The improvement effect and mechanism of conservation tillage measures on soil structure in wine vineyards

研究区位于宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄产区青铜峡子产区的塞上江南酒庄(105°87′01″~105°87′33″E, 38°07′45″~38°07′49″N)。该地土质以灰钙土为主，属于中温带干旱大陆性气候。降雨稀少，冬季寒冷时日长，持续5~6个月，而夏季炎热时日短只有2~3个月，温差大，日照充足，无霜期短。该区域海拔为1 126.0~1 300.0 m，年平均气温为9.2 ℃，年平均日照时数为2 892.2 h，年平均降水量约为181.7 mm，年平均无霜期为127.0~164.0 d。

本研究以酿酒葡萄品种‘赤霞珠’‘Cabernet Sauvignon’为试验材料，并设置4个处理：以清耕(ck)为对照，设置自然生草(NT)、枝条覆盖(CTS)和自然生草+枝条覆盖(NTS)，每个处理3次重复。每个试验小区面积为12 m×7 m，种植12株葡萄，12个小区共计种植葡萄144株，边缘设置保护行。统一田间管理，所有处理灌溉、修剪和病虫害防治措施一致。本试验于2023年4月开始至2023年10月。2023年4月前对试验地进行出土和清耕处理，清除所有植物残留物，之后对不同小区施行各自的处理。清耕：在生长季中当行间草生长高度到达10 cm左右时进行清除，每2周进行1次。自然生草：在生长季中不清耕，保持行间自然草的高度为15~20 cm，过长时进行刈割，并将刈割后的草覆盖在土壤表面。枝条覆盖：收集酿酒葡萄冬季修剪后的枝条，并于3月进行粉碎，将粉碎后的枝条覆盖于葡萄定植带，覆盖厚度为5 cm。

在2023年葡萄开花期(5月)、果实膨大期(7月)、果实成熟期(9月)，以五点采样法采集葡萄园内各小区0~20 cm土层的土壤。剔除土壤中的石块、植物及其根系，将样品放入硬质塑料盒和无菌自封袋内，利用冰袋降温并保存后运回实验室。土壤样品分为3个部分：①将用于土壤理化性质测定的样品保存于4 ℃冰箱。②将土壤样品风干，沿土壤结构的自然缝隙轻轻剥开成直径为5 mm左右的小土块，并除去作物根系和小石块等杂质，将土样摊平，置于通风透气处自然风干，用于土壤团聚体相关指标的测定。③将用于测定各粒级土壤微生物群落的土样用干筛法进行分级后，保存在−80 ℃冰箱中。

土壤理化性质参照文献[24]测定。土壤pH和电导率采用超纯水浸提，水土比(质量比)为2.5∶1.0，浸泡20 min后，玻璃电极法测量；土壤速效钾(AK)采用乙酸铵浸提-火焰光度计法测定；土壤有效磷(AP)采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测定；土壤碱解氮(AN)采用碱解扩散法测定；土壤全磷(TP)采用钼锑抗比色法测定^[25]；土壤全氮(TN)采用凯氏定氮法测定；土壤有机质(SOM)采用重铬酸钾外加热法测定。

参考ELLIOTT^[26]的湿筛法，将土壤团聚体分为4个粒级：＞2.000、＞0.250~2.000、＞0.053~0.250、≤0.053 mm，并采用平均质量直径(MWD)、平均几何直径(GMD)、＞0.250 mm团聚体百分比(R_0.25)来评价土壤团聚体稳定性。计算方法参照文献[27]。

土壤DNA采用试剂盒(OMEGA Soil DNA Kit，目录号D5625-01)提取，提取步骤按试剂盒说明书进行。用质量分数为0.8%琼脂糖凝胶电泳进行分子大小判断，利用紫外分光光度计对 DNA进行定量。使用16S rDNA V3-V4区特异性引物，338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)，806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；使用ITS rDNA特异性引物，上游ITS5F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAAGG-3′)，下游引物ITS1R(5′-GCTGCGTTCTT CATCGATGC-3′)对真菌进行PCR扩增。扩增结果用质量分数为2.0%琼脂糖凝胶电泳确认，切取目的片段后用Axygen凝胶回收试剂盒回收目的片段。在上海派森诺生物科技股份有限公司的协助下，对Illumina MiSeq进行双端(Paired-end)测序，并进行生物信息学分析和可视化分析。采用非量度多维尺度分析(NMDS)描述土壤微生物的β多样性。NMDS分析是通过对样本距离矩阵作降维分解，简化数据结构，从而在特定距离尺度下描述样本的分布特征。与PCoA分析不同，NMDS分析不依赖于特征根和特征向量的计算，而是通过对样本距离进行等级排序，使样本在低维空间中的排序尽可能符合彼此之间的相似距离的远近关系(而非确切的距离数值)，使用NMDS的应力值(S)对NMDS的结果进行评估。NMDS应力值越小越好，一般认为当该值小于0.2时，NMDS分析的结果较可靠^[28]。

使用Excel 2019软件，对数据进行整理与统计分析。使用SPSS 26的单因素方差分析(one-way ANOVA)对所需数据进行整理及对比分析，运用Origin 2021软件绘制相应的统计图表。采用NMDS描述样本的分布特征。采用Spearman相关性分析研究不同土壤环境与微生物的关系。

保护性耕作措施对酿酒葡萄园中葡萄不同生育期土壤pH、土壤电导率，以及土壤养分质量分数的影响如表1所示。由表1可知：NT、CTS、NTS处理能提高土壤的全效养分和速效养分，并降低碱性土壤的pH，使其向中性转变。土壤pH随时间的延长而增加，但是整体来说保护性耕作措施均可以降低土壤pH。在7和9月，只有NT处理显著降低了土壤pH，而在5月，NT、CTS、NTS处理均显著降低了土壤的pH (P＜0.05)；在9月，与ck相比，NT、CTS、NTS处理的pH分别降低了9.36%、5.75%、6.65%。在5和7月，NTS显著增加了土壤电导率，而在9月，NTS则显著降低了土壤电导率(P＜0.05)。保护性耕作措施增加了土壤中全效养分质量分数。在5月，与ck相比，NT、CTS、NTS处理均显著降低了土壤全磷质量分数(P＜0.05)，但是随着时间的推移，保护性耕作措施增加了土壤全磷的质量分数，特别是在9月，保护性耕作措施增加了土壤全磷质量分数，并且CTS和NTS处理显著增加。ck、CTS、NT处理下的全氮变化一致，均呈现先升高后平稳的趋势，NTS处理下的全氮质量分数则呈先不变后升高的趋势；9月，保护性耕作措施均使全氮质量分数显著高于ck (P＜0.05)。保护性耕作措施也提高了土壤速效养分的质量分数，特别是9月，NT、CTS、NTS处理显著提高了土壤速效磷质量分数(P＜0.05)。ck相比，NT、CTS、NTS处理使得9月的土壤速效磷质量分数分别增加了10.55%、123.59%、85.74%。保护性耕作措施能够增加土壤有机质的质量分数。在9月，NT、CTS、NTS处理土壤有机质质量分数分别比ck增加了34.71%、93.33%、68.73%。综上所述，保护性耕作措施能够显著增加土壤有机质质量分数，并降低碱性土壤的pH。

保护性耕作措施对不同生长时期酿酒葡萄园中土壤团聚体的影响如图1所示。土壤团聚体以＞0.250~2.000 mm的小团聚体为主。在5月，与ck相比，NT处理增加了＞0.250~2.000 mm和≤0.053 mm的土壤团聚体质量分数；CTS处理增加了＞2.000和＞0.250~2.000 mm的土壤团聚体质量分数；NTS降低了＞2.000和≤0.053 mm的土壤团聚体质量分数(P＜0.05)。在7月，NT处理降低了＞0.250~2.000和≤0.053 mm的土壤团聚体质量分数，CTS处理显著增加了＞0.250~2.000和≤0.053 mm的土壤团聚体质量分数(P＜0.05)。在9月，NT和NTS处理增加了＞0.250~2.000 mm的土壤团聚体质量分数，CTS处理增加了＞2.000和＞0.250~2.000 mm的土壤团聚体质量分数。整体而言，保护性耕作措施，特别是NT、CTS和NTS处理会增加土壤中＞0.250~2.000 mm的团聚体质量分数，使≤0.053 mm土壤团聚体质量分数降低。

Figure 1.  Composition of soil aggregates in different treatments at different stages

团聚体平均质量直径(MWD)、几何平均直径(GWD)和土壤中大于0.250 mm团聚体百分比(R_0.25)是评价土壤团聚体稳定性的重要指标，其数值越大土壤结构越稳定。5月，与ck相比，NT、CTS和NTS处理显著增加了几何平均直径和R_0.25(P＜0.05，表2)。7月，仅有CTS处理显著降低了平均质量直径(P＜0.05)，其他处理间差异不显著。9月，与ck相比，NT、CTS与NTS处理的平均质量直径、几何平均直径和R_0.25变化最显著，NT、CTS和NTS处理的平均质量直径分别提高了22.95%、36.07%、26.23%，几何平均直径分别提高了50.00%、38.24%、67.65%，R_0.25分别增加了26.46%、41.14%、31.33%。综上所述，NT、CTS和NTS处理增加了土壤团聚体平均质量直径、几何平均直径和R_0.25值，改善了土壤结构。

通过物种注释结果发现：在门水平上，ck、NT、CTS、NTS处理的细菌门类水平数分别为8.00、9.67、10.00、10.33。4个处理和4个团聚体粒级下土壤细菌门水平数量较多的均为放线菌门Actinobacteriota、变形菌门Proteobacteria、芽单胞菌门Gemmatimonadota，绝对丰度占各处理的总绝对丰度的比例为69.20%~78.56%。NT、CTS和NTS处理下＞2.000、＞0.250~2.000、＞0.053~0.250、≤0.053 mm土壤中变形菌门、芽单胞菌门的相对丰度显著高于ck处理下各粒级土壤的相对丰度(P＜0.05，图2)。与ck相比，NT、CTS和NTS处理不同粒级下放线菌门的相对丰度显著降低(P＜0.05)。在属水平上，ck、NT、CTS、NTS处理的真菌属水平数分别为75.00、90.33、97.67、85.00。各处理4个粒级下土壤真菌属水平数量最多的真菌属均为镰刀菌属Fusarium，绝对丰度占各处理的总绝对丰度的比例为10.32%~41.05%，ck和NT处理的优势菌群还有玫红假裸囊菌属Pseudogymnoascus，CTS和NTS处理的优势菌群还有光黑壳属Preussia。与ck相比，CTS和NTS处理显著增加了各粒级土壤光黑壳属Preussia的相对丰度(P＜0.05)，最大涨幅为583.35%，最小的为89.80%，NT、CTS和NTS处理还显著增加了各粒级中中枝孢菌属Cladosporium丰度(P＜0.05)，最大涨幅为436.92%，最小则为12.45%。从图2中还可以发现：＞0.250~2.000和＞0.053~0.250 mm土壤的微生物群落结构较为复杂，有益菌群(变形菌门、酸杆菌门Acidobacteriota的相对丰度较高。综上所述，NT、CTS和NTS处理显著改变了土壤微生物群落结构，增加了微生物群落的相对丰度。

Figure 2.  Microbial composition of soils of different aggregates under different treatments

细菌和真菌的α多样性分析结果如表3所示：通过观察不同处理下细菌的多样性情况，发现NT、CTS和NTS处理的土壤细菌Chao1和Shannon指数显著高于ck处理(P＜0.05)，分别高出9.68%~22.77%和1.72%~4.98%，并且NT和NTS处理下细菌的Simpson指数显著高于ck (P＜0.05)，表明NT、CTS和NTS处理后土壤细菌的丰富度、均匀度和多样性均有明显的增强。通过观察不同粒级下细菌的多样性情况，发现＞0.250~2.000 mm土壤团聚体中各指数最大，表明土壤细菌的丰富度和多样性受该团聚体的影响最大，与前文＞0.250~2.000 mm小团聚体质量分数最多相符。对于土壤真菌而言，与ck相比，NT处理显著增加了土壤中Chao1、Shannon和Simpson指数(P＜0.05)，CTS和NTS处理下的土壤真菌Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数无显著性差异，≤0.053 mm土壤团聚体中Chao1指数和Simpson指数最大，表明土壤真菌的丰富度和多样性受该团聚体的影响最大。

运用非量度多维尺度分析(NMDS)，可以很好地区分ck与NT、CTS和NTS处理之间土壤微生物的差异性。真菌和细菌NMDS的应力值(S)分别为0.122、0.144，均小于0.200，这表明NMDS图的拟合效果较好。由图3可知：NT、CTS和NTS处理与ck之间呈现明显的样品分离的情况，表明与ck相比，NT、CTS和NTS处理使得细菌和真菌群落结构发生了显著变化。图3中NT和NTS处理的样本分布较为集中，表明NT和NTS处理下不同粒径土壤团聚体的微生物群落结构较为相似；ck 和CTS处理的样本分布较为分散，则表明ck 和CTS处理下不同粒径土壤团聚体的微生物群落结构差异较大。通过观察不同粒级土壤的微生物发现：不同处理下＞2.000和≤0.053 mm的土壤样本在NMDS图中较为分散，表明这2个粒级土壤团聚体的微生物群落结构对不同处理方式的响应较为敏感。

Figure 3.  NMDS analysis of different aggregates of soil under different treatments

对土壤环境与微生物的相关关系进行Spearman相关性分析(图4)发现：不同处理下土壤理化指标和土壤微生物的相关性呈现出多样化特征。在ck处理下，pH与放线菌门、绿弯菌门、镰刀菌属、光黑壳属、假裸囊菌属呈极显著正相关(P＜0.001)，而与变形菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门呈极显著负相关(P＜0.001)；速效钾和速效磷与毛葡孢属和曲霉属呈极显著正相关(P＜0.001)。在NT处理下，速效钾和速效磷与镰刀菌属、曲霉属呈极显著正相关(P＜0.001)，与芽单胞菌门、酸杆菌门和毛葡孢属呈极显著负相关(P＜0.001)；全磷和有机质与放线菌门、绿弯菌门、光黑壳属呈极显著负相关(P＜0.001)，而与变形菌门呈极显著正相关。在CTS处理下，电导率、速效磷、碱解氮和有机质与放线菌门、绿弯菌门、镰刀菌属、假裸囊菌属、曲霉属、枝孢属呈极显著正相关(P＜0.001)，与变形菌门、拟杆菌门呈极显著负相关(P＜0.001)。NTS处理下，速效磷与有机质变形菌门、酸杆菌门呈极显著正相关(P＜0.001)，与镰刀菌属、毛葡孢属、假裸囊菌属、曲霉属、枝孢属呈极显著负相关(P＜0.001)，而pH与之相反。保护性耕作措施改变了土壤中微生物与理化性质之间的相关性关系，其中有机质与许多微生物都存在显著相关性。

Figure 4.  Spearman correlation analysis of soil physicochemical properties and soil microorganisms in wine vineyards under different treatments

土壤pH是影响土壤肥力的一个重要指标，过低或过高的pH会对葡萄生长产生威胁。NT、CTS和NTS处理等保护性耕作措施可以调节土壤pH至中性^[29]。本研究表明：NT、CTS和NTS处理在试验前期对土壤pH的影响不同，而在试验末期会不同程度地降低土壤pH，其中NT处理在试验全程中均使土壤pH呈现出降低趋势，并且效果最为显著。这可能是因为生草或者枝条等植物残体的加入，改善了土壤的通气性，并且植物残体的分解产生了较多的二氧化碳和有机酸，从而降低了土壤的pH^[30]。本研究还发现：酿酒葡萄园土壤pH呈现出一定程度的增加趋势，这与葡萄园土壤pH的季节变化有关，也有可能是夏季宁夏地区降水少，高温导致蒸发量增加，使得盐分在表层聚集进而导致土壤pH升高^[31]。本研究中出现的pH增加趋势是因为宁夏地区本试验年度的夏季降雨少，导致盐分在表层聚集而引起的pH升高。保护性耕作措施在前期降低程度不够明显，可能是因为处理的时间不够，未能充分改变土壤。这与前人的研究一致^[32−33]。本研究显示：对比ck，NT、CTS和NTS处理均提高了有效磷、碱解氮、全氮和全磷质量分数。有部分研究指出：生草能够有效增加土壤速效养分，但是对全效养分的影响很小^[34−35]。还有部分研究表明：草种不同对土壤养分的影响也不同^[36]，枝条覆盖可以显著提高土壤氮、磷、钾和有机质质量分数^[37−38]。生草和枝条覆盖通过降低土壤容重、增加土壤孔隙度和水稳性团聚体，改善土壤的物理性质。这些物理性质的改变会影响土壤中养分的保留和有效性，同时由于植物残体和根系分泌物的增多，改变了土壤的pH和电导率，改善了土壤矿质营养的配比。在生长季，土壤养分有所降低，这与自然生草前期杂草与树体竞争土壤养分，造成土壤养分消耗大于积累有关^[39]。有机质是土壤肥力和健康的重要指标，能够为植物的生长发育提供多种营养，对土壤耕作措施很敏感。本研究指出：与ck相比，NT、CTS和NTS处理显著增加了7和9月土壤中有机质质量分数。这种变化是多种因素共同作用的结果。首先，土壤没有经过耕作会减缓土壤有机质的氧化；其次，自然生草和枝条覆盖处理下动植物残体数量增多，增加了土壤微生物数量，有利于土壤有机质的积累^[40]，提高葡萄果实产量。可见，自然生草、枝条覆盖和自然生草+枝条覆盖是具有潜力和可持续发展的耕作措施。

土壤团聚体是土壤结构的重要组成部分，直接影响土壤的通气性、水分保持能力和养分供应能力。本研究表明：与ck相比，NT和NTS处理增加了＞0.250~2.000 mm土壤团聚体质量分数，CTS处理增加了＞0.250 mm土壤团聚体质量分数，并降低了≤0.053 mm土壤团聚体质量分数。这一结果与ELLIOTT^[26]的研究一致。这是因为NT和CTS处理既减少了人为对葡萄园土壤扰动的频率和强度，又增加了有机质的输入，促进了植物根系和土壤微生物的活动，使它们的代谢产物增多，土壤中有机胶结物质和载体介质的量增加，从而促进了大团聚体的形成^[41]。本研究还发现：在5和9月，各处理＞2.000 mm土壤团聚体质量分数最低，这与宁夏地区4月葡萄出土和葡萄成熟时人工以及机械对土壤团聚体的破坏有关。也有研究指出：人为干扰频率高的旱地和田地土壤稳定性较差，而受人为扰动较小的林地土壤稳定性较好^{[36, 42]}。还有多项研究表明^[43−45]：土壤团聚体的稳定性与平均质量直径和几何平均直径值成正比。在5和9月，NT、CTS和NTS处理显著增加了土壤的平均质量直径、几何平均直径和大于0.250 mm团聚体百分比，表明这些保护性耕作措施能够显著提高土壤结构的稳定性。本研究中土壤团聚体稳定性的增强，主要归因于土壤表层由于自然生草和枝条覆盖而带来的丰富的凋落物和植株根系分布增多。它们为表层土壤提供了大量有机质，促进了大团聚体的形成，并且使得团聚体的稳定性相应增强^[46]。

土壤微生物作为土壤的重要组成部分，对土壤养分的循环和利用起着推动作用，是评价土壤养分和土壤微生物环境变化的重要指标^[47]。本研究表明：保护性耕作措施显著改变了土壤微生物群落结构，增加了有益菌群(如变形菌门和酸杆菌门)的相对丰度。这与TRIVEDI等^[48−49]的研究结果一致。本研究中自然生草可以改变土壤真菌的相对丰度，以及它们在属水平上的组成，而且可以从土壤中检测到更高的细菌多样性和丰富度，这与前人的研究结果一致^[50−51]。这是由于自然生草后根系分泌物与凋落物增多，为土壤微生物的生长提供了适宜的营养环境，从而提高了土壤的微生物丰富度和多样性。本研究中，CTS增加了土壤中变形菌门、芽单胞菌门的相对丰度。变形菌门属于富营养型类群，参与土壤有机质的分解，这符合于波等^[52]的研究结果。变形菌门常富集于有机质高的土壤，能够反映土壤肥力，酸杆菌门能够预示土壤磷质量分数和积累消耗情况，放线菌门可以抑制病原菌并维持土壤微生态平衡。了解土壤微生物和理化性质以及具体功能之间的关联，可以为精准调控土壤微生物组，提升生态系统服务提供科学依据。刘思等^[53]的研究也表明：葡萄园秸秆和枝条覆盖下的优势菌门为变形菌门、酸杆菌门和放线菌门。本研究中，CTS处理下土壤细菌的Chao1和Shannon指数显著高于ck处理，真菌多样性指数则无显著差异。这可能是因为枝条覆盖腐解之后带来了丰度的有机质和分泌物，进而促进了微生物数量和多样性的变化，而土壤中真菌的数量和种类显著小于细菌，所以环境的改变对真菌群落的影响不大。段鑫垚等^[54]的研究也表明：碎枝段覆盖可增加土壤中的微生物数量。本研究中，NT处理改善土壤微生物组成的效果比CTS处理更显著，可能是因为枝条的腐解率会影响土壤微生物的变化，需要多年的覆盖才会产生更为明显的效果。土壤团聚体的形成依赖于有机质等胶结物质的参与，而微团聚体通过有机质的胶结作用进一步构成大团聚体^[47]。本研究中土壤细菌的丰富度和多样性受＞0.250~2.000 mm土壤的影响最大，这可能是因为NT和CTS处理为土壤带来了丰富的有机质，促进了土壤中大团聚体的形成，为微生物的生存提供了保护机制，进而增加了土壤微生物的数量和多样性。

NT、CTS和NTS处理能显著影响宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄园土壤的理化性质、团聚体质量分数和微生物群落。与ck相比，‘赤霞珠’酿酒葡萄园中NT、CTS和NTS处理均降低了土壤的pH，提高了土壤中磷、氮、有机质质量分数，使土壤团聚体稳定性指标平均质量直径、几何平均直径和大于0.250 mm团聚体百分比显著升高，并且促进了细菌和真菌群落之间的竞争关系，改变了土壤的微生物结构，进而提高了细菌群落的多样性和丰富度。本研究为保护性耕作措施在宁夏贺兰山地区的推广提供了理论依据，并为酿酒葡萄园的可持续发展提供了技术支持。