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杉木Cunninghamia lanceolata是中国南方最重要的速生造林树种，生长速度快，成材时间较短，其造林面积和蓄积量均居中国用材林树种的首位，人工林面积达8.95×106 hm2，占中国人工林面积的30%以上[1]，木材产量约占全国商品材的25%[2]。长期以来杉木人工林经营主要依靠营造大面积、高密度的速生丰产林来满足市场对木材的需求[3]。这种经营模式下的杉木人工林往往只能输出中小径材，杉木大径材数量少，林分生产力和经营效益不高。大力发展杉木大径材定向培育技术已成为杉木人工林经营的重要方向[4]。20世纪90年代末，中国才开始开展对杉木大径材的培育技术研究，研究主要集中在良种壮苗选择、立地选择、林分密度调控、施肥等经营措施上[5]，但缺乏杉木大径材培育的材种结构形成机制、不同培育措施的组装配套等关键技术的系统研究。间伐和施肥是大径材培育中用到较多的抚育措施，林分密度越大，小径阶林木株数越多，大中径阶林木株数越少[6]，合理密度能有效改变林分的材种结构[7]，带来最直观的林地生产效益和经济效益。晏姝等[8]对南岭山区现存杉木大径材林分的调查表明：林分密度和土壤肥力是培育杉木大径材的主导因子。但目前有关杉木人工林间伐和施肥管理的研究对象大多是幼龄林和中龄林，对于间伐和精准配方施肥共同作用于杉木成熟林的研究较少。本研究分析了不同间伐保留密度及不同氮、磷肥施用量对杉木成熟林材种结构、生产力、大径材出材量和出材率的影响，以期为高效培育杉木大径材提供参考。
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试验林位于福建省南平市顺昌县洋口林场，地形属武夷山支脉的低山丘陵地带，海拔为300~700 m。属中亚热带海洋性季风气候区，年平均气温为18.6 ℃，年平均降水量为1 300~2 100 mm，无霜期可达305 d，气候温暖，雨量充沛。土壤以山地红壤为主，是适合杉木大径材培育的中心产区。样地内土壤理化性质见表1。
表 1 试验地土壤理化性质
Table 1. Physical properties of soil in the experimental site
土层/cm 最大持
水量/mm毛管持
水量/mm最小持
水量/mm非毛管孔
隙度/%毛管孔
隙度/%总孔隙
度/%土壤密度/
(g·cm−3)氮/
(g·kg−1)磷/
(g·kg−1)0~10 71.53±0.00 66.33±0.00 64.93±0.00 5.20±0.00 66.33±0.00 71.53±0.00 2.66±0.15 24.11±5.01 1.60±0.38 10~20 72.13±0.00 63.53±0.00 61.47±0.00 8.60±0.00 63.53±0.00 72.13±0.00 2.68±0.10 26.04±4.05 1.01±0.30 20~40 135.80±0.01 123.00±0.01 119.60±0.01 6.40±0.00 61.50±0.00 67.90±0.01 2.87±0.14 26.50±5.37 0.70±0.16 -
样地选自27年生立地指数均大于22的杉木成熟人工林，处理前林分密度为800~850株·hm−2。采用正交试验，设置集中连片的9块样地，设间伐保留密度、氮肥施用量、磷肥施用量共3个因素。间伐保留密度设置为300、600、825 (不间伐)株·hm−2，氮肥(尿素)施用量设置为0、100、200 g·株−1，磷肥(钙镁磷肥)施用量设置为0、250、500 g·株−1。间伐和施肥处理于2016年的11月杉木生长停滞期进行，施肥采用沟施方法，在每株树上坡开一条弧形沟，沟在树冠正投影下，沟长约100 cm，宽约20 cm，深约30 cm，氮肥和磷肥一次性施入后立即覆土。各样地具体处理措施如表2。
表 2 各样地间伐施肥处理情况
Table 2. Various thinning and fertilization treatments
样地号 间伐保留密度/
(株·hm−2)氮肥施用量/
(g·株−1)磷肥施用量/
(g·株−1)样地号 间伐保留密度/
(株·hm−2)氮肥施用量/
(g·株−1)磷肥施用量/
(g·株−1)1 825 0 0 6 600 200 0 2 600 0 500 7 300 0 250 3 825 100 500 8 825 200 250 4 300 100 0 9 300 200 500 5 600 100 250 -
2017—2020年每年的4月对各样地的杉木进行标记号牌管理和每木检尺，采用Haglof Vertex Ⅳ超声波树木测高仪测量树高，以围径尺测定胸径，以5 m标杆测量南北冠幅和东西冠幅，并以2017年的数据作为间伐和施肥处理前的生长情况。
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为方便统计和计算，对杉木胸径进行径阶划分，以2 cm为1个径阶，以16为起测径阶，其立木胸径为[15 cm, 17 cm)，18径阶为[17 cm, 19 cm)，20径阶为[19 cm, 21 cm)，以此类推。对各径阶株数进行统计，并分别计算各径阶杉木的平均胸径(Di)，计算公式为
$D_i = \sqrt {\dfrac{1}{N_i}\displaystyle \sum {d_i^{\text{2}}}}$ 。其中，Ni表示第i径阶总株数，di表示第i径阶胸径值。 -
为提高树高测量值的精准度，通过建立试验样地内所有林木的胸径和树高生长模型，利用实测的平均胸径代入生长模型，算出拟合树高进行后续分析(图1)。胸径和树高生长模型的拟合优度分析表明：各拟合模型的精准度从大到小排序为幂函数(R2=0.235 8)、二次函数(R2=0.226 6)、指数函数(R2=0.216 6)、一次线性函数(R2=0.2036)，所以幂函数y=8.3553x0.334 4作为树高回归计算的最优函数模型。
图 1 树高和胸径回归拟合结果
Figure 1. Regression fitting results of tree height and DBH
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vi=0.000 058 777 042Di1.969 983 1Hi0.896 461 57。其中，Di为第i径阶平均胸径，Hi为第i径阶拟合树高。
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分别计算样地内各径阶平均单株材积，乘以所对应的径阶株数，即得相对应径阶材积。对样地内各径阶材积累加求和，得到样地林分的总材积，并换算林分的蓄积量(m3·hm−2)。
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林木材种按其直径大小的区分标准，进阶≥26为大径材，18~24为中径材，10~16为小径材。以径阶大小为区分标准计算各径阶立木出材量，并按照表3所示比例对林分立木各径阶中各材种所占株数进行归并。
表 3 各径级林木材种株数比例
Table 3. Proportion of tree species in different diameter classes
材种 不同径阶株数占比/% 16 18 20 22 24 ≥26 小径材 100 40 0 0 0 0 中径材 0 60 100 100 65 0 大径材 0 0 0 0 35 100 -
杉木规格材的原条用材出材量计算公式为V规(原条)=3.60243758×10−5×D1.94752076×H1.00793769。其中，D为径阶平均胸径(cm)；H为径阶平均树高(m)。V规(原条)=V规(小径材)+V规(中径材)+V规(大径材)，按比例求得小径材、中径材、大径材的出材量。出材率为出材量与林分蓄积量的比值。
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使用SPSS软件统计数据和分析差异显著性，使用Excel进行树高胸径拟合，使用Origin 2018制图。
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不同间伐和施肥处理下，林分的平均胸径、年平均树高、平均单株材积和蓄积量在3 a的生长中均有提升。处理前林木平均胸径为25.80~33.14 cm，处理后平均胸径为27.43~35.25 cm，平均胸径的增量为1.28~2.88 cm。处理前年平均树高为24.77~26.94 m，处理后年平均树高为25.29~27.50 m，年平均树高的增量为0.38~0.84 m。处理前平均单株材积为0.6351~1.123 4 m3，处理后平均单株材积为0.7302~1.2913 m3，平均单株材积的增量为0.0775~0.1972 m3。处理前蓄积量为270.3812~608.5037 m3·hm−2，处理后蓄积量为326.3937~716.550 0 m3·hm−2，蓄积量的增量为50.3838~120.7630 m3·hm−2。
不同处理下平均胸径、年平均树高、平均单株材积和蓄积量每年增量并不一致(图2)，说明间伐抚育和施肥会对成熟林的杉木生长产生影响。就其增量变化趋势来看，并无一定规律，这可能与每个样地的施肥配比有关，对于增量连年增长或先增后减的样地，其氮肥配比较多，较高的速效氮肥施用量能够有效促进杉木的短期速生。氮肥施用量较少而磷肥施用量较多样地，其施肥效应在往后的生长过程中逐步显现，随着施肥效应的逐步减弱，林分密度将会成为制约杉木生长的主要因素。
图 2 平均胸径、年平均树高、平均单株材积和蓄积量增量
Figure 2. Increment of average DBH, annual average tree height, average individual volume and stand volume in successive years
由图3显示：样地6平均胸径、年平均树高和平均单株材积的总增量最多，蓄积量总增量仅次于样地5，其处理方式为间伐保留密度600 株·hm−2、氮肥施用量200 g·株−1、磷肥施用量0 g·株−1。样地5的蓄积量总增量最多，其处理方式为间伐保留密度600 株·hm−2、氮肥施用量100 g·株−1、磷肥施用量250 g·株−1。相同的间伐保留密度下，高的氮肥施用配比能短期内增加杉木个体的生长，而氮肥磷肥配合施用能够短期内增加蓄积量的累积。总增量最少的4个样地分别为样地1、2、3、8，其中样地1、3、8的间伐保留密度均为825 株·hm−2，即不进行间伐。结果表明：虽然有施肥因素影响，但保留密度过大仍会限制杉木成熟林胸径增加。此外，林地3 a间的年平均树高总增量基本与平均胸径总增量一致，符合树高-胸径生长模型。平均单株材积总增量最少是样地1，其处理措施为不间伐，不施肥，也反映了合理的间伐保留密度和施肥处理能够有效促进杉木成熟林生长。样地2、4、7、9等的蓄积量总增量最少，其中样地4、7、9的间伐保留密度均为300 株·hm−2，表明间伐强度过大情况下会在3 a内明显影响林分蓄积量的增长。
图 3 平均胸径、年平均树高、平均单株材积和蓄积量总增量
Figure 3. Total increment of average DBH, annual average tree height, average individual volume and stand volume
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由图4可见：在间伐和施肥处理前后，除样地3有少量小径材，其余均只有中大径材，3 a间中径材出材量整体呈减少趋势，大径材出材量整体呈增长趋势。由图5~6可见：无论在处理前后，大径材出材量和出材率始终大于中径材出材量。大径材出材量在间伐和施肥处理后3 a的增量为42.9265~152.5223 m3·hm−2。样地8，即保留原林分密度825 株·hm−2、氮肥施用量为200 g·株−1、磷肥施用量为250 g·株−1处理下，大径材出材量的增量最大，比处理前增加了152.522 3 m3·hm−2。大径材出材率相比3 a前增加了0.10%~11.32%，其中增加最大的也是样地8，比处理前的大径材出材率增加了11.32%(图6)。
图 4 3 a间中大径材出材量变化情况
Figure 4. Change of output of medium and large diameter timber in the past three years
图 5 处理前后中大径材出材量雷达图
Figure 5. Radar chart of output of medium and large diameter wood before and after treatment
图 6 处理前后中大径材出材率雷达图
Figure 6. Radar chart of output rateof medium and large diameter wood before and after treatment
对于大径材出材率增量的分析(表4)表明：间伐保留密度和磷肥施用量对其具有显著影响(P＜0.05)，而氮肥施用量对其影响较小，3个因素的主次关系依次为磷肥施用量、间伐保留密度、氮肥施用量，最佳组合为间伐保留密度825株·hm−2(即不间伐)、氮肥施用量200 g·株−1、磷肥施用量250 g·株−1，这与大径材出材量的分析结果一致。因此，立地指数为22，间伐保留密度825株·hm−2的条件，能够使林分维持较高的大径材出材量和出材率。过低的间伐保留密度不再增加大径材，而合适的施肥量会有效提高林分大径材比例。
表 4 各影响因素对大径材出材量(率)的显著性情况
Table 4. Significance of the factors affecting the yield (rate) of large diameter materials
因变量 自变量 P 大径材出材量增量 间伐保留密度 0.019 氮肥量 0.029 磷肥量 0.015 大径材出材率增量 间伐保留密度 0.041 氮肥量 0.439 磷肥量 0.027 说明：P＜0.05表示差异显著 -
由于林木之间对养分空间的竞争作用，使间伐成为杉木人工林抚育中必不可少的环节。徐金良等[11]研究发现：间伐会显著增加杉木胸径的增长，高强度的间伐对其胸径增长的影响更加显著。这是由于间伐使林分密度减小，一方面林木之间间隙增大，林木有了足够的生长空间，同时对阳光、水分和养分的竞争减小[12]。另一方面，林内光照增强，促进了林下植被的生长，增加了生物多样性，使人工林生态系统更加稳定，杉木林免受病虫害侵扰[1]。不同间伐强度对杉木中龄林也具有相同作用[13]，中度和强度间伐林分的平均胸径显著高于弱度间伐，且平均胸径随着间伐强度的增大而增大。而这种规律对杉木成熟林同样适用，本研究表明：间伐保留的密度过大会限制杉木成熟林林分平均胸径的增加。其他树种也同样受间伐强度影响，对68年生的红松Pinus koraiensis人工林不同强度的抚育间伐研究结果[14]表明：随间伐强度的减弱，林分平均胸径达到较高水平所需年份越来越长。油松Pinus tabuliformis林间伐后2 a的平均胸径随间伐强度增大而升高[15]；北美短叶松Pinus banksiana的间伐强度越大，平均胸径越大[16]。对巨尾桉Eucalyptus grandis×E. urophylla的研究[17]表明：施用过量氮肥会抑制桉树生长。本研究也表明：氮肥施用量能促进杉木个体的生长，但基于成本、生态环境保护和施肥效益考虑，杉木大径材培育的氮施用量不宜过高。
林木的平均单株材积与胸径树高息息相关，在杉木成熟林间伐和施肥试验中，与未间伐相比，不同强度的间伐和施肥均促进了平均单株材积的增长。但间伐强度过大，不利于林分蓄积量的增长，反而会使林分蓄积量减少。郑鸣鸣等[13]对杉木中龄林的研究发现：增大间伐强度，间伐3 a后，平均单株材积增长量增大，而林分蓄积量则减小。涂育合等[18]针对杉木成熟林间伐的研究得出：间伐保留密度最小的样地，其蓄积量也最少。李杰茹等[19]对不同抚育间伐强度下秦岭南坡锐齿栎Quercus aliena var. acuteserrata天然次生林研究表明：单株材积增长随间伐强度的增大而增大，但低强度间伐下，其蓄积量最大。SULLIVAN等[20]研究了不同间伐强度对美国黑松Pinus contorta的影响得出：低强度间伐林分蓄积量增长最大，未间伐林分次之，中度和重度间伐则小于未间伐样地。说明间伐强度过大，并不利于林分蓄积量的增长，与本研究结果一致。但尤文忠等[21]认为：强度间伐有利于蒙古栎Quercus mongolica蓄积量的积累，在中龄林阶段应加大间伐强度。而龚固堂等[22]对柏木Cupressus funebris的研究表明：不同间伐强度对蓄积量的影响并不明显。关于间伐能否提高林分总蓄积历来有较大争议，这可能是由于间伐强度、立地条件、树种等各方面的差异，导致结果不同。相同间伐强度下，氮、磷肥共同施用能够增加林分蓄积量。湛红辉[23]研究表明：施肥对马尾松Pinus massoniana幼林及中龄林阶段的蓄积量增加都有影响，但磷肥在其中起关键作用。彭桂永[24]研究表明：杉木中龄林间伐和施肥6 a后，间伐和施肥均对蓄积量的增加起到了极显著的作用。
本研究认为：间伐和施肥导致立地指数为22的杉木成熟林中径材出材量和出材率不断减少，大径材出材量和出材率不断增加。可见立地指数高的林地更适合培育大径材，这可能是由于立地指数高的林地提供的养分更多，林木生长速度更快，林分间的竞争就越大，在成熟时期样地上保留的株数就越少，大径材的出材率越大[25]。郭光智等[26]在南亚热带杉木人工林材种结构长期立地与密度效应的研究中指出：立地指数为18的林分中，中径材比例随年龄增长表现出先增加后减少的趋势，与本研究结果一致，其大径材比例在成熟年龄之后也不断增加。惠刚盈等[27]研究表明：在材种的形成过程中，立地条件是其主要限制因子，在立地指数低的林地中，无论何种间伐保留密度，都难以形成大径材。本研究正交试验的方差分析表明：间伐保留密度、氮肥量、磷肥量对杉木成熟林大径材出材量的增加均具有显著的影响；间伐保留密度和磷肥量对大径材具有显著影响，而氮肥量这个因素对其的影响较小。
本研究得到的最佳间伐密度和施肥配比为间伐保留密度825株·hm−2、氮肥施用量200 g·株−1、磷肥施用量250 g·株−1。在高立地指数(22)杉木成熟林大径材培育过程中，保留适宜的间伐密度，并增施氮肥和适量磷肥，可有效促进大径材出材量和出材率，过低的间伐保留密度在短期内不能有效促进林地大径材出材量和出材率的增加。该结论可能与林地较高的立地指数有关，对于立地指数为18~22的杉木大径材林地，这一结论的一致性还有待继续研究。
Effects of thinning and fertilization on growth and timber structure of mature Chinese fir forest
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摘要:
目的 分析不同间伐保留密度及不同氮、磷肥施用量对杉木Cunninghamia lanceolata成熟林生长和材种结构的影响，为高效培育大径材杉木提供理论依据。 方法 选择27年生立地指数大于22的杉木人工林，采用正交试验设置9块标准地，间伐保留密度设为300、600和825株·hm−2，氮肥施用量设为0、100、200 g·株−1，磷肥施用量设为0、250、500 g·株−1。 结果 间伐保留密度过大会限制杉木成熟林胸径增加，间伐保留密度过小会降低林分蓄积量，间伐和施肥均能有效促进单株材积增长，较高氮肥施用量能够促进杉木胸径、树高和平均单株材积的生长，氮、磷肥混合施用能够更有效地增加林分蓄积量的积累。间伐保留密度及氮、磷肥施用量3个因素均显著影响杉木成熟林大径材出材量 (P＜0.05)，间伐保留密度和磷肥施用量对杉木成熟林大径材出材率具有显著影响 (P＜0.05)，而氮肥施用量的影响较小。在立地指数为22条件下，能够使杉木成熟林大径材出材量和出材率最高的处理为间伐保留密度825株·hm−2、氮肥施用量200 g·株−1、磷肥施用量250 g·株−1。 结论 高立地指数下，杉木成熟林大径材培育过程中，保留适宜的间伐密度，并增施氮肥和磷肥，能有效促进杉木大径材出材率和出材量。图6表4参27 Abstract:Objective This study aims to investigate the effects of different thinning retention density and different proportion of N and P fertilizer application on the growth and timber structure of mature Chinese fir forest. Method The 27 year-old Chinese fir plantation with a site index greater than 22 was selected, and 9 standard plots were set up by orthogonal experimental design. The thinning retention densities were 300, 600 and 825 plants·hm−2. The application rates of N fertilizer were 0, 100 and 200 g·plant−1, and the application rates of P fertilizer were 0, 250 and 500 g·plant−1. Result Excessive thinning retention density limited the diameter at breast height (DBH) increase of mature Chinese fir. Too small thinning retention density reduced the stand stock. Thinning and fertilization could effectively promote the growth of individual tree volume. Higher N application rate could promote the growth of DBH, tree height and average individual tree volume of Chinese fir, and the mixed application of N and P could increase the accumulation of stand volume more effectively. The thinning retention density, the application rate of N and P fertilizer all significantly affected the yield of large-diameter timber of mature Chinese fir forest (P＜0.05). The thinning retention density and the application rate of P fertilizer had a significant impact on the yield of large-diameter timber of mature Chinese fir forest (P＜0.05), while the application rate of N fertilizer had little impact. Under the site index of 22, the combination that produced the maximum yield and outturn rate of large-diameter timber of mature Chinese fir forest was thinning retention density of 825 plants·hm−2, N fertilizer application rate of 200 g·plant−1 and P fertilizer application rate of 250 g·plant−1. Conclusion Under the condition of high site index, the outturn and yield of large-diameter timber of Chinese fir could be effectively promoted by keeping appropriate thinning density and increasing N and P fertilizer application in the cultivation process of mature Chinese fir forest. [Ch, 6 fig. 4 tab. 27 ref.] -
Key words:
- Chinese fir /
- thinning /
- fertilization /
- large diameter timber /
- timber structure
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在遗传转化获得抗性植株时，转化体的抗性筛选是遗传转化能否取得成功的关键步骤。通常在选择培养基中加入合适种类和浓度的筛选剂，使其产生一定的筛选压起到抗性筛选的作用。转化体内选择标记基因的表达产物可对特定筛选剂产生抗性，使转化受体材料继续保持正常的生长发育[1]。目前的研究中，卡那霉素、潮霉素等抗生素被普遍作为筛选剂使用[2-3]。但是由于水稻Oryza sativa胚性愈伤组织对抗生素具有生理抗性，以抗生素为选择标记进行抗性筛选，不能起到很好的筛选效果，且经抗生素筛选后的转化体在分化和再生阶段易受抑制或产生白化苗[4-6]。以草甘膦作为筛选剂可以提高选择的灵敏度，消除转化体生理抗性对筛选结果的影响，克服了以往研究中抗生素筛选的局限性。可遗传的草甘膦抗性基因突变率低，并可在后代中稳定表达，因此进行抗草甘膦作物的培育是可行的[7]。籼稻Oryza sativa subsp. indica和粳稻Oryza sativa subsp. japonica是栽培稻的2个亚种，随着水稻遗传转化技术的发展，大部分粳稻品种已经建立了成熟的遗传转化体系，并成功引入抗虫、抗病、生长发育调控等诸多有利基因[8]。而大多数籼稻品种组培特性不佳，愈伤组织诱导率低，继代过程易褐化且分化再生频率低，导致籼稻的遗传转化效率低，有的品种甚至难以转化。尤其是对生产上广泛推广、农艺性状优良的重要品种而言，其改良与育种进程受到严重限制[9]。CHAN等[10]于1992年尝试利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法转化籼稻幼根愈伤组织，对转化体进行Southern印记杂交，结果表明：目的基因片段已成功转入转化体细胞中。后经酶活性检测，目的基因可在转化体中稳定表达。1994年，HIEI等[11]为建立高效稳定的农杆菌遗传转化体系，采用了“双超元”载体，并通过在菌液添加乙酰丁香酮(As)活化Vir基因提高转化效率等方法，推进了遗传转化技术在籼稻中的研究应用。目前，虽然已有转抗草甘膦基因的籼稻遗传转化体系的报道，但是转化效率低，还未建立一个高效的转化体系[12]。基于此，本研究选取具有成功再生体系的籼稻‘中恢161’ Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’为材料，利用农杆菌介导法，转入草甘膦抗性基因(CP4)，探索适合的草甘膦质量浓度用于抗性筛选，并对农杆菌介导的转化过程进行了合理优化，建立‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。
1. 材料与方法
1.1 材料
籼稻‘中恢161’成熟胚；农杆菌菌株EHA105；含CP4基因的表达载体p1300-HC。
1.2 方法
1.2.1 成熟胚胚性愈伤组织的诱导和增殖
将成熟种子去壳，进行消毒[13]，接种于诱导培养基R1[NB(N6+B5)+3.0 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite]上，接种20 粒·皿−1。放入培养条件为28 ℃，光照16 h/黑暗8 h的组培室中诱导培养。5~7 d后，可观察到幼芽处有淡黄色愈伤组织，统计每皿的出愈数和出愈率。15 d后，剥下色泽鲜黄、结构紧密、生理状态良好的胚性愈伤组织，分散平铺于新鲜配制的胚性愈伤组织增殖培养基R1上进行增殖培养。继代2~4次后，增殖并产生大量的胚性愈伤组织，可用做后期转化的受体材料。
1.2.2 胚性愈伤组织的草甘膦敏感性测试
设置5组草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L−1)，重复3次，设空白对照，接种20块·皿−1。15 d后，观察胚性愈伤组织的色泽、是否增殖等外观形态，统计胚性愈伤组织褐化率，选出合适的草甘膦质量浓度范围作为筛选压。
1.2.3 胚性愈伤组织的遗传转化和抗性筛选
利用悬浮培养基R2(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮)将培养好的含CP4基因表达载体的农杆菌菌株EHA105稀释至D(600)为0.5~0.8，用其侵染胚性愈伤组织[14]。将转化好的胚性愈伤组织用无菌滤纸吸干多余的菌液，适当干燥后，用灭菌镊子夹取愈伤组织分散地平铺在铺有1层无菌滤纸的共培养培养基R3(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮+4.0 g·L−1Gelrite)上，20 块·皿−1。于25 ℃培养室中暗培养2~3 d。取出共培养后的愈伤组织，用含100 mg·L−1羧苄青霉素的无菌蒸馏水清洗3~4次，直至清洗液澄清透明。适度干燥后，用镊子夹取愈伤组织整齐均匀地平铺在筛选培养基R4(NB+3 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite+0.5 g·L−1头孢霉素+不同质量浓度草甘膦)上。抗性筛选培养基中草甘膦质量浓度分别为300、350和400 mg·L−1。
1.2.4 分化、生根、移栽成活
将抗性愈伤组织系移至分化培养基R5(NB+0.5 mg·L−1 NAA+3.0 mg·L−16-BA+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite)上进行分化培养。约15~25 d，部分抗性愈伤组织长出绿点。待绿点进一步分化形成小苗，并长至2 cm左右时将其转移至生根培养基R6(1/2NB+20.0 g·L−1蔗糖+0.1 g·L−1肌醇+8.0 g·L−1琼脂)上生根培养。待幼苗生长出大量的茁壮根系，可将其从生根培养基中取出，小心洗净其根系附着的培养基，置于培养箱中炼苗，增强幼苗对环境的适应性，1周后将健壮的幼苗移至大棚成活。
1.2.5 转基因植株的分子检测和CP4基因试纸条检测蛋白表达
利用TPS法提取转基因植株叶片DNA。利用CP4基因引物(CP4-F: TTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG, CP4-R: TCCTTCATGTTCGGCGGTCTC)进行CP4基因的PCR扩增，目的片段大小为400 bp。扩增后的产物经质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，统计阳性率。取阳性植株叶片，利用CP4基因表达检测试纸条进行再生植株抗性检测。
2. 结果和分析
2.1 草甘膦抗性筛选最适质量浓度
图1和图2所示：‘中恢161’的胚性愈伤组织在不含草甘膦的培养基中可正常生长且大量增殖，未发生褐化现象；在含100 mg·L−1草甘膦的培养基中，绝大多数胚性愈伤组织可正常生长增殖，褐化率低，仅为5.00%，未起到选择作用；在含200 mg·L−1草甘膦的培养基中褐化率为16.67%，选择效果不明显；在含300 mg·L−1草甘膦的培养基中，褐化率为41.67%，且与200 mg·L−1相比差异显著(P＜0.05)，选择效果好，适合作为筛选压；在含400 mg·L−1草甘膦的培养基中，大部分胚性愈伤组织发生褐化，少部分正常生长，褐化率为65.00%，选择效果明显；在含500 mg·L−1草甘膦的培养基中，胚性愈伤组织基本发生褐化，褐化率为91.67%，显著高于其他质量浓度下的褐化率(P＜0.05)，说明选择压过大。结果表明：草甘膦质量浓度为300~400 mg·L−1时，胚性愈伤组织褐化率约50%，具有很好的筛选效果。
图 1 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化率Figure 1 Browning rate of O.sativa subsp.indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days
图 2 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化情况Figure 2 Browning rate of O. sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days2.2 抗性愈伤组织和转基因植株的分子检测
转化后的胚性愈伤组织在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，分别获得200、113、和84块抗性愈伤组织，提取抗性愈伤组织DNA进行CP4基因的PCR检测，阳性愈伤组织的PCR扩增产物经电泳可获得长度为400 bp的条带，与预期相符，表明CP4基因已成功整合到转化体内。进行3个草甘膦质量浓度抗性筛选后愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%。共获得67株再生植株，提取再生植株叶片DNA进行CP4基因的PCR检测。其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%(图3)。
图 3 籼稻‘中恢161’再生植株CP4基因的PCR检测Figure 3 PCR result of CP4 gene from glyphosate-resistance plants2.3 CP4基因试纸条检测蛋白表达
抗性检测结果(图4)表明：检测的43株PCR阳性植株中，有25株表现为CP4基因表达，表达率为58.13%。
2.4 ‘中恢161’成熟胚遗传转化体系的建立
遗传转化再生过程如图5所示：对籼稻‘中恢161’成熟胚进行胚性愈伤组织诱导，约7 d可诱导出胚性愈伤组织(图5A)。胚性愈伤组织进行2~4次继代增殖(图5B)，约40 d后进行遗传转化。转化后的胚性愈伤组织在选择培养基上进行抗性筛选(图5C~D)，一段时间后，抗性愈伤组织系会出现增殖(图5E)。约50 d后，抗性愈伤组织于R5培养基上进行分化培养，约15~25 d，长出绿点(图5F)。1个月左右，长出小苗(图5G)。小心取出转移至R6培养基进行生根培养(图5H)。约15 d，幼苗长出大量的茁壮根系，将其从培养基中移出，小心洗净根部培养基。置于培养箱中炼苗，炼苗1周后可移至大棚成活。对再生植株进行CP4基因的PCR检测，保留阳性植株。从诱导胚性愈伤组织至获得抗草甘膦再生植株的整个过程需要4~6个月。
图 5 CP4基因转化籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织的各个阶段Figure 5 Various stages of transforming CP4 gene into embryogenic callus of O.sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’3. 结论与讨论
3.1 草甘膦抗性筛选及其优势
本研究建立了以草甘膦抗性基因CP4为选择标记的‘中恢161’遗传转化体系。非转化体的EPSPS酶活性较低，草甘膦可与S3P形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体而竞争性抑制EPSPS酶活性，植物体内蛋白质合成受阻，生长受到抑制，不能正常生长分化[15]。而转化体抗草甘膦基因CP4的表达产物EPSPS酶具有高催化活性和低草甘膦亲和力不易与草甘膦结合，故能够进行正常的生长分化。因此，通过草甘膦筛选可获得转抗草甘膦基因CP4的再生植株。相较于以抗生素抗性基因为选择标记，草甘膦抗性基因不仅能作为筛选标记也能作为目的基因，使受体植物获得除草剂抗性，而且草甘膦比潮霉素等抗生素便宜[7]。不同植物细胞对草甘膦的抗性存在差异，选择合适的草甘膦质量浓度作为抗性筛选的筛选压是影响转化效率的关键因素。本研究将转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，进一步分化、成苗，共获得67株再生植株，进行CP4基因的PCR检测，其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%，达到很好的选择效果。
3.2 籼稻遗传转化体系的优化
3.2.1 受体材料的选择及胚性愈伤组织的代龄
能否成功进行遗传转化的重要前提是选择适合的植物材料作为转化受体。水稻幼胚分裂能力强，易形成大量优质胚性愈伤组织，但受季节的影响，水稻幼胚利用不便，且在组织培养过程中易受微生物污染，转化效率不高，因此作为转化体存在一定的困难[16]。成熟胚方便储存与利用，不受季节限制和胚性愈伤组织诱导率较高，通常被作为遗传转化和再生的良好的外源体材料。苏军[17]比较了不同代龄的胚性愈伤组织，发现第4、5代的胚性愈伤组织转化效率较高，并且分化能力也较强。早代愈伤组织不易接受外源遗传物质。但晚代愈伤组织容易出现质地软、水渍化等现象，影响遗传转化成功率。本研究选择胚性愈伤组织代龄为3~4代，可有效减少愈伤组织老化、色泽暗黄、结构松散和褐化率高等问题，有效提高了遗传转化效率。
3.2.2 转化过程的优化
为提高遗传转化效率，本研究采取一系列措施对转化过程进行合理优化。①转化阶段选用色泽鲜黄、外观形态良好、结构紧致的愈伤组织与农杆菌共培养，淘汰外观发白发软发褐的愈伤组织。②在共培养基R2和悬浮培养基R3中加入100 μmol·L−1乙酰丁香酮，可诱导农杆菌Vir基因的活化，从而促进外源基因的整合，极大提高转化效率[18]。③农杆菌菌液经悬浮培养液R3稀释后，D(600)为0.5~0.8。此时为最适菌液浓度，既不会使农杆菌在转化体表面过多繁殖影响其正常生长，又具一定的侵染能力，提高了转化效率。④黑暗条件下共培养2~3 d为适合的共培养时长。共培养时间过短，目的基因不能成功整合至转化体细胞内[19-20]。
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图 2 平均胸径、年平均树高、平均单株材积和蓄积量增量
Figure 2 Increment of average DBH, annual average tree height, average individual volume and stand volume in successive years
图 3 平均胸径、年平均树高、平均单株材积和蓄积量总增量
Figure 3 Total increment of average DBH, annual average tree height, average individual volume and stand volume
图 4 3 a间中大径材出材量变化情况
Figure 4 Change of output of medium and large diameter timber in the past three years
图 5 处理前后中大径材出材量雷达图
Figure 5 Radar chart of output of medium and large diameter wood before and after treatment
图 6 处理前后中大径材出材率雷达图
Figure 6 Radar chart of output rateof medium and large diameter wood before and after treatment
表 1 试验地土壤理化性质
Table 1. Physical properties of soil in the experimental site
土层/cm 最大持
水量/mm毛管持
水量/mm最小持
水量/mm非毛管孔
隙度/%毛管孔
隙度/%总孔隙
度/%土壤密度/
(g·cm−3)氮/
(g·kg−1)磷/
(g·kg−1)0~10 71.53±0.00 66.33±0.00 64.93±0.00 5.20±0.00 66.33±0.00 71.53±0.00 2.66±0.15 24.11±5.01 1.60±0.38 10~20 72.13±0.00 63.53±0.00 61.47±0.00 8.60±0.00 63.53±0.00 72.13±0.00 2.68±0.10 26.04±4.05 1.01±0.30 20~40 135.80±0.01 123.00±0.01 119.60±0.01 6.40±0.00 61.50±0.00 67.90±0.01 2.87±0.14 26.50±5.37 0.70±0.16 
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表 2 各样地间伐施肥处理情况
Table 2. Various thinning and fertilization treatments
样地号 间伐保留密度/
(株·hm−2)氮肥施用量/
(g·株−1)磷肥施用量/
(g·株−1)样地号 间伐保留密度/
(株·hm−2)氮肥施用量/
(g·株−1)磷肥施用量/
(g·株−1)1 825 0 0 6 600 200 0 2 600 0 500 7 300 0 250 3 825 100 500 8 825 200 250 4 300 100 0 9 300 200 500 5 600 100 250
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表 3 各径级林木材种株数比例
Table 3. Proportion of tree species in different diameter classes
材种 不同径阶株数占比/% 16 18 20 22 24 ≥26 小径材 100 40 0 0 0 0 中径材 0 60 100 100 65 0 大径材 0 0 0 0 35 100
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表 4 各影响因素对大径材出材量(率)的显著性情况
Table 4. Significance of the factors affecting the yield (rate) of large diameter materials
因变量 自变量 P 大径材出材量增量 间伐保留密度 0.019 氮肥量 0.029 磷肥量 0.015 大径材出材率增量 间伐保留密度 0.041 氮肥量 0.439 磷肥量 0.027 说明：P＜0.05表示差异显著
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210226
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