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长喙毛茛泽泻Ranalisma rostratum 是泽泻科Alismataceae毛茛泽泻属Ranalisma多年生莲座状沼生小草本植物，产于中国的浙江、江西、湖南省以及越南和马来西亚[1]。1930年，在浙江省丽水市南明山首次采到长喙毛茛泽泻标本[2]，之后几十年不曾采到，一度被认为灭绝。直到20世纪90年代，研究人员才相继在江西省东乡县和湖南省茶陵县陆续发现野生长喙毛茛泽泻种群[3]。由于人类对其生境的破坏和本身生存、竞争能力较差，湖南茶陵和江西东乡野外长喙毛茛泽泻种群已消失[2]。1999年，国家林业局和农业部正式发布了中华人民共和国《国家重点保护野生植物名录(第1批)》，长喙毛茛泽泻被列为极度濒危的植物，为国家Ⅰ级保护野生植物[4]。2008年，浙江省人文园林有限公司天景水生植物园从杭州植物园交换引入了长喙毛茛泽泻，并进行了大规模的迁地扩繁[5-6]。2015年，浙江省丽水市莲都区林业技术推广站从天景水生植物园引进长喙毛茛泽泻5000株，开始回归原生地试验。目前，在丽水市莲都区布局了3个回归示范点，2019年8月，每个示范点繁育长喙毛茛泽泻小苗不少于5000株，已初步具备了开发利用的物质基础。目前，国内学者围绕长喙毛茛泽泻繁育特性与遗传多样性[7-8]、有性生殖系统[9-13]、生物学特性与生活史[2,14]、种群生态与环境适应性[15-19]等方面开展研究，目的是揭示其濒危机制，为制定保护策略提供依据。但关于长喙毛茛泽泻植株营养成分和毒性试验的研究尚无报道。本研究测定了采自丽水3个示范点的长喙毛茛泽泻植株茎叶和根的主要营养成分，并对茎叶的急性经口毒性进行初步研究，以期为长喙毛茛泽泻的进一步保护利用提供理论依据。
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本研究所用的长喙毛茛泽泻植株分别来自丽水南明山、莲都区大港头镇和莲都区老竹镇。南明山样地处于丽水市南明山风景名胜区，长喙毛茛泽泻被栽植在一片沼泽地中，沼泽地处于森林边缘，森林整体郁闭度为0.5~0.7；沼泽周围有毛竹Phyllostachys edulis、枫香Liquidambar formosana等乔灌树种；沼泽地水位维持在2~10 cm，伴生植物有蕺菜(鱼腥草)Houttuynia cordata、蕨Pteridium aquilinum var. latiusculum、苎麻Boehmeria nivea、野芋Colocasia antiquorum 等。大港头样地位于丽水市莲都区大港头镇，长喙毛茛泽泻被栽植在水田，伴生植物有丁香蓼Ludwigia prostrata、喜旱莲子草Alternanthera philoxeroides等；水田呈梯田状，有高低落差，水位常年维持在5~15 cm，且有进水出水口，水流较缓；样地周边无乔灌木遮阴。老竹乡样地位于丽水市莲都区老竹乡，长喙毛茛泽泻被栽植在水田里，伴生植物有刺芋(野茨菇)Lasia spinosa、莲Nelumbo nucifera和喜旱莲子草等；水田坡度较为平缓，周围缺乏乔灌木遮阴；8月莲叶已展开，此时郁闭度接近0.9；水田水位及出水情况与大港头样地基本一致。
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2019年8月26日，每个试验地采集1份样品，每份样品鲜质量为300~1000 g。沥干样品表面水分，用精度为0.01 g的天平称量植株鲜质量，之后摊放在竹篾上曝晒，待连续3 d样品质量下降不超过1%时，认为样品已风干。2020年6月15日，再次采集南明山示范点样品1份，进行相同处理。
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剪掉风干后的长喙毛茛泽泻样品根系，将茎叶与根系分离，用精度为0.01 g的天平称量茎叶质量和根系质量，计算干鲜比和茎叶与根系生物量比，然后进一步检测风干样品茎叶和根的脂肪、氮、磷、钾和其他金属离子质量分数。每份样品每个指标重复测定3次。
将经营养元素测定后剩余样品的干燥茎叶用于小鼠急性经口毒性试验。称取干燥的茎叶35.00 g，用小型干磨研磨机在常温下(25 ℃)粉碎30 s，待无明显茎叶残渣时停止粉碎，刮取茎叶粉末，过 20目筛，去除未充分粉碎的颗粒，得到绿色均匀粉末状样品。称取上述粉末样品10 g，以质量分数1%羧甲基纤维素钠为溶媒溶解配制成80 mL悬浮样液。每个样品共配制这样的悬浮样液3瓶，每瓶80 mL，4 ℃冰箱冷藏备用。
小鼠急性经口毒性试验委托浙江省医学科学院完成。实验用小鼠Mus musculus由浙江省实验动物中心提供，SPF级，实验动物生产许可证号为SCXK(浙)2019-0002，实验动物使用许可证号为SYXK (浙)2019-0011，实验动物饲料由浙江省实验动物中心提供。实验所用小型干磨研磨机型号为TY-150A，由永康市敬业工贸有限公司生产。实验用天平型号为BS2202S，量程2.0 kg，由赛多利斯(北京)科学仪器有限公司生产。检测环境条件：温度为20~25 ℃，相对湿度为40%~70%。
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长喙毛茛泽泻样品植株中脂肪、全氮、全磷和6种金属元素质量分数的测定委托浙江方圆检测集团股份有限公司检测，其中脂肪质量分数依据GB 5009.6−2016《食品安全国家标准：食品中脂肪的测定》测定；茎叶和根中全氮质量分数的测定参照HJ 717−2014《土壤质量 全氮的测定 凯氏法》测定，全磷质量分数的测定参照NYT 88−1988《土壤全磷测定法》测定；钾、钙、镁、铁、锰和锌质量分数依据GB 5009.268−2016《食品安全国家标准：食品中多元素的测定》测定。
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①实验动物：选用健康、成熟，体质量18~22 g(美国癌症研究所分送)小鼠20只，雌雄小鼠各10只。②剂量和给药方法：按限量法设7.5 g·kg−1(体质量)1个剂量组。灌胃前小鼠禁食(禁水)6 h后，用悬浮样液按20 mL·kg−1 灌胃容量对小鼠进行灌胃，共计3次，每次间隔4 h，末次灌胃2 h后小鼠自由进食、饮水。③观察指标：灌胃后，观察小鼠的一般状况、中毒表现和死亡情况，观察期限为14 d，记录小鼠实验期初及期末体质量。
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由表1可知：长喙毛茛泽泻的干鲜比为0.17~0.19，整个植株，特别是茎叶部分的含水率较高。长喙毛茛泽泻茎叶与根的生物量之比为1.8~2.5，不同取样时间和取样地，茎叶与根的生物量之比相差很大，其中南明山2号样品和大港头镇样品的茎叶与根的生物量之比高于其余2个样地，特别是南明山2号样品。对表1的结果分析发现：未结实的长喙毛茛泽泻植株，其茎叶与根的生物量之比相较已结实的植株要高，茎叶生物量占整个植株的比例大。主要原因在于不同采样时期植株的成熟度和植株长势不一样，南明山2号采集时间为2020年6月中旬，长喙毛茛泽泻还未开花，此时植株生长比较旺盛；而大港头镇、南明山1号和老竹乡样品的采集时间为2019年8月，此时3个样品均已结实，植株长势开始衰败。
表 1 长喙毛茛泽泻3个样地4份样品的干鲜比和生物量
Table 1. Dry-fresh ratio and biomass of 4 batches of R. rostratum from 3 samples places
样品 结实与否 干鲜比 生物量 干质量/g 鲜质量/g 干鲜比 茎叶质量/g 根质量/g 茎叶/根 南明山1号 已结实 144.57 750 0.19 93.33 51.24 1.82 南明山2号 未结实 61.25 370 0.17 43.70 17.55 2.49 大港头镇 已结实 86.56 500 0.17 58.54 28.02 2.09 老竹乡 已结实 165.53 1000 0.17 107.96 57.57 1.88 说明：生物量栏中，茎叶质量和根质量都是指样品的干质量 -
由表2可知：长喙毛茛泽泻植株中脂肪、氮和钾质量分数均为25.00 mg·g−1左右，脂肪质量分数的最大最小值之比小于5，且变异系数为39.86%，说明脂肪在不同样品和植株器官间变异不大。营养元素平均质量分数大于10.00 mg·g−1的有氮和钾，平均质量分数为5.00~10.00 mg·g−1的有铁和钙，平均质量分为1.00~5.00 mg·g−1的有磷和镁，平均质量分数小于1.00 mg·g−1的有锰和锌。锌与大量元素氮和钾的平均质量分数相差了近3个数量级。各营养元素质量分数均值从高到低依次为氮、钾、铁、钙、磷、镁、锰、锌。
表 2 脂肪和各营养元素质量分数范围、均值和变异系数
Table 2. Range, mean values and coefficient variation of fat and nutrient elements
项目 脂肪及各养元素质量分数/(mg·g−1) 变异系数/% 最小值 最大值 最大/最小 平均值 标准差 脂肪 9.00 36.00 4.00 23.13 9.22 39.86 氮 22.40 34.20 1.53 26.50 4.53 17.09 钾 15.90 39.10 2.50 25.08 9.14 36.44 磷 0.50 8.50 17.00 3.87 3.28 84.70 铁 0.17 33.00 194.12 6.49 11.12 171.43 钙 3.30 9.71 2.94 6.21 2.33 37.58 镁 0.00 2.70 900.00 1.07 1.20 111.33 锰 0.38 1.52 4.00 0.68 0.38 56.70 锌 0.03 0.09 2.94 0.06 0.02 36.21 与世界陆生维管植物元素平均质量分数范围相比较[20]，丽水3个回归示范点4份长喙毛茛泽泻样品的氮、磷、钾、钙、镁这5种大量必需营养元素质量分数均在正常范围内(表2)。但与陆生高等植物所需元素的适合平均质量分数值相比较[21]，该5种元素的质量分数，除镁外，氮、磷、钾和钙均高于已报道的陆生高等植物所需元素的相应组织，这可能与长喙毛茛泽泻为水生草本植物有关。从变异系数来看，8种营养元素从大到小依次为铁、镁、磷、锰、钙、钾、锌、氮，铁质量分数在各样品和组织间变异系数最大，其次是镁和磷，说明铁、镁和磷在各样地和植株器官间质量分数不稳定，受样地环境影响较大。氮质量分数在各样品和植株器官间变异系数最小，说明氮在植株体内相对稳定。从元素质量分数的最大值与最小值之比(以下简称最大最小比)来看，镁的最大，其次是铁，再次是磷，其他元素均小于5.00，最大最小比从大到小的顺序与变异系数的顺序基本一致，进一步说明长喙毛茛泽泻中的镁、铁和磷质量分数不够稳定，而其他元素均较稳定。
由图1可知：南明山1号样品的脂肪质量分数最高，老竹乡样品中的脂肪质量分数最低，脂肪质量分数在4个样品之间存在显著差异(P＜0.05)。7种营养元素在样品内和各样品间的变异系数很大。铁质量分数在大港头镇样品中最高，而在南明山2号样品中的最低，两者均值相差30倍左右，但铁质量分数在4个样品中却无显著差异；镁质量分数均值在南明山1号样品中低于检测限(＜0.003 mg·g−1)，而在其他各样品中平均质量分数均在1.00 mg·g−1以上；由于锌质量分数极低，锌元素质量分数不纳入样品和器官的比较分析。除了未做分析的锌，7种营养元素在4个样品间均无显著差异。
图 1 4个样品茎叶和根的脂肪及营养元素平均质量分数
Figure 1. Average contents of fatty acid and nutrient elements in the stems，leaf and root of the four samples
由表3可见：脂肪质量分数在长喙毛茛泽泻的茎叶和根之间无显著差异，氮、磷、钾和钙在茎叶和根间存在显著差异(P＜0.05)，说明长喙毛茛泽泻根系对这些元素具有选择吸附性；铁元素在茎叶和根的平均质量分数(分别为1.22和11.75 mg·g−1)虽相差了1个数量级，但茎叶和根间却并无显著差异，原因在于铁质量分数在个别样品(大港镇)的根系中极高，在不同样品的不同组织之间变异极大(变异系数为123.67)，导致了方差匀齐度很低。这也说明长喙毛茛泽泻根系对土壤中的铁离子有富集作用。根系中的锰和镁元素在质量分数高于茎叶中的，但在茎叶和根之间差异不显著(P＞0.05)，表明这2种元素在茎叶和根之间没有明显的分布倾向性。
表 3 长喙毛茛泽泻茎叶与根系的脂肪和营养元素均值及显著性分析
Table 3. Mean value and significance analysis of fat and nutrient elements in stem, leaf and root
测定
指标测定
部位平均值/
(mg·g−1)自由度 组间均
方差F P 脂肪 茎叶 27.00±8.98 1 120.125 1.518 0.264 根 19.25±8.81 氮 茎叶 30.30±3.04 1 115.520 24.754 0.003 根 22.70±0.29 钾 茎叶 32.55±6.50 1 447.005 19.516 0.004 根 17.60±1.87 磷 茎叶 1.00±0.56 1 66.298 43.928 0.001 根 6.75±1.64 铁 茎叶 1.22±1.72 1 221.825 2.067 0.201 根 11.75±14.55 钙 茎叶 8.08±1.67 1 27.975 16.485 0.007 根 4.34±0.78 镁 茎叶 0.37±0.73 1 3.996 3.989 0.093 根 1.78±1.21 锰 茎叶 0.52±0.16 1 0.200 1.447 0.274 根 0.83±0.50 -
由表4可见：脂肪和营养元素质量分数之间的相关系数在较大范围内波动，说明不同元素之间的相互关系较为复杂。分析脂肪和8种营养元素的36 对因子的相关关系可知：7对因子间存在显著相关性，如钾与氮，磷与氮、钾，钙与氮、钾、磷，镁与磷，占总对数的19.44%。其中，氮与钾、钙呈极显著正相关(P＜0.01)，与磷呈极显著负相关；钾与磷呈极显著负相关(P＜0.01)，与钙呈显著正相关(P＜0.05)；磷与钙呈显著负相关(P＜0.05)，与镁呈显著正相关(P＜0.05)。这些结果说明：长喙毛茛泽泻的氮、钾、钙之间存在协同作用，与磷存在拮抗作用；镁与磷存在协同作用。
表 4 长喙毛茛泽泻植株脂肪和8种营养元素间相互关系
Table 4. Correlation between plant fat and 8 nutrient elements
元素 脂肪 氮 钾 磷 铁 钙 镁 锰 锌 脂肪 1 氮 0.527 1 钾 0.522 0.975** 1 磷 −0.695 −0.876** −0.844** 1 铁 −0.399 −0.497 −0.540 0.589 1 钙 0.158 0.850** 0.802* −0.762* −0.343 1 镁 −0.463 −0.402 −0.440 0.717* 0.377 −0.520 1 锰 0.331 −0.348 −0.268 0.168 −0.104 −0.398 −0.243 1 锌 0.065 0.086 −0.107 0.044 0.222 0.024 0.515 −0.264 1 说明：*表示显著相关(双尾t检验，P＜0.05); **表示极显著相关(双尾t检验，P＜0.01) -
如表5所示：实验期间，小鼠均未出现中毒表现，无死亡。长喙毛茛泽泻叶片对雌雄小鼠经口半致死量(LD50)均大于7.5 g·kg−1(体质量)，按急性毒性分级标准判定，属实际无毒级。
表 5 长喙毛茛泽泻茎叶的小鼠急性经口毒性试验结果
Table 5. Acute oral toxicity test in mice of leaf of R. rostratum
性别 小鼠始
质量/g小鼠终
质量/g死亡情况
(死亡数/组鼠数)LD50/
(g·kg−1)雌性 19.9±0.9 28.2±1.7 0/10 ＞7.5 雄性 19.6±0.6 31.5±1.4 0/10 ＞7.5 -
长喙毛茛泽泻为水生小草本植物，其叶片为纸质。根据干鲜比结果推测植株自由水含水率在81%以上，显示植株含水率较高。长喙毛茛泽泻植株中脂肪平均质量分数略高于23.13 mg·g−1，且在不同样品间和植株器官间变异不大，进一步的方差分析显示脂肪质量分数在茎叶和根之间差异不显著，但在不同样品间存在显著差异。
长喙毛茛泽泻植株的8种营养元素质量分数显示：5种大量营养元素质量分数均值从高到低依次为氮、钾、钙、磷、镁。从变异系数和各营养元素质量分数的最大值与最小值之比来看，长喙毛茛泽泻中的镁、铁和磷在不同样地和植株器官间不稳定，受样地环境影响较大，而其他元素均较稳定。进一步的方差分析显示：除锌外，其余7种营养元素质量分数在4个样品间均无显著差异，但氮、磷、钾和钙在茎叶和根间差异显著，说明长喙毛茛泽泻根系对这4种元素具有选择吸附性。对长喙毛茛泽泻不同样品和组织中营养元素质量分数的相关分析显示：氮、钾、钙这3种元素两两之间存在显著或极显著正相关，而与磷存在显著或极显著负相关，磷与镁存在显著正相关。
长喙毛茛泽泻茎叶的小鼠经口急性毒性试验表明：雌雄小鼠半致死质量分数均大于7.5 g·kg−1，试验期间各组小鼠均未出现死亡情况。按急性毒性分级标准判定，该样品属实际无毒级。
植物元素特征除与植物本身的遗传学特性有关外，主要受土壤和气候等生境条件的影响，也是植物对所在生境长期适应的结果[22]。罗绪强等[23]对雷公山自然保护区5种常见木本植物叶片的6种大量必需营养元素进行了测定分析。结果表明：6种元素质量分数从高到低依次为氮、钙、钾、硫、镁、磷；惠岑怿等[24]的研究显示：4种旱生针茅属Stipa植物叶片中7种大量元素质量分数均值从高到低依次为碳、氮、钾、硫、镁、磷、钙。这些大量元素质量分数的排序结果与本研究结果有所不同，可能的原因是本研究的研究对象为水生草本植物，而上述2篇文献的研究对象分别为陆生木本植物和旱生草本植物。
对陆地生态系统的高等植物而言，当氮磷比＞16时，说明植物生长受到磷的限制，当氮磷比＜14时，植物生长受到氮的限制，而当氮磷比为14~16时，氮与磷单独或共同影响植物的生长[25]。长喙毛茛泽泻的氮磷比在4个样品和不同器官间均小于14，说明其生长受到氮的限制。此外，罗绪强等[23]的文献结果显示：氮和磷、氮和钾、磷和钙、钾和钙质量分数之间均具有显著或极显著正相关关系。惠岑怿等[24]的研究结果显示：非金属元素碳、氮、硫、磷 等与金属元素钾之间显著正相关，与其他金属元素显著负相关。本研究结果表明：氮和钾、钾和钙质量分数间存在极显著和显著正相关，但磷与金属元素钾、钙、镁质量分数的相关性与其他文献的结果有明显的不同，说明不同植物体内这些元素之间具有不同的比例组成和协调关系。
石从广等[26]对越南安息香Styrax tonkinesis精炼的种子油开展了大小鼠急性经口毒性试验以及慢性毒性3项试验。结果发现：精炼油对应的小鼠半致死质量分数分别为雌性小鼠17.10 g·kg−1，雄性小鼠10.80 g·kg−1，达到理论无毒的标准；王亚萍等[27]对长兴吊瓜Trichosanthes bracteata籽油的食用安全性进行了评估。结果显示：小鼠经口急性毒性试验的半致死量高达40.00 mL·kg−1以上，表明吊瓜籽油实际无毒。本研究开展小鼠急性经口毒性的材料为茎叶，与上述试验所用的材料为液态油脂有所不同，评判标准不一样，小鼠的半致死质量分数也不同，但结果表明长喙毛茛泽泻的茎叶为实际无毒。
长喙毛茛泽泻是极度濒危植物，野生种质资源极其稀少，导致了对其茎叶的营养元素质量分数和活性化学成分的测定研究难以开展。2015年起，浙江省丽水市相关单位开展了人工栽培的长喙毛茛泽泻回归原生地的项目研究，至2019年已在3个回归示范点培育出了一定数量的苗，可供一个批次的指标测定和毒性试验所需的样品。由于所取的样品数量有限，本研究仅对3个回归示范点4份样品的茎叶和根中的脂肪及8种常见营养元素质量分数进行了定量测定(由于检测手段的限制未测定硫质量分数)，这与对中药材泽泻Alisma orientalis的测定偏重于三萜类等活性化学物质的报道[28]有所不同。本研究测定的指标不属于活性物质，而且缺乏大量元素硫的测定结果，同时缺乏近缘物种的各项指标值作为参照，这是本研究的不足之处。下一步的研究应侧重于茎叶活性化学成分的测定，并探讨这些活性化学成分与植株毒理的关联。
Nutritional components of rhizome and leaf of Ranalisma rostratum and its acute oral toxicity
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摘要:
目的 长喙毛茛泽泻Ranalisma rostratum是极度濒危保护植物，被纳入国家Ⅰ级重点保护植物。近年来，全国先后建立了多个长喙毛茛泽泻繁育基地，其种群数量得到了有效提升。对长喙毛茛泽泻营养成分及急性经口毒性的研究，有利于对其进行更好的保护利用。 方法 选取丽水市3个回归示范点的4批次样品，烘干前后称量样品质量，计算各营养器官的生物量比和干鲜比，测定其茎叶根的主要营养成分和元素(包括脂肪、氮、磷、钾、钙、镁、铁、锰、锌)的质量分数以及茎叶的小鼠Mus musculus急性经口毒性。 结果 ①长喙毛茛泽泻植株的干鲜比为0.17~0.19，整个植株含水率较高。②长喙毛茛泽泻植株中8种元素的平均质量分数从高到低依次为氮、钾、铁、钙、磷、镁、锰、锌，铁质量分数在各样品和组织间变异系数最大，其次是磷和镁。③脂肪质量分数在4个样品之间存在显著差异(P＜0.05)，除锌外，其余7种元素在4个样品间均无显著差异；脂肪质量分数在长喙毛茛泽泻的茎叶和根之间没有显著差异，而钠、磷、钾、钙质量分数在茎叶和根间差异显著(P＜0.05)。④钠、钾、钙这3种元素两两之间存在显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关，而与磷存在显著或极显著负相关，磷与镁存在显著正相关。⑤以长喙毛茛泽泻茎叶制取悬浮样品液，喂饲试验显示：对雌雄小鼠经口半致死量均大于7.5 g·kg−1。 结论 长喙毛茛泽泻中的镁、铁和磷质量分数不够稳定，而其他元素均较稳定。钠、磷、钾、钙质量分数在长喙毛茛泽泻的茎叶和根系间的分布有显著差异。小鼠急性经口毒性试验结果显示：其茎叶属实际无毒。图1表5参28 Abstract:Objective Ranalisma rostratum, a critically endangered plant species, is included in the national level Ⅰ key protection plants. Many breeding bases have been established in China in recent years, and the population of R. rostratum has been effectively increased. This study aims to explore the nutritional composition and acute oral toxicity of R. rostratum for its better protection and utilization. Method The 4 batches of samples from 3 regression plots in Lishui City were selected, and weighed before and after drying. The biomass ratio and dry-to-fresh ratio of each vegetative organ were calculated. The main nutrients and elements (including fat, N, P, K, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn)in stems, leaves and roots, as well as the acute oral toxicity of stems and leaves in Mus musculus were determined. Result (1) The dry-to-fresh ratio of the plant was 0.17−0.19, indicating that the water content of the whole plant was high. (2) The average contents of 8 nutrient elements from high to low were N, K, Fe, Ca, P, Mg, Mn and Zn. The coefficient of variation of Fe content among samples and tissues was the largest, followed by P and Mg. (3) There was a significant difference in fat content among the 4 samples (P＜0.05). There were no significant differences in the other 7 elements except Zn among the 4 samples. There were no significant differences in fat content between stem, leaf and root, but a significant difference in Na, P, K and Ca between the stem, leaf and root (P＜0.05). (4) There was a significant (P＜0.05) or extremely significant (P＜0.01) positive correlation among Na, K and Ca, and the 3 elements had significant or extremely significant negative correlation with P, while P had significant positive correlation with Mg. (5) The stem leaf suspended sample liquid was prepared for the acute oral toxicity test, which showed that the oral LD50 of male and female mice was greater than 7.5 g·kg−1 body weight. Conclusion The mass fraction of Mg, Fe and P in R. rostratum was unstable, while other elements were stable. The distribution of Na, P, K and Ca in the stem, leaf and root of R. rostratum was significantly different. The acute oral toxicity test of stem and leaf in M. musculus showed that it was practically non-toxic. [Ch, 1 fig. 5 tab. 28 ref.] -
Key words:
- botany /
- Ranalisma rostratum /
- nutrient element /
- fat /
- acute oral toxicity test
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无距虾脊兰Calanthe tsoongiana为兰科Orchidaceae虾脊兰属Calanthe地生草本，花朵娇艳，造型独特，受到人们的喜爱。近些年来，由于人为破坏，以及自身繁殖困难，导致野生无距虾脊兰种群数量锐减，现已被列为极度濒危等级[1]。
植物和真菌之间的互惠共生是自然界中普遍存在的现象[2]。兰科菌根真菌是一类与兰科植物形成共生关系并生成菌丝团的真菌，隶属于根系内生真菌，对兰科植物生长起促进作用[3]。研究表明：兰科植物的整个生命活动都需要菌根真菌的参与，菌根真菌不仅可以帮助兰花种子萌发[4−5]，也在其生长发育过程中扮演着重要的角色。它可以吸收土壤中的矿质元素、有机物等，在侵染兰科植物后被宿主细胞分解并向其传输营养物质[6−7]，若缺乏菌根真菌，兰科植物将无法长期存活。除了菌根真菌，兰科植物中非菌根真菌的数量也十分庞大，远远超过了菌根真菌。镰孢属Fusarium、木霉属Trichoderma和青霉属Penicillinum是兰科植物中常见的内生真菌，在适当的条件下不仅能促进兰科植物种子的萌发和生长发育，还可以有效抑制病原菌的生长[8−10]。由此可见，非菌根真菌的作用也不容忽视。兰科菌根真菌不仅广泛存在于根系内，也存在于植株周围土壤中，且距离植株越远，其相对丰度越低[11−12]，但也有研究表明：菌根真菌少量或者不存在于土壤中[13−14]。蒋玉玲等[15]研究表明：通过对周围土壤中真菌类群的分析，可推断兰科植物能否长期在此生存。因此，研究根际土壤真菌类群对兰科植物保育十分重要。
目前，虾脊兰属植物的研究集中在分类鉴别、育种和繁殖等方面，具体有资源调查、遗传多样性研究、化学与药用价值研究、快速繁育以及引种驯化等等[16−17]。国内外对虾脊兰属根系内生真菌多样性研究较少，尚处于初步阶段，未得到系统且全面的数据，尤其是无距虾脊兰还未见相关报道。鉴于此，本研究以浙江省天目山野生无距虾脊兰为材料，通过分析无距虾脊兰不同时期根际土壤真菌与根系内生真菌多样性，明确其优势真菌和共有真菌类群，以期为无距虾脊兰资源有效保护提供科学参考。
1. 材料与方法
1.1 研究地点与样品采集
所用材料采自浙江天目山国家级自然保护区内无距虾脊兰野生居群(海拔550 m，30°21′47″N，119°25′30″E)。该研究区属亚热带季风气候，雨水充沛，年降水量达1 870 mm，相对湿度较大，自然条件优越。
无距虾脊兰生长在海拔450~1 450 m的阔叶混交林下，生长周期可分为萌芽期、花期、果期和衰亡期[18]。选择未遭到破坏、分布集中且长势一致的植株，分别于2、5、7和11月进行根段采集。每次选取9株植株，每株取3~4个长约4~5 cm的根段，用根围土包裹装入采样袋，做好标记并放入4 ℃冰箱保存。
1.2 研究方法
1.2.1 样品处理
取出根系并用流水冲洗干净，无菌水冲泡，用体积分数为70%的乙醇洗涤2 min，质量分数为2.5%的次氯酸钠浸泡5 min，体积分数为70%的乙醇洗涤30 s，再经无菌水冲洗2~3次，用无菌滤纸吸去多余水分后转入液氮中紧急速冻。初步处理完成，置于−80 ℃超低温冰箱保存。
1.2.2 根际土提取
在超净台上抖掉根围土，保留附着在根系1 mm左右的根际土。用无菌镊子将根系转移至装有磷酸缓冲盐溶液(PBS)的离心管中，全温摇床下震荡20 min，挑出根系，将剩余悬浮液6 000 r·min−1高速离心20 min，弃上清液得到根际土。做好标签记录，将离心管放入液氮，待其彻底急速冷冻后，放入−80 ℃超低温冰箱保存。
1.2.3 DNA提取及PCR扩增
使用DNA提取试剂盒提取无距虾脊兰根系与根际土壤DNA，提取后利用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，引物合成和测序由上海美吉生物医药科技有限公司进行。
PCR 仪采用ABI Gene Amp® 9700型，每个样本3个重复，20.0 μL PCR反应体系为10.0 μL 2× ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物，0.4 μL 50 × ROX Reference Dye 1，2.0 μL DNA模板，ddH2O补至20.0 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，35个循环；72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。同一样本的PCR产物混合后用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，纯化后的PCR产物使用Illumina MiSeq平台进行测序。
1.2.4 序列分析与处理
首先根据overlap关系利用FLASH (v1.2.11)软件对Illumina测序得到的原始数据进行拼接，并通过FASTP (v.0.19.6)软件对序列质量进行质控、过滤和优化。区分样本后，在97%相似度水平下使用UPARSE (v11.0)软件对优化序列进行分类操作单元(OTU)聚类分析。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，基于97%相似水平下采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列与UNITE (v.8.0)数据库进行分类学比对。
基于OTU聚类分析结果，通过Mothur (v1.30.2)软件进行多样性指数分析，从而得到所有样本群落中物种的丰富度、覆盖度和多样性等信息。根据分类学分析结果，通过Qiime (v1.9.1)软件生成各分类学水平丰度表，进行Beta多样性距离计算，找出各样本在某一分类学水平上的优势物种、样本中各优势物种的相对丰度以及不同样本中物种的组成相似性，并利用R语言(version 3.3.1)工具统计和作图，将差异和距离通过二维坐标图呈现出来，从总体上反映各组样本之间的差异和组内样本之间的变异度大小。基于Kruskal-Wallis秩和检验(Kruskal-Wallis H test)，通过R (version 3.3.1)的stats包和python的scipy包运用DP的方法计算影响大小(effect size)，从而找出多组样本的物种进行差异显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 无距虾脊兰根系内生真菌多样性分析
无距虾脊兰萌芽期根系测序共获得31 987条优化序列。由图1可知：在门水平上担子菌门Basidiomycota和被孢霉门Mortierellomycota占比较大，属于萌芽期根系内生真菌优势门；在属水平上，被孢霉属Mortierella和红菇属Russula真菌序列占比相差不大，共同作为该时期优势内生真菌。花期根系测序共获得51 913条优化序列。其中，担子菌门为最大优势菌门；在属水平上，粗糙孔菌属Trechispora为该时期优势内生真菌。相较于萌芽期，花期真菌类群中担子菌门和子囊菌门Ascomycota相对丰度分别为萌芽期的1.33和1.97倍，被孢霉门、被孢霉属和红菇属的相对丰度呈现下降趋势，分别减少了67.82%、67.39%和75.70%。
图 1 不同时期无距虾脊兰根系内生真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成Figure 1 Community composition of root endophytic fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level果期根系测序共获得43 793条优化序列。其中担子菌门真菌在数量上占绝对优势；在属水平上，蜡壳耳属Sebacina为该时期优势内生真菌。相较于花期，担子菌门、子囊菌门、被孢霉门和红菇属相对丰度变化不大，但Saitozyma、锁瑚菌属Clavulina相对丰度有所增加，由原来占比不足3.00%增长到13.09%和10.29%，蜡壳耳属增加了67.30%。衰亡期根系测序共获得30 000条优化序列。该时期，子囊菌门属于优势菌门，镰孢属为优势内生真菌，相较于其他3个时期，衰亡期根系内生真菌多样性整体出现骤降现象。
2.2 无距虾脊兰根际土壤真菌多样性分析
在萌芽期，无距虾脊兰根际土壤测序共获得31 673条优化序列。由图2可知：萌芽期根际土壤与根系在门水平上真菌类群一致，但相对丰度稍有变化；在属水平上，红菇属相对丰度明显下降，占比仅为3.55%，其余真菌相对丰度较小，被孢霉属为该时期根际土壤优势真菌。
图 2 不同时期无距虾脊兰根际土壤真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成Figure 2 Community composition of rhizosphere soil fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level在花期，根际土壤测序共获得41 062条优化序列。与同时期根系内生真菌相比，担子菌门相对丰度减少，子囊菌门相对丰度增加。在属水平上，根际土壤和根系真菌类群相对丰度明显不同，其中青霉属Penicillium为该时期根际土壤优势真菌。相较于萌芽期根际土壤真菌，花期子囊菌门和罗兹菌门Rozellomycota相对丰度分别为萌芽期的1.34和4.74倍，担子菌门、被孢霉门真菌相对丰度分别减少了31.93%和67.82%。
在果期，根际土壤测序共获得47 863条优化序列。与根系内生真菌相比，门水平上子囊菌门和担子菌门变化最大，在属水平上，Paraboeremia仅存在于根际土壤真菌中，且占比较大，为该时期根际土壤优势真菌。相较于花期根际土壤真菌，果期子囊菌门、被孢霉门、Paraboeremia和Saitozyma相对丰度分别为花期的1.34、1.61、4.03和1.07倍，担子菌门和罗兹菌门相对丰度分别降低到花期的89.45%和42.21%。
在衰亡期，根际土壤测序共获得28 997条优化序列。在门水平上，担子菌门为根系内生真菌的5.61倍，根系内生真菌无被孢霉门，而在根际土壤中其真菌序列占7.29%。在属水平上，各真菌相对丰度差别较大，其中Paraboeremia为该时期根际土壤优势真菌。相较于果期根际土壤真菌，蜡壳耳属仅存在于衰亡期根际土壤中，担子菌门和被孢霉属真菌相对丰度分别为果期的1.53和1.31倍，Saitozyma相对丰度降低到果期的32.32%。
2.3 不同时期真菌群落差异性分析
通过对无距虾脊兰根际土壤与根系测序分析，发现不同生长发育时期物种注释结果存在较大差别，具体差异见表1。其中萌芽期根际土壤和根系优势真菌分别为被孢霉属和红菇属，花期优势真菌分别为青霉属和粗糙孔菌属，果期优势真菌分别为Paraboeremia和蜡壳耳属，衰亡期优势真菌分别为Paraboeremia和镰孢属，不同生长发育时期优势真菌不同。
表 1 物种注释结果统计Table 1 Species annotation results statistics生长
时期优化序
列/条门/个 纲/个 目/个 科/个 属/个 萌芽期 63 660 11 41 91 193 359 花期 92 975 13 46 101 217 367 果期 91 656 12 48 108 224 377 衰亡期 58 997 8 33 75 162 264 在门水平上，子囊菌门真菌在萌芽期、花期和果期的根际土壤与根系中存在显著差异；而被孢霉门真菌则在萌芽期与衰亡期的根际土壤和根系中存在显著差异(图3A，P＜0.05)。在属水平上，被孢霉属、红菇属、罗兹菌门未分类属以及青霉属在萌芽期的根际土壤与根系真菌上差异较为明显。由图4可知：有虫草菌属Cordyceps等321个属为4个时期共有真菌；裸盖菇属Psilocybe等29个属为萌芽期和花期共有真菌，复膜孢酵母属Saccharomycopsis等43个属为花期和果期共有真菌，Melanopsamma等36个属为果期和衰亡期共有真菌，Stenella等23个属为衰亡期和萌芽期共有真菌。
图 3 根际土壤真菌与根系内生真菌在门(A)、属(B)水平下差异显著的类群Figure 3 The endophytic fungi in rhizosphere soil and root were different at phylum (A) and genus (B) level
图 4 属水平不同时期根际土壤真菌与根系内生真菌分布韦恩图Figure 4 Venn diagram of endophytic fungi distribution in rhizosphere soil and root at genus level at different periods从表2可见：果期根系内生真菌的ACE指数、Chao指数、Shannon指数和Sobs指数最高，其次是花期，然后是萌芽期，衰亡期Alpha指数最低。意味着果期根系内生真菌多样性和丰富度最高，衰亡期根系内生真菌多样性和丰富度最低。在无距虾脊兰根际土壤真菌中，花期Alpha多样性指数高于其他3个时期，果期ACE指数、Chao指数和Sobs指数高于萌芽期和衰亡期，萌芽期和衰亡期Alpha多样性指数相对一致。综合来讲，花期的根际土壤真菌多样性和丰富度最高，果期次之。
表 2 Alpha多样性指数Table 2 Alpha diversity indexes样本 Alpha多样性指数 ACE指数 Chao指数 Shannon指数 Sobs指数 Coverage指数 MG 1 983±26 c 1 379±81 ab 3.734±0.522 b 680±104 cd 0.964±0.004 a HG 4 078±3 043 bc 2 337±50 ab 3.724±1.606 b 987±423 bcd 0.968±0.009 a GG 8 681±439 ab 4 499±351 ab 4.221±0.501 b 1 342±161 abc 0.926±0.006 b SG 817±292 c 630±308 b 3.298±0.788 b 210±31 d 0.990±0.005 a MT 4 642±3 043 bc 3 057±1 539 a 5.042±0.191 a 1 243±322 abc 0.926±0.017 b HT 12 860±9 858 a 7 178±4 937 a 5.423±0.221 b 1 926±847 a 0.891±0.027 c GT 6 559±1 695 abc 4 109±826 ab 4.713±1.078 b 1 580±398 ab 0.931±0.017 b ST 5 182±642 abc 3 323±465 ab 4.713±0.684 b 1 198±229 abc 0.908±0.014 bc 说明：数据均为平均值±标准差。同列不同字母表示同一指数在不同样本间差异显著(P＜0.05)。MG. 萌芽期根系；HG. 花期根系；GG. 果期根系；SG. 衰亡期根系；MT. 萌芽期根际土壤；HT. 花期根际土壤；GT. 果期根际土壤；ST. 衰亡期根际土壤。 在同一时期中，萌芽期、花期和衰亡期根际土壤真菌的Alpha多样性指数均高于根系内生真菌，说明在该时期根际土壤真菌多样性和丰富度高于根系内生真菌。果期根系内生真菌ACE指数、Chao指数高于根际土壤真菌，但是根际土壤真菌Shannon指数和Sobs指数高于根系内生真菌。
为了进一步明确无距虾脊兰不同时期根际土壤真菌和根系内生真菌群落结构的差异，本研究采用主成分分析(PCA)分析其真菌群落的相似性和差异性。PCA结果显示：无距虾脊兰在花期、果期、萌芽期、衰亡期有明显的聚类区分(图5A)，主成分1解释了差异的12.92%，主成分2解释了差异的7.73%。其中在主成分1轴上花期区分较为明显，主成分2轴上果期区分较为明显，萌芽期和衰亡期距离较近，意味着衰亡期和萌芽期根际土壤真菌、根系内生真菌类群相似度高，进一步说明无距虾脊兰根际土壤真菌和根系内生真菌群落在整个生长发育时期存在阶段性差异。由图5B可知：4个时期根系内生真菌相较于根际土壤真菌，距离较近，意味着根际土壤真菌彼此间真菌类群差异较大，其中花期和果期尤为明显。另外，在每个时期中根际土壤与根系之间彼此分开较远，相较于各自内部样品之间两者真菌类群差别较为明显，其中根系样品之间内生真菌类群差别小于根际土壤。
图 5 根际土壤真菌与根系内生真菌群落主成分分析Figure 5 Principal component analysis of rhizosphere soil fungi and root endophytic fungi3. 讨论
本研究表明：无距虾脊兰根际土壤真菌和根系内生真菌优势菌门均为担子菌门和子囊菌门。根际土壤真菌类群与根系内生真菌类群相互重叠存在一定相似性，说明有一部分根系内生真菌来自根际土壤真菌。推测由于根系与根际土壤长期互相接触，彼此真菌类群相互影响[19]，且根系对根际土壤真菌具有一定的选择性等原因造成的[20]。从另一方面来讲，彼此之间也相互独立具有一定差异性，根际土壤真菌群落的丰富度、均匀度以及多样性均高于根系内生真菌。在根际处根系经常与其他根系、土壤微生物互作，从而导致了根际土壤真菌多样性高于根内真菌。
在根系内生真菌中，真菌多样性和丰富度从萌芽期到果期依次递增，并在果期达到顶峰，衰亡期又急剧下降。而根际土壤真菌类群变化情况却与之相差较大，从萌芽期到花期逐渐增加，在花期达到顶峰后逐渐下降，衰亡期与萌芽期真菌多样性和丰富度变化相对平稳。这与吕立新等[21]的观点相吻合，夏季真菌多样性高于春季和秋季，随着季节变化，温度、土壤含水量等环境因子相继发生变化，真菌群落结构也随之发生变化。YOKOYA等[22]在研究兰花时也发现了在雨季分离出的真菌，在旱季不一定出现，而同一类真菌的相对丰度也不尽相同。花期为无距虾脊兰生长初期，此时温度适宜、光线充足，周围伴生植物数量增加，土壤和根际土壤真菌丰富度也相应增加。无距虾脊兰果期为每年的7—9月，此时温度高，周围植物数量相较于花期会有所减少，所以果期根际土壤真菌丰富度少于花期。而根系内生真菌出现上述差异情况可能是从萌芽期到果期，无距虾脊兰生长发育需要大量营养物质持续输入，且夏季温度高，需要增加自身抗逆性，因此根系内生真菌种类和丰富度显著增加并在果期达到顶峰。随着冬季的到来，周围植物逐渐进入休眠期，植被凋落物、土壤微生物的分解等都会使土壤有机质增加，从而促进微生物的生长，造成衰亡期真菌群落丰富度的降低[23]。
兰科植物在自然状态下无法自主萌发，内生真菌通过向兰科植物传输营养物质，从而促进种子萌发和原球茎的分化[24]。李孟凯等[25]用镰孢属菌液处理过的铁皮石斛Dendrobium officinale种子胚膨大，种皮有被假根冲破的迹象。内生真菌对兰科植物的促生作用在生长期也有体现。王亚妮[26]研究发现：接种了内生真菌的铁皮石斛，其鲜质量、移栽成活率相比对照均有所增加；此外，张霞[27]研究表明：接种内生真菌的铁皮石斛，其抗旱性明显增强。由此可见，内生真菌在兰科植物生长发育过程中的作用不可忽视。本研究显示：无距虾脊兰不同时期优势真菌及相对丰度不同，推测兰科植物在相应生长期会选择对自己生长益处最大的真菌共生。有研究表明：在碳的需求方面，果期需求是花期的2倍[28]，而花期的优势真菌不能满足果期对生长素等方面的需求，所以不同时期优势真菌的相对丰度会随之发生变化，也进一步证实了内生真菌极易受周围环境和生长阶段影响[29]。
镰孢属和青霉属是兰科植物中常见的内生真菌，在适当的条件下不仅能促进兰科植物种子的萌发和生长发育，还可以有效抑制病原菌的生长。这2种真菌类群在花期和衰亡期属于优势真菌，由此可以推测：镰孢属和青霉属在无距虾脊兰中同样可以促进其生长，并提高其抗病性。庄鑫等[30]研究不同地点朝鲜淫羊藿Epimedium brevicornu生长时期内生真菌表明：蜡壳耳属真菌与淫羊藿中黄酮类化学成分含量成正比，证明蜡壳耳属真菌可以促进植物对磷元素的吸收，促进植物生长，同时增强植株抗灰霉病的能力。被孢霉属真菌被证实在生物分解以及土壤养分转化的过程中发挥重要作用[31]。红菇属曾被认定为菌根真菌，并与多种兰科植物存在共生关系[32]。上述几类真菌均为无距虾脊兰不同时期的优势真菌，但是这几类优势真菌是否与无距虾脊兰菌根真菌存在共生关系，是否对无距虾脊兰生长发育过程中起促进作用，还需采用石蜡切片观察是否在根细胞中形成菌丝结，并结合共生培养视植株的生长状况而定。然而，另外一些公认的菌根真菌，如胶膜菌科Tulasnellaceae在本研究中尚未见到，有研究表明可能与DNA测序区域有关[33]，在后续实验进行高通量测序时可以采取不同的引物。除此之外，可能与植物种类有关，有些真菌广泛存在于多种植物体内，而有些真菌却只与某种特定植物产生共生关系[34]。
4. 结论
本研究表明：在不同生长发育时期，无距虾脊兰真菌群落多样性和丰富度存在较大差异。根际土壤真菌多样性高于根系内生真菌，花期根际土壤真菌多样性最高，果期根系内生真菌最丰富。不同时期优势真菌差别较大，萌芽期根际土壤和根系内生优势真菌分别为被孢霉属、红菇属，花期优势真菌分别为青霉属、粗糙孔菌属，果期分别为Paraboeremia、蜡壳耳属，衰亡期分别为Paraboeremia、镰孢属。
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图 1 4个样品茎叶和根的脂肪及营养元素平均质量分数
Figure 1 Average contents of fatty acid and nutrient elements in the stems，leaf and root of the four samples
表 1 长喙毛茛泽泻3个样地4份样品的干鲜比和生物量
Table 1. Dry-fresh ratio and biomass of 4 batches of R. rostratum from 3 samples places
样品 结实与否 干鲜比 生物量 干质量/g 鲜质量/g 干鲜比 茎叶质量/g 根质量/g 茎叶/根 南明山1号 已结实 144.57 750 0.19 93.33 51.24 1.82 南明山2号 未结实 61.25 370 0.17 43.70 17.55 2.49 大港头镇 已结实 86.56 500 0.17 58.54 28.02 2.09 老竹乡 已结实 165.53 1000 0.17 107.96 57.57 1.88 说明：生物量栏中，茎叶质量和根质量都是指样品的干质量 
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表 2 脂肪和各营养元素质量分数范围、均值和变异系数
Table 2. Range, mean values and coefficient variation of fat and nutrient elements
项目 脂肪及各养元素质量分数/(mg·g−1) 变异系数/% 最小值 最大值 最大/最小 平均值 标准差 脂肪 9.00 36.00 4.00 23.13 9.22 39.86 氮 22.40 34.20 1.53 26.50 4.53 17.09 钾 15.90 39.10 2.50 25.08 9.14 36.44 磷 0.50 8.50 17.00 3.87 3.28 84.70 铁 0.17 33.00 194.12 6.49 11.12 171.43 钙 3.30 9.71 2.94 6.21 2.33 37.58 镁 0.00 2.70 900.00 1.07 1.20 111.33 锰 0.38 1.52 4.00 0.68 0.38 56.70 锌 0.03 0.09 2.94 0.06 0.02 36.21
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表 3 长喙毛茛泽泻茎叶与根系的脂肪和营养元素均值及显著性分析
Table 3. Mean value and significance analysis of fat and nutrient elements in stem, leaf and root
测定
指标测定
部位平均值/
(mg·g−1)自由度 组间均
方差F P 脂肪 茎叶 27.00±8.98 1 120.125 1.518 0.264 根 19.25±8.81 氮 茎叶 30.30±3.04 1 115.520 24.754 0.003 根 22.70±0.29 钾 茎叶 32.55±6.50 1 447.005 19.516 0.004 根 17.60±1.87 磷 茎叶 1.00±0.56 1 66.298 43.928 0.001 根 6.75±1.64 铁 茎叶 1.22±1.72 1 221.825 2.067 0.201 根 11.75±14.55 钙 茎叶 8.08±1.67 1 27.975 16.485 0.007 根 4.34±0.78 镁 茎叶 0.37±0.73 1 3.996 3.989 0.093 根 1.78±1.21 锰 茎叶 0.52±0.16 1 0.200 1.447 0.274 根 0.83±0.50
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表 4 长喙毛茛泽泻植株脂肪和8种营养元素间相互关系
Table 4. Correlation between plant fat and 8 nutrient elements
元素 脂肪 氮 钾 磷 铁 钙 镁 锰 锌 脂肪 1 氮 0.527 1 钾 0.522 0.975** 1 磷 −0.695 −0.876** −0.844** 1 铁 −0.399 −0.497 −0.540 0.589 1 钙 0.158 0.850** 0.802* −0.762* −0.343 1 镁 −0.463 −0.402 −0.440 0.717* 0.377 −0.520 1 锰 0.331 −0.348 −0.268 0.168 −0.104 −0.398 −0.243 1 锌 0.065 0.086 −0.107 0.044 0.222 0.024 0.515 −0.264 1 说明：*表示显著相关(双尾t检验，P＜0.05); **表示极显著相关(双尾t检验，P＜0.01)
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表 5 长喙毛茛泽泻茎叶的小鼠急性经口毒性试验结果
Table 5. Acute oral toxicity test in mice of leaf of R. rostratum
性别 小鼠始
质量/g小鼠终
质量/g死亡情况
(死亡数/组鼠数)LD50/
(g·kg−1)雌性 19.9±0.9 28.2±1.7 0/10 ＞7.5 雄性 19.6±0.6 31.5±1.4 0/10 ＞7.5
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