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目前,环境污染得到广泛重视,水体污染为受关注的热点领域[1]。在水污染物的重金属成分中,铅(Pb)是一种典型的重金属污染物,严重威胁着生态系统和人体健康[2-3],是水污染控制的重点。在众多的水体污染处理技术中[4-5],水凝胶作为一种高含水量,具有良好生物相容性和环保吸附性能的软材料,已被广泛应用于水污染物去除领域[6]。水凝胶基材的选择决定着凝胶吸附性能的强弱。生物质有着廉价易得、生产成本、不易造成二次污染等优点,可作为理想的改性基材。选择生物质作为基材构筑新型高效、绿色吸附材料是发展趋势。在众多生物质基材原料中,海藻酸钠(SA)作为天然的生物质高分子有机物质,由于其亲水性很强,与钙离子(Ca2+)在水溶液中通过离子交换反应聚合形成凝胶球[7-8],能够有效地去除水中重金属[9]。该特性使其成为制备复合吸附剂的理想框架。在传统的化学吸附材料中添加磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒可以使传统的化学吸附剂具有物理磁性。吸附剂可以在外部磁场下快速从水体中分离,同时不会在环境中产生二次污染,解决了传统吸附剂不容易与水体分离,难以回收的缺点。因此,制备磁性可回收生物质基水凝胶是一项极有新意的工作。结合海藻酸钠和Fe3O4的优良特性,海藻酸钠和烷基化磁性 Fe3O4纳米粒子制备出新型的复合吸附剂,可以达到增强吸附性能的效果,具有低成本、绿色安全和其他优势。具体工作内容是通过硅烷化反应制备含有端氨基的磁性纳米颗粒,进而利用生物质海藻酸钠包覆磁性颗粒,获得生物基磁性凝胶微球吸附材料。纳米级粒度更有利于凝胶球的包覆行为,并使结构更紧密。本研究制备了1种富含氨基、羟基和羧基多官能团的新型磁性复合凝胶球,同时,研究了复合凝胶球的吸附性能。新型磁性复合凝胶球对铅离子(Pb2+)的吸附效果显著,并具有良好的重复利用性能,为绿色零污染吸附剂的制备提供了基础。
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海藻酸钠[(C6H7O6Na)n,980 g·kg−1],七水合硫酸亚铁(Ⅱ)(FeSO 4·7H2O,980~1020 g·kg−1),氢氧化钠(NaOH,960 g·kg−1),氯化钙(CaCl2,990 g·kg−1)购自杭州安耐尔技术有限公司;3-氨丙基-三甲氧基硅烷(APTS,纯度970 g·kg−1)购自阿拉丁制药有限公司;氯化铁(Ⅲ)六水合物(FeCl3·6H2O,980 g·kg−1)、无水乙醇(999 g·kg−1)、氢氧化钠(NaOH,250~280 g·kg−1)、氯乙酸(980 g·kg−1)、氯化铅(分析级)、甲醇(995 g·kg−1)、异丙醇丙二醇(995 g·kg−1)购自国药股份化学试剂有限公司;实验水为蒸馏水。
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磁性粒子Fe3O4(MNP)的制备方法为离子共沉淀法[10]。将5.9 g FeCl3·6H2O和3.0 g FeSO4·7H2O溶解分散于100 mL蒸馏水中,1 mol·L−1NaOH调节溶液pH至11.0,获得磁性粒子(MNP),75 ℃ 超声搅拌40 min,蒸馏水和甲醇交替洗涤数次。采用强磁分离产物,在甲醇溶液储存合成的MNP,备用。
在200 mL甲醇中加入上述制备得到的MNP,搅拌分散。加入10 mL APTS,氮气(N2)保护下(60 ℃)回流搅拌12 h。甲醇洗涤数次,得到端氨基修饰磁性颗粒(AM),磁力法分离产物,储存在甲醇溶液中备用。参考文献[7],取20 mL 10 g·kg−1海藻酸钠溶液在烧杯中,加入氨基修饰AM,搅拌混合后超声波处理30 min;配置20 g·kg−1氯化钙溶液,将混合悬浮液缓慢匀速滴入其中。悬浮液在水中发生交联形成颜色偏黑、粒度均匀的复合磁性凝胶球。凝胶球在CaCl2溶液中充分浸泡48 h后,用超纯水洗涤数次,即得新型磁性海藻酸钠复合凝胶球(SA@AM)。冻干备用。
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反应物、中间产物及终产物的红外光谱(IR)谱采用傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)测定,扫描波数为4 000~400 cm−1,溴化钾(KBr)压片法制做样品。产物的X射线衍射分析采用粉末衍射仪测试,扫描范围为2θ=20.0°~80.0°,扫描速度为2°·min−1。采用扫描电子显微仪和透射电子显微镜进行样品表观形貌分析。透射电镜采用铜网为载体制样,观察比较MNP、AM和SA@AM复合凝胶球表面形貌。振动样品磁强计(0~±1 T)测量磁化曲线,测试条件为300 K;元素分析仪测试产物元素的分布情况。
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分别配制以下系列质量浓度10、20、30、40、50、60、70、80、90 mg·L−1的Pb2+标准溶液(pH 6.0),加入1 g的SA@AM凝胶球置于50 mL溶液中,在25 ℃持续吸附3 h。取上清液,确定滤液中离子的浓度,绘制等温吸附曲线,得到产物中Pb2+的最大吸附量。通过模型拟合离子吸附剂的热力学特性并研究吸附曲线。
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取1 g的SA@AM微球于50 mL质量浓度为80 mg·L−1的Pb2+标准溶液。在25 ℃振动吸附,并在5、10、15、30、45、60、75、90、105、120 min的间隔取出上清液,并测量上清液中的离子浓度,绘制吸附量随时间变化的曲线,得到离子吸附的动力学曲线。通过动力学模型拟合离子吸附动力学曲线来研究离子的吸附动力学。
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由图1可知:在560 cm−1的吸收峰归属于纳米磁性粒子Fe3O4(MNP)的Fe—O伸缩振动峰,3 428 cm−1的吸收峰归属于Fe3O4的—OH的伸缩振动峰[11]。与MNP的红外光谱相比可知:在3 398 cm−1的吸收峰归属于端氨基AM的N—H伸缩振动峰;亚甲基的对称和不对称伸缩振动峰归属于2 919和2 844 cm−1的吸收峰[12];Si—O—C的伸缩振动吸收峰在1 059 cm−1处显现,Fe3O4中Fe—O键的特征吸收峰在560 cm−1出现。比较产物MNP、AM、SA@AM的红外谱可知:在N—H伸缩振动峰归属于3 397 cm−1的吸收峰;制备的产物AM、SA@AM都含有Fe3O4中Fe—O键的特征吸收峰562 cm−1。综上分析可得:图谱所表示的特征峰基本与产物的结构相一致,可以判定目标产物的成功制备。
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NMR结构分析是产物表征常用的有效方法。由于强磁材料的特殊性干扰核磁场强,无法获得较为准确核磁谱图,因此,利用元素分析结合X射线衍射仪(XRD)等表征方法对材料结构进行分析。由表1可知:各样品中均可以检测出碳、硅、氧、氮、铁等元素。MNP经硅烷化反应制备得到的富含端氨基AM,AM中氮和硅的质量分数(4.72%和4.98%)有所增加。氨基改性的AM被包覆在SA@AM中,SA@AM与磁性粒子MNP、AM相比,其碳、氧元素的质量分数增加,硅、氮、铁元素的质量分数减少,SA@AM的组成特征与分析结果相符合。综上所述,元素分析质量分数检测结果与产物实际特征相符合,进一步验证了预期产物的成功合成。
表 1 产物样品中各元素质量分数
Table 1. The mass fraction of each element in the product sample
磁性材料 元素质量分数/% 碳 硅 氧 氮 铁 MNP 13.27 0.01 16.12 0.37 53.25 AM 14.74 4.98 15.97 4.72 47.34 SA@AM 32.96 1.92 20.21 2.34 26.46 -
产物MNP、中间产物(AM)和终产物(SA@AM)的扫描电镜(TEM)、透射电镜(SEM电镜)照片和复合凝胶球外观照片如图2的所示。从图2可见:氨基改性AM的扫描电镜(SEM)图2A看出其结构单一,大小较为均匀,呈圆球状,颗粒堆积成簇。AM的透射电镜(TEM)图(图2B)看出:端氨基AM表面紧致,为不规则、无定形态,尺寸为15~20 nm,中心部分是磁性核粒子为黑色,边缘部分较为松散,为白色透明状,说明氨基硅烷在磁性核粒子上包覆成功。同时,图2显示,AM发生微量堆积而且相互吸附,可能是由于AM自带的磁力使其发生团聚成簇现象[13]。SA@AM的冻干凝胶球SEM图2C看出:AM颗粒附着包覆在海藻酸钠凝胶上,凝胶球含有较多褶皱和大的空隙。这是凝胶球高吸附性能的基础。SA@AM的外观图2D看出:凝胶球为黑色球型,表面光滑而且具有一定的弹性。因此,从表面形貌定性分析,验证得到了目标复合产物。
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原料SA、原始产物MNP、AM和终产物SA@AM的XRD谱如图3所示。在图3各样品的XRD图谱中可以得到:MNP、AM和SA@AM在相同位置出现6个典型特征峰,分别为2θ=30.3°、35.4°、43.2°、53.9°、57.2°和 62.8°,分别对应(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)6种Fe3O4在X射线中的晶面[14]。其中特征峰的位置和强度均没有发生变化,结构为Fe3O4反尖晶石,磁铁矿晶型表现为顺磁性[15]。表明在改性磁性纳米粒子过程均未改变磁性材料的晶型结构。此外,图3中AM与MNP的XRD曲线比较,非晶相衍射峰在2θ=20.0°~30.0°内出现。此峰是由于非晶相的氨基硅烷包裹在MNP表面所致。终产物SA@AM与SA、AM的XRD曲线图相比,在2θ=20.0°~27.0°内出现SA的非晶相衍射峰;另外,由于SA包覆在MNP表面,使得终产物中Fe3O4在2θ=53.9°的衍射峰变宽。这些结果进一步证明产物磁性粒子MNP、AM和SA@AM的成功合成。
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原始产物MNP、AM和终产物SA@AM的VSM分析磁化曲线如图4所示。产物的磁场饱和强度采用磁强度计进行测定[16]。在300 K、外部磁场为−1~1 T条件下,各产物几乎无剩磁产生,因为其磁滞曲线为S型而且过原点,同时矫顽力和剩余磁场强度都接近0[17],表明所制备的MNP、AM和SA@AM具有超顺磁性而且有良好的磁力响应性能[18]。测试的结果表示:MNP、AM和SA@AM的磁化值分别为13.8、13.4和6.85 A·m2·kg−1,SA@AM比MNP和AM的磁化值高。粒子表面被硅烷官能团覆盖可能影响产物AM的磁化值,这或许是AM的磁性比MNP稍低的原因。AM被海藻酸钠包覆影响SA@AM的磁化性能,造成其磁性减弱。
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样品的吸光度采用原子分光光度计检测,吸附量根据吸光度结合公式(1)计算得出 [19]。
$$ Q=\frac{\left(C_{0}-C_{\rm{e}}\right) V}{W}\text{。} $$ (1) 式(1)中:Q表示吸附量(mg·g−1),W表示凝胶的质量(g),C0表示重金属离子的初始质量浓度(mg·L−1),Ce表示金属离子的最终质量浓度(mg·L−1),V表示吸附溶液的体积(mL)。根据公式(1)计算新型磁性微球SA@AM对Pb2+的吸附量,绘制等温吸附性曲线,如图5所示。吸附等温线选择常用的Freundlich和Langmuir模型,其线性方程表示分别如下:
$$ \ln q_{\mathrm{e}}=\ln K_{\mathrm{F}}+\frac{1}{n} \ln C_{\rm{e}}^{\prime} \text{;} $$ (2) $$ \frac{C_{\rm{e}}^{\prime}}{q_{\rm{e}}}=\frac{C_{\rm{e}}^{\prime}}{q_{\rm{max }}}+\frac{1}{q_{\rm{max }} K_{\rm{L}}}\text{。} $$ (3) 式(2)和式(3)中:
${C}_{\rm{e}}'$ 表示平衡时离子质量浓度(mg·L−1);qe为平衡时的吸附量(mg·g−1);qmax为饱和时的吸附量(mg·g−1);KF和n是Freundlich的吸附常数; KL是Langmuir的吸附常数。材料等温吸附特性分别采用Freundlich和Langmuir模型[20]进行拟合,拟合曲线和结果如图6所示。图 6 SA@AM的Langmuir(A)和Freundlich(B)吸附模型拟合图
Figure 6. Fitting diagram of the adsorption model of Langmuir (A) and Freundlich (B) of SA@AM
由图5凝胶等温吸附性曲线可知:SA@AM凝胶对Pb2+的最大饱和吸附量为102.12 mg·g−1。随着Pb2+溶液质量浓度的增加,吸附剂对其吸附量也明显增加直至饱和。凝胶对Pb2+的吸附过程具有规律性,显著性检验系数P<0.01表明呈极显著相关。由图6可知:Langmuir模型和Freundlich模型的线性相关系数分别为0.9786和0.9509,对2个相关系数进行显著性检验,均为极显著正相关(P<0.01)。由数值大小可见:Langmuir模型较Freundlich模型线性相关高。Langmuir模型线性拟合结果与实际测试结果较为相近,SA@AM对Pb2+的最大吸附量为105.82 mg·g−1,故凝胶吸附材料对Pb2+的吸附热力学行为更符合Langmuir吸附等温模型。
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SA@AM对Pb2+的吸附量根据公式(1)计算,动力学吸附曲线如图7所示。常采用准一级反应动力学模型
$\ln \left(q_{\mathrm{e}}-q_{\mathrm{t}}\right)=\ln q_{\mathrm{e}}-$ $K_{1} t $ 和准二级反应动力学模型[21]$\dfrac{t}{q_{t}}=\dfrac{1}{K_{2} q_{\rm{e}}^{2}}+\dfrac{t}{q_{\rm{e}}}$ 描述吸附反应动力学过程。其中:t是吸附时间;qe为吸附达平衡时吸附材料对重金属的吸附量(mg·g−1);qt为t时吸附材料对重金属的吸附量(mg·g−1);K1为一级吸附速率常数;K2为二级吸附速率常数。吸附剂动力学吸附特性分别采用准一级动力学模型和准二级动力学模型对其进行拟合,拟合方程及结果如图8所示。由图7可知:吸附量随时间增加而增大。在吸附反应的初始阶段(0~45 min),凝胶吸附速率大;在50~80 min时,吸附速率逐渐减慢。当时间达80 min时,水凝胶对Pb2+的吸附基本上达到了吸附动力学平衡。SA@AM对Pb2+的吸附过程是有规律性的,经显著性分析,呈极显著相关(P<0.01)。由图8可知:实验过程中,SA@AM凝胶对Pb2+的最大饱和吸附量为91.72 mg·g−1,从准一级吸附动力学模型线性拟合结果和准二级吸附动力学模型线性拟合结果可得:SA@AM凝胶对Pb2+最大吸附量分别为98.74和101.60 mg·g−1。由此可见:相比于实测值,准二级吸附动力学模型线性拟合的平衡吸附量比准一级动力学模型拟合的更接近。动力学吸附拟合方程的参数可以看出:准二级吸附动力学模型线性相关性(R2=0.982 8)较准一级动力学模型相关性(R2=0.956 6)高,表明极显著相关(P<0.01),故吸附材料对Pb2+的吸附动力学行为更符合准二级吸附动力学模型。LI等[22]关于海藻酸铁介孔碳微球对砷吸附性能的研究,以及CHEN等[23]关于海藻酸钠与纳米Fe3O4共混凝胶球对有机污染物甲基橙的吸附行为的研究均得到类似结果。
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图9显示:磁性海藻酸钠凝胶球对Pb2+有良好的磁分离效果,这是由于海藻酸钠凝胶球中包覆有氨基末端的磁性粒子,使得凝胶球含有磁性。参考文献[24]方法,通过吸附-解吸过程来测试磁性海藻酸钠凝胶球的重复利用性。恢复率如图10所示。图10表明:SA@AM对Pb2+的去除率与重复循环解吸次数有关,而且吸附率逐渐减少。每次重复吸附-解吸后,凝胶对Pb2+的吸附量减少6%~7%。经过重复循环5次后,SA@AM对Pb2+的吸附去除率保持在76%以上,说明SA@AM循环性能良好,利于对Pb2+的重复吸附。
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本研究通过滴定法,将表面接枝端氨基的磁性纳米颗粒包覆于海藻酸钠凝胶球中,制备得到1种新型磁性海藻酸钠复合凝胶球(SA@AM),并通过各种表征方法测试产物,得出结论如下:①红外光谱表明:已经成功获得磁性凝胶产物,通过分析元素质量分数及分布情况证实了产物的元素结构。XRD光谱分析证明端氨基磁性颗粒的非晶相峰的出现;磁化曲线分析可知:产物具备优异磁性能,同时磁化值的差异证实了磁性凝胶球的成功制备。②SA@AM具有独特的磁响应性能,对Pb2+具有较好的吸附能力,达102.12 mg·g−1,吸附能力相比于已有的磁性纳米材料(吸附能力65~90 mg·g−1)更优[25];二级动力学模型更符合凝胶球的吸附动力学性能,Langmuir模型更能充分描述凝胶球的等温吸附规律。循环脱附-吸附过程中证明了材料具有良好的重复利用性能。③本研究所制备出的SA@AM,相比化学吸附剂具有功能磁响应性,可以通过控制外加磁场实现对吸附剂分离回收,为生态环境中治理重金属污染提供了1种绿色、高效的新型应用型功能吸附剂。
Preparation of magnetic sodium alginate composite gel balls and their adsorption properties for Pb2+
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摘要:
目的 磁性凝胶微球是新型吸附剂,其高效去除污染物的功能和重复利用性能受到热切关注,因此制备1种新型的磁性凝胶球极有必要。 方法 将离子共沉淀法制备的磁性粒子(MNP)用作载体进行硅烷化反应以合成具有氨基末端的磁性纳米颗粒(AM)。静电作用将海藻酸钠(SA)包覆在磁性颗粒表面,制备了1种富含氨基、羟基和羧基多官能团的新型磁性复合凝胶球(SA@AM)。利用傅立叶变换红外光谱(FTIR)、元素分析仪、X射线衍射仪(XRD)、扫描/透射电子显微镜(SEM/TEM)、振动样品磁力计(VSM)表征产物,并开展产物对重金属离子吸附性能研究。 结果 成功制备的目标功能复合凝胶球(SA@AM)呈顺磁性磁铁矿晶型,SA@AM凝胶球的尺寸为1.5~2.0 mm;MNP、AM、SA@AM的磁化值分别为13.8、13.4和6.85 A·m2·kg−1。吸附实验显示:SA@AM对重金属铅离子(Pb2+)表现出高效吸附能力,对Pb2+的最大吸附量为105.82 mg·g−1,吸附机理更符合Langmuir等温吸附模型。重复吸附-解吸实验表明:SA@AM对Pb2+的去除率≥76%。 结论 新型海藻酸钠磁性复合凝胶球对重金属Pb2+有着优异的吸附能力,同时磁性凝胶球有着良好的再生性能。图10表1参25 Abstract:Objective Magnetic gel balls are new adsorbents which can efficiently remove pollutants and can be reused. Therefore, it is necessary to prepare a new type of magnetic gel ball. Method Magnetic particles (MNP) prepared by the ion co-precipitation method were used as carries for silanization reaction to synthesize magnetic nanoparticles (AM) with amino terminals. A novel magnetic composite gel ball (SA@AM) containing amino, hydroxyl and carboxyl multifunctional groups was prepared by coating sodium alginate (SA) on the surface of magnetic particles with electrostatic effect. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), elemental analyzer, X-ray diffractometer (XRD), scanning/transmission electron microscope (SEM/TEM), and vibrating sample magnetometer (VSM) were used to characterize the product, and the adsorption properties of the products for heavy metal ions were studied. Result The target functional composite gel ball (SA@AM) successfully prepared was of paramagnetic magnetite crystal type, and the size of the SA@AM gel ball was 1.5−2.0 mm. The magnetization values of MNP, AM, SA@AM were 13.8, 13.4, and 6.85 A·m2·kg−1, respectively. Adsorption experiments showed that the maximum adsorption capacity of heavy metal Pb2+ by SA@AM was 105.82 mg·g−1, and the adsorption mechanism was more in line with the Langmuir isothermal adsorption model. Repeated adsorption-desorption experiments showed that the removal rate of Pb2+ by SA@AM was more than 76%. Conclusion The new sodium alginate magnetic composite gel ball has excellent adsorption capacity for heavy metal ions Pb2+, and the magnetic gel ball has good regeneration properties. [Ch, 10 fig. 1 tab. 25 ref.] -
Key words:
- environmental protection /
- magnetic nanoparticles /
- sodium alginate /
- adsorption property /
- Pb2+
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在遗传转化获得抗性植株时,转化体的抗性筛选是遗传转化能否取得成功的关键步骤。通常在选择培养基中加入合适种类和浓度的筛选剂,使其产生一定的筛选压起到抗性筛选的作用。转化体内选择标记基因的表达产物可对特定筛选剂产生抗性,使转化受体材料继续保持正常的生长发育[1]。目前的研究中,卡那霉素、潮霉素等抗生素被普遍作为筛选剂使用[2-3]。但是由于水稻Oryza sativa胚性愈伤组织对抗生素具有生理抗性,以抗生素为选择标记进行抗性筛选,不能起到很好的筛选效果,且经抗生素筛选后的转化体在分化和再生阶段易受抑制或产生白化苗[4-6]。以草甘膦作为筛选剂可以提高选择的灵敏度,消除转化体生理抗性对筛选结果的影响,克服了以往研究中抗生素筛选的局限性。可遗传的草甘膦抗性基因突变率低,并可在后代中稳定表达,因此进行抗草甘膦作物的培育是可行的[7]。籼稻Oryza sativa subsp. indica和粳稻Oryza sativa subsp. japonica是栽培稻的2个亚种,随着水稻遗传转化技术的发展,大部分粳稻品种已经建立了成熟的遗传转化体系,并成功引入抗虫、抗病、生长发育调控等诸多有利基因[8]。而大多数籼稻品种组培特性不佳,愈伤组织诱导率低,继代过程易褐化且分化再生频率低,导致籼稻的遗传转化效率低,有的品种甚至难以转化。尤其是对生产上广泛推广、农艺性状优良的重要品种而言,其改良与育种进程受到严重限制[9]。CHAN等[10]于1992年尝试利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法转化籼稻幼根愈伤组织,对转化体进行Southern印记杂交,结果表明:目的基因片段已成功转入转化体细胞中。后经酶活性检测,目的基因可在转化体中稳定表达。1994年,HIEI等[11]为建立高效稳定的农杆菌遗传转化体系,采用了“双超元”载体,并通过在菌液添加乙酰丁香酮(As)活化Vir基因提高转化效率等方法,推进了遗传转化技术在籼稻中的研究应用。目前,虽然已有转抗草甘膦基因的籼稻遗传转化体系的报道,但是转化效率低,还未建立一个高效的转化体系[12]。基于此,本研究选取具有成功再生体系的籼稻‘中恢161’ Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’为材料,利用农杆菌介导法,转入草甘膦抗性基因(CP4),探索适合的草甘膦质量浓度用于抗性筛选,并对农杆菌介导的转化过程进行了合理优化,建立‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。
1. 材料与方法
1.1 材料
籼稻‘中恢161’成熟胚;农杆菌菌株EHA105;含CP4基因的表达载体p1300-HC。
1.2 方法
1.2.1 成熟胚胚性愈伤组织的诱导和增殖
将成熟种子去壳,进行消毒[13],接种于诱导培养基R1[NB(N6+B5)+3.0 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite]上,接种20 粒·皿−1。放入培养条件为28 ℃,光照16 h/黑暗8 h的组培室中诱导培养。5~7 d后,可观察到幼芽处有淡黄色愈伤组织,统计每皿的出愈数和出愈率。15 d后,剥下色泽鲜黄、结构紧密、生理状态良好的胚性愈伤组织,分散平铺于新鲜配制的胚性愈伤组织增殖培养基R1上进行增殖培养。继代2~4次后,增殖并产生大量的胚性愈伤组织,可用做后期转化的受体材料。
1.2.2 胚性愈伤组织的草甘膦敏感性测试
设置5组草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L−1),重复3次,设空白对照,接种20块·皿−1。15 d后,观察胚性愈伤组织的色泽、是否增殖等外观形态,统计胚性愈伤组织褐化率,选出合适的草甘膦质量浓度范围作为筛选压。
1.2.3 胚性愈伤组织的遗传转化和抗性筛选
利用悬浮培养基R2(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮)将培养好的含CP4基因表达载体的农杆菌菌株EHA105稀释至D(600)为0.5~0.8,用其侵染胚性愈伤组织[14]。将转化好的胚性愈伤组织用无菌滤纸吸干多余的菌液,适当干燥后,用灭菌镊子夹取愈伤组织分散地平铺在铺有1层无菌滤纸的共培养培养基R3(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮+4.0 g·L−1Gelrite)上,20 块·皿−1。于25 ℃培养室中暗培养2~3 d。取出共培养后的愈伤组织,用含100 mg·L−1羧苄青霉素的无菌蒸馏水清洗3~4次,直至清洗液澄清透明。适度干燥后,用镊子夹取愈伤组织整齐均匀地平铺在筛选培养基R4(NB+3 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite+0.5 g·L−1头孢霉素+不同质量浓度草甘膦)上。抗性筛选培养基中草甘膦质量浓度分别为300、350和400 mg·L−1。
1.2.4 分化、生根、移栽成活
将抗性愈伤组织系移至分化培养基R5(NB+0.5 mg·L−1 NAA+3.0 mg·L−16-BA+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite)上进行分化培养。约15~25 d,部分抗性愈伤组织长出绿点。待绿点进一步分化形成小苗,并长至2 cm左右时将其转移至生根培养基R6(1/2NB+20.0 g·L−1蔗糖+0.1 g·L−1肌醇+8.0 g·L−1琼脂)上生根培养。待幼苗生长出大量的茁壮根系,可将其从生根培养基中取出,小心洗净其根系附着的培养基,置于培养箱中炼苗,增强幼苗对环境的适应性,1周后将健壮的幼苗移至大棚成活。
1.2.5 转基因植株的分子检测和CP4基因试纸条检测蛋白表达
利用TPS法提取转基因植株叶片DNA。利用CP4基因引物(CP4-F: TTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG, CP4-R: TCCTTCATGTTCGGCGGTCTC)进行CP4基因的PCR扩增,目的片段大小为400 bp。扩增后的产物经质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,统计阳性率。取阳性植株叶片,利用CP4基因表达检测试纸条进行再生植株抗性检测。
2. 结果和分析
2.1 草甘膦抗性筛选最适质量浓度
图1和图2所示:‘中恢161’的胚性愈伤组织在不含草甘膦的培养基中可正常生长且大量增殖,未发生褐化现象;在含100 mg·L−1草甘膦的培养基中,绝大多数胚性愈伤组织可正常生长增殖,褐化率低,仅为5.00%,未起到选择作用;在含200 mg·L−1草甘膦的培养基中褐化率为16.67%,选择效果不明显;在含300 mg·L−1草甘膦的培养基中,褐化率为41.67%,且与200 mg·L−1相比差异显著(P<0.05),选择效果好,适合作为筛选压;在含400 mg·L−1草甘膦的培养基中,大部分胚性愈伤组织发生褐化,少部分正常生长,褐化率为65.00%,选择效果明显;在含500 mg·L−1草甘膦的培养基中,胚性愈伤组织基本发生褐化,褐化率为91.67%,显著高于其他质量浓度下的褐化率(P<0.05),说明选择压过大。结果表明:草甘膦质量浓度为300~400 mg·L−1时,胚性愈伤组织褐化率约50%,具有很好的筛选效果。
2.2 抗性愈伤组织和转基因植株的分子检测
转化后的胚性愈伤组织在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选,分别获得200、113、和84块抗性愈伤组织,提取抗性愈伤组织DNA进行CP4基因的PCR检测,阳性愈伤组织的PCR扩增产物经电泳可获得长度为400 bp的条带,与预期相符,表明CP4基因已成功整合到转化体内。进行3个草甘膦质量浓度抗性筛选后愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%。共获得67株再生植株,提取再生植株叶片DNA进行CP4基因的PCR检测。其中阳性植株43株,再生植株阳性率为64.18%(图3)。
2.3 CP4基因试纸条检测蛋白表达
抗性检测结果(图4)表明:检测的43株PCR阳性植株中,有25株表现为CP4基因表达,表达率为58.13%。
2.4 ‘中恢161’成熟胚遗传转化体系的建立
遗传转化再生过程如图5所示:对籼稻‘中恢161’成熟胚进行胚性愈伤组织诱导,约7 d可诱导出胚性愈伤组织(图5A)。胚性愈伤组织进行2~4次继代增殖(图5B),约40 d后进行遗传转化。转化后的胚性愈伤组织在选择培养基上进行抗性筛选(图5C~D),一段时间后,抗性愈伤组织系会出现增殖(图5E)。约50 d后,抗性愈伤组织于R5培养基上进行分化培养,约15~25 d,长出绿点(图5F)。1个月左右,长出小苗(图5G)。小心取出转移至R6培养基进行生根培养(图5H)。约15 d,幼苗长出大量的茁壮根系,将其从培养基中移出,小心洗净根部培养基。置于培养箱中炼苗,炼苗1周后可移至大棚成活。对再生植株进行CP4基因的PCR检测,保留阳性植株。从诱导胚性愈伤组织至获得抗草甘膦再生植株的整个过程需要4~6个月。
3. 结论与讨论
3.1 草甘膦抗性筛选及其优势
本研究建立了以草甘膦抗性基因CP4为选择标记的‘中恢161’遗传转化体系。非转化体的EPSPS酶活性较低,草甘膦可与S3P形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体而竞争性抑制EPSPS酶活性,植物体内蛋白质合成受阻,生长受到抑制,不能正常生长分化[15]。而转化体抗草甘膦基因CP4的表达产物EPSPS酶具有高催化活性和低草甘膦亲和力不易与草甘膦结合,故能够进行正常的生长分化。因此,通过草甘膦筛选可获得转抗草甘膦基因CP4的再生植株。相较于以抗生素抗性基因为选择标记,草甘膦抗性基因不仅能作为筛选标记也能作为目的基因,使受体植物获得除草剂抗性,而且草甘膦比潮霉素等抗生素便宜[7]。不同植物细胞对草甘膦的抗性存在差异,选择合适的草甘膦质量浓度作为抗性筛选的筛选压是影响转化效率的关键因素。本研究将转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选,进一步分化、成苗,共获得67株再生植株,进行CP4基因的PCR检测,其中阳性植株43株,再生植株阳性率为64.18%,达到很好的选择效果。
3.2 籼稻遗传转化体系的优化
3.2.1 受体材料的选择及胚性愈伤组织的代龄
能否成功进行遗传转化的重要前提是选择适合的植物材料作为转化受体。水稻幼胚分裂能力强,易形成大量优质胚性愈伤组织,但受季节的影响,水稻幼胚利用不便,且在组织培养过程中易受微生物污染,转化效率不高,因此作为转化体存在一定的困难[16]。成熟胚方便储存与利用,不受季节限制和胚性愈伤组织诱导率较高,通常被作为遗传转化和再生的良好的外源体材料。苏军[17]比较了不同代龄的胚性愈伤组织,发现第4、5代的胚性愈伤组织转化效率较高,并且分化能力也较强。早代愈伤组织不易接受外源遗传物质。但晚代愈伤组织容易出现质地软、水渍化等现象,影响遗传转化成功率。本研究选择胚性愈伤组织代龄为3~4代,可有效减少愈伤组织老化、色泽暗黄、结构松散和褐化率高等问题,有效提高了遗传转化效率。
3.2.2 转化过程的优化
为提高遗传转化效率,本研究采取一系列措施对转化过程进行合理优化。①转化阶段选用色泽鲜黄、外观形态良好、结构紧致的愈伤组织与农杆菌共培养,淘汰外观发白发软发褐的愈伤组织。②在共培养基R2和悬浮培养基R3中加入100 μmol·L−1乙酰丁香酮,可诱导农杆菌Vir基因的活化,从而促进外源基因的整合,极大提高转化效率[18]。③农杆菌菌液经悬浮培养液R3稀释后,D(600)为0.5~0.8。此时为最适菌液浓度,既不会使农杆菌在转化体表面过多繁殖影响其正常生长,又具一定的侵染能力,提高了转化效率。④黑暗条件下共培养2~3 d为适合的共培养时长。共培养时间过短,目的基因不能成功整合至转化体细胞内[19-20]。
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表 1 产物样品中各元素质量分数
Table 1. The mass fraction of each element in the product sample
磁性材料 元素质量分数/% 碳 硅 氧 氮 铁 MNP 13.27 0.01 16.12 0.37 53.25 AM 14.74 4.98 15.97 4.72 47.34 SA@AM 32.96 1.92 20.21 2.34 26.46 -
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20190751