Volume 37 Issue 2
Apr.  2020
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YE Wen, YUAN Chaoqun, QIN Wei, WANG Zhentao, ZHU Yuqiu. Optimization of regeneration system of stem segments of Nandina domestica 'Firepower' in vitro culture[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2020, 37(2): 391-396. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2020.02.026
Citation: YE Wen, YUAN Chaoqun, QIN Wei, WANG Zhentao, ZHU Yuqiu. Optimization of regeneration system of stem segments of Nandina domestica 'Firepower' in vitro culture[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2020, 37(2): 391-396. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2020.02.026

Optimization of regeneration system of stem segments of Nandina domestica 'Firepower' in vitro culture

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2020.02.026
  • Received Date: 2019-04-16
  • Rev Recd Date: 2019-06-11
  • Publish Date: 2020-04-20
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Optimization of regeneration system of stem segments of Nandina domestica 'Firepower' in vitro culture

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2020.02.026

Abstract:   Objective  To realize the large-scale production of Nandina domestica 'Firepower', this research is focused on the optimization of the regeneration system of the stem segments of 'Firepower' in vitro.  Method  With stem segments of 'Firepower' as the explant, a study is conducted of the key factors such as the basic medium, 6-BA and NAA concentration, sugar concentration and pH that affect the adventitious bud induction, proliferation and rooting.  Result  (1) The ideal medium for adventitious bud induction was WPM+0.50 mg·L-1 6-BA+0.10 mg·L-1 NAA, with an induction rate of adventitious bud of 93.8%, and a robust growth rate; (2) The medium for adventitious bud multiplication was WPM+0.75 mg·L-1 6-BA+0.10 mg·L-1 NAA, with a proliferation cofficient of 3.3 and favorable growth of the new bud; (3) The rooting medium was 1/2 WPM+0.50 mg·L-1 NAA + white sugar 30.0 g·L-1(pH 6.0), with a rooting rate of 95.0%.  Conclusion  The regeneration system of the stem segments of 'Firepower' in vitrothat has been optimized in the current study will provide reliable technical support for large-scale production of 'Firepower'.

YE Wen, YUAN Chaoqun, QIN Wei, WANG Zhentao, ZHU Yuqiu. Optimization of regeneration system of stem segments of Nandina domestica 'Firepower' in vitro culture[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2020, 37(2): 391-396. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2020.02.026
Citation: YE Wen, YUAN Chaoqun, QIN Wei, WANG Zhentao, ZHU Yuqiu. Optimization of regeneration system of stem segments of Nandina domestica 'Firepower' in vitro culture[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2020, 37(2): 391-396. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2020.02.026
  • 火焰南天竹Nandina domestica ‘Firepower’为园艺新品种,植株矮小、株型紧凑,茎节短,只有南天竹N. domestica的1/10,叶片呈卵形或者椭圆形,和南天竹披针形叶存在着明显的区别[1-4]。当气温下降到5 ℃以下且昼夜温差超过10 ℃时,叶片呈火红色,经霜不落,春夏季呈淡绿色,极具观赏价值与经济价值,市场需求量大[1-2]。常采用扦插繁殖,繁殖周期较长,繁殖率极低,并且扦插容易感染病毒,造成品质退化。已有报道利用组织培养技术解决火焰南天竹繁殖数量少、繁殖速度慢、种质易退化等缺点[3-10],虽然能够通过愈伤组织、茎尖和叶片等作为外植体获得不定芽,但增殖系数相对较低[6, 11]。有些虽然能够大规模生产,培养基配方中使用蔗糖[12],成本较高,距规模化、产业化生产还有一定的差距。鉴于此,本研究以火焰南天竹不带叶茎段为外植体,进行离体快繁影响关键因子优化,建立适合大规模生产的火焰南天竹茎段离体快速繁殖技术体系,旨在为火焰南天竹种苗高效、快捷和稳定生产提供技术和理论基础。

  • 火焰南天竹由嘉兴中瑞生物科技有限公司提供。选择生长健壮、无病虫害的火焰南天竹优良单株的嫩枝条为外植体。

  • 以1/2MS、WPM、DCR、B5为基本培养基,分别添加6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.50 mg·L-1,萘乙酸(NAA)0.20 mg·L-1,蔗糖30.0 g·L-1,卡拉胶7.0 g·L-1(pH 5.8),进行芽生长基本培养基筛选。选取长0.5~1.0 cm带节茎段,保持极性,接种于不同筛选培养基上,接种茎段10个·瓶-1,每种培养基接种10瓶,于1 500~3 000 lx光照,(25±2)℃培养40 d后,观察和统计芽诱导、增殖和生长情况。

  • 选取1.2.1筛选的理想基本培养基,添加不同质量浓度6-BA(0、0.25、0.50、0.75、1.00 mg·L-1)和NAA(0.10、0.50 mg·L-1)组成10种不同配方培养基,以初代培养获得无菌芽苗为试材,剪取带节的茎段,接种在培养基上,接种茎段10个·瓶-1,培养条件同1.2.1。培养40 d后,统计芽诱导、增殖情况。

  • ① 生根基本培养基的筛选。选取约3 cm高的无菌芽苗,分别接种在添加0.25 mg·L-1 IBA + 0.25 mg·L-1 NAA+30.0 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉胶(pH 5.8)的1/2MS和1/2WPM基本培养基上。接种芽苗10株·瓶-1,每种培养基接10瓶。②生根最佳NAA质量浓度的筛选。选取约3 cm高的芽苗分别接种在添加不同质量浓度(0.10、0.30、0.50 mg·L-1)NAA,30.0 g·L-1蔗糖,7.0 g·L-1卡拉胶(pH 5.8)的生根理想基本培养基上,接种芽苗10株·瓶-1,每种培养基接10瓶。③生根白砂糖质量浓度的筛选。蔗糖是组织培养中最好的碳源,但种苗规模化生产过程中,降低成本是很有必要的,为此研究白砂糖不同质量浓度对火焰南天竹生根的影响。选取约3 cm高的芽苗,分别接种于20.0、30.0、40.0 g·L-1白砂糖的生根培养基(pH 5.8)上,以30.0 g·L-1蔗糖为对照。接种芽苗10株·瓶-1,每种培养基接10瓶。④试管苗生长的最佳pH值筛选。将约3 cm高的芽苗分别接种于不同pH值(5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4、8.8、9.2)的生根培养基上,接种芽苗10株·瓶-1,每种培养基接10瓶。以上筛选试验培养条件同1.2.1,培养30 d后,统计生根率。

  • 将0.5~1.0 cm长带节火焰南天竹茎段接种在前期筛选的芽诱导、增殖和生根的最佳培养基上,接种后分别暗培养0、5、15 d后,于1 500~3 000 lx光照,时间12 h·d-1,(25±2)℃下进行芽诱导、芽增殖、生根培养等试验,每处理接种10瓶,外植体10个·瓶-1,统计其生长情况,筛选出各培养阶段的合适条件。

  • 采用Excell和SPSS 17.0对所得数据进行统计分析和作图。芽诱导率、生根率和芽增殖系数计算公式如下:芽诱导率=出芽外植体数/接种数×100%;生根率=生根外植体数/接种数×100%;芽增殖系数=外植体诱导芽数/外植体接种数。

  • 表 1可知:基本培养基对火焰南天竹芽诱导有明显的影响。DCR对火焰南天竹的芽诱导效果最好,出芽率高达96.8%;其次是WPM和1/2MS,芽诱导率分别为90.2%和85.0%,而B5的芽诱导率只有43.2%。因此,选择DCR火焰南天竹茎段芽诱导较理想的基本培养基。培养40 d后,在WPM上,芽的增殖倍数和芽高分别为3.18和1.18 cm,植株生长健壮,叶色绿色,叶片舒展宽大;在DCR上芽增殖倍数为2.05,芽高0.95 cm,植株生长正常,叶色绿色,但叶小卷曲。而在1/2MS和B5培养基上,芽的增殖位数仅为1.52和1.06。4种基本培养基无机盐质量浓度从高到低依次为B5、1/2MS、DCR、WPM,因此,可以推断低质量浓度无机盐有利于火焰南天竹芽诱导、繁殖和生长。因此,综合芽诱导、增殖和植株生长情况等,选择WPM为本试验的理想基本培养基。

    基本培养基 芽诱导率/% 芽增殖倍数 芽高/cm 生长情况
    1/2MS 85.0 ± 1.2 b 1.52 ± 0.04 b 0.76 ± 0.10 b 生长势弱,叶色绿色,叶小而少
    WPM 90.2 ± 1.2 a 3.18 ± 0.17 a 1.15 ± 0.09 a 植株健壮,叶色绿色,叶片舒展宽大
    DCR 96.8 ± 2.3 a 2.05 ± 0.34 a 0.95 ± 0.06 a 生长正常,叶色绿色,叶小卷曲
    B5 43.2 ± 2.4 b 1.06 ± 0.16 b 0.63 ± 0.03 b 生长势弱,叶色发黄,叶小而少
    说明:不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)

    Table 1.  Effect of basic media on rooting of N. domestica'Firepower

  • 图 1可见:6-BA和NAA的质量浓度对芽的诱导和增殖影响差异极显著(P=0.000 1)。当NAA质量浓度一定时,随着6-BA质量浓度的增加,火焰南天竹的出芽率及芽的增殖倍数呈上升趋势,当6-BA达1.00 mg·L-1时,出芽率及芽的增殖倍数达最高值,但芽生长缓慢,叶小,叶片皱褶卷曲,新生幼叶脆弱,易玻璃化,不利于芽苗的生长。综合分析表明:芽诱导理想培养基为WPM+ 0.50 mg·L-1 6-BA + 0.10 mg·L-1 NAA,芽诱导率高达93.0%;芽增殖的理想培养基为WPM + 0.75 mg·L-1 6-BA + 0.10 mg·L-1 NAA,芽增殖倍数为3.3,新芽生长良好,叶片舒展宽大,叶色鲜绿(图 2A)。方差分析可知:6-BA和NAA两者互作的差异不显著(P=0.998 1)。

    Figure 1.  Effects of different media combinations on adventitious bud induction rate and bud proliferation times of N. domestica'Firepower'

    Figure 2.  Adventitious bud induction, proliferation and rooting culture of N. domestica 'Firepower'

  • 表 2可见:基本培养基对火焰南天竹试管苗生根有一定的影响,火焰南天竹在WPM上的生根优于1/2MS培养基,在WPM上的生根率、平均根数分别是1/2MS的3.1和2.6倍,且试管苗生长良好,叶片舒展、鲜绿色。因此,低质量浓度无机盐的WPM培养基有利于试管苗生根和生长。

    培养基类型 生根率/% 生根数/根 根长/cm 生长情况
    1/2WPM 78.0 ± 3.4 4.2 ± 0.2 1.15 ± 0.04 生长良好,叶色鲜绿,叶片大而舒展
    1/2MS 25.0 ± 4.0 1.6 ± 0.0 0.27 ± 0.04 生长缓慢,叶色黄绿,植株矮小

    Table 2.  Effect of basic media on rooting of N. domestica'Firepower

  • 表 3可知:NAA质量浓度对火焰南天竹芽苗生根影响明显,随着NAA质量浓度的增加,试管苗的生根率、平均生根数有明显增加,但对根长的生长影响不明显。当NAA质量浓度达0.50 mg·L-1时,试管苗生根率高达91.0%,平均根数为5.4根,试管苗生长正常。

    NAA/(mg·L-1 生根率/% 根数/(根·株-1 根长/cm 生长情况
    0.10 67.0 ± 2.9 b 2.6 ± 0.5 b 1.00 ± 0.23 a 生长缓慢,植株矮小
    0.30 74.0 ± 3.0 b 4.2 ± 1.2 a 1.07 ± 0.20 b 生长正常
    0.50 91.0 ± 9.9 a 5.4 ± 0.5 a 0.99 ± 0.17 a 生长正常
    说明:不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)

    Table 3.  Effect of NAA on rooting of N. domestica'Firepower'

  • 表 4可知:添加白砂糖30.0 mg·L-1的培养基中火焰南天竹的生根率可达90.4%,平均根数达5.1且植株正常,生长较好,叶片绿色(图 2B2C),与添加蔗糖30.0 mg·L-1的培养基中的生根差异不显著。综合成本和生根情况考虑,大规模种苗生产过程中,可用相同质量浓度的白砂糖替代蔗糖作为碳源。

    种类 质量浓度/(g·L-1 生根率/% 根数/(根·株-1 根长/cm 生长情况
    白砂糖 20 50.8 ± 3.2 c 1.7 ± 0.2 c 0.66 ± 0.14 b 植株较矮小,叶色绿色
    白砂糖 30 90.4 ± 1.9 a 5.1 ± 0.2 a 1.00 ± 0.14 a 生长较好,植株正常,叶色绿色
    白砂糖 40 81.6 ± 3.3 b 4.6 ± 0.1 b 0.79 ± 0.02 ab 植株矮小,叶色黄绿
    蔗糖(ck) 30 92.2 ± 2.6 a 5.4 ± 0.2 a 1.09 ± 0.12 a 生长健壮,植株正常,叶色鲜绿
    说明:不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)

    Table 4.  Effect of sugar on rooting of N. domestica'Firepower'

  • 表 5可见:pH为6.0时,生根率达95.0%,平均生根数和根长分别为6.1根和1.07 cm,好于其他pH的生根情况。当pH≥6.2时,火焰南天竹生根的各项指标明显下降,致使植株瘦弱,生长缓慢甚至停止生长。因此,火焰南天竹生根培养基的最佳pH为6.0。

    pH 生根率/% 根数/根 根长/cm 生长情况
    5.8 90.0 ± 1.7 a 5.7 ± 1.4 a 0.87 ± 0.29 a 生长正常
    6.0 95.0 ± 1.6 a 6.1 ± 0.8 a 1.07 ± 0.18 a 生长较好
    6.2 79.0 ± 4.4 ab 4.0 ± 0.8 ab 1.03 ± 0.21 ab 生长正常
    6.4 74.0 ± 1.3 abc 4.0 ± 0.8 ab 0.93 ± 0.21 abc 生长缓慢
    6.6 75.0 ± 1.8 ab 3.9 ± 1.1 ab 1.00 ± 0.13 ab 生长缓慢
    6.8 72.0 ± 1.4 abc 3.6 ± 1.1 abc 0.87 ± 0.21 abc 生长缓慢
    7.2 77.0 ± 2.7 abc 4.2 ± 1.3 ab 0.88 ± 0.16 abc 生长缓慢
    7.6 76.0 ± 2.8 abc 3.6 ± 1.1 abc 0.83 ± 0.17 abc 生长缓慢
    8.0 74.0 ± 1.5 abc 3.4 ± 1.0 abc 0.72 ± 0.11 abc 生长缓慢
    8.4 73.0 ± 1.3 abc 3.0 ± 0.8 bc 0.67 ± 0.10 bc 生长缓慢, 植株瘦弱
    8.8 60.0 ± 2.7 bc 1.7 ± 1.1 bc 0.63 ± 0.07 bc 停止生长, 植株瘦弱
    9.2 57.0 ± 1.3 c 1.3 ± 1.1 c 0.55 ± 0.07 c 停止生长, 植株瘦弱
    说明:不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)

    Table 5.  Effect of pH value on rooting of N. domestica 'Firepower'

  • 在火焰南天竹的组培过程中器官的形成所需培养条件不同,接种后暗培养5 d后转为光照培养有利于芽的诱导和增殖;生根培养条件为接种后在光强1 500~3 000 lx,光照时间12 h·d-1,温度为(25 ± 2)℃条件下培养(表 6)。

    芽诱导
    暗培养/d 芽诱导率/% 生长情况
    0 91.0 ± 0.9 a 生长健壮,叶绿色
    5 91.7 ± 2.8 a 生长健壮,叶绿色
    15 77.7 ± 4.6 b 生长细弱,叶黄绿色
    0 3.4 ± 0.2 a 生长正常
    5 3.5 ± 0.2 a 生长正常
    15 2.3 ± 0.2 b 生长细弱
    0 94.8 ± 2.0 a 3~7根,粗壮
    5 92.8 ± 1.9 a 3~7根,粗壮
    15 72.2 ± 2.0 b 1~5根,较细
    说明:不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)

    Table 6.  Effect of culture conditions on rooting of N. domestica'Firepower'

  • 节间较短,枝条细弱,株形矮小,枝条数量有限,这些制约了火焰南天竹的分株和扦插繁殖,使火焰南天竹不能满足市场的需求[11-12]。为了扩大火焰南天竹的繁殖率,近年来植物组织培养技术已应用于火焰南天竹的繁殖,一定程度打破火焰南天竹自然繁殖力低的限制,加快繁育速度,但在生长过程中发现基因型和环境条件仍然制约着火焰南天竹扩繁。本研究对影响火焰南天竹组织培养再生体系的关键因子进行了优化。糖是植物组织培养中提供培养物所需要的碳骨架和能源,是维持培养基稳定的渗透压不可缺少的碳源物质。本研究发现:30.0 mg·L-1白砂糖和蔗糖分别作为碳源的培养效果差异不显著,因此考虑到成本问题,规模化生产火焰南天竹时可用白砂糖代替蔗糖。火焰南天竹试管苗生根培养基适宜的pH为5.8~6.0,尤以pH为6.0时生长良好,与李慧[8]研究结果基本一致,同邓玉营等[9]的研究结果稍有出入,可能是由于所用火焰南天竹的基因型不一致所导致。

    本研究以火焰南天竹茎段为材料,优化了火焰南天竹的组织培养再生体系的影响因素,优化的体系为:不定芽诱导理想培养基为WPM + 0.50 mg·L-1 6-BA + 0.10 mg·L-1 NAA,不定芽增殖培养基为WPM + 0.75 mg·L-1 6-BA + 0.10 mg·L-1 NAA,生根培养基为1/2WPM + 0.50 mg·L-1 NAA+白砂糖30.0 g·L-1,pH 6.0。

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