鹅掌楸自然分布在中国的南方，如江西、贵州、福建等省份，生长在海拔1 000 m左右的山地中。在引种过程中，抗寒性的大小是选择优树最重要的考量标准，该树种的引种成活率与受到冻害程度的大小有重要关系[3-4]。探究鹅掌楸的抗寒性不仅在了解其抗寒生理机制上具有重要的科学意义，在实际的引种栽培和规模化生产上也具有较高的价值。目前，鹅掌楸树种抗寒性研究主要集中在对该树种的表型性状的评价上[4]，尚未开展从抗寒生理水平上对鹅掌楸的抗寒性进行分析和评价。低温对植物的生长及地理分布起到重要的限制作用。环境温度过低，导致植物进行较低的光合作用和较高的呼吸作用，从而使其生物合成效率下降，加大了能源物质消耗，严重影响其生长发育，甚至会引发植物死亡[5]。在冷应答过程中，植物接收到低温信号后开启防御机制，包括膜结构上的适应，细胞间调节渗透物质的增加和抗氧化物质的协调配合等，通过上述方法，起到平衡生物合成和碳水化合物代谢的作用，提高植物在寒冷环境下的存活率[6]。通过测定生理指标来鉴定植物抗寒性的方法已被广泛使用[7-9]。植物的抗寒性是一个复杂的生理生化过程，使用单一指标评价鹅掌楸的抗寒性具有一定的局限性。隶属函数分析方法因其便于开展直观、综合的评价，作为一种对植物抗寒性综合评价的方法，目前已广泛应用于多种植物的抗寒性评价中[10-13]，而在鹅掌楸的抗寒性评价中未见应用。本研究以鹅掌楸地理分布上纬度差异较大的4个种源为材料，比较其自然环境下秋季和冬季的生理指标，探索其变化规律，并应用隶属函数法对所测指标进行综合评价分析，以期获得评价鹅掌楸抗寒性鉴定的有效方法。
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供试材料采自江西省分宜县大岗山年珠林场，27.80°N，114.40°E，海拔为129 m，年平均气温为19.30 ℃，年降水量为1 619.7 mm，土质为红棕壤，平均坡度为15°。本课题组于1990年秋季采集全国鹅掌楸种源种子，于1991年春季种植于年珠林场。本研究选取了其中由南向北纬度差异较大的4个鹅掌楸种源的植株作为研究对象[14](表 1)。各种源分别选择30株树龄一致、生长情况良好的植株，随机采集每株树的1年生枝条顶端叶芽，纯净水清洗后擦干，用锡纸包裹后投入液氮中带回实验室，置于-80 ℃低温冰箱中保存，用于抗寒生理指标的测定。随机采集各种源30株树的1年生枝条，剪取枝条中部约20 cm长材料，将其截断处用湿纱布包裹，置于封口袋中，用携带式低温冷藏箱中保存，迅速带回实验室开展相对电导率测量实验。按照近几年的气温变化规律，1月中旬，江西林场的气温进入到1 a中最低的时期，故冬季的采样时间为2014年1月中旬，秋季的采样时间为2013年9月中旬。
种源 环境因子 北纬N/(°) 东经E/(°) 海拔/m 年均气温/℃ 年降水量/mm 云南勐腊 21.40 101.60 700 20.30 1 942 安黴大别山 31.13 118.20 1450 10.10 1 280 贵州黎平 26.50 108.60 1 100 15.30 1 308 浙江富阳 29.13 119.90 76 18.40 1 523 Table 1. Environmental factors of Liriodendron Chinese provenances
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丙二醛(MDA)质量摩尔浓度测定采用硫代巴比妥酸法[15]；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)法[17]；可溶性蛋白质量分数的测定采用考马斯亮蓝法[16]；可溶性糖质量分数的测定采用蒽酮法[18]；脯氨酸质量分数的测定采用酸性茚三酮显色法[17]。
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取鹅掌楸枝条，平均分成3份，纱布包好，放入具塞试管后加入10 mL蒸馏水。摇匀振荡1 min后，第1次测电导率(E0)；然后室温下放置24 h，充分摇匀后第2次测电导率(E1)；然后，把试管置沸水浴中15 min，冷却，测定第3次电导率(E2)。根据下面公式计算相对电导率(CRE)：CRE=(E1-E0)/(E2-E1)×100%。每个样品测定3次，并计算平均值[15]。
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取30株·种源-1鹅掌楸的叶芽，用称量天平称取样品的质量(W0)；然后把样品放入升温至60 ℃的烘箱中，24 h后取出称量(W1)。根据下面公式计算样品的含水量：含水量=[(W0-W1)/W0]×100%[15]。
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各种源分别测定30株树，测量3次·株-1，3次测量值的平均值作为每株树的生理指标数值，将30株树的生理指标数值取平均值作为种源的生理指标数值。用Excel 2007软件进行数据统计和作图；用SPSS 17.0 软件进行方差分析和相关性分析。采用相对增幅来比较各种源指标的季节变化程度，相对增幅(%)=(冬季鹅掌楸指标-秋季鹅掌楸指标)÷秋季鹅掌楸指标×100。
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使用隶属函数法综合评价鹅掌楸抗寒性[15]。与抗寒性呈正相关的参数计算：Uij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)；与抗寒性呈负相关的参数计算：Uij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。其中：Uij为i种类鹅掌楸种源第j项指标的抗寒隶属函数值； i表示某个种源；j表示某项指标；Xij表示第i个鹅掌楸种第j项生理指标测定值；Xjmax和Xjmin为鹅掌楸4个种源中，第j项生理指标的最大值和最小值。按照上述公式，根据各种源生理指标的相对增幅计算各项指标的隶属函数值，取各指标的隶属函数值的算术平均数作为平均隶属函数值。
1.1. 试验材料
1.2. 测定方法
1.2.1. 抗寒生理生化指标测定
1.2.2. 相对电导率
1.2.3. 含水量测定
1.3. 数据分析
1.4. 抗寒性综合评价方法
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本研究结果显示：鹅掌楸不同种源的几种抗寒生理指标在秋季和冬季的变化趋势总体上保持一致。具体为，冬季的鹅掌楸叶芽中的丙二醛质量摩尔浓度、可溶性蛋白质量分数、SOD活性、可溶性糖质量分数、脯氨酸质量分数、相对电导率均高于秋季，含水量低于秋季(表 2和表 3)。
种源 相对电导率/% 丙二醇/(μmol•g-1) SOD活性/(×16.67μkat•g-1) 含水量/% 可溶性糖/(μg•g-1) 可溶性蛋白(μg•g-1) 脯氨酸(μg•g-1) 云南勐腊 14.31±1.54a 1.77±0.32 a 110.15±3.96b 48.86±0.24 a 131.91±2.71 b 14.80±0.50 b 12.33 ± 0.63 c 贵州黎平 16.98±1.87a 1.35±0.17 c 115.40±5.61 a 48.32±2.50 a 151.06±3.47 a 24.03±0.27 b 21.86±0.71 b 安黴大别山 13.35±1.09b 1.56±0.49 b 117.67±6.94 a 44.20±1.47 b 193.03±7.37 a 31.17±0.45 a 18.55±0.26 bc 浙江富阳 17.28±0.72 a 1.70±0.40 bc 108.54±4.46b 45.51±1.95 b 135.54±5.87 ab 33.17±0.29 a 23.34±0.98 a 说明: 表中每列的值是平均值±标准误。同列标有小写字母者表示差异显著(P < 0.05), 标有相同字母者表示差异不显著。 Table 2. Cold resistant physiological indicators of different provenances in autumn
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表 2显示，秋季时，丙二醛质量摩尔浓度最低的是贵州黎平种源，最高的是云南勐腊种源，云南勐腊种源显著高于安徽大别山种源；浙江富阳和安徽大别山的可溶性蛋白质量分数分别为33.17 μg·g-1和31.17 μg·g-1，显著高于贵州黎平和云南勐腊；贵州黎平和安徽大别山的可溶性糖质量分数显著高于云南勐腊；SOD活性依次为安徽大别山＞贵州黎平＞云南勐腊＞浙江富阳，贵州黎平和安徽大别山的SOD活性显著高于云南勐腊和浙江富阳；脯氨酸质量分数依次为浙江富阳＞贵州黎平＞安徽大别山＞云南勐腊，浙江富阳种源显著高于其他3个种源；相对电导率依次为浙江富阳＞贵州黎平＞云南勐腊＞安徽大别山，对各个种源的相对电导率均值差异性分析比较发现，安徽大别山种源相对电导率为13.35%，显著低于其他3个种源；云南勐腊和贵州黎平的含水量显著高于安徽大别山和浙江富阳。表 3显示，冬季时，云南勐腊和贵州黎平的丙二醛质量摩尔浓度分别为6.90 μmol·g-1和5.77 μmol·g-1，显著高于安徽大别山和浙江富阳；可溶性蛋白质量分数依次为浙江富阳＞安徽大别山＞贵州黎平＞云南勐腊，浙江富阳的可溶性蛋白质量分数显著高于其他3个种源；安徽大别山和贵州黎平的可溶性糖质量分数显著高于云南勐腊和浙江富阳；SOD活性依次为安徽大别山＞云南勐腊＞浙江富阳＞贵州黎平，云南勐腊和安徽大别山的SOD活性显著高于贵州黎平；脯氨酸质量分数依次为安徽大别山＞浙江富阳＞贵州黎平＞云南勐腊；云南的相对电导率为36.06%，显著高于其他3个种源；含水量依次为云南勐腊＞贵州黎平＞浙江富阳＞安徽大别山。
种源 相对电导率/% 丙二醇/(μmol•g-1) SOD活性/(×16.67μkat•g-1) 含水量/% 可溶性糖/(μg•g-1) 可溶性蛋白(μg•g-1) 脯氨酸(μg•g-1) 云南勐腊 36.03±1.56a 6.90±0.18 a 134.34±1.23 a 33.30±1.10a 317.83±5.07 b 18.34±0.34 22.50±0.87 b 贵州黎平 31.05±2.89b 5.77±0.34 a 131.25±2.50 b 32.11±3.25 bc 337.35±5.26 a 37.65±0.37 b 32.29±1.73 ab 安黴大别山 25.98±0.82c 4.89±0.09 b 191.12±5.50a 25.45±0.89 c 482.35±9.76 a 52.94±0.34 bc 50.29±0.72 a 浙江富阳 29.35±1.57bc 4.43±0.54 b 132.37±2.45 ab 29.42±0.46b 300.40±8.28 b 66.88±0.47 a 34.48±1.74a 说明: 表中每列的值是平均值±标准误。同列标有小写字母者表示差异显著(P < 0.05), 标有相同字母者表示差异不显著。 Table 3. Cold resistant physiological indicators of different provenances in winter
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对鹅掌楸4个种源的抗寒生理指标测定结果显示，各生理指标的季节变化趋势不同，仅使用单一指标衡量该树种的抗寒性缺乏科学性。本研究采用隶属函数分析法综合评鹅掌楸的抗寒性。隶属函数均值的大小反映了抗寒性的强弱。根据各种源的生理指标变化相对增幅，计算出鹅掌楸4个种源的隶属函数值，作为抗寒性的综合评价值，大小分别为：云南勐腊0.021，贵州黎平0.286，安徽大别山0.834，浙江富阳0.488。根据综合评价结果对 4个鹅掌楸种源的抗寒性进行了综合排序：安徽大别山＞浙江富阳＞贵州黎平＞云南勐腊(表 4和表 5)。抗寒性最强的安徽大别山种源可溶性糖质量分数、脯氨酸质量分数、可溶性蛋白质量分数、含水量的相对增幅较高，而相对电导率值和丙二醛质量摩尔浓度的相对增幅较低。
种源 相对增幅/% 相对电导率 丙二醛 SOD活性 含水量 可溶性糖 可溶性蛋白 脯氨酸 云南勐腊 151.78 289.83 21.96 -31.84 140.94 23.92 82.48 贵州黎平 82.86 327.41 13.73 -33.55 123.32 56.68 47.71 安黴大别山 64.64 213.46 62.42 -42.42 149.88 69.84 171.11 浙江富阳 69.85 160.59 21.96 -35.35 121.63 101.63 47.73 Table 4. Relative growth ratio of cold resistant physiological indicators of provenances in different seasons
种源 隶属函数值 隶偶函数均值 抗寒能刀排序 相对电导率 丙二醛 SOD活性 含水量 可溶性糖 可溶性蛋白 脯氨酸 云南勐腊 0.000 0.225 0.169 0.000 0.683 0.000 0.282 0.194 4 贵州黎平 0.791 0.000 0.000 0.162 0.059 0.421 0.000 0.204 3 安黴大别山 1.000 0.683 1.000 1.000 1.000 0.591 1.000 0.896 1 浙江富阳 0.940 1.000 0.169 0.332 0.000 1.000 0.001 0.491 2 Table 5. Comprehensive evaluation on cold resistant ability
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对各抗寒生理指标与隶属函数值进行相关性分析：结果显示，相对电导率、含水量均与隶属函数值呈显著性负相关(P＜0.01)；脯氨酸质量分数分别与隶属函数值呈显著性正相关(P＜0.01)(表 6)。因此，在今后的鹅掌楸抗寒性评价时，上述指标可以被用作较好的评价指标。
抗寒生理指标 隶属函数均值 相关性分析 P值 相对电导率 -0.980* 0.010 可溶性蛋白 0.758 0.121 可溶性糖 0.780 0.110 丙二醛 -0.819 0.091 SOD活性 0.817 0.092 含水量 -0.984* 0.008 脯氨酸 0.937* 0.006 说明：*表示在0.01水平相关。 Table 6. Correlation analysis between subordinate function value and cold resistant physiological indicators
2.1. 抗寒性生理指标的季节变化
2.2. 种源间抗寒生理指标的差异
2.3. 不同种源抗寒性综合评价
2.4. 抗寒性生理指标与抗寒性相关性分析
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鹅掌楸生理指标季节变化的规律与前人在植物抗寒性研究[17-19]上取得的结果一致，说明实验结果是可靠的。 本研究采用隶属函数分析法综合评定鹅掌楸种源的抗寒性，其强弱依次为安徽大别山＞浙江富阳＞贵州黎平＞云南勐腊，这与本课题组对各种源试验林的长期观测的结果相符。安徽大别山种源的鹅掌楸在幼苗时期即表现出较强的抗寒性，受到冷害后存活率较高，且幼苗成年后生长速度快，云南勐腊种源的抗寒性则较弱。在同样的生长环境下，安徽大别山和云南勐腊2个种源表现出了对低温环境的适应性上的显著差异。抗寒性差别较大的种源间的抗寒性差异可能与不同种源对生长环境的长期适应有关。抗寒性最强的安徽大别山种源和抗寒性最弱的云南勐腊种源，在4个种源中分属地理分布的最北端和最南端，高纬度地区的冬季温度较低，季节间温差较大，长期对低温环境的冷适应，可能是增强安徽大别山种源抗寒性的原因之一。本研究结果显示：抗寒性最强的安徽大别山种源和抗寒性最弱的云南勐腊种源在生理指标的含量和季节间的相对增幅上存在差异，可能是造成2个种源的鹅掌楸抗寒性差别较大的原因。
膜系统是植物遇冷害后首先受到伤害的部位，由于冻害引发的细胞脱水会对膜系统造成多方面的伤害[20]。低温胁迫下，膜的结构遭到破坏，电导率会随着细胞内各种水溶性物质包括电解质在内的外渗程度的增加而增大，是判断植物受低温伤害的程度和抗寒能力的重要指标[13]。膜质过氧化产生的丙二醛常用于评价细胞膜系统受伤害的程度[21]。本研究结果显示：鹅掌楸4个种源的相对电导率和丙二醛的季节变化一致，冬季的含量高于秋季，表明随着温度降低，植物受到低温胁迫后受到伤害的程度加剧。安徽大别山种源的丙二醛季节变化的相对增幅较小，体现出植物细胞受损程度较低，具有较强的抗寒性。云南勐腊种源的相对电导率的增幅最大，表明细胞受到低温胁迫后损伤程度较高，抗寒性较低。脯氨酸参与到许多环境胁迫的响应当中，是最有效的有机渗透物质之一，在抵抗低温胁迫时可以起到平衡细胞代谢的作用，其含量的增加有利于提高植物抗寒性[22]。本研究中，冬季的安徽大别山种源的脯氨酸质量分数在4个种源中最高，并且脯氨酸质量分数的相对增幅最大，可能在该种源的植株抵抗低温时较好地发挥平衡细胞代谢作用，从而提高该种源的抗寒性。冬季时，虽然云南勐腊种源脯氨酸的相对增幅较高，但其脯氨酸的质量分数在4个种源间最低，可能在平衡细胞代谢方面的作用效果较差，导致该种源表现出较低的抗寒性。低温胁迫下，植物中可溶性蛋白和可溶性糖的增加均有利于提高其抗寒性，可溶性蛋白可以提高细胞液浓度，通过降低渗透势来保持水压，可溶性糖能够提高原生质活性，增强细胞液流动性[13, 23]。本研究中的可溶性蛋白和可溶性糖质量分数在冬季高于秋季，显示出植物在低温胁迫下，都具备提高自身渗透调节的能力。但每个种源的可溶性蛋白和可溶性糖相对增幅不同，说明不同种源鹅掌楸对低温的调节和敏感程度有所差异。冬季叶芽中，安徽大别山种源的可溶性蛋白质量分数和相对增幅在4个种源中均排名第2，可溶性糖质量分数在4个种源中最高，并且相对增幅最大，可能是该种源抗寒性强的原因之一。冬季，云南勐腊种源的可溶性蛋白质量分数最低，季节间的相对增幅也最小，可能导致该种源的抗寒性较低。
SOD是植物体内清除活性氧的最为重要关键抗氧化酶[24]。本研究中，冬季气温较低，4个种源中，安徽大别山种源的SOD活性最高，同时相对增幅也最高，可能会在最大程度上减缓该种源受到低温伤害的程度，增强该种源植株的抗寒性；云南勐腊种源的SOD活性在4个种源中排列第3位，但是SOD活性的相对增幅最小，可能导致该种源的植株对低温伤寒的防御能力较差，从而降低该种源的抗寒性。鹅掌楸在基因水平上的抗寒机制如何？不同种源的鹅掌楸是否存在差异表达的抗寒相关基因？相关的问题在另一篇文章中通过转录组测序对其进行研究。今后，在具体评定鹅掌楸种源抗寒性时，还应进一步开展人工低温胁迫实验，为全面评价其抗寒能力提供可靠的依据。
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