Analysis of flower color phenotypes and pigment components in different Prunus mume cultivars

参考陈俊愉等^[16]的方案，观察浙江农林大学种质资源库梅花的表型，在资源库中选择尽可能不同的品种群，对生长健壮、长势一致的15个不同花色的梅花品种(表1)进行调查研究，测定不同品种盛花期花瓣颜色表型并采样。取样时每个品种随机选取5株，每株采集至少10朵盛开花朵，均取自树冠外围中上部花枝，并仅取最外层花瓣。将同一品种的花瓣样品分3份混合均匀，作为生物学重复。混合样品标记后用锡箔纸包裹并立即用液氮速冻，放置于−80 ℃冰箱保存备用。

采用英国皇家园艺学会标准比色卡对15个不同花色梅花品种盛开期的花瓣进行颜色比对。使用色差仪测定花瓣的明度(L*)、红绿色度(a*)、黄蓝色度(b*)。L*代表明暗程度，数值越高颜色越亮；a*的正值代表红色，a*越大颜色越红；b*的正值表示黄色。每个品种测5朵花作为生物学重复，离体测量，以白纸为背景，测最外层花瓣上表皮中央位置。

将梅花花瓣取出后加入液氮充分研磨，精确称取0.3 g，加入V(甲醇)∶V(水)∶V(甲酸)∶V(四氢呋喃)＝70∶27∶2∶1的提取液3 mL，在4 ℃冰箱内避光静置24 h后，超声30 min，在4 ℃、12 000 r·min⁻¹条件下离心10 min，吸取上清液。用0.22 µm过滤头过滤上清液后，避光保存在−20 ℃冰箱供上机分析。进行UPLC-MS/MS检测梅花花瓣类黄酮化合物组分，每个样品3个生物学重复。

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 (1.8 µm，2.1 mm×100.0 mm)，柱温为40 ℃，进样为2 μL，流速为0.4 mL·min⁻¹，洗脱方式为梯度洗脱，流动相A为体积分数1%的甲酸，B为纯乙腈(洗脱程序百分值为体积分数)。梯度洗脱程序为：0 min，5%B；2.0 min，11%B；6.0 min，13%B；9.4 min，38%B；10.0 min，50%B；12.0 min，5%B；16.0 min，5%B。检测波长为350 nm、520 nm。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正/负离子模式扫描；扫描范围为m/z 80~1 500；离子源温度：正模式为600 ℃，负模式为550 ℃；离子化电压为5 500 V；一级扫描参数：去簇电压(DP)为100 V；聚焦电压(CE)为10 V；二级扫描采用TOF MS-Product Ion-IDA模式，碰撞诱导解离(CID)能量为4 020 eV；进样前以校准液输送系统(CDS)泵校准质量轴，误差＜2×10⁻⁶。结合各色素组分的保留时间、离子大小、二级碎片大小和文献，推测梅花花色素成分。花青苷结构参考文献[13, 17−21]，类黄酮结构则参考文献[22−24]。

将标准品芦丁和矢车菊素3-O-葡萄糖苷(纯度质量分数＞98%)配制成1 000 mg·L⁻¹的母液，将标准品稀释成不同的梯度，暂放−20 ℃冰箱保存待测。以标准品浓度(x)为横坐标，色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线。其中：矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准曲线为y＝18 871x−23 280，R²=0.999 5；芦丁标准曲线为y＝9 174.6x+6 227.2，R²=0.999 8。将待测样品(鲜质量)与标准品同步处理，按标准曲线计算总花青苷(total anthocyanins，TA)、总黄酮(total flavonoids，TF)及各组分质量分数(μg·g⁻¹)。

使用Excel 2021进行数据整理，以平均值表示结果。使用SPSS 27对15个梅花品种花色表型参数L*、a*、b*进行最远邻元素法系统聚类分析，对总花青苷、总类黄酮进行差异化分析，对类黄酮化合物进行主成分分析，筛选主要有效因子，采用步进法对关键色素组分进行线性逐步回归分析。使用GraphPad Prism 9和Origin 2025绘图，并对梅花花色表型与色素组分进行Pearson相关性分析。

通过比色卡和色差仪测定15个梅花品种(图1)的花色表型。根据花色表型L*、a*、b*，对梅花品种进行聚类分析(图2)。聚类分析将花色分为4类，结合比色卡将这4类花色定义为：白色系(M11、M12、M14)；浅粉色系(M6、M8、M9、M10、M13、M15)；粉红色系(M3、M5、M7)；紫红色系(M1、M2、M4)。

Figure 1.  Phenotypic characteristics of P. mume at full-bloom stage

Figure 2.  Cluster analysis of flower color phenotypes in P. mume cultivars

梅花品种紫红色系的a*为31.28~38.60，包括‘先春朱砂’‘骨红朱砂’‘晨晖朱砂’，a*最高；其次是粉红色系，a*为17.72~23.52，包括‘粉红朱砂’‘银红朱砂’‘晓红宫粉’；然后是浅粉色系，包括‘春意早宫粉’‘童颜宫粉’‘早花宫粉’‘桃红宫粉’‘单粉跳枝’‘单粉垂枝’；白色系的a*基本为负值。白色系的L*为84.88~86.92，包括‘六萼玉蝶’‘月光玉蝶’‘江梅’；紫红色系的L*为47.44~51.46，说明白色系L*最大，紫红色系L*最小。各色系的梅花b*均不高，其中白色系的b*最高，为7.18~14.94。可见，花瓣颜色越深，L*越低，a*越高。

在a*和b*二维分布图(图3A)中，白色系位于第Ⅱ象限，浅粉色系集中于第Ⅰ象限，紫红色系与粉红色系位于第Ⅳ象限。在L*、a*、b*的三维分布图(图3B)中，各色系的参数分布集中、界限明显。

Figure 3.  Flower color distribution of P. mume in 2D quadrant of a*，b* (A) and 3D quadrant of L*，a*，b* (B)

利用超高效液相色谱法(UPLC)在不同梅花品种花瓣中共中检测出6种花青苷成分和14种黄酮类物质。图4以‘桃红宫粉’为例展示UPLC色谱图。根据UPLC-MS/MS的结果(表2)，推定4类花青素，分别为矢车菊素、芍药色素、飞燕草素、矮牵牛素；以及其他黄酮类物质，分别为2类黄酮醇苷元(槲皮素和异鼠李)和1类黄烷醇苷元(儿茶素)。

Figure 4.  UPLC chromatograms of flavonoid extract from P. mume ‘Taohong Gongfen’ at detection wavelengths of 520 nm (A) and 350 nm (B)

在520 nm区域的6个峰(A1~A6)中，具体结构的判定主要依据分子离子峰[M]⁺、苷元碎片离子[Y0]⁺和糖基丢失规律。A1和A2均产生m/z 287 [Y0]⁺碎片离子(矢车菊素特征)，并分别因丢失162 Da葡萄糖基或308 Da芸香糖基被推定为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷；A3和A4则均产生m/z 301 [Y0]⁺碎片离子(芍药花素特征)，推定为芍药花素-3-O-葡萄糖苷和芍药花素-3-O-芸香糖苷。A5和A6基于m/z 303 [Y0]⁺碎片离子(飞燕草素特征)和m/z 317 [Y0]⁺碎片离子(矮牵牛素特征)及连续的糖基丢失模式推定为飞燕草素-3-O-芸香糖鼠李糖苷和矮牵牛素-3-O-芸香糖-5-O-鼠李糖苷。

在350 nm区域检测到14种类黄酮成分(F1~F14)，其具体结构的判定主要依据去质子化分子离子峰[M-H]^－、苷元碎片离子[Y0]^－和糖基修饰规律。F1、F2、F3、F5、F6、F7、F12和F13均产生m/z 301 [Y0]^－碎片离子(槲皮素特征)，通过不同的糖基组合，如葡萄糖、鼠李糖、半乳糖及乙酰化修饰，推定为槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷(芦丁)等多种糖苷形式；F4、F8、F9、F10和F14则均产生m/z 315 [Y0]^－碎片离子(异鼠李素特征)，并据此推定为异鼠李素-3-O-葡萄糖苷等衍生物；F11基于其分子离子m/z 613 [M-H]^－及分子式被推定为儿茶素二己糖苷。具体鉴定结果见表2。

不同梅花品种的总花青苷和总类黄酮积累模式有一定差异。紫红色系品种花瓣的总花青苷质量分数最高，白色系品种不含或仅含有少量总花青苷；总类黄酮在不同色系品种中的分布没有明显的规律(图5)。为更好比较不同品种梅花各单体类黄酮化合物的积累差异，将鉴定出的6种花青苷化合物、14种类黄酮化合物进行热图分析，对总花青苷和总类黄酮进行差异分析。如图6所示：紫红、粉红、浅粉色系品种中均含有花青苷，其中，紫红色系‘骨红朱砂’‘晨晖朱砂’和浅粉色系‘单粉跳枝’的花青苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-芸香糖苷相对含量较高；粉红色系‘粉红朱砂’‘银红朱砂’和紫红色系‘先春朱砂’的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-芸香糖苷相对含量也较其他品种高。而4个色系的花青苷飞燕草素-3-O-芸香糖鼠李糖苷和矮牵牛素-3-O-芸香糖-5-O-鼠李糖苷相对含量均较低。

Figure 5.  Bar charts of total anthocyanins (A) and total flavonoids (B) of different P. mume cultivars

Figure 6.  Heatmap analysis of flavonoid component content across P. mume cultivars

紫红、粉红、浅粉色、白色系品种中均含有类黄酮，并且在前8个类黄酮成分中富集。类黄酮F1~F14中前10个成分是所有品种共有的成分，后4个成分只在部分品种中出现。其中，异槲皮素相对含量最高，其次是槲皮素-3-O-(2''-O-α-L-鼠李糖)-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷。相对含量较高的有香浦新苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素3-O-(2，6''-α-L-吡喃鼠李糖)-β-D-吡喃半乳糖苷、异鼠李素-3-O-α-L-鼠李糖-β-D-吡喃半乳糖苷和F2槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-β-D-吡喃葡萄糖苷。

相关性分析(图7)显示：L*与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-芸香糖苷和总花青苷呈极显著负相关(P＜0.01)。a*与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-芸香糖苷和总花青苷呈极显著正相关(P＜0.01)。a*越高，花瓣颜色越红，说明这4种花青苷的积累对花瓣红色形成起作用。b*与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-芸香糖苷和总花青苷呈显著负相关(P＜0.05)。

Figure 7.  Correlation analysis between floral color phenotypes and pigment components in P. mume

L*与槲皮素-3-O-α-鼠李糖-(1'''-6'')-(4''-O-乙酰)-β-D-半乳糖苷、2''-O-乙酰-3'-O-甲基芦丁呈极显著正相关(P＜0.01)；与儿茶素二己糖苷、槲皮素-3-O-6''-O-乙酰-β-D-吡喃葡萄糖苷呈显著正相关(P＜0.05)，表明这4种类黄酮组分积累会提高梅花花瓣亮度；但L*与槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-β-D-吡喃葡萄糖苷呈显著负相关(P＜0.05)。a*与儿茶素二己糖苷、槲皮素-3-O-α-鼠李糖-(1'''-6'')-(4''-O-乙酰)-β-D-半乳糖苷和2''-O-乙酰-3'-O-甲基芦丁呈极显著负相关(P＜0.01)；与槲皮素-3-O-6''-O-乙酰-β-D-吡喃葡萄糖苷呈显著负相关(P＜0.05)；但与槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-β-D-吡喃葡萄糖苷呈显著正相关(P＜0.05)。b*与儿茶素二己糖苷、2''-O-乙酰-3'-O-甲基芦丁呈极显著正相关(P＜0.01)；与槲皮素-3-O-α-鼠李糖-(1'''-6'')-(4''-O-乙酰)-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-6''-O-乙酰-β-D-吡喃葡萄糖苷呈显著正相关(P＜0.05)，表明随着这4种类黄酮组分的增加，花瓣黄色程度相应增强。

将梅花花色表型和色素组分进行主成分分析发现：前6个主成分贡献率为92.37%，其中，第1主成分(PC1)贡献率为40.64%，第2主成分(PC2)贡献率为19.87%。筛选出20种主要色素、a*和b*。主成分因子载荷和得分图(图8)显示：后4个主成分贡献率较低，可能仅在特定品种中发挥作用。第1主成分包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-芸香糖苷、总花青苷和a*，说明花青苷是梅花红色调的主要贡献者，a*与上述花青苷相对含量高度相关，说明矢车菊素和芍药花素衍生物主导红色花色。第2主成分包括是槲皮素3-O-(6''-O-β-L-鼠李糖)-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、异槲皮素、异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-6''-O-乙酰-β-D-吡喃葡萄糖苷、2''-O-乙酰-3'-O-甲基芦丁和总类黄酮。

Figure 8.  Principal component analysis (PCA) of floral color phenotypes and pigment components in P. mume

多元回归分析发现：(1) L*的回归方程为y=87.151−0.012x₁−0.016x₂ (R²=0.819，P＜0.05)，其中，y代表L*，x₁代表总花青苷质量分数，x₂代表槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-β-D-吡喃葡萄糖苷质量分数，以上2种物质的积累可显著降低花瓣的亮度。(2) a*的回归方程为y=7.065+0.081x (R²=0.746，P＜0.01)，其中，y代表a*，x代表芍药花素-3-O-芸香糖苷质量分数，其积累量可显著提高花瓣红色程度。(3) b*的回归方程为y=7.104−0.061x (R²=0.363，P＜0.05)，其中，y代表b*，x代表芍药花素-3-O-葡萄糖苷质量分数，其积累量可降低花瓣的黄色程度。可见，梅花花色与色素组分之间显著相关(P＜0.05)。

早前研究表明：类黄酮化合物是影响梅花花色的主要色素，红色梅花含花青苷和类黄酮，白色梅花仅含类黄酮^[11]。张芹^[12]研究发现：除白色系以外，其他色系中也含有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-鼠李糖葡萄糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-鼠李糖葡萄糖苷4种核心花青苷，并推断其他色系的代谢途径是矢车菊素苷分支。吴思惠等^[13]利用HPLC-MS等方法，不仅验证白色梅花中芦丁、槲皮素等黄酮的特异性积累，且揭示矢车菊素和芍药花素衍生物主导红色花色形成，槲皮素衍生物影响黄绿花色。WANG等^[14]研究发现：在部分紫红色梅花品种中，花青苷代谢途径是天竺葵素和飞燕草素分支。本研究通过UPLC-MS/MS技术验证了前人研究中矢车菊素与芍药花素糖苷的核心地位，揭示特定花青苷组分和其他类黄酮组分对梅花花色差异的影响，提出“花青苷主导-类黄酮协同”的代谢网络。

本研究表明：在15个梅花品种花瓣中共检测出6种花青苷成分，14种类黄酮成分，除已报道的矢车菊素和芍药色素外^[11]，还存在少量的飞燕草素和矮牵牛素。矢车菊素和天竺葵素多使花与果实呈现红色，芍药素对植物呈现紫红色具有重要作用，飞燕草素和矮牵牛素负责蓝色和蓝紫色^[25−27]。矢车菊素是大多植物中最常见的花青苷成分，例如梅花^[12]、玫瑰Rusa rugosa^[28]和山茶Camellia japonica^[29]等。芍药色素在观赏植物花色形成中起关键作用，如在牡丹Paeonia suffruticosa^[30]、长春花Catharanthus roseus^[31]、芍药Paeonia lactiflora^[32]等植物中，该色素是红色系花色的主要呈色物质之一，而在夏蜡梅Sinicalycanthus chinensis和光叶红蜡梅Calycanthus floridus var. glaucus中，紫红色花的形成则主要由矢车菊素主导^[33]。类似地，换锦花Lycoris sprengeri的花色苷主要成分包括矢车菊素、天竺葵素和飞燕草素^[34]。本研究发现：在梅花紫红、粉红、浅粉色系品种中均含有花青苷，以矢车菊素和芍药花素为主，其中矢车菊素-3-O-芸香糖苷和芍药花素-3-O-芸香糖苷相对含量较高。白色系品种中几乎不含有花青素苷，但类黄酮含量较高。

相关分析发现：L*与儿茶素二己糖苷、槲皮素-3-O-α-鼠李糖-(1'''-6'')-(4''-O-乙酰)-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-6''-O-乙酰-β-D-吡喃葡萄糖苷、2''-O-乙酰-3'-O-甲基芦丁呈显著正相关，表明这4种类黄酮成分积累会提高梅花花瓣亮度。a* 与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-芸香糖苷、总花青苷和槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-β-D-吡喃葡萄糖苷呈显著正相关，说明这4种花青苷成分和类黄酮积累对梅花花瓣红色形成起一定作用。b*与儿茶素二己糖苷、槲皮素-3-O-α-鼠李糖-(1'''-6'')-(4''-O-乙酰)-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-6''-O-乙酰-β-D-吡喃葡萄糖苷、2''-O-乙酰-3'-O-甲基芦丁呈显著正相关，说明随着这4种类黄酮成分的增加，花瓣黄色程度相应增强。

主成分分析表明：决定梅花红色的色素主要为花青苷。多元线性回归分析表明：总花青苷积累显著降低了L*。a*的核心贡献因子为芍药花素-3-O-芸香糖苷，这与第1主成分中以芍药花素-3-O-芸香糖苷为重要载荷的结论一致。芍药花素-3-O-葡萄糖苷降低了b*，证实花青苷主导核心呈色。

本研究通过多维度分析揭示了梅花花色形成的代谢调控规律，明确了花青苷是花色分化的核心色素。矢车菊素和芍药花素衍生物主导梅花红色花色形成，其中芍药花素-3-O-芸香糖苷通过显著正向调控红度成为红色表型的关键贡献者。主成分分析与多元线性回归分析共同证实：花青苷与a*呈极显著正相关，其积累通过降低L*加深花色。