Differences in free amino acids during post-ripening process of Torreya grandis ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds

种实采集于浙江省湖州市安吉县上墅乡刘家塘村(30°38′N，119°41′E)，选取突破种鳞后525 d的‘细榧’ 和‘象牙榧’种实。样品采摘后于4 h内运回实验室，人工去除假种皮后清洗干净，放置一晚去除田间热。选取大小、颜色、形状一致的香榧种实，将其分为3个生物学重复，每个重复20 kg，置于温度25 ℃和湿度90%的室内进行后熟处理。每天进行1次翻堆，保证种实处于均匀的后熟环境。分别于后熟的第0、5、10、15和20天进行采样，人工去除香榧种壳，并将2个品种香榧种仁切碎分装于50 mL离心管，立即置于液氮中冷却速冻，放置于−80 ℃冰箱中保存，用于后续研究。

茚三酮、乙酸、乙酸钠、盐酸、氢氧化钠、乙醇等分析纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司，柠檬酸、柠檬酸钠等优级纯试剂购自日本和光公司，氨基酸混标购自Sigma公司。L-8900全自动氨基酸分析仪购自日本日立公司，天平为波兰RADWAG-AS 220.R2专业分析天平。

准确吸取Type B、Type AN-Ⅱ氨基酸混标(日本和光)各0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于25 mL容量瓶中，用0.02 mol·L⁻¹盐酸溶液定容，4 ℃冷藏保存。取配制好的17种氨基酸混标，进样20 µL，以氨基酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

取5 g液氮研磨好的香榧种实粉末鲜样，溶于10 mL去离子水，混匀成匀浆。再将该匀浆移至100 mL的容量瓶中，并添加60 mL的去离子水，摇匀后沸水浴1 h，期间每15 min涡旋1次。待冷却到室温后，定容到100 mL。从中取5 mL的定容液置于15 mL的离心管中，再加入等体积质量浓度为10%的磺酸水杨酸溶液混匀后，在4 ℃、10 000 r·min⁻¹的条件下离心15 min。离心后用注射器吸取上清液，取上清液过0.22 μm水膜，待测。采用L-8900全自动氨基酸分析仪测定香榧种实游离氨基酸。

色谱柱为Na⁺型阳离子交换柱；离子交换树脂2622，检测器为紫外可见光检测器；显色剂为茚三酮；缓冲液系统为柠檬酸钠缓冲液B1 (pH 3.2)，B2 (pH 3.0)，B3 (pH 4.0)，B4 (pH 4.9)；缓冲液流速为0.40 mL·min⁻¹，茚三酮流速为0.35 mL·min⁻¹；柱温为57 ℃，室温为135 ℃。进样体积为20 μL。用外标法测定样品溶液中的游离氨基酸，其中脯氨酸检测波长为440 nm，其他氨基酸检测波长为570 nm。

数据通过Excel进行计算并绘图，方差分析采用SPSS 26.0。对数据进行标准化处理，进一步计算特征值和特征向量，基于累积方差贡献率进行主成分分析(PCA)；数据分析过程在Origin 2022平台完成，采用内置的PCA分析模块进行处理，并绘制相应的得分图(Score Plot)，以直观展示各类氨基酸在主成分空间中的分布特征及其相互关系。

以17种游离氨基酸为对照，分别检测后熟过程中‘细榧’和‘象牙榧’种实的氨基酸组分。如图1所示：在‘细榧’和‘象牙榧’种实中氨基酸种类无差异，均检测到了包含天冬氨酸、苏氨酸等14种蛋白质氨基酸以及γ-氨基丁酸，但组氨酸和精氨酸未检出(表1和表2)。

Figure 1.  17 amino acid mixed standards (A), amino acid chromatograms of ‘Xi Fei’ (B) and ‘Xiangya Fei’ (C) on day 0 during post-ripening process

根据标准曲线计算得到每种氨基酸的质量分数，结果显示：2个品种种实在后熟过程中的总游离氨基酸质量分数均显著(P＜0.05)增加，‘细榧’种实的总游离氨基酸质量分数为673.11~1 102.36 µg·g⁻¹，‘象牙榧’种实为881.77~1 068.93 µg·g⁻¹(图2)。后熟过程开始后，‘细榧’和‘象牙榧’种实总非必需氨基酸质量分数显均呈现上升趋势，‘细榧’在第20天积累达到最多，而‘象牙榧’种实则在第15天达时达到最大值后下降(表1)。‘细榧’种实总必需氨基酸质量分数显著高于‘象牙榧’(P＜0.05，表2)，然而，‘细榧’种实总必需氨基酸占比(26.59%~32.76%)却小于‘象牙榧’的占比(27.77%~36.19%)。在这2个品种中，γ-氨基丁酸质量分数最高，其次是谷氨酸和酪氨酸。γ-氨基丁酸在后熟过程中显著积累，且在第20天‘细榧’种实中γ-氨基丁酸质量分数为‘象牙榧’的1.38倍。

Figure 2.  Total free amino acid content of ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process

甜味氨基酸包括脯氨酸、赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸；芳香味氨基酸包括酪氨酸和苯丙氨酸；鲜味氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；苦味氨基酸包括蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。在‘细榧’和‘象牙榧’种实中，总呈味氨基酸的质量分数从大到小排序为甜味氨基酸＞芳香族氨基酸＞鲜味氨基酸＞苦味氨基酸。鲜味氨基酸在‘象牙榧’种实中的占比高于‘细榧’，而芳香族氨基酸占比则相反，即在‘细榧’种实中的占比高于‘象牙榧’(图3A)。PCA结果(图3B)显示：鲜味、甜味、苦味和芳香族氨基酸在这2个品种中显示出明显的分离，且‘细榧’种实具有较高的芳香族氨基酸，而‘象牙榧’种实具有较高的鲜味氨基酸和甜味氨基酸。

Figure 3.  Flavor amino acid content (A) and PCA of flavor amino acids (B) in ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process

在后熟过程中，‘细榧’种实的总甜味氨基酸质量分数无显著变化，在第20天时最高，为235.53 µg·g⁻¹；‘象牙榧’种实的总甜味氨基酸逐渐积累，在第15天时达到最大值，为250.89 µg·g⁻¹(图4A)。在‘象牙榧’种实中，赖氨酸的质量分数最高，在‘细榧’中，赖氨酸逐渐积累且在第15天达到最高。PCA结果(图4B)显示：2个品种种实的甜味氨基酸在第0天差异明显，其中丝氨酸在‘象牙榧’中的贡献较大。随着后熟时间的推移，2个品种的甜味氨基酸质量分数差异不明显。

Figure 4.  Sweet amino acid content (A) and PCA of sweet amino acids (B) in ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process

如图5A所示：后熟第0天时，‘细榧’种实的芳香族氨基酸质量分数低于‘象牙榧’。在后熟过程中，2个品种种实的芳香族氨基酸质量分数均呈上升趋势，但‘象牙榧’到第10天后趋于稳定，不再增加，而‘细榧’仍不断增加，在第15天达到最大值，且高于‘象牙榧’。‘细榧’种实的芳香族氨基酸质量分数介于110.67~231.40 µg·g⁻¹，‘象牙榧’则介于156.60~189.77 µg·g⁻¹。苯丙氨酸和酪氨酸是构成香榧芳香族氨基酸的重要成分，其中酪氨酸在后熟过程中质量分数增加更为显著，这2种氨基酸都对‘细榧’种实后熟过程中芳香味的形成有较大贡献(图5B)。

Figure 5.  Aromatic amino acid content (A) and PCA of aromatic amino acids (B) in ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process

在后熟过程中，2个品种种实总鲜味氨基酸质量分数的变化趋势与芳香族氨基酸相似，均呈上升的趋势。然而，‘象牙榧’种实的鲜味氨基酸质量分数在整个后熟期间始终高于‘细榧’，特别是在后熟的第20天时，‘象牙榧’种实的鲜味氨基酸质量分数比‘细榧’高79.86 µg·g⁻¹(图6A)。谷氨酸和天冬氨酸是构成香榧鲜味氨基酸的关键成分，均在后熟过程中逐渐积累。相比而言，‘细榧’种实的谷氨酸变化较小，这说明天冬氨酸可能是影响‘细榧’鲜味变化的主要因素。而在‘象牙榧’种实中，天冬氨酸和谷氨酸的质量分数则相对接近。PCA结果(图6B)进一步显示：谷氨酸和天冬氨酸均对‘象牙榧’种实在后熟过程中的鲜味有着较大的贡献。

Figure 6.  Umami amino acid content (A) and PCA of umami amino acid (B) in ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process

如图7A所示：‘细榧’和‘象牙榧’的苦味氨基酸质量分数接近，在后熟过程中的变化趋势也相似，均在后熟第10天达到最高值，后逐渐降低。亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸占‘细榧’和‘象牙榧’苦味氨基酸的90%。2个品种在PCA分析(图7B)中呈现一定的分离，说明2个品种在后熟过程中苦味氨基酸组成的变化模式存在差异，其中亮氨酸和蛋氨酸对‘象牙榧’种实苦味贡献较大。

Figure 7.  Bitter amino acid content (A) and PCA of bitter amino acids (B) in ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process

近年来，香榧坚果因其高营养价值和独特风味，深受消费者青睐^[19]。本研究发现：香榧种实中总游离氨基酸质量分数为673.11~1102.36 µg·g⁻¹，均值为991.06 µg·g⁻¹，低于核桃，但高于山核桃Carya cathayensis和巴西松子Araucaria angustifolia ^[12]。香榧中的氨基酸组成与联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(FAO/WHO)推荐的理想模式非常接近，易被人体吸收利用^[2]。本研究检测到15种游离氨基酸，与ZHANG等^[10]的研究相比，相差2种，可能是由于香榧品种及产地的不同，造成氨基酸组成成分和质量分数的差异。

在后熟过程中，2个品种种实的游离氨基酸质量分数均显著提高，‘细榧’种实的整体游离氨基酸质量分数高于‘象牙榧’。其中，质量分数较高的氨基酸从高到低依次为γ-氨基丁酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。这些氨基酸不仅对香榧的营养价值有重要贡献，还通过参与美拉德反应等化学反应，生成多种风味化合物^[20]，能显著提升香榧的风味品质。已有研究表明：天冬氨酸能改善心肌收缩功能、促进能量代谢、保护线粒体功能以及降低缺血性心脏病风险^[21−22]。谷氨酸作为中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质^[23]，参与神经信号传递，调节学习和记忆功能^[24]。酪氨酸作为芳香族氨基酸，与降低血压相关，尤其是在高血压患者中，其水平与心血管健康指标之间存在关联^[25]。质量分数最高的γ-氨基丁酸能通过调节自主神经系统^[26]，降低血压^[27]。这说明后熟过程不仅能提升香榧的氨基酸质量分数，还能优化其营养成分。

氨基酸的多样性和组成差异是香榧独特口感的重要基础^[28]。呈味氨基酸在食物的风味调节中发挥重要作用，它们赋予食品甜味、鲜味和苦味等多种风味特征，显著影响食品的整体风味和决定食品的可接受性^[29]。在种实后熟过程中香榧的游离氨基酸，特别是鲜味和芳香族氨基酸的积累，显著提升了香榧的风味品质。本研究发现：香榧中各类呈味氨基酸的质量分数从高到低排序为：甜味＞芳香族＞鲜味＞苦味。‘细榧’种实中γ-氨基丁酸与酪氨酸质量分数较高，芳香风味更突出。有研究表明：在柑橘Citrus中，酪氨酸和苯丙氨酸也是重要的芳香味氨基酸，是柑橘风味多样性的重要来源^[30]。酪氨酸和苯丙氨酸会通过参与挥发性化合物的合成，影响果实的香气特征^[31]。‘象牙榧’种实因天冬氨酸与谷氨酸质量分数高，鲜味更足。谷氨酸具有明显的鲜味，是发酵食物和调味品中最丰富的氨基酸，也是其中最重要的风味成分物质^[32]，间接影响蔬菜的风味形成^[33]。番茄Solanum lycopersicum中的谷氨酸和天冬氨酸为它提供了特有的鲜味，其含量随着果实成熟逐渐增加，有助于番茄果实风味的形成^[34]。综上，后熟过程使香榧种实具有了不同于其他坚果的独特呈味。

本研究结果显示：香榧不同品种种实的氨基酸组成和质量分数存在较大差异，在香榧种实的后熟过程中，游离氨基酸质量分数逐渐增加，‘细榧’和‘象牙榧’种实氨基酸差异主要体现在芳香族氨基酸和鲜味氨基酸上。未来可进一步优化检测方法，深入研究不同香榧品种种实游离氨基酸差异的形成机制，并结合转录组分析不同香榧品种后熟过程中氨基酸合成代谢机制。