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3个白桦BpBEE基因的克隆与表达分析

武丹阳 杨洋 李慧玉

武丹阳, 杨洋, 李慧玉. 3个白桦BpBEE基因的克隆与表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2017, 34(1): 137-144. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019
引用本文: 武丹阳, 杨洋, 李慧玉. 3个白桦BpBEE基因的克隆与表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2017, 34(1): 137-144. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019
WU Danyang, YANG Yang, LI Huiyu. Cloning and expression of three BpBEE genes in Betula platyphylla[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2017, 34(1): 137-144. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019
Citation: WU Danyang, YANG Yang, LI Huiyu. Cloning and expression of three BpBEE genes in Betula platyphylla[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2017, 34(1): 137-144. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019

3个白桦BpBEE基因的克隆与表达分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019
基金项目: 

“十二五”国家科技计划农村领域项目 2013AA102704

详细信息
    作者简介: 武丹阳, 从事林木遗传育种研究。E-mail:wudanyang_nm@126.com
    通信作者: 李慧玉, 副教授, 博士, 从事林木遗传育种研究。E-mail:lihuiyu0519@aliyun.com
  • 中图分类号: S722.3

Cloning and expression of three BpBEE genes in Betula platyphylla

图(5) / 表(2)
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出版历程
  • 收稿日期:  2016-01-17
  • 修回日期:  2016-04-13
  • 刊出日期:  2017-01-20

3个白桦BpBEE基因的克隆与表达分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019
    基金项目:

    “十二五”国家科技计划农村领域项目 2013AA102704

    作者简介:

    武丹阳, 从事林木遗传育种研究。E-mail:wudanyang_nm@126.com

    通信作者: 李慧玉, 副教授, 博士, 从事林木遗传育种研究。E-mail:lihuiyu0519@aliyun.com
  • 中图分类号: S722.3

摘要: 根据已有的白桦Betula platyphylla茎尖、叶片及木质部等45个转录组信息,获得3条白桦BEE基因的全长cDNA序列,分别命名为BpBEE1,BpBEE2和BpBEE3。对3个BpBEE基因进行了生物信息学分析和实时定量聚合酶链式反应分析,结果表明:3个基因具有典型的结合DNA及特异识别序列E-box和N-box,属于bHLH类转录因子。这3个基因与拟南芥Arabidopsis thalianaAtBEE基因亲缘关系较近,属于bHLH超家族第25亚类。在白桦生长季内,BpBEE1,BpBEE2和BpBEE3在不同组织中均有表达,叶中BpBEE基因表达量明显高于其他部位。在生长旺盛时期,茎、叶和顶芽中BpBEE基因均呈现上调表达,表明BpBEE基因可能参与到白桦的生长过程。油菜素内酯(BR)激素处理之后,BpBEE1在早期(2 h和4 h)的芽和木质部中呈显著上调(>2倍);BpBEE2在早期(2 h)的木质部和芽显著上调外,其他处理时间也呈现不同程度的上调。表明3个白桦BpBEE基因参与BR激素应答,且BpBEE1和BpBEE2呈现早期应答响应。

English Abstract

武丹阳, 杨洋, 李慧玉. 3个白桦BpBEE基因的克隆与表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2017, 34(1): 137-144. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019
引用本文: 武丹阳, 杨洋, 李慧玉. 3个白桦BpBEE基因的克隆与表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2017, 34(1): 137-144. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019
WU Danyang, YANG Yang, LI Huiyu. Cloning and expression of three BpBEE genes in Betula platyphylla[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2017, 34(1): 137-144. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019
Citation: WU Danyang, YANG Yang, LI Huiyu. Cloning and expression of three BpBEE genes in Betula platyphylla[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2017, 34(1): 137-144. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019
  • Basic helix-loop-helic (bHLH)转录因子是一类在生物界广泛存在的转录因子家族,通过特定的氨基酸残基与靶基因相互作用,进而调节相关基因的表达[1]。依据进化关系及与DNA的结合模式,将动物中bHLH转录因子分为A~F等6个家族,植物bHLH蛋白大多属于B组[2]。拟南芥Arabidopsis thaliana中有147个bHLH基因,水稻Oryza sativa中有167个bHLH转录因子[3]。CARRETERO-PAULE等[3]对拟南芥、水稻、苔藓和藻类全基因组的bHLH转录因子进行了系统分析,这4类植物中所有638个bHLH基因被分为32个亚家族,主要特征是含有约60个氨基酸的bHLH结构域,可以分为长度15个氨基酸左右的碱性氨基酸区和45个氨基酸左右的α螺旋-环-α螺旋区(HLH区)[4],并且定义了植物bHLH的保守区域,即碱性氨基酸区含有高度保守的H5-E9-R13序列(His5-Glu9-Arg13),这为鉴定新的bHLH转录因子提供了依据[3]。bHLH基因参与植物的生长发育,促进花形态的建成和抑制及种子的萌发,控制气孔细胞分化及保卫细胞形成[5]。bHLH还参与植物适应非生物逆境反应[6]。拟南芥中AtbHLH92表达受盐、干旱、渗透和寒冷等多种胁迫强烈诱导,陆地棉Gossypium hirsutum中分离的GhbHLH1被ABA,干旱和盐胁迫诱导表达[7];过表达水稻OsbHLH001转录因子的拟南芥抗盐及抗冻能力均得到的提高[1]。之外,bHLH还参与生物合成及信号转导。研究发现,bHLH类基因OSB1,ATR2和IND分别参与花青素、色氨酸及赤霉素的合成;PIF3,PIF4和HFR1在光敏色素信号传导中起调控作用;BEE1,BEE2和BEE3在油菜素内酯(brassinolid,BR)的信号传导中起作用[8]BEE(BR enhanced expression)所编码的蛋白质是属于bHLH超家族的一员,是调控BR信号转导的重要元件[8]。迄今为止对BEE基因的研究积累较少。在拟南芥中,3个BEE基因在BR信号途径中是早期应答受体[8]。拟南芥BEE基因突变体出现植株矮小和开花延迟的表型,且该家族成员存在功能冗余[8]。在木本植物中BEE基因的功能研究未见报道。白桦Betula platyphylla是桦木科Betulaceae桦木属Betula的落叶乔木,天然次生林更新的先锋树种,也是中国重要的经济树种之一。油菜素内酯是对植物生长发育有多方面调节作用的植物激素,对植物生长发育有着多方面的重要影响。本研究以白桦为材料,克隆了3条BpBEE基因,通过生物信息学及实时定量聚合酶链式反应技术,对BpBEE在白桦不同生长阶段的表达变化及响应BR处理的情况进行了研究,旨在深入揭示BpBEE基因功能,探索它在木本植物BR信号途径的作用。

    • 基因表达分析材料采自东北林业大学林木遗传育种试验基地10年生的白桦。雌花序出现于4月中下旬, 始花5~10 d后开始受粉, 持续1周左右,雄花序出现于5月底, 8月中旬结束。白桦的雄配子体发育很特殊, 在当年不形成成熟的雄配子体, 直到第2年4月中下旬才发育成熟,称为越冬宿存现象[9]。2013年6月5日至9月20日,隔15 d取材1次,每次均选取相同3株白桦中部的雄花序、叶片、嫩茎和顶芽,分别混样。越冬后第2年4月15日至4月25日,隔5 d采取雄花序和雌花序。植物材料经液氮速冻后,放入-80℃超低温冰箱保存备用。

      BR处理以1年生、长势一致的白桦无性系为材料。喷洒0.2 mg·L-1的BR (含质量分数为0.1%的吐温80)溶液5.0 mL,同时设置对照(喷洒质量分数为0.1%吐温80溶液5.0 mL),在处理0,2,4,6,12,24,48和72 h后,分别采集顶芽、叶、木质部和韧皮部。液氮冷冻处理,-80℃冰箱中保存备用。

    • 根据研究团队已有的白桦不同组织转录组数据,获得3个BEE基因的全长cDNA序列,分别命名为BpBEE1,BpBEE2,BpBEE3。

      利用美国生物技术信息中心(NCBI)在线开放阅读框(ORF)寻找程序确定基因的开放读码框;利用Conserved Domains工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struct-ure/cdd/wrpsb.cgi)预测保守区及蛋白质的基本结构域。对蛋白质的分子量和理论等电点进行了在线计算[http://web.expasy.org/protparam/。根据白桦基因组DNA序列(白桦基因组测序、拼接工作已经完成,数据尚未公布)在GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/]上对其基因组序列进行外显子和内含子的预测。用BioEdit中的ClustalW进行氨基酸的多序列比对;选取白桦和拟南芥AtBEE基因序列,使用MEGA 5.1以默认参数构建邻接树(neighbor-joining tree,NJ-tree),其中Bootstrap分析进行1 000次重复。

    • 采用RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司,RP3302),按说明书提取白桦不同组织部位的总RNA。用微量紫外检测仪NanoDrop测定提取的RNA样品浓度,用质量分数为1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

    • 利用PrimeScriptTM RT reagentkit (TaKaRa)进行RNA反转录,反应体系和条件参照试剂盒说明书操作。

    • 根据已知的3个BpBEE全长序列设计实时定量引物,同时以白桦α-Tubulin为内标基因(引物序列参见表 1)。以获得的白桦不同生长阶段材料(雌花、雄花、茎、叶和顶芽)及BR处理后不同时间(0,2,4,6,12,24,48和72 h)收集的组织(顶芽、叶、木质部和韧皮部) cDNA稀释10倍作为模板。荧光定量反应体系为SYBR Premix Ex Taq10.0 μL,上、下游引物(10 mmol·L-1)各0.8 μL,Rox DyeⅡ0.4 μL,cDNA 2.0 μL,加水至终体积20.0 μL。反应在ABI PRISM 7500实时定量聚合酶链式反应(PCR)仪上进行,程序为95℃预变性30 s,95℃变性5 s,60℃退火延伸34 s,循环40次,绘制溶解曲线,温度由95℃ 15 s,60℃ 1 min,至95℃ 15 s止,重复3次·反应-1,采用-ΔΔCt算法分析结果。

      表 1  定量RT-PCR分析所用引物

      Table 1.  Primers used in RT-PCR analysis

      基因 上游引物序列(5'→3') 下游引物序列(5'→3')
      BpBEE1 CAGCCAAATGCAAGCATGATGG GGAGCTGGTTGTTGATAGTTCC
      BpBEE2 GCTAGACAAGCTTCATCAACC TTCCATCTCCTCCACCACC
      BpBEE3 GTTCAACCAGAATGTGGTGC CTGTGACTGTCAGTAGCTTGG
      α-Tubulin GCACTGGCCTCCAAGGAT TGGGTCGCTCAATGTCAAGG
    • 根据白桦基因组信息,对3个基因的基因组序列进行分析,结果BpBEE1,BpBEE2及BpBEE3基因的基因组序列长度差异较大,其中BpBEE1基因组序列最长,达2 700 bp,BpBEE2和BpBEE3基因分别为1 600 bp和1 400 bp,但3个基因的内含子和外显子数目一致,均含有6个外显子5个内含子,且BpBEE1的5个内含子长度(110,140,574,106和982 bp)均比BpBEE2的内含子(134,80,72,127和73 bp)长,BpBEE3内含子长度依次为82,11,104,91和146 bp (图 1)。BpBEE1和BpBEE3编码的氨基酸数目接近,分别为263和269个氨基酸,BpBEE2编码的氨基酸序列较长,为360个氨基酸,理论等电点的范围为5.3~6.5(表 2)。

      图  1  BpBEE基因的结构

      Figure 1.  Structure of BpBEE genes

      表 2  3个BpBEE基本理化性质

      Table 2.  Basic physico-chemical properties of BpBEEs genes

      基因 5'UTR/bp 3'UTR/bp ORF长度/bp 氨基酸数目 相对分子质量/kD 理论等电点
      BpBEE1 76 407 792 263 29.9 6.42
      BpBEE2 73 411 1 083 360 39.9 5.31
      BpBEE3 30 167 810 269 30.2 5.93

      美国生物技术信息中心BLAST序列分析表明,BpBEE1,BpBEE2和BpBEE3所编码的蛋白具有明显的bHLH蛋白质结构域,包括2个螺旋和1个环状结构,含有特异识别序列E-box (CANNTG)和N-box (CACGC/AG)。多重序列比对结果表明:白桦BpBEE基因所编码的bHLH结构域与bHLH氨基酸序列中的严格保守的位点完全一致,包括碱性结构域中第9位组氨酸,第13位谷氨酸与第16位、第17位的精氨酸,螺旋区域中第10位的亮氨酸(图 2)。白桦BpBEE2与拟南芥AtBEE2基因的氨基酸同源性高达87%,BpBEE3与拟南芥AtBEE1和AtBEE3基因的氨基酸同源性高达为90%,BpBEE1也与拟南芥中AtBEE1和AtBEE3基因的氨基酸同源性达到55%。分子进化树表明,白桦BpBEE1,AtBEE2,AtBEE3基因聚为一类,均与拟南芥AtBEE基因同源性较高。根据已有的bHLH转录因子分类情况,白桦BpBEE基因在bHLH蛋白家族中属于第25亚类(图 3)。

      图  2  BpBEE和AtBEE蛋白的多序列比对

      Figure 2.  Multiple protein sequence alignment result between BpBEE and AtBEE

      图  3  BpBEE氨基酸序列与拟南芥bHLH氨基酸序列的系统进化树分析

      Figure 3.  Phylogenetic tree of amino acid sequences of BpBEE with bHLHs from Arabidopsis thaliana

    • 利用实时定量PCR技术对3个BpBEE基因在不同时间和不同组织中的表达模式进行分析。结果显示:雌花中(参考组织为2014年4月15日BpBEE1表达量),BpBEE1基因随着雌花的发育表达量逐渐降低,在4月25日达到最低值,下调2-1.8倍。BpBEE2基因呈现上调表达趋势,但是表达量逐渐减少。而BpBEE3呈现先下调后上调的趋势,下调最低峰出现在4月20日(2-2.0倍),而后显著上调(24.0倍)(图 4)。

      图  4  BpBEE基因在不同时期不同组织部位的表达分析

      Figure 4.  Expression patterns of BpBEE genes

      在雄花发育初期,3个BpBEE的表达丰度下调或不变(参照组织为2014年4月15日BpBEE1基因表达量),在发育中期(7月5日到8月5日)BpBEE2和BpBEE3基因上调表达,上调倍数在22.0~24.0,而越冬后3个基因均成下调表达,尤其以BpBEE3最为明显(图 4)。

      茎中3个基因的表达趋势不尽相同(参考组织为2013年6月5日BpBEE1基因表达量)。BpBEE1在发育初期呈现上调趋势,到发育中期依然上调表达但表达量有所减少,到8月20日出现下调最低峰(2-1.0倍),而后显著上调(23.0倍)。BpBEE2基因呈现持续上调趋势,在7月5日出现上调最高峰(25.0倍),随后仍呈现上调表达但是表达量逐渐减少。而BpBEE3基因在整个发育阶段大部分呈现上调趋势,但是变化量小,在6月20日达到下调最低峰(2-1.8倍),在9月5日出现了明显的上调趋势(23.0倍)(图 4)。

      在叶中,BpBEE1和BpBEE2基因表达量随着生长持续上调(参考组织为2013年6月5日BpBEE1基因表达量),8月20日达到最高值(27.0~28.0倍),9月5日表达量显著减少。BpBEE3在发育初期呈现下调趋势,随后持续上调(24.5~24.8倍),在9月5日达到下调最低峰(2-2.5倍)(图 4)。

      在顶芽中,BpBEE1基因在发育初期表达量较低(参考组织为2013年6月5日BpBEE1基因表达量),在发育的旺盛时期7月5日达到最高峰(22.0倍)随后表达量逐渐降低,在9月5日达到最低点。BpBEE2和BpBEE3的表达规律是相同的,发育初期下调表达,发育的旺盛时期上调表达,发育后期表达量减少甚至下调表达。这表明基因对于顶芽的发育有影响。

    • 利用实时定量PCR技术分析了BpBEE1,BpBEE2和BpBEE3对BR激素的响应。结果显示:在芽中BpBEE2和BpBEE3的表达趋势相似,4~48 h均为下调表达(不同组织以0 h取材的BpBEE1基因的表达量为参照),分别在6 h和24 h达到下调的最低值(2-2.0和2-4.5倍)。而BpBEE1与其相反,早期(2 h和4 h)上调表达,在中后期下调表达,上调表达最高值在处理2 h出现(21.8倍)(图 5),这与拟南芥中AtBEE基因是BR信号通路中的早期应答受体的结果相符合[8]

      图  5  BR处理对BpBEE基因表达的影响

      Figure 5.  Effects of BR treatment on BpBEE gene expression

      在叶中,3个BpBEE基因的表达趋势相同,表达丰度均低于处理前。BpBEE1在早期(6 h)表现为下调表达,在中后期的表达呈现波动状,但是在20和2-2.0倍之间波动。BpBEE2出现了较为明显的下调表达,并在48 h时出现了最低值(2-2.0倍)。BpBEE3的表达呈现下调,在6 h达到了最低值(2-6.0倍)(图 5)。

      在木质部中,BpBEE1在BR处理后表达量升高,BpBEE1在4 h达到了最高值(22.0倍)。BpBEE2在处理后呈现上调表达,但是表达量均低于处理前。BR处理后BpBEE3下调表达,最低值出现在6 h (2-4.5倍)。

      在韧皮部中,BpBEE1和BpBEE3基因表达趋势相似,均为下调表达,分别在48 h和6 h时达到表达最低值(2-3.0倍和2-5.5倍),而BpBEE2在BR处理0 h时为上调表达,处理后呈现下调表达趋势,24 h达到最低值(2-4.0倍)(图 5)。

      以上结果表明:BR激素影响BpBEE基因的表达量,在不同组织部位的影响不同。

    • 真核生物中bHLH蛋白是一大类转录因子,已在多种生物的基因组中得到鉴定[10]。植物中bHLH家族成员数量众多,仅次于MYB类转录因子家族,在拟南芥中bHLH转录因子超过140个,水稻中则多于160个[5]。根据白桦基因组和转录组数据,分析预测白桦中含有的bHLH转录因子有157个。bHLH蛋白主要特征是含有bHLH结构域,白桦BpBEE均含有62个氨基酸组成的bHLH结构域,并存在高度保守的序列[11],对bHLH与靶DNA的结合密切相关。同时通过序列分析BpBEE能识别E-box (CANNTG)并结合,进而激发基因进行转录[2]

      在进化上,一个保守结构域的内含子/外显子的剪切位点也是十分保守的,所以它对于基因家族的进化研究也是非常重要的证据[12]。在植物的bHLH蛋白超家族中,其内含子的位置十分保守,但数量具有多样化的特点,最常见的是含有2或3个内含子[12],也有个别基因含有更多数目的内含子。例如,拟南芥AtBEE基因含有4~5个内含子和5~6个外显子[11]。白桦BpBEE基因含有的内含子数目一致,均含有5个内含子,故在亲缘关系上比较相近。

      进化树分析发现,BpBEE1,BpBEE2和BpBEE3属于bHLH转录因子的第25亚类,与拟南芥中AtBEEs同源性较高[13]。已有研究报道,拟南芥第25亚类中共有17个成员,其中包括AtBEE1,AtBEE2,AtBEE3和AtCIB1基因,这些基因参与激素信号途径和器官的发育[11]AtBEEs基因表达受BR和脱落酸(ABA)的诱导,在喷洒植物生长调节物质BR后,AtBEE基因的表达量明显高于未处理前,拟南芥幼苗的胚轴也有一定程度的增长;而ABA的效果与BR相反,在喷洒植物生长调节物质后AtBEE基因的表达量降低[8]AtCIB1基因所编码的蛋白质可以调控光诱导基因的表达,从而控制植物的成花转变[14]。拟南芥隐花色素CRY2与bHLH转录因子CIB1发生互作,CIB1能够和成花素FT基因启动子区的E-box (CANNTG)结合,从而促进FT表达,而FT编码一个可移动的转录因子,从叶片转移到茎端分生组织促进开花基因的表达,最终促进光周期控制的开花[15]。在本研究中,3个BpBEE基因在不同组织部位的表达呈现出一定程度的相似性,预测其在功能上有一定的冗余,但也有很多不同点。在生长旺盛时期,3个BpBEE基因在叶、顶芽和茎中均呈现上调表达;在雄花的减数分裂时期,BpBEE2和BpBEE3基因呈现上调表达,故我们认为白桦BpBEE基因参与到了植物的生长发育过程中。在进行BR激素处理之后,3个BpBEE基因的表达量都明显的变化,在处理早期0~6 h期间,BpBEE1和BpBEE2基因的表达量有明显的变化,表明BpBEE基因参与对BR激素应答,BpBEE1与BpBEE2表现为早期应答反应。在拟南芥中AtBEEs基因作为转录因子调控多个基因,例如BRI1,BIMs,BIN2和BZR2基因的表达从而调节BR信号途径[16]。本研究的3个基因与其同源性较高,BpBEE基因是否具有相同的调节功能,及对下游基因及表达调控机制仍然需要进一步研究揭示。

参考文献 (16)

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