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竹材因孔隙层次多,含有丰富的多糖、蛋白质和水分等营养物质,极易受微生物侵染[1−2]。因此,通过技术手段改良竹材以增强竹材的抑菌性能尤为重要[3]。目前常用的木材、竹材抑菌改性剂有无机抑菌剂和有机抑菌剂2类[4]。无机抑菌剂与纤维之间是物理吸附,相互作用力弱,容易流失;有机抑菌剂虽能与纤维形成化学联接,却容易对环境造成污染,使微生物产生抗药性。植物多酚是天然植物原料中的有效成分,因其种类繁多、生产量大、能抗炎抑菌而备受关注[5]。天然多酚类化合物没食子酸能通过接触微生物造成细胞膜局部破裂成孔,破坏细胞膜完整性,使得细胞膜内物质泄漏,进而杀死细胞[6],因此,近年来被广泛应用于改良材料的抑菌性能。ZHANG等[7]和ZARANDONA等[8]使用没食子酸制备的乙酰化果胶和壳聚糖膜均表现出优异的抑菌效果。龙竹Dendrocalamus giganteus是滇东南地区广泛分布的特色大型丛生竹材,常被应用于西南少数民族建筑和家具制品,但其抗生物侵害能力不足的特性严重影响了其使用周期和产品质量[9]。本研究基于竹材细胞壁组分多羟基特性和没食子酸的天然抑菌活性,用没食子酸改性龙竹竹粉,并对改性竹粉的结构特性和抑菌性能进行分析表征,可为发展植物源竹材绿色防护技术提供方法借鉴和理论支撑。
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供试竹材为云南省临沧市沧源县3年生无腐朽无霉变龙竹。供试菌种大肠埃希菌Escherichia coli (革兰氏阴性细菌)和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (革兰氏阳性细菌)购自北京保藏生物科技有限公司。
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将龙竹去节,去除竹青竹黄,劈成竹片,用粉碎机粉碎后过40~60目筛,将该原料记作DG;用苯醇抽提(体积比为2∶1) 6 h做脱蜡处理,放在60 ℃的烘箱内干燥备用,抽提物料记作DG-E;称取DG-E物料10.00 g,加入质量浓度为5%的氢氧化钠溶液,固液比为1∶20,在80 ℃的恒温水浴锅内磁力搅拌回流2 h,用蒸馏水洗涤至中性,冷冻干燥,制备得到碱处理的竹粉,碱处理物料记作DG-A。
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龙竹改性方法在文献[10]的基础上略有改动:称取10.00 g没食子酸(GA)于烧杯中,加入100 mL N, N-二甲基甲酰胺(DMF),搅拌完全溶解;加入DG-A 3.50 g、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC) 12.00 g和4-二甲氨基吡啶(DMAP) 1.45 g;水浴搅拌反应48 h,反应温度为60 ℃,待反应结束后用蒸馏水和乙醇反复洗涤烘干备用,得到的物料标记为DG-GA。
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参考GB/T 20944.3—2008[11]略有改动制备菌液。将第3代菌液采用10倍稀释法稀释到合适倍数后,取50 μL涂布,培养24 h观察,确定菌液浓度达1×1012~5×1012 CFU·L−1,菌液分别记作SA-1和EC-1。将SA-1和EC-1菌液用10倍稀释法稀释4次,使菌液浓度达3×108~4×108 CFU·L−1,分别记作SA-2和EC-2,作为预接种菌液。
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使用直接红染料(Direct red 28, DR28)对DG、DG-E、DG-A进行可及度测定[12]。称取0.1 g待测样品与10 mL不同质量浓度的染液(0、0.13、0.30、0.60、0.90、1.20、1.80、2.40、2.80和3.00 mg·mL−1)混合。放置于恒温振荡器中,50 ℃,150 r·min−1保持24 h,收集上清液并用紫外可见分光光度计(UV-210 PC)在498 nm条件下测定其吸光度,使用标准曲线计算残液浓度。根据Langmuir吸附等温线拟合分析几种物料对染料的吸附能力,对龙竹竹粉的可及范围做出评估。
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参照美国能源再生实验室NREL法[13]对DG、DG-E、DG-A和DG-GA的化学成分进行分析。用体积分数为72%的硫酸对物料进行酸水解,使用高效液相色谱仪(Agilent 1200S)对4种物料中的碳水化合物成分进行分析;使用紫外可见分光光度计在205 nm处对酸溶木质素进行分析,将剩余固体残渣用G3砂芯漏斗洗净,65 ℃烘干,木质素总量为酸溶木质素与固体残渣的总和。
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分析DG、DG-E、DG-A和DG-GA等4种样品的化学结构,使用傅里叶红外光谱仪(Nexus 670,FTIR)进行扫描,扫描范围为4 000~500 cm−1,分辨率为2 cm−1,扫描次数32次的模式下采集数据。采用X射线衍射分析仪(X Pert Powder,XRD)分析样品的结晶结构,使用铜靶波长为0.154 18 nm,2θ扫描区间为5°~40°,电压40 kV,电流40 mA。其中结晶指数可以根据Segal公式进行计算:$ {{I}}_{\text{cr}}\text{=}\dfrac{\text{(}{{I}}_{\text{002}}{-}{{I}}_{\text{amorph}}\text{)}}{{{I}}_{\text{002}}}\text{×100}\text{}{\%} $。其中,Icr为结晶指数,Iamorph指2θ为18°时无定形区衍射峰的强度,I002为主结晶峰002的最大衍射强度。
使用扫描电子显微镜(Hitachi Regulus 8100,SEM)观察样品的表面形貌,加速电压为2~5 kV,物料表面喷金处理。采用热重分析仪(TG),分别称取4种样品约3.0 mg于陶瓷坩埚中,利用高纯度氮气作为保护气(气体流量为20 mL·min−1)和吹扫气(气体流量为50 mL·min−1),样品升温速率为10 ℃·min−1,温度为35~600 ℃。
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参照GB/T 20944.3—2008[11],探究DG-A和DG-GA对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性能。在三角烧瓶中称取上述2种样品各(0.75±0.05) g,然后在烧瓶中各加入(70.00±0.03) mL 0.03 mol·L−1的PBS缓冲溶液,再加入5.0 mL SA-2菌液,每种样品制备3个平行样,另准备3个不加样品的空白对照;将每个烧瓶盖好透气封口膜,置于恒温振荡器上,在(24±1) ℃,以150 r·min−1,振荡18 h。到规定时间后,将烧瓶中的试液稀释至合适的倍数,取(50.0±0.1) μL移入固体培养基中,每个试液及不同的稀释浓度制作3个平行样,倒置平板,在(37±1) ℃,培养24~48 h。选择30~300 CFU的平板进行计数,对DG-A和DG-GA的活菌浓度进行计数。按下式计算抑菌率(Y): $ {Y}\text{=}\dfrac{{{W}}_{\text{t}}-{{Q}}_{\text{t}}}{{{W}}_{\text{t}}}\text{×100}\text{}{\%} $。其中,Wt为空白对照组3组平行样菌液浓度的平均值;Qt为每种试样3组平行样菌液浓度的平均值。
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图1表明:经过苯醇抽提处理后的竹粉(DG-E)对染料的吸附量从44.92 mg·g−1增加到78.66 mg·g−1;碱处理竹粉(DG-A)对染料的吸附量从78.66 mg·g−1增加到174.39 mg·g−1,增加了121.7%。可能是由于碱液进入竹纤维束内部,将细胞壁内的部分木质素和半纤维素溶解,同时润胀纤维,增大了竹粉的可及度。选择最大可及度的条件下制备的竹粉样品进行后续酯化改性。
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由图2可见:经过苯醇抽提脱蜡处理的竹粉(DG-E)的木质纤维化学成分无明显变化;碱处理竹粉(DG-A)的纤维素相对含量从48.63%增加到61.24%,半纤维素相对含量从15.29%减少到11.39%,木质素相对含量从30.36 %减少到18.81%。该结果表明:碱处理去除了部分碳水化合物和木质素,使得没食子酸与竹材内部的羟基接触反应的可能性变大[14]。DG-A与DG-GA的化学组分比较结果显示:纤维素、木质素和半纤维素的相对含量几乎不变,可见没食子酸与竹粉的酯化反应对其纤维素、木质素和半纤维素的相对含量影响不大。
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由图3可知:3 401和2 900 cm−1处分别出现O—H和C—H的伸缩振动峰,在1 592和1 511 cm−1处的苯环伸缩振动峰是木质素的基本特征吸收峰[15],在1 052 cm−1处是醚键(C—O—C)的吸收峰,894 cm−1是木糖单元之间的β-糖苷键的特征吸收[16];对比DG-E和DG-A,在1 724 cm−1处的酯键(C=O)消失,这是由于木质素结构单元之间和木质素与碳水化合物之间的联接键是酯键,该键在碱性条件下非常容易被水解[14],所以在碱处理之后,该峰位置的信号明显减弱;经过GA改性后,1 724 cm−1处的C=O的吸收峰又显著增强,并且在1 150~1 200 cm−1处C—O的伸缩振动也增强,说明竹粉表面可能生成酯键[17]。LIU等[18]用GA改性果胶,证实了在1 749 cm−1处,果胶的羟基基团与GA末端的羧基形成酯键,该结果与GA改性DG的结果相符。
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由图4可以看出:DG、DG-E、DG-A和DG-GA等4种物料的峰形相似,均表现出纤维素Ⅰ型衍射峰。在2θ为16.0°的峰对应为纤维素(101)晶面衍射峰,在2θ为22.0°的峰对应为纤维素(002)晶面衍射峰[14]。与原竹粉相比较,随着抽提、碱处理和酯化反应的进行,纤维素的结晶度逐渐降低,这是由于碱的润胀作用会在一定程度上破坏纤维素的结晶结构,从而降低结晶度[19]。经过酯化反应后,结晶度由54.93%降至50.73%,这一变化可能是酯基的引入将相对松散的区域破坏,使得结晶度下降。ZHU等[20]在松香酸改性木质纤维素的研究中,也证实了酯化之后的纤维素结晶度有所降低。
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如图5所示:天然DG表面有细微颗粒,纤维束之间黏结紧密;经过抽提后,DG-E表面呈鳞状较为粗糙,是因为解除了蜡质的包裹作用;在碱处理后,竹纤维经过润胀,原本连接紧密的竹纤维束变得更加松散,说明碱液有效的浸透到竹材中,DG-A细胞之间的连接物质如木质素和半纤维素等减少,这一现象与龙竹化学组分分析结果一致。由于部分低聚物溶出,让原本致密的竹材变得松散,使得GA更容易浸入到竹材内部发生反应。改性后的物料DG-GA更加光滑,无明显的层次结构,表明纤维素与GA酯化形成的产物可能形成了包裹物包裹在纤维上。
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由图6所示:在初始升温阶段(30~200 ℃),所有物料均无明显降解,其质量损失主要是由物料中的水等小分子挥发所导致。180~360 ℃阶段为纤维素、半纤维素和部分木质素的降解阶段[21]。对比可知,DG和DG-E的初始降解温度为190 ℃,DG-A的初始降解温度为280 ℃,说明碱处理竹材热稳定性明显增强,这是由于DG-A脱除了部分相对易热解的半纤维素和木质素所致。据报道[22],GA在260 ℃附近有明显的热化学转变,但本研究在该温度附近并未出现转变,说明GA并非简单吸附在竹粉表面,而是通过与酯键与竹粉形成紧密结合。在纤维热降解最剧烈阶段(320~360 ℃),DG-GA的初始热解温度和最大降解速率温度均高于DG,说明本研究中所采用的没食子酸改性有助于提高竹材热稳定性。原因可能是由于酯化反应主要发生在竹纤维最外层,包裹在竹纤维表面的酯化产物可以有效地充当物理屏障,进而赋予竹粉较高的热稳定性。
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由图7可见:改性前物料(DG-A)对大肠埃希菌抑菌率为30.70%,改性后的物料(DG-GA)对大肠埃希菌抑菌率为93.24%,抑菌率提高了62.54%;DG-A对金黄色葡萄球菌抑菌率为32.18%,DG-GA对金黄色葡萄球菌抑菌率为75.29%,抑菌率提高了43.11%,抑菌效果明显提升。改性后的竹粉的菌落变得稀少,这是由于没食子酸与竹粉成功接枝,赋予了龙竹没食子酸的抑菌能力。ZHANG等[7]将天然果胶用没食子酸酶法酰化,提高了对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率,这与本研究结果相似。
图 7 竹粉样品DG-A和DG-GA对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果
Figure 7. Antibacterial effect of bamboo powder samples DG-A and DG-GA on E. coli and S. ureus
由图8发现:DG-GA对大肠埃希菌的抑制作用优于金黄色葡萄球菌,这可能与革兰氏阳性菌有较厚的肽聚糖层结构有关[23],对比革兰氏阴性菌的双膜结构,这种肽聚糖层结构具有更高级的保护屏障,因此改性竹材表现出对大肠埃希菌的抑菌效果优于金黄色葡萄球菌。改性得到的产物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出优异的抑制效果,可能是因为竹粉和没食子酸酯化后,其酚羟基能与细菌细胞上的金属离子螯合,影响细胞膜的通透性,使细菌代谢紊乱而不能正常生长,从而起到抑菌作用[24]。
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竹材由于含有营养物质易被微生物感染,现存抑菌剂存在易流失和污染环境等问题,本研究使用没食子酸对竹粉进行改性,结果发现竹粉的抑菌效果有明显提升。通过振荡法对改性前后竹材抑菌活性的测试可知:竹材对大肠埃希菌抑菌率为93.24%,对金黄色葡萄球菌抑菌率75.29%。该研究与已有研究结果相似,如HUANG等[25]将没食子酸改性果胶,对大肠埃希菌有11.41 mm的抑菌圈,对金黄色葡萄球菌有12.52 mm的抑菌圈,该产品作为涂层能有效地延长中国鲈鱼Lateolabrax muculatus鱼片的整体质量。ZHANG等[7]用酶法酰化天然果胶,制备得到的样品对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑制率也分别从2.93%和8.92%提高到26.95%和42.18%。 改性后物料红外分析表现出新的吸收峰,结晶度下降,纤维束表面变光滑,最大降解温度增加,抑菌效力显著增强,均表明没食子酸与竹粉成功接枝。近些年,没食子酸及其衍生物与竹材反应机制复杂,反应过程受多因素影响[26]。在后续研究中,可进一步阐明没食子酸与竹材的反应及抑菌机制。
在处理显著提高了龙竹粉可及度的基础上,没食子酸可以与竹粉组分之间通过酯化反应形成接枝共聚物,在竹纤维束表面形成一层包裹物,使其表面变得更加光滑;没食子酸改性后,竹粉的热稳定性不仅没有降低,反而提高约40 ℃;没食子酸改性竹粉的抑菌效力明显提高。
Preparation and antibacterial properties of gallic acid modified bamboo powder
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摘要:
目的 以龙竹Dendrocalamus giganteus竹粉为原料,采用酯化反应制备没食子酸改性竹材,并探究没食子酸对竹材抑菌性能的影响。 方法 通过傅里叶红外光谱仪、X射线衍射仪、扫描电子显微镜和热重分析对改性竹粉特性进行表征,采用振荡法评估改性竹粉的抑菌性能。 结果 没食子酸可以与竹粉形成接枝共聚物,并在竹纤维束表面形成一层包裹物,从而使其表面变得更加光滑;没食子酸改性后,竹粉的热稳定性提高约40 ℃,对大肠埃希菌Escherichia coli抑制率从30.70%提高到93.24%,对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus抑制率从32.18%提高到75.29%。 结论 没食子酸改性可明显提高龙竹竹粉对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑制能力,该方法为竹材抑菌性能改良的有效方法。图8参26 Abstract:Objective This study, with gallic acid modified Dendrocalamus giganteus (DG) prepared by esterification reaction, is aimed to investigate the effect of gallic acid (GA) on antibacterial performance of DG. Method The modified products (DG-GA) were characterized by Fourier transform infrared spectrometer, X-ray diffractometer, scanning electron microscope and thermogravimetric analysis before the antibacterial tests were performed by shaking method after modification. Result Gallic acid formed graft copolymer with bamboo powder successfully with a layer of coating formed on the surface of bamboo fiber bundle, making the surface become smoother. After gallic acid modification, the thermal stability of bamboo powder increased by about 40 ℃, the inhibition rate against Escherichia coli increased from 30.70% to 93.24%, and the inhibition rate against Staphylococcus aureus increased from 32.18% to 75.29%. Conclusion The modification of gallic acid can obviously improve the inhibition ability of bamboo powder against gram-negative and gram-positive bacteria, making it an effective method to improve the antibacterial property of bamboo. [Ch, 8 fig. 26 ref.] -
Key words:
- Dendrocalamus giganteus /
- gallic acid /
- modification /
- antibacterial
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榧树Torreya grandis是红豆杉科Taxaceae榧属Torreya中国特有的植物,呈片状分布于浙江、福建、江西、湖南、安徽等省的丘陵地带[1]。榧树雌雄异株,稀同株,种内变异十分丰富[2]。香榧T. grandis ‘Merrillii’是雌性榧树的一个优良栽培类型,其结实所需花粉来自雄性榧树天然居群。然而雄株因不结实而往往遭受随意砍伐,数量大幅度减少[3]。近年来随着香榧产业的发展,人们认识到充分优质的授粉对雌株种实产量及品质影响极大,日益重视在香榧丰产造林中配置授粉雄株的作用。因此,对榧树雄株开展调查与选优是提高香榧产量及质量的重要因素之一。表型性状多样性是植物多样性最直观的反映,是衡量生物多样性的重要指标,也是了解遗传变异的重要线索[4]。在板栗Castanea mollissima[5]、樱桃Cerasus pseudocerasus[6]、椰枣Phoenix dactylifera[7]、李Prunus divaricata[8]、玉米Zea mays[9]等物种中都开展了表型性状多样性研究。榧树雌雄异株,天然杂交,且生长地理环境存在差异,使得天然群体内榧树变异十分丰富[10]。近年来对榧树的研究主要集中在病害[11]、生物学特性[12]、栽培管理技术[13]、分子标记[14]等方面。由于香榧具有极高的经济价值,研究多集中在雌性香榧上,而雄性榧树的研究鲜见报道。董雷鸣等[15]探讨榧树雄株若干性状的变异发现:叶片与雄球花各指标均有较大的变异系数,且不同来源的花粉对香榧幼果坐果率有显著影响,表明榧树雄株具有很大的选育潜力。本研究以来自5个雄性榧树天然居群的121个单株为研究材料,对叶片、雄球花等10个表型性状指标进行多样性分析,并在此基础上初选雄性榧树优株,为今后雄性榧树资源保护、授粉树配置及新品种选育提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
浙江省与安徽省是榧树主要的天然分布区。榧树目前主要生产与利用的是其种子,野生雄株天然居群除采种外受到的人为干扰较少。本研究在基本呈野生状态的雄性榧树天然居群开展,分布点分别为浙江省淳安县半夏村(淳安)、杭州市临安区洪岭村(临安)、杭州市富阳区洞桥村(富阳)、浙江嵊州市榆树村(嵊州)及安徽省黄山市呈坎村(黄山)开展。在分布点的雄性榧树林中各选取10~30株生长旺盛,彼此间距不小于50 m,无病虫害,树龄50~200 a的实生雄性榧树作为研究对象,用于试验观测与采样,同时利用全球卫星定位系统(GPS)定位采样点(表1)。各单株采集新鲜叶片即时装入加硅胶的自封袋中,带回实验室置于−80 ℃冰箱保存。各单株采集20个带雄球花的1年生幼枝,枝条底部用湿纸巾包裹后置于采样袋,带回实验室进行水培。
表 1 5个雄性榧树天然居群的地理位置及采样数Table 1 Geographic locations of five natural populations in T. grandis居群 采样数量/株 样品编号 纬度(N) 经度(E) 海拔/m 淳安 17 CA01~CA17 29°55′20″ 119°12′06″ 320~430 临安 24 LA01~LA24 29°59′30″ 119°12′32″ 305~360 富阳 24 FY01~FY24 30°05′47″ 119°38′42″ 360~410 嵊州 24 SZ01~SZ24 29°42′28″ 120°33′22″ 280~420 黄山 32 HS01~HS32 29°57′52″ 118°14′18″ 350~500 1.2 方法
1.2.1 叶片性状测定
各单株选取20个叶片,用游标卡尺测量(精确至0.01 mm)叶宽和叶长,并计算叶形指数(叶宽/叶长);用托盘天平(PB1502-L,瑞士)称取叶质量。
1.2.2 雄球花表型性状测定
各单株随机选取30个雄球花,用游标卡尺测量雄球花横径、纵径,并计算花形指数(球花横径/纵径),同时用托盘天平称取雄球花质量。
1.2.3 雄球花水培及散粉时间观察
各单株选取3个雄球花数量较多且长势良好的枝条插入水中,置于浙江农林大学校园,培养条件设置为温度20 ℃,湿度75%,光强400 μmol·m−2·s−1,二氧化碳摩尔分数520 μmol·mol−1,2 d更换1次水,每天定期观察并记录花枝散粉情况。当雄球花的小孢子叶松散,颜色变黄,花粉囊纵裂,部分花苞散出黄色花粉时记为始花期,直至完全散粉。大约3 d时间。
1.2.4 花粉得率测定
每个单株各选30个即将散粉(即各小孢子叶松散,花苞颜色变黄,花粉囊开始纵裂)的雄球花,置干燥玻璃培养皿中,放置在室内干燥桌面上,使雄球花自然散粉。待雄球花完全开放,抖落所有花粉,收集花粉称量,计算花粉得率。花粉得率=[花粉质量/(花粉质量+撒粉后球花质量)]×100%。
1.2.5 花粉生活力测定
在全程避光的条件下,用荧光染料反应法(fluorescein diaectate reaction,二乙酸荧光素染色)测定花粉生活力[16]。随机观测3个不同视野,统计有活力花粉(呈绿色)数量和花粉总数(绿色和黑色)。花粉生活力=(有活力花粉数量/花粉总数)×100%。
1.3 数据处理
运用Excel和SPSS 17.0对各指标进行数据统计和方差分析、t检验及相关性分析等。
2. 结果与分析
2.1 雄性榧树叶片与雄球花表型性状的差异显著性分析
方差分析表明:叶片性状的叶长在居群间有显著差异(P<0.05),雄球花性状的花粉得率在居群间呈极显著性差异(P<0.01),其他指标均无显著差异(表2)。t检验分析结果显示:在居群内单株间10个表型性状均差异极显著(P<0.01),表明雄性榧树表型性状的变异可能主要来源于居群内。
表 2 雄性榧树5个居群叶片与雄球花相关指标的方差分析Table 2 ANOVA in leaf- and male flower-associated parameters among five natural populations in T. grandis指标 平方和 自由度 均方 F P 指标 平方和 自由度 均方 F P 叶质量 0.000 4 0.000 0.434 0.784 球花横径 0.354 4 0.089 0.310 0.871 叶宽 0.298 4 0.075 0.792 0.533 球花纵径 2.138 4 0.543 0.421 0.793 叶长 51.915 4 12.979 2.498 0.046* 花形指数 0.010 4 0.003 0.240 0.915 叶形指数 0.002 4 0.001 0.820 0.515 花粉得率 0.170 4 0.043 4.980 0.001** 球花质量 0.001 4 0.000 0.686 0.603 花粉生活力 0.095 4 0.024 0.355 0.840 说明:*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01) 多重比较分析发现:叶长在5个居群间差异显著(P<0.05),5个居群中淳安居群的叶片平均最长(18.99 mm),显著长于其他居群;嵊州与黄山居群的叶片最短,且2个居群间无显著差异;临安与富阳居群的叶片长度居中,2个居群间无显著差异(图1A)。花粉得率在5个居群间差异极显著(P<0.01),嵊州和富阳居群的花粉得率较高,显著高于其他居群,且2个居群间无显著差异;而淳安与临安居群花粉得率最低且无显著差异(图1B)。
变异系数与性状的离散程度呈正相关,变异系数越大表明个体间的差异越大,多样性越丰富,选择的潜力就越大[17]。本研究表明:同一性状在不同居群中变异系数不同;同一居群中不同性状的变异系数也存在差异。5个雄性榧树居群间叶片的变异程度由大到小依次为叶质量、叶长、叶形指数、叶宽;雄球花的变异程度由大到小依次为花粉生活力、花粉得率、球花质量、球花纵径、球花横径、花形指数。花粉生活力的变异最为丰富,5个居群的花粉生活力为51.70%~58.51%,变异系数为39.04%~45.40%,平均值为42.36%;其次是花粉得率(31.03%~37.77%),平均达34.13%;叶宽和球花横径变异系数较小,分别为10.82%和12.13%(表3)。
表 3 5个雄性榧树居群叶片与雄球花指标的极值与变异Table 3 Extreme values and variation in the parameters of leaves and male flowers of five natural populations in T. grandis居群 叶质量 叶宽 最大值/g 最小值/g 平均值±标准差/g 变异系数/% 最大值/mm 最小值/mm 平均值±标准差/mm 变异系数/% 淳安 0.024 0.015 0.018±0.003 14.06 3.794 2.267 2.941±0.336 11.42 临安 0.025 0.012 0.018±0.003 19.44 3.775 2.400 2.901±0.345 11.90 富阳 0.023 0.013 0.017±0.003 15.36 3.422 2.344 2.850±0.281 9.86 嵊州 0.029 0.013 0.018±0.004 20.34 3.254 2.186 2.791±0.334 11.97 黄山 0.026 0.012 0.017±0.003 16.68 3.340 2.385 2.829±0.253 8.96 居群 叶长 叶形指数 最大值/mm 最小值/mm 平均值±标准差/mm 变异系数/% 最大值 最小值 平均值±标准差 变异系数/% 淳安 22.319 16.124 18.99±1.82 9.58 0.174 0.137 0.155±0.012 7.91 临安 25.475 13.650 18.41±2.84 15.45 0.228 0.107 0.161±0.029 18.27 富阳 25.139 15.360 18.05±2.51 13.93 0.205 0.130 0.159±0.015 9.68 嵊州 22.082 13.399 17.17±2.17 12.64 0.243 0.135 0.164±0.023 13.97 黄山 20.800 14.000 17.28±1.88 10.90 0.192 0.139 0.165±0.015 9.06 居群 球花质量 球花横径 最大值/g 最小值/g 平均值±标准差/g 变异系数/% 最大值/mm 最小值/mm 平均值±标准差/mm 变异系数/% 淳安 0.071 0.038 0.056±0.010 18.71 4.883 3.267 4.288±0.440 10.26 临安 0.078 0.032 0.058±0.014 24.51 5.344 2.947 4.369±0.594 13.61 富阳 0.089 0.034 0.054±0.014 25.96 6.283 3.714 4.452±0.551 12.37 嵊州 0.093 0.033 0.052±0.016 31.49 5.975 3.589 4.321±0.542 12.54 黄山 0.089 0.033 0.053±0.014 27.06 6.147 3.640 4.330±0.514 11.86 居群 球花纵径 花形指数 最大值/mm 最小值/mm 平均值±标准差/mm 变异系数/% 最大值 最小值 平均值±标准差 变异系数/% 淳安 6.937 4.425 5.671±0.718 12.66 0.893 0.656 0.760±0.060 7.84 临安 7.890 4.166 5.988±1.100 18.37 0.872 0.555 0.740±0.090 12.11 富阳 8.555 4.768 6.121±1.016 16.59 0.928 0.602 0.736±0.088 11.91 嵊州 10.884 4.458 5.900±1.423 24.12 0.938 0.434 0.753±0.110 14.57 黄山 9.889 4.516 5.907±1.146 19.40 0.854 0.588 0.745±0.083 11.04 居群 花粉得率 花粉生活力 最大值/% 最小值/% 平均值±标准差/% 变异系数/% 最大值/% 最小值/% 平均值±标准差/% 变异系数/% 淳安 26.38 5.82 17.00±5.28 31.03 92.71 21.61 58.51±25.05 42.80 临安 32.19 8.32 17.38±6.11 35.16 97.26 19.34 51.70±21.52 41.62 富阳 45.12 11.54 23.31±8.12 34.84 92.55 16.73 52.19±22.40 42.93 嵊州 41.39 10.23 25.08±7.99 31.85 92.08 11.09 56.70±25.74 45.40 黄山 36.56 8.72 20.67±7.81 37.77 94.30 23.90 56.56±22.08 39.04 居群差异体现了居群对当地环境的不同适应状况,数值大小反映了不同居群对不同环境的适应性[18]。基于叶片的表型指标分析发现:5个天然居群的变异系数临安(16.27%)最大,其次是嵊州(14.73%),淳安(10.74%)最小;而雄球花是嵊州(26.82%)和黄山(26.42%)的变异系数较高,淳安(19.49%)最小。本研究中榧树雄株的生殖器官花的变异系数大于营养器官叶。
2.2 雄球花散粉时间的变异
榧树雄株的散粉时间不仅与遗传有关[15],也与地域气候、环境差异有关。榧树的雌雄花期不集中,且雄株花期比雌株早[19],散粉时间一般在4月中旬[20]。因此在新造林中要配置适当花期的雄性授粉树,满足雌花充分受粉的要求[15]。
经温室水培雄球花枝观测统计,雄球花散粉时间在4月7−17日,散粉周期约10 d。中花型所占比例最大(47株),占总样本数的38.84%,散粉时间在4月11−15日;晚花型比例最小(30株,24.79%),散粉时间在4月15−17日(表4)。5个居群中,淳安、临安、黄山这3个居群的中花型偏多,分别有11、13、13株,而富阳和嵊州的早花型略多,花期为4月7−11日(表4)。
表 4 5个天然居群榧树雄株散粉期比较Table 4 Pollen availability of male flowers in T. grandis居群 花期 花期类型 株数/株 群内比例/% 居群 花期 花期类型 株数/株 群内比例/% 淳安 4月9−17日 早 2 11.76 嵊州 4月7−15日 早 17 70.84 中 11 64.71 中 5 20.83 晚 4 23.53 晚 2 8.33 临安 4月9−17日 早 6 25.00 黄山 4月7−17日 早 7 21.87 中 13 54.17 中 13 40.63 晚 5 20.83 晚 12 37.50 富阳 4月7−15日 早 12 50.00 中 5 20.83 晚 7 29.17 2.3 雄性榧树叶片表型性状间的相关性分析
叶质量、叶长与叶形指数均呈极显著负相关(P<0.05),而其他指标间均为显著正相关(P<0.05)(表5)。这与董雷鸣等[15]的研究结果一致。
表 5 雄性榧树叶片各指标之间的相关系数Table 5 Correlation coefficients among indexes of leaves in male T. grandis指标 叶质量 叶宽 叶长 叶形指数 叶质量 1 叶宽 0.381** 1 叶长 0.804** 0.476** 1 叶形指数 −0.626** 0.376** −0.513** 1 说明:**表示差异极显著(P<0.01) 球花质量与球花大小及花粉得率呈显著正相关(P<0.05),球花大小与花粉得率均显著正相关(P<0.05),花粉活力与花粉得率呈极显著正相关(P<0.01),而球花质量和球花纵径都与花形指数呈极显著负相关,其他指标间相关性不显著(表6)。
表 6 榧树雄球花及各指标间的相关系数Table 6 Correlation coefficients among indexes of male flowers in T. grandis指标 球花
质量球花
横径球花
纵径花形
指数花粉
得率花粉
生活力球花质量 1 球花横径 0.735** 1 球花纵径 0.788** 0.693** 1 花形指数 −0.412** −0.020 −0.701** 1 花粉得率 0.209* 0.238* 0.296* −0.164 1 花粉生活力 0.103 0.010 0.035 −0.081 0.441** 1 说明:*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01) 2.4 雄性榧树优株的初选
花粉会对植株坐果率高低、果实大小以及产量等产生直接影响[21−22]。筛选适宜的雄性优株可以提供香榧基地授粉雄株不足、香榧树体坐果率低的现状,从而促进香榧产业健康发展。营养器官叶片受环境影响较大,因而榧树可基于生殖器官的性状初选核心种质[23]。本研究主要依据榧树雄株散粉时间、花粉生活力、花粉量的多少等综合进行雄株优株的筛选。早花类型中表现较好的优株有富阳居群的雄9、嵊州居群的雄5以及黄山居群的雄23,花粉生活力分别高达92.55%、92.08%、90.01%,花粉得率也在20%以上;中花类型表现最佳的优株有临安居群的雄22、嵊州居群的雄1,花粉活力均在90%以上,花粉得率也不低;而晚花类型中,淳安居群的雄3、临安居群的雄18以及黄山居群的雄1花粉生活力分别为92.71%、92.61%、91.65%,共初选36个单株作为优良授粉树,占所有供试材料的29.75%(表7)。
表 7 雄性榧树优株的初选Table 7 Screening of male elite trees in T. grandis居群 开花类型 编号 花粉生活力/% 花粉得率/% 花形指数 淳安 早花型 CA09 65.35 26.38 0.656 中花型 CA07 76.97 21.95 0.790 CA10 82.59 21.70 0.736 CA15 87.36 19.27 0.736 CA16 85.91 15.74 0.754 晚花型 CA01 86.00 22.19 0.743 CA03 92.71 19.98 0.826 CA17 82.05 22.16 0.735 临安 早花型 LA03 66.86 18.92 0.764 中花型 LA13 87.31 32.19 0.802 LA22 97.26 20.05 0.653 晚花型 LA17 87.00 20.98 0.818 LA18 92.61 23.91 0.850 富阳 早花型 FY03 70.56 34.28 0.782 FY06 81.58 32.29 0.822 FY09 92.55 23.02 0.605 FY14 85.04 30.23 0.660 FY19 69.44 33.37 0.602 晚花型 FY01 84.07 33.24 0.671 嵊州 早花型 SZ02 89.09 34.48 0.750 SZ05 92.08 38.23 0.725 SZ13 66.39 20.71 0.730 SZ16 86.05 30.28 0.799 SZ17 82.96 25.74 0.588 SZ24 88.63 25.67 0.766 中花型 SZ01 91.53 23.79 0.859 黄山 早花型 HS21 68.89 35.01 0.754 HS23 90.01 30.98 0.764 HS28 62.25 29.76 0.607 中花型 HS13 81.59 23.91 0.751 HS15 68.19 21.01 0.745 HS18 89.42 20.76 0.797 HS19 81.83 23.92 0.850 晚花型 HS02 91.65 25.67 0.705 HS04 87.61 21.98 0.595 HS29 87.16 24.81 0.801 3. 结论与讨论
本研究发现:在居群间,叶片与雄球花的10个表型指标,只有叶长和花粉得率差异显著,而居群内,单株间10个指标均差异极显著,表明居群内的变异比居群间更加丰富。该结果与刘浩凯等[24]研究雌性榧树居群遗传多样性的结果基本一致。因此,为配置香榧授粉树的榧树雄株选育可选择优良单株。
变异系数是衡量各观测性状变异程度的一个统计指标。本研究各指标的相对极差和变异系数的变化趋势完全不同,表明榧树雄株表型性状存在丰富的表型多样性。经过长期的自然选择,不同数量性状对环境形成了不同的适应能力。相关分析表明:雄性榧树的大部分表型性状相关性达显著或极显著水平,说明这些性状在环境适应中表现出相互调节的作用。
雄性榧株以提供花粉为主要利用目的,花粉得率和花粉生活力在居群间和个体间变异大,且比较稳定,不仅有利于选择,选择结果也相对可靠。本研究显示:雄球花各指标变异系数大,球花大小与花粉得率呈显著正相关,直接影响花粉得率。因此优株初选应从花粉生活力、花粉得率及球花大小等综合考虑。基于上述指标初步筛选出36个优良雄性单株,其中8个单株的花粉生活力在90%以上。在今后的育种工作中,这些雄性优株应是优先考虑的对象。本研究所有单株的花粉得率最高值为38.23%,与董雷鸣等[15]的研究结果类似。
居群内的变异主要受遗传因素的影响,而居群间的变异则与遗传和环境2个因素相关[25]。由于榧树雄株不结果,以往人为破坏严重,部分地区的雄株资源已濒临绝迹,雌雄比例严重失调。易官美等[26]对榧树资源分布进行调查发现:雌雄株比例在江西岩泉自然保护区为4∶1,在福建建瓯玉山镇居群为29∶1;在安徽居群为19∶1;在浙江诸暨赵家镇居群为99∶1。因此,加强雄性榧树资源保护刻不容缓,需加大种质资源调查与收集力度,建立雄性榧树优株资源库。
本研究仅对雄性榧树的表型多样性进行初步研究,后续的研究将扩大居群选择的范围及居群个数,并结合分子生物学从DNA水平深入揭示雄性榧树天然居群的遗传变异特点和规律。
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20220718