Cloning and functional identification of SmJRB2 gene in Salvia miltiorrhiza

丹参无菌苗，亚细胞定位瞬时表达载体和遗传转化超表达载体(pHB-X-YFP)，大肠埃希菌Escherichia coli菌株(DH5α)，农杆菌菌株C58C1、GV3101和EHA105为浙江中医药大学中药生物技术实验室保存；平末端试剂盒(pEASY-Blunt Cloning，北京全式金生物科技公司)，柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工生物公司)，植物总RNA提取试剂盒和实时荧光定量PCR (RT-qPCR)试剂盒(天根生物科技有限公司)，限制性核酸内切酶(Thermo Fisher Scientific公司)，PowerUpTM SYBRTM Green Master (Applied Biosystem公司)。

按照植物总RNA提取试剂盒操作说明，提取丹参总RNA，用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳来检测其完整性，并使用微量核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度与260、280 nm下吸光度比值D(260/280)，检测合格后备用。使用RT-qPCR试剂盒对检测合格的RNA进行反转录，合成双链cDNA备用。

以丹参cDNA为模板，基于已测得的丹参转录组数据(NCBI登录号：GSE100970)拼接获得的SmJRB2序列信息，设计特异性引物组合SmJRB2-BamHⅠ-F和SmJRB2-SpeⅠ-R，以及SmJRB2-Anti-BamHⅠ-F和SmJRB2-Anti-SpeⅠ-R (表1)，用来扩增目标SmJRB2基因序列；将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将获得的目的DNA片段切下，通过胶回收试剂盒回收；取5 μL胶回收产物进行凝胶电泳检测，剩余的DNA回收片段用于克隆载体pMD-19T构建、转化大肠杆菌、阳性克隆鉴定与测序检测。测序正确的SmJRB2基因序列用于pHB超表达和反义抑制表达载体的构建。

使用Vector NTI对候选基因的氨基酸进行同源比对分析，比较其保守结构域并着色。通过网站NCBI的blastp工具筛选同源氨基酸序列，采用MEGA 5.1绘制进化树。使用网站ExPASy分析蛋白质的分子量和理论等电点；使用网站TMHMM Server v2.0分析其是否有跨膜结构域；使用网站SignalP 4.1 Server分析基因信号肽^[26−28]。

向培养1个月且生长状态良好的毛状根中加入10 µmol·L⁻¹的MeJA进行诱导处理，选择0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、9.0和12.0 h共8个时间点进行收获，每个时间点3次重复。以稀释20倍的cDNA为模板，根据需检测的基因设计特异RT-qPCR检测引物(表1)。以丹参Actin为内参基因，进行RT-qPCR检测，反应体系：8.0 μL RNase-free ddH₂O，10.0 μL 2×SuperReal PreMix，0.2 μL 50×ROX Reference Dye，0.4 μL正向引物(QF)，0.4 μL反向引物(QR)，1.0 μL模板(cDNA)。

将上述测序正确的pMD-19T-SmJRB2大肠埃希菌阳性克隆以及包含pHB-X-YFP空质粒的大肠埃希菌，分别提取质粒后用BamHⅠ和SpeⅠ进行双酶切、电泳和切胶回收纯化；取SmJRB2基因回收片段与pHB-X-YFP空质粒双酶切回收的大片段进行连接、转化大肠埃希菌、阳性克隆鉴定及再转化C58C1农杆菌。

采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)法^[13]分别提取上述获得的丹参毛状根系总DNA，作为PCR反应扩增的模板；再依据SmJRB2基因编码序列设计上游引物QF，pHB载体中NOS终止子设计下游引物NOS-R，扩增特异性DNA片段序列；再采用引物rolB-F和rolB-R扩增rolB基因(表1)。将不含SmJRB2基因的pHB空载体进行遗传转化，以获得超表达和反义抑制的毛状根，再以提取的总DNA为模版进行扩增，作为PCR鉴定的阴性对照。PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s、58 ℃退火 45 s、72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸8 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证是否为阳性毛状根系。

根据阳性鉴定结果，筛选出超表达效果较好的阳性毛状根，将生长良好的毛状根接入100 mL 1/2MS液体培养基中，在摇床中25 ℃、120 r·min⁻¹避光扩大培养，培养至60 d即可收根。分别检测丹参酮合成途径DXS2、DXR、HMGR、CPS1、KSL1和CYP76AH1基因的表达量，检测引物如表1所示。

分别收集3个SmJRB2超表达与3个抑制表达毛状根系，用液氮研磨成粉，冷冻干燥处理24 h；取100 mg干粉，加入16 mL甲醇/三氯甲烷(体积比为3∶1)，超声处理1 h后再过夜浸提，12 000×g离心10 min收集上清液倒入蒸馏烧瓶中，50 ℃蒸馏去掉提取液，6 500×g离心10 min收集药效提取物干物质。收集的干物质用1 mL蒸馏水充分溶解，再用0.22 µmol·L⁻¹滤膜过滤。过滤后的样品通过高效液相色谱(HPLC)检测毛状根中丹参酮的质量分数^[29]。

所有测试数据用SPSS 16.0进行t检验单因素方差分析。所有基因表达量和丹参酮质量分数检测均为3次生物学重复，取平均值。

通过PCR扩增获得SmJRB2基因的编码序列，全长为1 506 bp，共编码501个氨基酸，包含71个酸性氨基酸和58个碱性氨基酸；蛋白质分子量为55.57 kD，理论等电点为5.57。对拟南芥Arabidopsis thaliana的AtJAM与 SmJRB2进行蛋白同源比对分析发现：SmJRB2基因蛋白与拟南芥AtJAM3蛋白序列的同源性最高。SmJRB2基因含有2个bHLH-MYC亚家族的保守结构域(图1)，其中1个位于N端的bHLH-MYC结构域(114~228区段)；另外1个位于C端的HLH结构域(354~405区段)，说明SmJRB2极可能属于bHLH转录因子家族的MYC类转录因子。

Figure 1.  Multiple alignment of SmJRB2 gene with other bHLH transcription factors

分别以丹参、葡萄Vitis vinifera、长春花Catharanthus roseus及拟南芥AtMYC和AtJAM基因的氨基酸序列为研究对象，利用邻接法构建了SmJRB2蛋白的系统进化树(图2)。结果表明：SmJRB2与拟南芥AtJAM家族成员聚在同一分支，而与MYC类转录因子的亲缘关系相对较远；在拟南芥AtJAM家族成员中，SmJRB2与AtJAM3蛋白具有相对最近的亲缘关系。在拟南芥中，AtJAM3是MYC类转录因子在JA信号通路中基因靶点的竞争子^[30−31]，说明SmJRB2与AtJAM3具有相似的功能。

Figure 2.  Phylogenic tree of SmJRB2 protein

通过RT-qPCR检测SmJRB2基因在丹参各个组织中的表达量。结果表明：SmJRB2基因在叶中表达量最高，在主根中表达量次之，在须根和茎的表达量相对较低(图3)。利用RT-qPCR分析在MeJA诱导下丹参毛状根中SmJRB2基因的表达变化。结果表明：SmJRB2受MeJA诱导0.5 h后，表达量显著上调(P＜0.05)，而诱导4 h时SmJRB2表达量达到最高，上调15倍以上，表明SmJRB2强烈响应MeJA的诱导(图4)。

Figure 3.  Tissue expression profiles of SmJRB2 gene

Figure 4.  Expression profiles of SmJRB2 gene induced by MeJA

将C58C1空菌株、pHB-SmJRB2-YFP (图5A)+C58C1、pHB-SmJRB2-Anti-YFP (图5B)+C58C1阳性农杆菌活化后，以丹参无菌苗叶片为外植体进行遗传转化。转化后叶片置于1/2MS+500 mg·L⁻¹头孢噻肟钠(Cef)+100 mg·L⁻¹卡那霉素(Kana)的培养基上培养，每周更换1次培养基；4周后待叶片伤口处出现发根后，再转接到1/2MS+300 mg·L⁻¹ Cef+100 mg·L⁻¹ Kana的培养基上，每周更换1次培养基；2周后再转到1/2MS+200 mg·L⁻¹ Cef+100 mg·L⁻¹ Kana的培养基上，每周更换1次培养基；2周后置于无抗生素的1/2MS培养基上。将2 cm以上的毛状根置于1/2MS培养基中分株系单独培养，用于阳性检测与扩大培养。

Figure 5.  Schematic diagram of SmJRB2 overexpression vector (A) and suppression expression vector (B)

以鉴定成功的pHB-SmJRB2-YFP重组子作为阳性对照，以C58C1空菌株诱导的毛状根的DNA为阴性对照，分别检测超表达(SmJRB2-OE)和抑制表达(SmJRB2-Anti)各30个株系中SmJRB2、rolB基因的靶序列。结果表明：SmJRB2过表达阳性株系有8个，阳性率为26.67%；抑制表达阳性株系有9个，阳性率为30% (图6)。

Figure 6.  PCR identification of transgenic hairy roots

选取3个超表达转基因毛状根系，对SmJRB2过表达毛状根丹参酮代谢途径中关键酶基因的表达量进行RT-qPCR分析。结果显示：丹参酮代谢通路中SmDXS2和SmHMGR基因的表达量显著上调(P＜0.05) (图7)。SmJRB2基因可通过上调丹参酮代谢途径的SmDXS2、SmHMGR和SmCPS1等关键酶基因的表达来促进丹参酮的代谢合成。

Figure 7.  Relative expression profiles of key enzyme genes in tanshinone biosynthetic pathway in SmJRB2 gene overexpression transgenic hairy roots of Salvia miltiorrhiza

过表达SmJRB2后，3个超表达毛状根系中二氢丹参酮(DT)、隐丹参酮(CT)、丹参酮Ⅰ(TA-Ⅰ)和总丹参酮(TTA)的质量分数均显著提高(P＜0.05)；3个抑制表达毛状根系中丹参酮DT、CT、TA-Ⅰ和TTA的质量分数均显著下调(P＜0.05)，TTA质量分数最低，仅为对照的0.31倍；丹参酮ⅡA (TA-ⅡA)质量分数在转基因毛状根中无显著变化(图8) 。结果表明：SmJRB2促进毛状根中丹参酮的积累，是丹参酮代谢的正向调节因子。

Figure 8.  Contents of tanshinones in SmJRB2 transgenic hairy root lines　　　　

本研究基于比较转录组测序的结果，采用同源克隆技术克隆了SmJRB2基因的全长编码序列。将SmJRB2基因、丹参转录组数据库获得的SmJRB1基因，以及拟南芥、葡萄、长春花等物种中的MYCs、JAMs转录因子合并构建系统进化树，发现SmJRB2基因与拟南芥的AtJAM3具有较高的同源关系，且含有MYC和JAM保守结构域。基于候选基因的遗传转化实验验证发现，SmJRB2对丹参酮的合成起正向调控作用。YANG等^[32]研究发现：MYCs类转录因子作为正向调节子，能显著正调控丹参酮和丹参酚酸的合成。ZHAO等^[33]研究发现丹参JAM类转录因子会抑制丹参酚酸的代谢合成。对SmJRB2蛋白的结构域进行分析，结合基因进化特征，推测所克隆的SmJRB2基因属于MYC类转录因子的JAM类亚型，具有其他物种JAM亚型转录调控因子的类似基因功能。

组织表达和诱导表达特征分析表明：SmJRB2转录因子在丹参根、茎、叶中均有表达，且在叶片和主根中的表达量相对最高，在须根和茎中的表达量相对较低。SmJRB2属于MYC类转录因子，叶片中SmJRB2的高表达不仅有利于叶片和茎的生长，还有利于次级代谢产物的生物合成^[34−36]。结果显示：SmJRB2能够响应MeJA的诱导，且在诱导后2~4 h内的表达量较高。汪琬宜等^[37]和ZHOU等^[38−40]研究发现，MeJA是丹参酮和丹参酚酸代谢合成的有效诱导子。因此，推测SmJRB2是MeJA调控丹参药效物质代谢合成的信号响应因子，可为MeJA调控丹参药效物质代谢合成分子机制的阐释提供理论参考。

本研究克隆了SmJRB2转录因子，基于农杆菌介导的遗传转化技术分析了该基因的组织表达，发现SmJRB2转录因子在植物的根、茎和叶中均有表达，且在叶中的表达量最高。同时，SmJRB2能响应MeJA的诱导且显著上调。初步阐明了SmJRB2转录因子对丹参次生代谢产物合成的影响，得出SmJRB2是丹参酮代谢合成的正向调控因子。本研究进一步完善了SmJRB2转录因子的调控理论体系，并为丹参优质新品种选育提供了分子靶标和理论基础。