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果实的生长发育一般具有较长周期，外形上表现为由小变大，内部伴随着营养物质的积累与代谢[1]。果实大小主要由细胞分裂和细胞膨大2个阶段决定，发育前期主要以细胞分裂为主，而细胞膨大主要是从细胞分裂结束后开始的[1]。不同物种果实的生长发育有着不同的特性。核桃Juglans regia、板栗Castanea mollissima等生长发育随时间变化呈现“S”形的生长曲线[2]，桃Amygdalus persica、杏Armeniaca vulgaris等在生长中会有一个缓慢期，生长曲线呈双“S”形[3]。山核桃Carya cathayensis果实5月初开始膨大，6—7月果实快速生长[4]。银杏Ginkgo biloba授粉后40~80 d为快速膨大阶段，纵径和体积增长显著[5]。果实膨大过程涉及一系列生理生化变化[1]。果实内部光合同化物的积累与代谢是果实生长发育的调控中心环节，直接影响果实膨大过程。蔗糖是植物光合同化物的主要积累物质，是重要的能量载体，在果实中积累后会被分解为葡萄糖和果糖[6]。这些小分子还原糖进一步参与糖酵解、三羧酸循环等过程，为果实早期发育和细胞膨大提供能量和碳骨架[7]。同时，蔗糖、葡萄糖、果糖通过区隔积累于液泡中，使果实内部保持较高的膨压，促进水分吸收，从而促进果实细胞膨大[8]。此外，旺盛的蔗糖代谢也有利于果实内部内源激素的积累与分配，提高果实对营养物质的调运能力，使更多的光合同化产物、矿质元素源源不断地流入正在发育的果实细胞，满足果实生长发育的营养需求[8]。果实中的蔗糖主要源于叶片光合同化物的韧皮部输入，运输到库器官后通过其代谢过程被进一步利用[9]。蔗糖代谢过程涉及到多种酶，主要有蔗糖合成酶(sucrose synthase, SS)，蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)和蔗糖转化酶(invertase)。这些蔗糖代谢相关酶的活性变化对果实发育过程有着重要影响[10]。研究发现：果实中蔗糖磷酸合成酶活性与蔗糖积累呈正相关关系[11]。GALTIER等[12]在番茄Lycopersicon esculentum中过量表达蔗糖磷酸合成酶基因，转基因番茄中蔗糖磷酸合成酶蛋白含量升高，同时其含糖量也增加。蔗糖水解成己糖后可为果实发育提供能量，参与蔗糖水解的酶主要有蔗糖转化酶和蔗糖合成酶。蔗糖转化酶根据在细胞中的定位不同可以分为细胞壁蔗糖转化酶(cell wall invertase)、液泡蔗糖转化酶(vacuolar invertase)和细胞质蔗糖转化酶(cytoplasmic invertase)[10]。蔗糖转化酶活性高低可以作为衡量果实库活力的重要标志[13]。番茄转化酶活性在果实生长发育的整个阶段都有较高水平，有利于己糖积累[14]。蜜柑Satsuma mandarin果实快速膨大期液泡蔗糖转化酶活性较高[15]。蔗糖合成酶既可以合成蔗糖也可以分解蔗糖。在果实膨大过程中，蔗糖合成酶主要起着分解蔗糖的作用[16]。此外，果实内部蔗糖代谢过程也会受到植物激素、光照和水分等因子的影响。研究发现：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)能够增强蔗糖运输，促进蔗糖向果肉细胞扩散[17]。葡萄Vitis vinifera果实发育前期，IAA和赤霉素(gibberellins，GAs)促进了果实中蔗糖的输入[18]。外源GA处理通过增强蔗糖转化酶编码基因表达，提高果实蔗糖转化酶活性，促进枇杷Eriobotrya japonica等果实膨大[19]。
香榧Torreya grandis ‘Merrillii’是红豆杉科Taxaceae榧树属Torreya植物，是中国特有的珍稀干果。香榧种仁营养丰富，具有很高的保健、药用和综合开发利用价值[20-22]。然而，人们在长期的生产实践中发现，香榧种实膨大率低，部分香榧林分膨大率不足5%，严重影响香榧的产量和栽培效益，成为限制香榧产业发展的瓶颈。本研究通过分析香榧种实膨大过程中蔗糖积累与代谢规律，探讨内源激素动态变化及其与蔗糖代谢之间的相关性，初步阐明蔗糖及其代谢对香榧种实膨大的影响。同时，筛选鉴定蔗糖代谢关键酶相关基因，分析蔗糖代谢对香榧种实膨大的调控作用。研究结果将为阐明香榧种实发育机制奠定基础，同时为提高种实产量、开展良种选育等提供理论支撑。
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本研究试验地位于浙江省杭州市临安区锦源村香榧生态化种植示范基地(30°09′45″N，119°42′36″E)。该种植基地属亚热带季风气候，年均日照时数为1 710~2 100 h，年均气温为15.0~18.0 ℃，年均降水量为980.0~2 000.0 mm。基地内的香榧于2007年种植，每年施用复合肥2~3次，有机肥隔年施用1次。
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本研究在香榧种实膨大期的不同阶段，分别于种实突破种鳞后的30 (5月1日)、60 (6月1日)和90 d时 (7月1日)进行香榧种实样品采集。选取长势一致、挂果良好的3株香榧实验树，分别于东、南、西、北方向各随机采集香榧种实10粒(3株树共120粒)。香榧种实采后放置在冰盒中，立即运回实验室，去除有损伤的种实。部分种实用于形态观察、拍照和含水率测定，其余种实分别取假种皮和种仁组织，切碎后立即用液氮速冻，在−80 ℃冰箱中保存备用。种实横纵径用游标卡尺测量，其中以种实中部横断面的直径作为横径；单粒质量用分析天平(0.001 g)测量，105 ℃杀青0.5 h后，置于80 ℃烘箱中烘至恒量以测定干质量，并计算相对含水率。体积采用排水法测定。根据香榧种实横纵径、单粒质量、体积变化，将香榧种实生长发育过程分为幼果期(授粉受精至翌年4月)、膨大期(5—7月)、成熟期(7—9月)。
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蔗糖、葡萄糖、果糖和淀粉质量分数参照蒽酮比色法测定。
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取0.1 g样品，液氮研磨至粉末，置2.5 mL甲醇溶液(甲醇∶水体积比为80∶20)中，于40 ℃下萃取2 h。15 000×g离心10 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤并用氮气干燥，甲醇溶液(甲醇与水体积比为30∶70)复溶后4 ℃冰箱保存备用。采用液相色谱-质谱串联(LC-MS/MS)对植物激素进行分离和分析，使用Acquity UPLC BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)在40 ℃下以0.3 mL·min−1的流速分离样品。IAA、GA3、GA4等质量分数参照ZHAO等[23]的方法测定。
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蔗糖磷酸合成酶和细胞质蔗糖转化酶参照NIELSEN等[24]和LOWELL等[25]的方法提取和测定。液泡蔗糖转化酶和细胞壁蔗糖转化酶活性参照TANG等[26]的方法测定。酶活性单位为μmol·mg−1·min−1。
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使用RNAprep植物总RNA提取试剂盒(中国北京天根生化)提取各个发育阶段种仁的总RNA。使用NanoDrop ND-
1000 分光光度计(NanoDrop Technologies Inc.，美国)和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和质量。每个样品使用3 µg RNA构建cDNA文库，利用Illumina Hi Seqogies平台进行测序。对原始下机数据进行过滤去除低质量序列后，利用软件Trinity v.6.0组装mRNA序列，并使用美国国家生物信息中心(NCBI)非冗余蛋白质序列(Nr，
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )，NCBI非冗余核苷酸序列(Nt，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )，瑞士蛋白数据库(SwissProt，http://www.uniprot.org/ )，同源蛋白质簇(COG,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ )，京都基因和基因组百科全书(KEGG,http://www.genome.jp/kegg/ )和GO数据库(GO)进行单基因簇(unigene)的功能注释。利用FPKM法计算基因虚拟表达量，差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)应满足差异倍数|log2A|≥2[A表示差异倍数或变化倍数(flod change)]、错误发现率[false discovery rate(FDR)]≤0.001、样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05 (P＜0.05)等条件，并通过GO和KEGG途径富集分析差异表达基因的功能。 -
采用Excel 2016进行数据整理与分析，所有数据均是至少3次生物学重复的平均值±标准误；采用SPSS 22.0进行差异显著性和相关性分析，并利用Cytoscape 3.0软件构建相关性网络图。
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由图1可知：香榧种实膨大过程可分为3个阶段，分别是种实突破种鳞后的0~30、30~60和60~90 d，其中，种实突破种鳞后的30~60 d是香榧种实质量和体积增大的关键时期。这一阶段种实横径、纵径、单粒质量和体积都明显增大，种仁从半透明状逐渐固化变白，面积占据整个种实的绝大部分(图1A~C)。种实突破种鳞后的60~90 d是香榧种实内部种仁固化的重要阶段。这一阶段形态上，中种皮结构更为明显，种仁进一步固化充实；种实大小(横径、纵径)、单粒质量、体积虽然仍在增大，但趋势缓慢；种实突破种鳞后90 d时，种实大小和质量均与种实突破种鳞后60 d时，相差不大(图1A~C)。然而，香榧种实膨大过程中假种皮和种仁含水率变化有较大差异，假种皮含水率从种实突破种鳞后30~90 d呈缓慢上升至平稳趋势，而种仁含水率则逐渐下降，尤其是种实突破种鳞后60 ~90 d含水率显著(P＜0.05)降低(图1D)。
图 1 香榧种实膨大期生长指标变化
Figure 1. Changes of growth indexes during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion stages
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香榧种实膨大过程中，蔗糖、葡萄糖、果糖以及淀粉质量分数在假种皮和种仁中变化显著(P＜0.05)，且假种皮和种仁间各物质质量分数变化趋势不同(图2)。种实突破种鳞后30~90 d，假种皮中蔗糖质量分数从49.70 mg·g−1上升至75.83 mg·g−1，随后又下降至57.14 mg·g−1；种仁中蔗糖质量分数则持续下降，在种实突破种鳞后60~90 d下降明显，从82.89 mg·g−1下降至55.82 mg·g−1(图2A)。随着香榧种实的膨大，葡萄糖和果糖质量分数在假种皮中同样先上升后下降，至种实突破种鳞后90 d时分别为5.90和37.0 mg·g−1；种仁中两者质量分数均显著下降(P＜0.05)，从种实突破种鳞后60~90 d阶段下降了约50% (图2B~C)。假种皮中淀粉质量分数呈现逐渐下降趋势，从种实突破种鳞后30 d时的462.07 mg·g−1下降到90 d时的254.05 mg·g−1，种仁中淀粉则在种实突破种鳞后90 d时显著积累(P＜0.05) (149.72 mg·g−1)，为30 d时的1.5倍(图2D)。
图 2 香榧种实膨大期蔗糖(A)、葡萄糖(B)、果糖(C)和淀粉(D)质量分数变化
Figure 2. Changes of sucrose (A), glucose (B), fructose (C) and starch (D) contents in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion
蔗糖代谢相关酶活性分析发现：香榧种实膨大过程中，蔗糖磷酸合成酶在假种皮中一直呈现上升趋势，酶活性从0.46 μmol·mg−1·min−1升高至1.16 μmol·mg−1·min−1，种仁中蔗糖磷酸合成酶活性则逐渐下降，种实突破种鳞后90 d时的活性仅为种实突破种鳞后30 d时的28.82%(图3A)。参与蔗糖水解的细胞质蔗糖转化酶、液泡蔗糖转化酶和细胞壁蔗糖转化酶随着种实的膨大在假种皮中均呈现上升趋势，酶活性最大值分别为21.91、23.49以及4.93 μmol·mg−1·min−1，而三者在种仁中的活性均有所下降，其中细胞质蔗糖转化酶和液泡蔗糖转化酶活性在种实突破种鳞后30~60 d无显著差异，而从种实突破种鳞后60~90 d显著下降(P＜0.05)，分别为3.69和4.63 μmol·mg−1·min−1，细胞壁蔗糖转化酶活性则持续下降，至种实突破种鳞后90 d时，活性仅0.97 μmol·mg−1·min−1(图3B~D)。
图 3 香榧种实膨大期蔗糖磷酸合成酶(A)、细胞壁蔗糖转化酶(B)、液泡蔗糖转化酶(C)和细胞质蔗糖转化酶(D)活性变化
Figure 3. Changes of sucrose phosphate synthase (A), cell wall invertase (B), vacuolar invertase (C) and cytoplasmic invertase (D) activities in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion
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内源激素质量分数变化分析发现：随着香榧种实膨大，假种皮中GA4、GA3、水杨酸(SA)质量分数总体呈现显著积累，并在种实突破种鳞后90 d时达到最高值，分别为种实突破种鳞后30 d时的2、11和8倍，而IAA、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和茉莉酸异亮氨酸(JA-ILE)质量分数则显著降低(P＜0.05)(表1)。此外，乙烯前体物质—1-氨基-环丙烷羧酸(ACC)和多种细胞分裂素(DHZ、tZR、IP等)质量分数也显著下降(P＜0.05)。种仁中，GA3、SA、ABA也随着种实膨大逐渐积累，其中ABA质量分数为922.31 ng·g−1。而GA4、IAA、JA、JA-ILE和绝大多数细胞分裂素[DHZ、tZR、IP、反式玉米素(tZ)]质量分数则显著降低(P＜0.05) (表1)。
表 1 香榧种实膨大期内源激素质量分数变化分析
Table 1. Analysis of endogenous hormone contents in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion
植物激素 种实突破种鳞后不同时间激素水平 /(ng·g−1) 30 60 90 d 假种皮 种仁 假种皮 种仁 假种皮 种仁 生长素 (IAA) 149.81±4.75 c 467.88±30.98 a 23.68±0.25 d 215.04±3.24 b 12.59±0.40 d 3.65±0.03 d 赤霉素 (GA4) 1.03±0.03 b 0.30±0.03 cd 0.89±0.31 bc 0.22±0.03 d 2.12±0.37 a 0.17±0.03 d 赤霉素 (GA3) 1.06±0.11 cd 0.09±0.01 e 2.56±0.17 b 1.43±0.03 c 12.08±0.53 a 0.42±0.04 ed 脱落酸 (ABA) 875.62±29.96 ab 763.09±76.84 bc 712.75±15.28 c 907.91±50.30 a 207.71±6.13 d 922.31±42.40 a 水杨酸 (SA) 11.88±0.57 c 10.70±0.52 c 8.93±0.33 c 8.68±0.17 c 96.05±3.32 a 43.66±0.83 b 茉莉酸 (JA) 155.52±4.45 a 4.39±0.59 bc 9.05±0.50 b 0.53±0.10 c 8.39±0.71 b 0.14±0.01 c 茉莉酸异亮氨酸 (JA-ILE) 254.36±7.94 a 6.93±0.60 bc 15.46±1.03 b 0.59±0.01 d 4.57±0.40 d 0.36±0.02 d 1-氨基-环丙烷羧酸 (ACC) 7.92±0.19 a 0.75±0.22 b 2.26±0.16 c 0.38±0.05 d 0.47±0.03 d 4.66±0.36 b 双氢玉米素 (DHZ) 1.16±0.09 a 0.71±0.05 b 0.71±0.02 b 0.32±0.03 c 0.41±0.02 c 0.46±0.02 c 反式玉米素核苷(tZR) 0.44±0.05 a 0.03±0.00 c 0.17±0.00 b 0.02±0.00 c 0.12±0.01 b 0.04±0.00 c 异戊烯基腺嘌呤(IP) 0.21±0.02 a 0.05±0.01 c 0.13±0.01 b 0.02±0.00 d 0.14±0.01 b 0.02±0.00 d 反式玉米素(tZ) 0.18±0.01 a 0.03±0.01 c 0.06±0.00 b 0.02±0.00 c 0.03±0.00 c 0.02±0.00 c 说明：不同字母表示不同组织、不同膨大阶段间存在显著差异(P＜0.05) -
相关性分析发现：假种皮中葡萄糖、果糖、淀粉质量分数以及蔗糖代谢相关酶与种实大小密切相关，其中葡萄糖、果糖质量分数与种实横、纵径，单粒质量和含水率呈正相关关系，与淀粉质量分数则呈负相关关系；蔗糖转化酶和蔗糖磷酸合成酶均与种实大小正相关(图4A)。同时，假种皮中蔗糖、葡萄糖、果糖质量分数与细胞质蔗糖转化酶、液泡蔗糖转化酶及细胞壁蔗糖转化酶活性变化呈正相关，而淀粉质量分数与葡萄糖、果糖质量分数，细胞质蔗糖转化酶、液泡蔗糖转化酶、细胞壁蔗糖转化酶及蔗糖磷酸合成酶活性均呈负相关关系(图4A)。与激素质量分数相关性分析发现：大多数激素(GA3、IAA、JA、ACC、DHZ、TZR等)与蔗糖、葡萄糖、果糖质量分数以及各种糖代谢酶活性呈负相关，与种实大小也表现出负相关关系(图4A)。
图 4 香榧种实膨大期假种皮(A)和种仁(B)中各生长指标、糖质量分数、酶活性和激素质量分数间相关性分析
Figure 4. Correlation analysis of growth index, sugar content, enzyme activity and hormone content in aril (A) and kernel tissues (B) during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion
随着香榧种实膨大，种仁中蔗糖、葡萄糖、果糖与淀粉质量分数呈负相关关系，与细胞质蔗糖转化酶、液泡蔗糖转化酶、细胞壁蔗糖转化酶和蔗糖磷酸合成酶活性呈正相关关系，同时淀粉质量分数与香榧种实单粒质量和体积也呈正相关关系(图4B)。与激素的相关性分析发现：GA4和IAA质量分数与蔗糖、葡萄糖、果糖质量分数和4种蔗糖代谢酶活性呈正相关，而与淀粉质量分数呈负相关(图4B)。此外，多种激素质量分数与种仁含水量呈正相关，SA与种实单粒质量和体积也呈正相关关系(图4B)。
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为了深入分析香榧种实膨大过程中，蔗糖代谢、淀粉代谢以及激素信号途径相关基因表达情况及其相互调控与种实的膨大关系等，本研究对各膨大阶段的香榧种实进行转录组测序。转录组分析发现：与种实突破种鳞后30 d相比，在种实突破种鳞后60 d时共鉴定到12 346个差异表达基因，其中，5 456个上调表达，6 884个下调表达。与种实突破种鳞后30 d相比，种实突破种鳞后90 d时共鉴定到22 668个差异表达基因，包括10 569个上调表达基因和12 099个下调表达基因(图5A)。KEGG代谢途径富集分析发现：在前20个被显著富集的代谢途径中，淀粉和蔗糖代谢、激素信号转导等途径均被显著富集(图5B)。
图 5 香榧种实膨大期差异表达基因(A)及KEGG代谢途径富集(B)分析
Figure 5. Analysis of differential expression genes (A) and KEGG pathway enrichment (B) during T.grandis ‘Merrillii’ seed expansion
进一步差异表达基因分析发现：36个单基因簇参与香榧种实中蔗糖的转运、合成和水解过程；16个单基因簇参与淀粉的合成与分解过程(图6A)。其中，蔗糖合成酶编码基因随着香榧种实膨大表达量逐渐降低(图6B)；蔗糖结合蛋白(sucrose-binding protein，SBP)和蔗糖转运蛋白(sucrose transport protein，SUT)呈明显上调表达趋势，但参与蔗糖及葡萄糖和果糖运输的糖转运蛋白(sugar transporter sweet，Sweet)基因呈下调表达(图6B)。此外，参与蔗糖水解的细胞壁蔗糖转化酶、细胞质蔗糖转化酶和液泡蔗糖转化酶其编码基因随着香榧种实膨大既有上调又有下调情况。参与淀粉合成的可溶性淀粉合成酶[soluble starch synthase (SSS)]、颗粒结合型淀粉合成酶[granule-bound starch synthase (GBSS)]、淀粉分支酶[starch branching enzyme (SBE)]和异淀粉酶[isoamylase (ISA)]基因表达量均随着香榧种实膨大而呈现上调表达趋势(图6B)；参与淀粉水解的α-淀粉酶(alpha-amylase，AMY)和β-淀粉酶(beta-amytase，BAM)香榧种实膨大过程中则分别上调表达和下调表达。
图 6 香榧种实膨大过程中蔗糖代谢途径(A)及相关基因表达(B)分析
Figure 6. Sucrose metabolism pathway (A) and the relative gene expression (B) analysis during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion
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香榧种实从授粉到成熟跨2 a，历时17个月之久，其雌球花4月开花授粉，9月完成受精，形成的幼果对生并包裹在种鳞中。次年4月，幼果开始启动细胞分裂和膨大，5—7月进入快速生长期，种实横径、纵径、单粒质量和体积都明显增大，种仁逐渐固化，含水率降低。这一时期的变化是香榧种实产量和品质形成的重要基础，但由于各种内外因素的影响，绝大部分香榧幼果在种实膨大期生长缓慢，甚至停止生长，严重制约香榧产量。研究[27]已经证实：处于膨大期前的香榧幼果授粉受精状况良好，发育正常。因此，香榧种实发育过程中某些重要生理过程的变化是影响香榧种实膨大的关键因素，对这些生理过程的研究也是提高香榧产量的必要前提。
蔗糖作为光合同化物的主要积累形式，其在果实中积累后会被分解为葡萄糖和果糖。这些小分子还原糖进一步参与糖酵解、三羧酸循环等过程，为果实早期发育和细胞膨大提供能量和碳骨架[6]。同时，蔗糖水解产物也会进一步合成淀粉，以淀粉形式储藏[28]。有报道表明：在蚕豆Vicia faba种实发育过程中，葡萄糖可能调节细胞分裂，而蔗糖则调节细胞扩张和储备物沉积[29]。菠萝Ananas comosus幼果期蔗糖含量呈下降趋势，苹果Malus sieversii果实发育前期果糖和蔗糖含量较低[30]；咖啡Coffea racemosa果实果皮和胚乳之间存在密切的蔗糖运输，并且果皮中可溶性糖和还原糖含量随着果实发育逐渐降低[31]。本研究发现：香榧假种皮中的蔗糖、葡萄糖、果糖随着种实膨大先上升后下降，淀粉质量分数不断下降；种仁中蔗糖质量分数则持续下降，淀粉逐渐积累。相关性分析发现：假种皮中葡萄糖、果糖质量分数与种实横纵径显著正相关，与淀粉质量分数显著负相关，种仁中各种糖质量分数与种实体积显著负相关，淀粉质量分数与种实体积正相关。以上结果表明：膨大前期香榧假种皮中的蔗糖以积累为主，而在种实膨大后期蔗糖和淀粉主要以分解为主，以满足种实的不断发育；种仁中蔗糖则一直以分解为主，供给香榧种实膨大和淀粉积累。
蔗糖代谢及其相关酶活性和基因表达量的高低是衡量果实库竞争能力强弱的重要指标，与果实大小和产量密切相关，但不同植物果实中起主导作用的酶不同。研究发现：蜜柑果实膨大期液泡蔗糖转化酶活性较高，蔗糖含量随着液泡蔗糖转化酶活性下降而逐渐积累[15]。较高活性的细胞壁蔗糖转化酶和细胞质蔗糖转化酶则有利于番茄和龙眼Dimocarpus longan果实发育过程中糖向果实中的分配及代谢过程[32-34]。梨Pyrus spp. 果实中蔗糖合成酶活性和蛋白质含量在发育期的梨果实中明显增加，催化蔗糖的分解代谢和果实干物质积累，促进果实增大[35]。糖转运蛋白和蔗糖磷酸合成酶基因的上调表达对苹果果实发育至关重要[33]。本研究中，随着香榧种实膨大，蔗糖磷酸合成酶在假种皮中活性上升，而在种仁中活性下降，蔗糖转化酶活性在香榧假种皮中也显著上升。相关性分析发现：蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉质量分数与3种蔗糖转化酶和蔗糖磷酸合成酶活性显著相关。结合基因表达分析发现：参与蔗糖及还原糖运输的SBP和SUT在种实膨大过程中显著上调表达，参与蔗糖水解的细胞质蔗糖转化酶、液泡蔗糖转化酶编码基因部分转录本也随着种实膨大显著上调，而细胞壁蔗糖转化酶和蔗糖合成酶编码基因则明显下调表达。进一步表明香榧种实膨大过程中假种皮和种仁之间，以及种仁内部存在活跃的碳水化合物运输和代谢过程，且负责蔗糖水解的酶主要是蔗糖转化酶，细胞质蔗糖转化酶和液泡蔗糖转化酶起到重要作用。同时，在种实膨大后期，种仁中参与淀粉合成的SSS、GBSS、SBE均显著上调表达，参与淀粉水解的ISA、AMY上调表达，BAM下调表达。上述结果表明：香榧种实膨大早期，蔗糖分解代谢活跃，主要用于香榧种实的快速膨大；膨大后期蔗糖代谢的同时伴随淀粉合成，有利于种实成熟过程中营养物质转化积累干物质。
此外，果实内部蔗糖代谢与激素含量变化存在显著互作关系，共同调控果实生长发育[36]。草莓Fragaria ananassa果实发育过程中，蔗糖可作为信号分子，诱导细胞内ABA合成途径基因NCEDs的表达，促进ABA的积累[37]。番茄果实发育早期，果实中生长素积累有利于蔗糖向果实中运输及代谢[38]。N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲(N-(2-chloro-4-pyridyl)-N′-phenylurea, CPPU)处理后的猕猴桃Actinidia chinensis var. deliciosa‘Hayward’果实通过增加含水率，促进果实膨大[39]。1.25 mmol·L−1 GA处理能够显著增加桃果实大小以及蔗糖含量[40]。本研究发现：香榧种实膨大过程中，假种皮中GA4、GA3、SA质量分数总体呈显著积累模式，种仁中GA3、SA、ABA也随着种实膨大逐渐积累。相关性分析发现：种仁中GA和IAA质量分数与蔗糖、葡萄糖、果糖质量分数和4种蔗糖代谢酶活性显著正相关，表明香榧种实膨大过程中种仁内部激素质量分数变化与糖代谢密切相关。转录组代谢途径富集显示：激素信号转导和蔗糖代谢通路在香榧种实膨大过程中均被显著富集。结合基因表达分析发现：香榧种实膨大过程中伴随GA3和GA4等激素质量分数的增加，蔗糖转运相关蛋白、细胞壁蔗糖转化酶、细胞质蔗糖转化酶、液泡蔗糖转化酶编码基因均呈现不同程度的上调表达，表明这些基因的表达可能受到种实内部激素质量分数变化的调控。与之相似，外源GA处理增强了液泡蔗糖转化酶编码基因VvGIN1和VvGIN2在葡萄果实中的表达，明显提高蔗糖转化酶活性，促进糖在果实中的积累与代谢，增加果实体积[19]。同样，外源喷施细胞分裂素能够有效提高逆境下番茄果实蔗糖合成酶和细胞壁蔗糖转化酶活性，抑制转化酶抑制蛋白(Invertase inhibitor，INVINH)的表达，增强果实库活力，促进果实生长[41-42]。这表明香榧种实中激素质量分数变化可能参与调控蔗糖代谢相关基因的表达，促进蔗糖的积累与代谢过程，提高种实库活力，进而调控香榧种实的膨大，但具体的调控机制仍有待深入研究。
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本研究发现：膨大前期香榧假种皮中的蔗糖以积累为主，在种实膨大后期蔗糖和淀粉以分解为主，提供能量和碳骨架，以满足种实的不断发育；种仁中蔗糖则一直以分解为主，一方面供给香榧种实膨大，另一方面逐渐合成淀粉，为后期成熟过程中营养物质转化积累干物质。代谢相关酶活性及基因表达分析表明：香榧种实膨大过程中假种皮和种仁之间，以及种仁内部存在活跃的碳水化合物运输和代谢过程，且负责蔗糖水解的酶主要是蔗糖转化酶，细胞质蔗糖转化酶和液泡蔗糖转化酶起到重要作用。此外，假种皮中GA4、GA3、SA质量分数总体呈现显著积累模式，种仁中GA3、SA、ABA也随着种实膨大逐渐积累，且与蔗糖、淀粉质量分数和代谢酶活性呈现相关关系，表明蔗糖代谢的增强可能促进了这些激素的合成和积累，激素质量分数变化进一步调节香榧种实中蔗糖代谢活性和基因表达等。
Sucrose metabolism and gene expression during seed expansion of Torreya grandis ‘Merrillii’
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摘要:
目的 研究香榧Torreya grandis ‘Merrillii’种实膨大过程中蔗糖及其产生的己糖在假种皮和种仁中积累与分配规律，初步阐明蔗糖变化对香榧种实库活力的影响，深入探讨蔗糖代谢关键酶活性及其基因表达模式对香榧种实膨大的影响。 方法 以香榧种实膨大不同阶段的种仁和假种皮为研究材料，测定蔗糖、葡萄糖、果糖及淀粉质量分数，蔗糖代谢相关酶活性，激素质量分数以及蔗糖代谢相关酶编码基因的表达量变化。 结果 随着香榧种实膨大，假种皮中的蔗糖、葡萄糖、果糖先上升后下降，淀粉质量分数不断下降，至种实突破种鳞后90 d时下降至254.05 mg·g−1。种仁中蔗糖质量分数则持续下降，至种实突破种鳞后90 d时下降了61.24%；淀粉逐渐积累，由种实突破种鳞后30 d时的105.29 mg·g−1增加至90 d时的149.72 mg·g−1；蔗糖磷酸合成酶在假种皮中活性上升，而在种仁中活性下降，至种实突破种鳞后90 d时约降低了28.82%；蔗糖转化酶活性在香榧假种皮中也显著上升(P＜0.05)，种实突破种鳞后90 d时细胞质蔗糖转化酶和液泡蔗糖转化酶分别上升至21.52和23.49 μmol·mg−1·min−1。基因表达分析发现：参与蔗糖及还原糖运输的基因在种实膨大过程中显著上调表达(P＜0.05)，参与蔗糖水解的基因部分转录本也随着种实膨大显著上调(P＜0.05)。种仁中参与淀粉合成的基因在种实膨大后期均显著上调表达(P＜0.05)。相关性分析发现：假种皮和种仁中多种激素均与葡萄糖、果糖、蔗糖以及淀粉质量分数和酶活性间呈现一定的相关关系。 结论 膨大前期香榧假种皮中的蔗糖以积累为主，种实膨大后期蔗糖和淀粉以分解为主。种仁中蔗糖则一直以分解为主。假种皮和种仁之间，以及种仁内部存在活跃的碳水化合物运输和代谢过程。负责蔗糖水解的酶主要是蔗糖转化酶，细胞质蔗糖转化酶和液泡蔗糖转化酶起到重要作用。图6表1参42 Abstract:Objective This study is designed to investigate the accumulation and distribution of sucrose and hexose in aril and kernel tissue during seed expansion of Torreya grandis ‘Merrillii’, clarify the effect of sucrose metabolism on the sink vitality of seeds, and explore the effects of key enzyme activity of sucrose metabolism and gene expression patterns on seed expansion. Method The kernel and aril at different stages of T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion were used as research materials. The contents of sucrose, glucose, fructose and starch, the activity of enzymes related to sucrose metabolism, the contents of hormones and changes in the expression of genes encoding enzymes related to sucrose metabolism were measured. Result With the expansion of T. grandis ‘Merrillii’ seeds, the contents of sucrose, glucose and fructose in the aril first increased and then decreased, while the starch content decreased continuously to 254.05 mg·g−1 at 90 d after seed protrusion. Sucrose content in seed kernel decreased by 61.24% at 90 d after seed protrusion, and starch content gradually increased from 105.29 mg·g−1 at 30 d after seed protrusion to 149.72 mg·g−1 at 90 d after seed protrusion. The activity of sucrose phosphate synthase increased in seed aril, but decreased in seed kernel by 28.82% at 90 d after seed protrusion. The activity of sucrose invertase also increased significantly (P＜0.05) in seed aril. At 90 d after seed protrusion, cytoplasmic invertase and vacuolar invertase increased to 21.52 and 23.49 μmol·mg−1·min−1. Gene expression analysis showed that genes involved in sucrose and hexose transport were significantly up-regulated (P＜0.05) during seed expansion, and several transcripts of genes involved in sucrose hydrolysis were also significantly up-regulated (P＜0.05). The genes involved in starch synthesis in seed kernel were significantly up-regulated (P＜0.05) at the later stage of seed expansion. Correlation analysis showed there was a certain correlation between various hormones in aril and kernel and the contents of glucose, fructose, sucrose, starch and enzyme activity. Conclusion The accumulation of sucrose in the aril tissue mainly occurs during the early stage of seed expansion, while the hydrolysis of sucrose and starch occurs in the later stage of seed expansion. Sucrose in seed kernel is mainly decomposed. There are active carbohydrate transport and metabolism between seed aril and kernel, as well as within kernel. Sucrose invertase is the key enzyme responsible for sucrose hydrolysis, and cytoplasmic invertase and vacuolar invertase play an important role. [Ch, 6 fig. 1 tab. 42 ref.] -
Key words:
- Torreya grandis ‘Merrillii’ /
- seed expansion /
- sucrose metabolism /
- enzyme activity /
- gene expression
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九龙山国家级自然保护区位于浙江省遂昌县西南部，与福建浦城县、浙江龙泉市接壤，总面积55.25 km2。1983 年建立，2003年升级为国家级自然保护区。保护区以黑麂Muntiacus crinifrons、黄腹角雉Tragopan caboti、伯乐树Bretschneidera sinensis和南方红豆杉Taxus mairei等珍稀野生动植物和典型的中亚热带森林生态系统为主要保护对象[1]。潘金贵等[2]结合早期研究对九龙山自然保护区的鸟类进行了全面汇总，共记录到鸟类143种；郑伟成等[1]在2012−2013年利用红外相机监测法调查保护区内鸟兽多样性，记录到鸟类10种。本研究整合了以上来源的鸟类调查记录，在此基础上结合本次调查，分析保护区内鸟类组成特征，为研究区鸟类保护和恢复提供科学依据。
1. 研究方法
通过鸟类专项调查活动[2]和红外相机监测记录[1]收集九龙山国家级自然保护区鸟类的历史数据；通过样线法和红外相机监测记录2016−2018年保护区鸟类调查数据。
固定距离样线法在2016−2018年繁殖季(5−8月)和越冬季(10月至次年1月)分别进行，共设置8条样线，每个季度由不同组合的观测者在1周内对每条样线进行1次(2017年繁殖季及以前)或3次(2017越冬季及以后)调查，其中屁股窟、大岩前2条样线仅在2017年越冬季和2018年繁殖季进行调查(表1)。样线单侧宽度为25 m，步行调查，平均速度为2 km·h−1，调查时间为6:00−11:00和15:00−17:00。红外相机监测法在2016年11月至2018年3月进行，以自然保护区地形图为基础将整个调查区域划出1 km×1 km的网格图，每1 km2放置1台，共63台进行网格化监测，累积有效工作时长为22 440个工作日。
表 1 九龙山国家级自然保护区鸟类群落调查样线Table 1 Transect lines of bird community survey in Jiulongshan National Nature Reserve样线 起点 终点 长度/km 坐标 海拔/m 坐标 海拔/m 外九龙 28°22′22.16″N，118°53′26.66″E 703 28°21′53.70″N，118°52′41.38″E 1 149 2.13 游步道 28°23′35.96″N，118°50′43.98″E 525 28°22′53.55″N，118°50′55.82″E 661 3.09 内北坪 28°21′15.67″N，118°51′20.60″E 1 072 28°20′46.51″N，118°51′02.86″E 1 297 2.26 中心坑 28°22′34.91″N，118°53′32.01″E 676 28°22′06.93″N，118°53′46.71″E 979 1.84 上廖坑 28°22′05.57″N，118°51′27.68″E 765 28°22′33.15″N，118°52′01.06″E 1 082 2.18 考坑 28°23′19.99″N，118°50′38.34″E 545 28°23′06.64″N，118°50′10.83″E 802 1.78 屁股窟 28°22′52.72″N，118°53′21.69″E 621 28°23′15.47″N，118°53′30.10″E 756 1.75 大岩前 28°22′32.32″N，118°53′28.91″E 667 28°21′39.10″N，118°53′29.42″E 1 143 1.88 鸟类分类系统的修订和居留型划分参照《中国鸟类分类与分布名录》[3]。地理型划分依据虞快等[4]、张荣祖[5]、诸葛阳[6]方法进行。IUCN濒危物种红色名录按照IUCN Red List (
https://www.iucnredlist.org/ )标准；中国鸟类红色名录按照中国脊椎动物红色名录[7]。2016−2018年样线法调查到的鸟类根据D＝N/2LW计算种群密度，其中D为鸟类密度，N为种群数量，L为样线长度，W为样线单边宽度。鸟类数量等级划定依据相对多度，即1种鸟类的统计数量占所有被统计鸟类总个体数的百分比，相对多度≥10%的为优势种，1%~10%为常见种，＜1%为偶见种。
2. 结果
2.1 鸟类物种组成
2016−2018年调查到81种鸟，其中样线法调查到71种，红外相机调查到24种。通过汇总历史及本次调查记录，九龙山国家级自然保护区共记录鸟类165种，隶属15目49科(表2和表3)；其中，雀形目Passeriformes最多，共30科105种(63.64%)，其次为鹰形目Accipitriformes，1科13种(7.88%)，其余各目物种数均不超过10种。
表 2 九龙山国家级自然保护区鸟类名录Table 2 Species list of bird recorded in Jiulongshan National Nature Reserve序号 目 科 种 居留型 地理型 国家
保护
级别IUCN
红色
名录中国
红色
名录记录
类型2016−
2018历史 1 鸡形目
Galliformes雉科
Phasianidae白眉山鹧鸪Arborophila gingica 留鸟 东洋界 无 NT VU C + + 2 鹌鹑Coturnix japonica 冬候鸟 古北界 无 NT LC L + 3 灰胸竹鸡Bambusicola thoracicus 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 4 黄腹角雉Tragopan caboti 留鸟 东洋界 Ⅰ VU EN LC + + 5 勺鸡Pucrasia macrolopha 留鸟 古北界 Ⅱ LC LC C + + 6 白鹇Lophura nycthemera 留鸟 东洋界 Ⅱ LC LC LC + + 7 白颈长尾雉Syrmaticus ellioti 留鸟 东洋界 Ⅰ NT VU C + + 8 环颈雉Phasianus colchicus 留鸟 古北界 无 LC LC L + + 9 雁形目
Anseriformes鸭科
Anatidae鸳鸯Aix galericulata 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC NT L + 10 普通秋沙鸭Mergus merganser 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 11 鸽形目
Columbiformes鸠鸽科
Columbidae山斑鸠Streptopelia orientalis 留鸟 广布种 无 LC LC LC + 12 火斑鸠S. tranquebarica 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 13 夜鹰目
Caprimulgiformes夜鹰科
Caprimulgidae普通夜鹰Caprimulgus indicus 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 14 雨燕科
Apodidae白腰雨燕Apus pacificus 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 15 鹃形目
Cuculiformes杜鹃科
Cuculidae大鹰鹃Hierococcyx sparverioides 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 16 四声杜鹃Cuculus micropterus 夏候鸟 广布种 无 LC LC L + + 17 中杜鹃C. saturatus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 18 大杜鹃C. canorus 夏候鸟 广布种 无 LC LC L + 19 鹤形目
Gruiformes秧鸡科
Rallidae灰胸秧鸡Lewinia striata 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 20 红脚田鸡Zapornia akool 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 21 鸻形目
Charadriiformes鸻科
Charadriidae凤头麦鸡Vanellus vanellus 冬候鸟 古北界 无 NT LC L + 22 鹬科
Scolopacidae白腰杓鹬Numenius arquata 冬候鸟 古北界 无 NT NT L + 23 红脚鹬Tringa totanus 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 24 鹈形目
Pelecaniformes鹭科
Ardeidae池鹭Ardeola bacchus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 25 中白鹭Ardea intermedia 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 26 鹰形目
Accipitriformes鹰科
Accipitridae黑冠鹃隼Aviceda leuphotes 夏候鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 27 蛇雕Spilornis cheela 留鸟 东洋界 Ⅱ LC NT L + 28 鹰雕Nisaetus nipalensis 留鸟 东洋界 Ⅱ LC NT L + 29 乌雕Clanga clanga 冬候鸟 古北界 Ⅱ VU EN L + 30 白腹隼雕Aquila fasciata 留鸟 东洋界 Ⅱ LC VU L + 31 赤腹鹰Accipiter soloensis 留鸟 广布种 Ⅱ LC LC L + 32 松雀鹰A. virgatus 留鸟 古北界 Ⅱ LC LC C + + 33 雀鹰A. nisus 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC LC L + 34 苍鹰A. gentilis 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC NT L + 35 鹰形目
Accipitriformes鹰科
Accipitridae黑鸢Milvus migrans 留鸟 古北界 Ⅱ LC LC L + 36 灰脸鵟鹰Butastur indicus 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC NT L + 37 毛脚鵟Buteo lagopus 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC NT L + 38 普通鵟B. japonicus 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC LC L + 39 鸮形目
Strigiformes鸱鸮科
Strigidae领角鸮Otus lettia 留鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 40 红角鸮O. sunia 留鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 41 雕鸮Bubo bubo 留鸟 东洋界 Ⅱ LC NT L + 42 领鸺鹠Glaucidium brodiei 留鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 43 斑头鸺鹠G. cuculoides 留鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 44 长耳鸮Asio otus 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC LC L + 45 草鸮科
Tytonidae草鸮Tyto longimembris 留鸟 东洋界 Ⅱ LC DD L + 46 犀鸟目
Falconiformes戴胜科
Upupidae戴胜Upupa epops 旅鸟 广布种 无 LC LC L + 47 佛法僧目
Coraciformes佛法僧科
Coraciidae三宝鸟Eurystomus orientalis 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 48 白胸翡翠Halcyon smyrnensis 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 49 蓝翡翠H. pileata 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 50 普通翠鸟Alcedo atthis 留鸟 广布种 无 LC LC L + 51 冠鱼狗Megaceryle lugubris 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 52 啄木鸟目
Piciformes拟啄木鸟科
Capitonidae大拟啄木鸟Psilopogon virens 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 53 啄木鸟科
Picidae斑姬啄木鸟Picumnus innominatus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 54 棕腹啄木鸟Dendrocopos hyperythrus 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 55 星头啄木鸟D. canicapillus 留鸟 广布种 无 LC LC L + 56 大斑啄木鸟D. major 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 57 灰头绿啄木鸟Picus canus 留鸟 广布种 无 LC LC C + + 58 黄嘴栗啄木鸟Blythipicus pyrrhotis 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + 59 隼形目
Falconiformes隼科
Falconidae红隼Falco tinnunculus 留鸟 广布种 Ⅱ LC LC L + 60 燕隼F. subbuteo 夏候鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 61 雀形目
Passeriformes八色鸫科
Pittidae蓝翅八色鸫Pitta moluccensis 迷鸟 东洋界 Ⅱ LC DD L + 62 黄鹂科
Oriolidae黑枕黄鹂Oriolus chinensis 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 63 莺雀科
Vireonidae淡绿鵙鹛Pteruthius xanthochlorus 留鸟 东洋界 无 LC NT L + 64 山椒鸟科
Campephagidae小灰山椒鸟Pericrocotus cantonensis 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 65 灰喉山椒鸟P. solaris 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 66 卷尾科
Dicruridae灰卷尾Dicrurus leucophaeus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 67 发冠卷尾D. hottentottus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 68 伯劳科
Laniidae牛头伯劳Lanius bucephalus 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 69 红尾伯劳L. cristatus 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 70 棕背伯劳L. schach 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 71 鸦科
Corvidae松鸦Garrulus glandarius 留鸟 古北界 无 LC LC LC + + 72 红嘴蓝鹊Urocissa erythrorhyncha 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 73 灰树鹊Dendrocitta formosae 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 74 雀形目
Passeriformes鸦科
Corvidae喜鹊Pica pica 留鸟 古北界 无 LC LC L + 75 白颈鸦Corvus pectoralis 留鸟 广布种 无 VU NT L + 76 大嘴乌鸦C. macrorhynchos 留鸟 广布种 无 LC LC L + 77 山雀科
Paridae煤山雀Periparus ater 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 78 黄腹山雀Pardaliparus venustulus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 79 大山雀Parus cinereus 留鸟 广布种 无 LC LC L + + 80 黄颊山雀Machlolophus spilonotus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 81 扇尾莺科
Cisticolidae褐山鹪莺Prinia polychroa 迷鸟 东洋界 无 LC LC L + 82 纯色山鹪莺P. inornata 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 83 燕科
Hirundinidae崖沙燕Riparia riparia 留鸟 古北界 无 LC LC L + 84 家燕Hirundo rustica 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 85 金腰燕Cecropis daurica 夏候鸟 广布种 无 LC LC L + 86 鹎科
Pycnonotidae领雀嘴鹎Spizixos semitorques 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 87 黄臀鹎Pycnonotus xanthorrhous 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 88 白头鹎P. sinensis 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 89 绿翅短脚鹎Ixos mcclellandii 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 90 栗背短脚鹎Hemixos castanonotus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 91 黑短脚鹎H. leucocephalus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + + 92 柳莺科
Phylloscopidae褐柳莺Phylloscopus fuscatus 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 93 巨嘴柳莺P. schwarzi 旅鸟 古北界 无 LC LC L + + 94 黄腰柳莺P. proregulus 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + + 95 黄眉柳莺P. inornatus 旅鸟 古北界 无 LC LC L + + 96 极北柳莺P. borealis 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 97 冕柳莺P. coronatus 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 98 冠纹柳莺P. claudiae 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 99 黄胸柳莺P. cantator 迷鸟 东洋界 无 LC LC L + 100 金眶鹟莺Seicercus burkii 迷鸟 东洋界 无 LC LC L + 101 栗头鹟莺S. castaniceps 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 102 树莺科
Cettiidae棕脸鹟莺Abroscopus albogularis 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 103 强脚树莺Horornis fortipes 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 104 长尾山雀科
Aegithalidae红头长尾山雀Aegithalos concinnus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 105 莺鹛科
Sylviidae棕头鸦雀Sinosuthora webbianus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 106 绣眼鸟科
Zosteropidae栗耳凤鹛Yuhina castaniceps 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 107 暗绿绣眼鸟Zosterops japonicus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 108 林鹛科
Timaliidae斑胸钩嘴鹛Erythrogenys gravivox 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 109 棕颈钩嘴鹛Pomatorhinus ruficollis 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 110 红头穗鹛Cyanoderma ruficeps 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 111 幽鹛科
Pellorneidae灰眶雀鹛Alcippe morrisonia 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 112 噪鹛科
Leiothrichidae画眉Garrulax canorus 留鸟 东洋界 无 LC NT LC + + 113 灰翅噪鹛G. cineraceus 留鸟 东洋界 无 LC LC C + 114 黑脸噪鹛G. perspicillatus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 115 雀形目
Passeriformes噪鹛科
Leiothrichidae小黑领噪鹛G. monileger 留鸟 东洋界 无 LC LC C + + 116 黑领噪鹛G. pectoralis 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 117 棕噪鹛G. berthemyi 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 118 白颊噪鹛G. sannio 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 119 红嘴相思鸟Leiothrix lutea 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 120 䴓科
Sittidae普通䴓Sitta europaea 留鸟 古北界 无 LC LC L + 121 河乌科
Cinclidae褐河乌Cinclus pallasii 留鸟 广布种 无 LC LC L + + 122 椋鸟科
Sturnidae八哥Acridotheres cristatellus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 123 鸫科
Turdidae白眉地鸫Geokichla sibirica 旅鸟 东洋界 无 LC LC C + 124 虎斑地鸫Zoothera aurea 冬候鸟 古北界 无 LC LC C + + 125 灰背鸫Turdus hortulorum 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 126 乌鸫T. mandarinus 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 127 白腹鸫T. pallidus 冬候鸟 古北界 无 LC LC C + 128 红尾斑鸫T. naumanni 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 129 鹟科
Muscicapidae红胁蓝尾鸲Tarsiger cyanurus 冬候鸟 古北界 无 LC LC LC + + 130 鹊鸲Copsychus saularis 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 131 北红尾鸲Phoenicurus auroreus 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + + 132 红尾水鸲Rhyacornis fuliginosa 留鸟 古北界 无 LC LC L + + 133 白顶溪鸲Chaimarrornis leucocephalus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 134 紫啸鸫Myophonus caeruleus 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 135 小燕尾Enicurus scouleri 留鸟 古北界 无 LC LC L + + 136 黑背燕尾E. immaculatus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 137 灰背燕尾E. schistaceus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 138 白额燕尾E. leschenaulti 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 139 灰林䳭Saxicola jerdoni 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 140 蓝头矶鸫Monticola cinclorhyncha 留鸟 古北界 无 LC LC L + 141 蓝矶鸫M. solitarius 留鸟 古北界 无 LC LC LC + 142 北灰鹟Muscicapa dauurica 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 143 白眉姬鹟Ficedula zanthopygia 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 144 白腹蓝鹟Cyanoptila cyanomelana 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 145 白腹暗蓝鹟C. cumatilis 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 146 白喉林鹟Cyornis brunneatus 夏候鸟 东洋界 无 VU VU L + 147 叶鹎科
Chloropseidae橙腹叶鹎Chloropsis hardwickii 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 148 梅花雀科
Estrildidae白腰文鸟Lonchura striata 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 149 梅花雀科
Estrildidae斑文鸟L. punctulata 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 150 雀科
Passeridae山麻雀Passer cinnamomeus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 151 麻雀P. montanus 留鸟 广布种 无 LC LC L + + 152 鹡鸰科
Motacillidae山鹡鸰Dendronanthus indicus 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 153 黄鹡鸰Motacilla tschutschensis 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 154 雀形目
Passeriformes鹡鸰科
Motacillidae白鹡鸰M. alba 留鸟 古北界 无 LC LC L + + 155 树鹨Anthus hodgsoni 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + + 156 红喉鹨A. cervinus 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 157 燕雀科
Fringillidae锡嘴雀Coccothraustes coccothraustes 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 158 黑尾蜡嘴雀Eophona migratoria 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 159 金翅雀Chloris sinica 留鸟 广布种 无 LC LC L + + 160 鹀科
Emberizidae凤头鹀Melophus lathami 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 161 三道眉草鹀Emberiza cioides 留鸟 古北界 无 LC LC L + 162 白眉鹀E. tristrami 冬候鸟 古北界 无 LC NT L + + 163 小鹀E. pusilla 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + + 164 田鹀E. rustica 冬候鸟 古北界 无 VU LC L + 165 灰头鹀E. spodocephala 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + + 说明：LC表示低危；NT表示近危；VU表示易危；EN表示濒危；DD表示数据缺乏。L表示样线法观察；C表示红外相机监测。+表 示调查到此鸟 表 3 九龙山国家级自然保护区鸟类组成与保护级别Table 3 Taxonomic composition and national protection category of birds in Jiulongshan National Nature Reserve目 科 种 国家保护级别/种 目 科 种 国家保护级别/种 I Ⅱ Ⅰ Ⅱ 鸡形目 1 8 2 2 雁形目 1 2 0 1 鸽形目 1 2 0 0 夜鹰目 2 2 0 0 鹃形目 1 4 0 0 鹤形目 1 2 0 0 鸻形目 2 3 0 0 鹈形目 1 2 0 0 鹰形目 1 13 0 13 鸮形目 2 7 0 7 犀鸟目 1 1 0 0 佛法僧目 2 5 0 0 啄木鸟目 2 7 0 0 隼形目 1 2 0 2 雀形目 30 105 0 1 合计 49 165 2 26 2.2 濒危保护物种
九龙山国家级自然保护区记录到的165种鸟中，有国家Ⅰ级重点保护鸟类2种，分别为雉科的白颈长尾雉和黄腹角雉；国家Ⅱ级重点保护鸟类26种，主要为鹰形目(13种)和鸮形目(7种)物种；鸡形目和隼形目各2种；雁形目和雀形目各1种(表3)。
被IUCN濒危物种红色名录列为易危(VU)的有5种；近危(NT)的有5种；其余155种为低危(LC)种。被中国濒危物种红色名录列为濒危(EN)的有2种，分别为黄腹角雉和乌雕；易危(VU)的有4种；近危(NT)的有12种；数据缺乏(DD)2种；其余145种为低危(LC)种。
2.3 区系组成与居留型
在居留型方面，留鸟最多，有93种，占九龙山国家级自然保护区鸟类总数的56.36%；夏候鸟28种，占比16.97%；冬候鸟27种，占比16.36%；旅鸟13种，占比7.88%；迷鸟4种，占比2.42%。在留鸟、夏候鸟、冬候鸟和旅鸟中，物种数最多的都是雀形目鸟类，分别为61种、14种、15种和11种，分别占留鸟、夏候鸟、冬候鸟和旅鸟物种数的65.59%、50.00%、55.56%和84.62%。
在地理型方面，东洋界种最多(89种)，占九龙山国家级自然保护区鸟类物种总数的53.94%；古北界种60种，占比36.36%；广布种16种，占比9.70%。东洋界种在留鸟和夏候鸟中占比最多，分别占72.04%和60.71%；古北界种在旅鸟和冬候鸟中占绝对优势，分别为84.62%和100%；记录到的本区域内121种繁殖鸟(即留鸟与夏候鸟之和)中，东洋界种最多，共84种，占69.42%。
所有鸟类和繁殖鸟类，均以东洋界种占优势，因此认为九龙山国家级自然保护区鸟类地理区系以东洋界为主体，兼有东洋界向古北界过渡性的特征，更偏向于华南区的区系。
2.4 鸟类密度和相对多度
样线法调查发现(表4)：2016−2018年，九龙山国家级自然保护区共调查到鸟类71种，优势种为灰眶雀鹛(相对多度为28.39%，种群密度为199.88只·km−2)和红头长尾山雀(相对多度为10.19%，种群密度为71.75只·km−2)。常见种20种，密度为7~70只·km−2，如栗背短脚鹎、大山雀、棕脸鹟莺、山麻雀、麻雀等。其余49种为偶见种，种群密度小于7只·km−2。
表 4 九龙山国家级自然保护区鸟类种群密度和相对多度(2016−2018年)Table 4 Population density and relative abundance of birds in Jiulongshan National Nature Reserve (2016−2018)种名 密度/(只·km−2) 百分比/% 优势度 种名 密度/(只·km−2) 百分比/% 优势度 灰眶雀鹛 199.88 28.39 +++ 红头长尾山雀 71.75 10.19 +++ 栗背短脚鹎 63.47 9.01 ++ 大山雀 46.13 6.55 ++ 棕脸鹟莺 24.05 3.42 ++ 山麻雀 19.71 2.80 ++ 麻雀 19.71 2.80 ++ 红嘴蓝鹊 18.14 2.58 ++ 绿翅短脚鹎 17.74 2.52 ++ 红头穗鹛 16.16 2.30 ++ 黑短脚鹎 14.98 2.13 ++ 领雀嘴鹎 14.59 2.07 ++ 棕头鸦雀 13.40 1.90 ++ 红尾水鸲 11.43 1.62 ++ 白额燕尾 9.86 1.40 ++ 白鹡鸰 9.86 1.40 ++ 棕颈钩嘴鹛 9.46 1.34 ++ 松鸦 9.07 1.29 ++ 灰喉山椒鸟 8.67 1.23 ++ 白鹇 7.88 1.12 ++ 锡嘴雀 7.88 1.12 ++ 画眉 7.49 1.06 ++ 白头鹎 6.70 0.95 + 灰背燕尾 5.52 0.78 + 小灰山椒鸟 5.52 0.78 + 灰树鹊 4.34 0.62 + 灰胸竹鸡 3.94 0.56 + 小燕尾 3.94 0.56 + 黑脸噪鹛 3.55 0.50 + 红嘴相思鸟 3.55 0.50 + 强脚树莺 3.55 0.50 + 北红尾鸲 3.15 0.45 + 红胁蓝尾鸲 3.15 0.45 + 黄颊山雀 2.37 0.34 + 黄腰柳莺 2.37 0.34 + 环颈雉 1.97 0.28 + 黄眉柳莺 1.97 0.28 + 棕噪鹛 1.97 0.28 + 白眉鹀 1.58 0.22 + 斑胸钩嘴鹛 1.58 0.22 + 冠纹柳莺 1.58 0.22 + 黄臀鹎 1.58 0.22 + 灰头鹀 1.58 0.22 + 斑文鸟 1.18 0.17 + 褐河乌 1.18 0.17 + 黄腹山雀 1.18 0.17 + 极北柳莺 1.18 0.17 + 树鹨 1.18 0.17 + 白腰文鸟 0.79 0.11 + 斑姬啄木鸟 0.79 0.11 + 橙腹叶鹎 0.79 0.11 + 大鹰鹃 0.79 0.11 + 黑领噪鹛 0.79 0.11 + 黄腹角雉 0.79 0.11 + 暗绿绣眼鸟 0.39 0.06 + 白颊噪鹛 0.39 0.06 + 大斑啄木鸟 0.39 0.06 + 红脚田鸡 0.39 0.06 + 红脚鹬 0.39 0.06 + 黄鹡鸰 0.39 0.06 + 黄嘴栗啄木鸟 0.39 0.06 + 金翅雀 0.39 0.06 + 巨嘴柳莺 0.39 0.06 + 冕柳莺 0.39 0.06 + 鹊鸲 0.39 0.06 + 四声杜鹃 0.39 0.06 + 乌鸫 0.39 0.06 + 小鹀 0.39 0.06 + 星头啄木鸟 0.39 0.06 + 紫啸鸫 0.39 0.06 + 棕腹啄木鸟 0.39 0.06 + 说明：+表示偶见种；++表示常见种；+++表示优势种 2.5 鸟类组成变化
对比历史记录，2016−2018年的鸟类监测活动记录到的81种鸟类中，有22种为九龙山国家级自然保护区新纪录到的鸟种，均为雀形目鸟类(表2)，其中19种为样线法记录到的鸟类，4种为红外相机记录到的鸟类；从地理型和居留型角度来看，新记录种中大多数为繁殖鸟类(夏候鸟和留鸟，18种)和东洋界种(13种)。
3. 讨论
浙江九龙山国家级自然保护区地形复杂，属中亚热带湿润季风气候，四季分明，雨水充沛，优良的生态环境使得这里的鸟类物种多样性十分丰富[2]。保护区面积仅55.25 km2，但鸟类物种数超过浙江省鸟类物种数的30%[8]；森林覆盖率高(98.8%)，山间多溪流而少大型湖泊，以雀形目鸟占优势(105种，63.64%)，如一些噪鹛科、鹟科、柳莺科、鹎科、鹀科在本地种类较多。样线调查数据显示：灰眶雀鹛和红头长尾山雀等2种喜欢集群生活的鸟类为本地优势种。
在中国动物地理的划分上，浙江省属于东洋界华中区的东部丘陵平原亚区，与古北界华北区黄淮平原亚区相毗邻[5]，省内鸟类组成兼具古北界与东洋界成分。九龙山国家级自然保护区位于浙江省西南部较低纬度带内，绝大部分鸟类组成为东洋界种(53.94%)和古北界种(36.36%)，由此认为九龙山国家级自然保护区鸟类组成具有东洋界和古北界相混杂和过渡的特征，且偏向于东洋界。研究发现：位于浙江省西北部较高纬度的天目山地区鸟类组成中，东洋界种(51.8%)占比略高于古北界种(44.04%)[9]；而位于九龙山南部、浙江省较低纬度的凤阳山鸟类组成中，东洋界种(63.5%)则远高于古北界种(24.3%)[10]。由此可见，随地理位置向华南区移动，鸟类群落中东洋界成分增加。
就居留型而言，九龙山国家级自然保护区鸟类中留鸟最多(93种)，占鸟类物种数的一半以上(56.36%)；夏候鸟(28种)和冬候鸟(27种)次之。除留鸟外，黑短脚鹎、三宝鸟、发冠卷尾等夏候鸟多在浙江以南的东洋界越冬而飞来此地繁殖；北红尾鸲、灰背鸫、苍鹰等冬候鸟多在古北区繁殖而飞来此地越冬。因此认为研究区鸟类组成中的夏候鸟主要是东洋界种(17种，60.71%)，冬候鸟主要是古北界种(27种，100.00%)。该区旅鸟大多为古北界种(11种，84.62%)，由此不难推测，该保护区是北灰鹟、褐柳莺、极北柳莺等旅鸟秋季由北向南或春季由南向北的迁徙途径地。
研究区共观察到国家级重点保护鸟类或中国和IUCN红色名录中的受胁种37种，占本区所有物种数的22.42%。近年来，利用红外相机监测鸟类(夜行性以及地栖性鸟类)的作用突出[11]，在监测对人类活动敏感或不易在样线法中发现或迅速隐秘踪影而难以辨别物种上尤其有用。2012−2013年4个月[1]和本次调查中利用红外相机监测到九龙山国家级自然保护区鸟类物种数共26种，占研究区鸟类物种总数的15.76%，包括6种雉科鸟类，7种近地面活动的鸫科鸟类，其中灰翅噪鹛、白眉地鸫、白腹鸫为红外相机单独监测到。由于红外相机可以连续24 h无干扰工作，能更全面记录区域内的物种，更真实估测雉类种群数量大小并探究其分布活动规律，因此结合红外相机监测法对黄腹角雉[12]、白颈长尾雉[13]等中国特有珍禽进行生态学研究，可为保护工作的实施拓宽思路。
4. 致谢
感谢浙江大学生命科学学院任鹏参与红外相机监测与物种鉴定工作；感谢曾頔、赵郁豪、李家琦、周浩楠、金挺浩等同学参与鸟类群落调查工作。
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图 1 香榧种实膨大期生长指标变化
Figure 1 Changes of growth indexes during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion stages
图 2 香榧种实膨大期蔗糖(A)、葡萄糖(B)、果糖(C)和淀粉(D)质量分数变化
Figure 2 Changes of sucrose (A), glucose (B), fructose (C) and starch (D) contents in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion
图 3 香榧种实膨大期蔗糖磷酸合成酶(A)、细胞壁蔗糖转化酶(B)、液泡蔗糖转化酶(C)和细胞质蔗糖转化酶(D)活性变化
Figure 3 Changes of sucrose phosphate synthase (A), cell wall invertase (B), vacuolar invertase (C) and cytoplasmic invertase (D) activities in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion
图 4 香榧种实膨大期假种皮(A)和种仁(B)中各生长指标、糖质量分数、酶活性和激素质量分数间相关性分析
Figure 4 Correlation analysis of growth index, sugar content, enzyme activity and hormone content in aril (A) and kernel tissues (B) during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion
图 5 香榧种实膨大期差异表达基因(A)及KEGG代谢途径富集(B)分析
Figure 5 Analysis of differential expression genes (A) and KEGG pathway enrichment (B) during T.grandis ‘Merrillii’ seed expansion
图 6 香榧种实膨大过程中蔗糖代谢途径(A)及相关基因表达(B)分析
Figure 6 Sucrose metabolism pathway (A) and the relative gene expression (B) analysis during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion
表 1 香榧种实膨大期内源激素质量分数变化分析
Table 1. Analysis of endogenous hormone contents in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion
植物激素 种实突破种鳞后不同时间激素水平 /(ng·g−1) 30 60 90 d 假种皮 种仁 假种皮 种仁 假种皮 种仁 生长素 (IAA) 149.81±4.75 c 467.88±30.98 a 23.68±0.25 d 215.04±3.24 b 12.59±0.40 d 3.65±0.03 d 赤霉素 (GA4) 1.03±0.03 b 0.30±0.03 cd 0.89±0.31 bc 0.22±0.03 d 2.12±0.37 a 0.17±0.03 d 赤霉素 (GA3) 1.06±0.11 cd 0.09±0.01 e 2.56±0.17 b 1.43±0.03 c 12.08±0.53 a 0.42±0.04 ed 脱落酸 (ABA) 875.62±29.96 ab 763.09±76.84 bc 712.75±15.28 c 907.91±50.30 a 207.71±6.13 d 922.31±42.40 a 水杨酸 (SA) 11.88±0.57 c 10.70±0.52 c 8.93±0.33 c 8.68±0.17 c 96.05±3.32 a 43.66±0.83 b 茉莉酸 (JA) 155.52±4.45 a 4.39±0.59 bc 9.05±0.50 b 0.53±0.10 c 8.39±0.71 b 0.14±0.01 c 茉莉酸异亮氨酸 (JA-ILE) 254.36±7.94 a 6.93±0.60 bc 15.46±1.03 b 0.59±0.01 d 4.57±0.40 d 0.36±0.02 d 1-氨基-环丙烷羧酸 (ACC) 7.92±0.19 a 0.75±0.22 b 2.26±0.16 c 0.38±0.05 d 0.47±0.03 d 4.66±0.36 b 双氢玉米素 (DHZ) 1.16±0.09 a 0.71±0.05 b 0.71±0.02 b 0.32±0.03 c 0.41±0.02 c 0.46±0.02 c 反式玉米素核苷(tZR) 0.44±0.05 a 0.03±0.00 c 0.17±0.00 b 0.02±0.00 c 0.12±0.01 b 0.04±0.00 c 异戊烯基腺嘌呤(IP) 0.21±0.02 a 0.05±0.01 c 0.13±0.01 b 0.02±0.00 d 0.14±0.01 b 0.02±0.00 d 反式玉米素(tZ) 0.18±0.01 a 0.03±0.01 c 0.06±0.00 b 0.02±0.00 c 0.03±0.00 c 0.02±0.00 c 说明：不同字母表示不同组织、不同膨大阶段间存在显著差异(P＜0.05) 
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