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牦牛Bos grunniens是中国青藏高原及其毗邻高山、亚高山高寒地区的特有珍稀牛种之一[1]。作为牦牛肉加工过程中产生的主要副产物，牦牛骨钙质丰富，是目前市面上优质的小分子骨胶原肽来源[2]。多肽螯合钙是第3代具有活性结构的生物钙补钙制剂，稳定性好，抗干扰能力强，吸收效果好，生物利用度高。甘林火等[3]发现：L-亮氨酸螯合钙的生物利用度比葡萄糖酸钙要高，具有缓释、药效时间长、不需要消耗胃酸等特点。植物来源的精油可以作为调味剂和天然防腐剂，肉桂精油具有清除自由基、抗油脂氧化的作用和较强的抗菌能力[4]，是对抗常见食源性病原体的最有效精油之一[5]，主要成分为肉桂醛，此外还含有丁子香酚、芳樟醇和α-pine烯等[6]。HUANG等[7]发现：肉桂精油抗菌活性高，能有效抑制微生物生长，延长草鱼Ctenopharyngodon idellus鱼片保质期。OJAGH等[8]发现富含肉桂油的壳聚糖涂层延长了虹鳟鱼Oncorhynchus mykiss冷藏期间的保质期。本研究利用牦牛骨资源，制备包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物，探讨其对水产品中的优势腐败菌维氏气单胞菌Aeromonas veronii的缓释抑菌作用，为水产品的防腐保鲜提供新思路。
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木瓜蛋白酶购自安琪酵母股份有限公司；维氏气单胞菌由中国农业大学食品科学与营养工程学院水产品加工实验室提供；牦牛骨购自国肽生物科技(北京)有限公司；肉桂精油购自江西恒城天然香料油有限公司。肉桂精油的添加使用遵照GB 2760−2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》的相关规定[9]。
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参考魏洁琼等[10]方法并稍作修改。破碎后的牦牛骨粒经高压灭菌锅蒸煮3.0 h；冷却后除去油脂，过滤得到骨渣和滤液。骨渣∶盐酸(1.0 mmol·L−1)以1∶50(m∶V)酸溶15 h[11]，蒸发浓缩，EDTA滴定后用去离子水稀释得到2.0 mmol·L−1的可溶性牦牛骨钙，备用。滤液浓缩，冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白；去离子水溶解，调节至60 ℃，pH 7.0[12-13]，木瓜蛋白酶(4 000×16.67 nkat·g−1)酶解2.0 h[14]，95 ℃水浴灭酶20 min，冷却后离心，取上清液浓缩后冷冻干燥，即为牦牛骨蛋白肽。
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参照HONG等[15]方法并稍作修改。牦牛骨胶原蛋白肽用去离子水溶解成10.0 g·L−1蛋白肽溶液，离心去除沉淀。在使用均质仪(德国IKA)均质的同时向牦牛骨蛋白肽溶液中逐滴加入牦牛骨钙溶液，得到牦牛骨蛋白肽-钙螯合物。量取10 mL牦牛骨蛋白肽溶液，分别加入0(对照)、10、15、20、25、30 μL肉桂精油，在均质的同时逐滴加入1 mL 0(对照)、0.5、1.0、2.0 mmol·L−1牦牛骨钙溶液，得到包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物[16]。
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参照XIE等[17]方法，通过分子量排阻的高效液相色谱法(SE-HPLC)，使用液相色谱仪(日本岛津)测定牦牛骨蛋白肽分子量[18]。仪器参数：TSK凝胶G2000SWXL柱(7.8 mm×300 .0 mm)，进样量25.0 μL，流速0.5 mL·min−1，紫外检测器波长214 nm。以三氟乙酸-水-乙腈(体积比为0.1∶54.9∶45.0)为流动相。标准物为细胞色素C(12.362 kDa)，抑肽酶(6.5114 kDa)，杆菌肽(1.423 kDa)，Gly-Gly-Tyr-Arg(四肽，0.451 kDa)和Gly-Gly-Gly(三肽，0.189 kDa)。将混合标准溶液进样，以标准物分子量(M)的对数值为纵坐标，保留时间(t)为横坐标，建立保留时间和分子量对数之间的标准曲线。
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使用Q-Exactive高分辨质谱仪(美国赛默飞)对样品进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)全扫描，质荷比为100~1 990 Da[19]。使用Peaks studio 8.0软件结合Mascot MS/MS搜索SwissProt蛋白质数据库，鉴定牦牛骨多肽序列[20]。
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根据AKBARI等[16]和ZHANG等[21]方法稍作修改，使用可见分光光度计每隔10 min测定1次牦牛骨蛋白肽原始溶液、牦牛骨蛋白肽-钙螯合物和去离子水乳化的牦牛骨蛋白肽(对照)的吸光度(600 nm)，计算相对浊度，研究蛋白肽钙螯合物的稳定性。计算公式为：相对浊度=(Ax−A0)/A0×100%。其中：Ax为不同条件下制得的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物(或对照)的吸光度，A0为牦牛骨蛋白肽原始溶液的吸光度。
每隔2 h测定1次包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的吸光度(600 nm)[22]，以牦牛骨蛋白肽-钙螯合物为对照，研究肉桂精油对螯合物稳定性的影响。
使用ZS90纳米粒径电位分析仪(英国，马尔文)在25 ℃下通过动态光散射(DLS)测定螯合物的平均粒径和多分散指数(PDI)[21]。
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采用感官评价法和抑菌活性测定缓释效果。取包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物和去离子水稀释的等比例肉桂精油样品各1份，室温下静置24 h后，参考朱红梅等[23]进行感官评价。感官指标评分表如表1所示。参照周子雄等[24]的方法并稍作修改测定抑菌活性。活化过夜的维氏气单胞菌菌液[25-26]调整至106 CFU·mL−1，取4份25 mL受试菌菌悬液，分别加入100 μL已灭菌的包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物、牦牛骨蛋白肽-钙螯合物、肉桂精油和去离子水(对照)，震荡混匀。每隔2 h测定1次菌悬液吸光度(600 nm)，检测螯合钙的抑菌效果。抑菌率=(Ac−At)/Ac×100%。其中：Ac为对照组的吸光度，At为不同处理条件下的吸光度。
表 1 感官评价评分标准
Table 1. Standard of sensory evaluation
评分 状态 色泽 香气 异味 协调性 7~9 分散均一，无分层、结块、沉淀 一致，无杂质、霉变 肉桂味浓郁、纯正 气味良好，
无不良风味气味协调 4~6 分散略不均一，无分层、结块、沉淀 不均，有杂质，无霉变 肉桂味较浓郁 稍有异味 气味较协调 1~3 分散不均一，有明显分层、结块、沉淀，
有油滴出现不均，有大量杂质，有霉变 肉桂味不突出 有明显异味 气味不协调 -
所有实验重复3次，数据用平均值±标准差表示。采用RStudio 1.3.1073软件对测定结果进行显著性分析，差异显著水平为0.05。
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标准曲线方程为：lgM=7.013 8+0.226 9t，计算得到不同分子量区间的蛋白肽占总蛋白的比例。由表2可知：酶解后的牦牛骨蛋白肽肽段的分子量均小于3.0 kDa，其中分子量小于1.0 kDa的牦牛骨蛋白肽占全部肽段的95.867%，说明牦牛骨蛋白肽多为小分子肽。
表 2 牦牛骨蛋白肽的分子量
Table 2. Molecular weight of yak bone peptides
t/min 分子量/kDa 占比/% ＜15.579 ≥3.0 0 15.579~＜16.363 2.0~＜3.0 0.040 16.363~＜17.688 1.0~＜2.0 4.094 17.688~＜18.508 0.5~＜1.0 34.211 ≥18.508 ＜0.5 61.656 -
LC-MS/MS测序发现：牦牛骨蛋白肽主要成分为胶原Ⅰ蛋白α1链和α2链，分别含肽段336和285条，肽段覆盖率为55%。共测得945个肽段序列信息，相对分子量为306~1 032 Da，组成肽段的氨基酸为7~37个。对其中分子量小于1.0 kDa且可信度较高的33条蛋白肽段(表3)进一步的分析，牦牛骨蛋白肽可用于制备具备缓释杀菌功能的钙螯合物。
表 3 牦牛骨蛋白肽部分多肽序列鉴定结果
Table 3. Identification of partial peptides sequences of yak bone peptides
主要肽段 可信度 分子量/Da 质核比 功能 GPVGPVG 40.23 581.317 3 582.324 1 SVPGPMG 32.33 643.299 9 644.306 6 VPGPMGP 31.42 653.320 7 654.326 5 APGPVGPAG 34.80 721.375 9 722.382 3 AP(+15.99)GPVGPAG 31.27 737.370 8 738.377 4 羟基化 FP(+15.99)GADGVA 34.14 748.339 1 749.345 7 羟基化 VP(+15.99)GPMGPS 33.76 756.347 6 757.356 1 羟基化 SDGSVGPVG 36.97 773.355 5 774.362 2 SP(+15.99)GN(+0.98)IGPAG 33.70 785.355 5 786.362 5 羟基化 GAAGPTGPIG 30.08 796.407 9 797.415 6 TPGPQ(+0.98)GIAG 30.34 797.391 9 798.399 9 脱酰胺 LPQPPQE 31.34 807.412 7 808.419 7 IQ(+0.98)GPP(+15.99)GPAG 30.19 809.391 9 810.398 9 脱酰胺，羟基化 AP(+15.99)GPQ(+0.98)GFQ 31.21 817.360 6 818.366 5 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GPVGPAG 33.96 820.407 9 821.415 4 羟基化 GP(+15.99)AGPIGPVG 34.90 836.439 1 837.445 6 羟基化 GPVGPTGPVG 37.77 836.439 2 837.445 6 TP(+15.99)GPQGLLG 31.36 854.449 8 855.456 9 羟基化 GASGPP(+15.99)GFVG 31.32 860.402 8 861.412 9 羟基化 GPQ(+0.98)GPVGPVG 31.77 864.434 1 865.440 8 脱酰胺 GIQGPP(+15.99)GPAG 30.73 865.429 3 866.436 9 羟基化 AGPSGPAGPTG 36.13 867.408 6 868.415 5 GPP(+15.99)GLQ(+0.98)GVQ 33.31 868.429 0 869.436 0 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GPMGPPG 42.39 878.395 6 879.402 2 羟基化 TGPIGPP(+15.99)GPA 41.22 878.449 8 879.457 6 羟基化 GPP(+15.99)GPIGNVG 33.95 879.445 0 880.452 9 羟基化 GPP(+15.99)GPIGN(+0.98)VG 32.42 880.429 0 881.436 0 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GFP(+15.99)GAVG 34.44 886.418 5 887.424 9 羟基化 VGPAGPN(+0.98)GFA 40.33 886.418 5 887.425 0 脱酰胺 AGPP(+15.99)GPTGPAG 31.53 893.424 3 894.431 5 羟基化 AAGPP(+15.99)GPTGPA 34.87 907.439 9 908.446 5 羟基化 VGPAGPN(+0.98)GFAG 38.51 943.439 9 944.445 9 脱酰胺 APGAPGPVGPAG 30.84 946.487 2 947.493 7 -
由图1可知：除加入去离子水并乳化的牦牛骨蛋白肽(对照)外，不同浓度牦牛骨钙溶液制成的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的相对浊度存在显著差异(P＜0.05)。随牦牛骨钙溶液浓度增加，蛋白肽-钙螯合物相对浊度增加，但不同沉降时间下相对浊度变化不大，说明鳌合效果良好，螯合物稳定，可以用于混合乳液的制备，后续研究选用2.0 mmol·L−1牦牛骨钙溶液制备鳌合物。由图2可知：除牦牛骨蛋白肽-钙螯合物(对照)外，添加不同体积肉桂精油制成的包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的吸光度存在显著差异(P＜0.05)。当添加的肉桂精油大于20 μL时，螯合物吸光度随时间急剧下降，稳定性较差；添加的肉桂精油小于20 μL时，螯合物吸光度变化不大，说明稳定性较好。因此后续研究以10 mL牦牛骨蛋白肽中加入20 μL肉桂精油为螯合时肉桂精油的适宜添加量。
图 1 牦牛骨钙溶液浓度对牦牛骨蛋白肽-钙螯合物稳定性的影响
Figure 1. Stability of yak bone peptides-calcium chelate prepared by different yak bone calcium solution
图 2 不同肉桂精油添加量对包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物稳定性的影响
Figure 2. Stability of yak bone peptides-calcium chelate prepared by different ratio of cinnamon essential oil
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由图3可知：牦牛骨蛋白肽的粒径为167.8 nm，牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的粒径为368.2 nm，包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的粒径为780.2 nm，三者差异显著(P＜0.05)；牦牛骨蛋白肽、牦牛骨蛋白肽-钙螯合物及包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的多分散指数没有显著性差别(P＞0.05)，且包埋肉桂精油的螯合物多分散指数小于0.2，螯合物分散性较好。
图 3 螯合物的粒径和多分散指数
Figure 3. Particle size and polydispersity coefficient of emulsion of cinnamon essential oil and yak bone peptides-calcium chelate
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由表4可知：包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的总体评分为7.22分，即该螯合物表观状态良好，分散均一，无分层，色泽一致，无杂质，肉桂香浓郁、风味纯正，气味较协调，无不良气味，其中“香气”项的分值显著高于肉桂精油稀释液(P＜0.05)。
表 4 感官评价结果
Table 4. Artificial sensory evaluation results
感官特性 包埋肉桂精油的牦牛骨
蛋白肽-钙螯合物/分肉桂精油稀释液/分 感官特性 包埋肉桂精油的牦牛骨
蛋白肽-钙螯合物/分肉桂精油稀释液/分 状态 7.60±0.70 b 8.65±0.47 a 异味 7.10±0.99 b 8.00±0.67 a 色泽 8.15±0.34 a 8.25±0.59 a 协调性 6.10±0.88 b 8.15±0.34 a 香气 7.15±1.00 a 4.35±0.82 b 平均 7.22 7.48 说明：不同字母表示样品间差异显著(P＜0.05) -
由图4可知：在2 h后，对照和牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的吸光度明显上升，维氏气单胞菌大量繁殖；相比之下，牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的吸光度值增速更快，12 h抑菌率为−13.70%，推测是牦牛骨蛋白肽为菌的繁殖提供营养。肉桂精油稀释液和包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物都表现出了良好的抑菌效果，12 h抑菌率分别为70.24%和77.33%。螯合物对维氏气单胞菌的6 h抑菌率为61.41%，且6 h后抑菌率始终高于肉桂精油稀释液，说明螯合物抑菌效果较为稳定。
图 4 肉桂精油和螯合物对维氏气单胞菌的抑菌效果
Figure 4. Bacteriostatic effect of cinnamon essential oil and yak bone peptides-calcium chelate on Aeromonas veronii
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人体从外界摄取的蛋白类营养物质被分解后多以小分子肽的形式被吸收利用，肽的螯合能力受分子量影响；相比之下，小分子肽内部活性基团和螯合位点暴露程度较大，与钙离子的接触机率也较大[27]。本研究中得到的多数牦牛骨蛋白肽分子量小于1.0 kDa，属于小分子肽，因此适用于钙螯合物的制备。
本研究发现：大量牦牛骨蛋白肽在pH小于7时带负电荷，有利于蛋白肽侧链与钙离子间的静电吸引，当负电荷被钙离子中和时，中性蛋白肽受到疏水作用影响，形成蛋白肽-钙螯合物。同时，牦牛骨蛋白肽中还存在大量的脯氨酸(P)和甘氨酸(G)；HAINES-BUTTERICK等[28]发现：脯氨酸和甘氨酸通常依次出现在β-折叠的边缘链或β-发夹中，这种蛋白质超二级结构有助于形成球形结构[29]，可被应用于药物的释放[30]。因此，牦牛骨蛋白肽可用于制备具缓释杀菌功能的钙螯合物。
浊度是评价多肽螯合钙螯合程度的重要指标之一[21]，与螯合物粒径正相关；当悬浮液浊度达到原始分散体的50%且随着钙离子浓度增加不再形成沉淀物时，被认为螯合钙形成良好[19]。AKBARI等[16]发现：随着钙离子浓度增加，螯合物的粒径增加。ZHANG等[21]发现：高浓度钙离子可以平衡肽的负电荷，形成沉淀或附聚物(肽-钙螯合物)。本研究中，随着牦牛骨钙溶液浓度增加，相对浊度显著升高，且未生成沉淀物，与AKBARI等[16]结论一致；因此，使用2.0 mmol·L−1牦牛骨钙溶液可形成螯合钙，且稳定性良好。
多分散指数(PDI)可用来表征纳米乳液粒子的分布情况，PDI越小表示乳液粒子分布越均匀[31]。本研究中，通过高速剪切法向牦牛骨蛋白肽溶液中加入牦牛骨钙溶液，粒径明显增加，PDI较小，说明有新的物质形成，即生成了肽-钙螯合物，且分散性较好；继续加入肉桂精油，乳液粒径出现显著增加，推断是形成了包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物。
人工感官评定是最基础的食品质量评价方法[32]。本研究制备的包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物在各项评价中表现良好，且“香气”项分值显著高于肉桂精油稀释液，与肉桂精油稀释液相比，静置24 h后肉桂香更浓郁，认为螯合物有一定的缓释作用。
微生物是食物腐败的主要原因，抑制微生物生长是延长保质期和提高水产品质量的有效方法，气单胞菌是水产品中的优势腐败菌[33]。本研究中，包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物对气单胞菌表现出明显的抑菌效果，与HUANG等[7]结果相符。随时间增长，螯合物抑菌效果逐渐优于肉桂精油稀释液，说明螯合物具有缓释效果，延长了抑菌时间，有助于延长水产品的货架期。
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本研究利用牦牛骨资源制备包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物；通过分析螯合物相对浊度，确定制备条件；通过测定牦牛骨蛋白肽分子量，分析牦牛骨蛋白肽序列，确认牦牛骨蛋白肽适用于螯合物的制备，并推断螯合物形成机制为牦牛骨蛋白肽的负电荷与钙离子间产生静电吸引作用，受疏水作用影响形成球形肽-钙螯合物；通过测定粒径、多分散指数和浊度，表征螯合物特性，确认螯合物的形成；通过测定抑菌率和感官评价实验，验证包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物抑菌效果良好，且具有缓释作用，为新型抑菌剂的开发提供思路。
Preparation and antibacterial effect of yak bone protein peptide-calcium chelate embedded with cinnamon essential oil
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摘要:
目的 为充分利用牦牛Bos grunniens骨资源，改善其利用率低下，浪费严重的现状；研究包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的形成机制及抑菌效果。 方法 牦牛骨经高温蒸煮，分离出蛋白质和骨渣。酶解蛋白质得到牦牛骨胶原蛋白肽，酸溶骨渣得到可溶性牦牛骨钙。通过肉桂精油与牦牛骨胶原蛋白肽混合均质形成肉桂精油-牦牛骨蛋白肽乳液，乳液与牦牛骨钙通过高速剪切法获得包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物。测定螯合钙浊度、粒径、多分散指数和抑菌率，并进行感官评价。 结果 牦牛骨蛋白肽多为小分子肽(＜1.0 kDa)，适合钙螯合物的制备。pH＜7时多数牦牛骨蛋白肽带负电荷，受疏水作用影响，形成牦牛骨蛋白肽-钙螯合物。牦牛骨蛋白肽由大量的脯氨酸(P)和甘氨酸(G)组成，容易构成多肽二级结构β-转角，利于物质释放。包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物稳定性良好，平均粒径为780.2 nm；分散性良好，多分散指数小于0.2。牦牛骨蛋白肽、肉桂精油和螯合物对维氏气单胞菌Aeromonas veronii的12 h抑菌率分别为−13.70%、70.24%和77.33%，螯合物抑菌效果良好；6 h后螯合物抑菌率超过肉桂精油。感官评价结果发现：螯合物和肉桂精油的香气评分分别为7.15和4.35分，螯合物肉桂味浓郁程度显著高于肉桂精油(P＜0.05)，螯合物有一定缓释效果。 结论 牦牛骨蛋白肽和牦牛骨钙适用于研发复合氨基酸矿物质螯合钙产品，包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物可用于新型抑菌剂的开发。图4表4参33 Abstract:Objective This study aims to explore the formation mechanism and antibacterial effect of yak bone protein peptide-calcium chelate embedded with cinnamon essential oil, so as to make full use of the bone resource and improve its utilization rate and avoid serious waste. Method The yak bone was autoclaved at high temperature to separate protein and bone residue. Yak bone collagen peptide was obtained from enzymatic hydrolysis of protein, and soluble yak bone calcium was obtained from acid-dissolved bone residue. The cinnamon essential oil and the yak bone collagen peptide were mixed and homogenized to form a cinnamon essential oil-yak bone peptide emulsion, and the calcium chelate of yak bone protein peptide encapsulated in cinnamon essential oil was obtained by high speed shear method. The turbidity, particle size, polydispersity index, antibacterial activity of the chelated calcium were determined and organoleptic evaluation was conducted. Result The yak bone peptides were mostly small molecule peptides (less than 1.0 kDa), and were suitable for the preparation of chelated calcium. When pH value was less than 7, many yak bone peptides were negatively charged and were affected by hydrophobicity to form yak bone protein peptide-calcium chelates. The yak bone peptide was composed of a large number of proline (P) and glycine (G), which could easily form the β-turn, one of the polypeptide secondary structures, and facilitate the release of substances. The yak bone protein peptide-calcium chelate embedded with cinnamon essential oil had good stability, with an average particle size of 780.2 nm. The dispersibility was good and the polydispersity index was less than 0.2. The 12 h antibacterial rates of yak bone protein peptide, cinnamon essential oil and chelate against Aeromonas veronii were −13.70%, 70.24% and 77.33%, respectively. The inhibition rate of chelate to Aeromonas was higher than that of cinnamon essential oil after 6 hours. The organoleptic evaluation revealed that the aroma scores of chelate and cinnamon essential oil were 7.15 and 4.35 respectively, and the cinnamon flavor of chelate was significantly stronger than that of cinnamon essential oil (P＜0.05), indicating that the chelate had a certain sustained-release effect. Conclusion Yak bone protein peptide and yak bone calcium are suitable for the development of complex amino acid mineral chelated calcium products, and the yak bone protein peptide-calcium chelate encapsulated with cinnamon essential oil can be used for the development of new antibacterial agents. [Ch, 4 fig. 4 tab. 33 ref.] -
Key words:
- yak bone /
- protein peptide /
- cinnamon essential oil /
- chelate /
- bacteriostasis in vitro
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植物群落的空间(地带性)特征和时间(演替动态)特征都会反映在物种多样性这一重要的群落信息上[1]。森林群落的物种组成与结构是生态系统功能和过程的基础，既能反映群落的种间关系，也可表现环境对物种的影响，同时也是衡量植物群落稳定的重要尺度和方式[2]。物种多样性是物种丰富度和分布均匀性的综合反映，体现了群落的结构类型、组织水平、发展阶段、稳定程度和生境差异[3-4]，分析植物群落的结构和物种多样性，对揭示群落的更新、稳定性与演替规律具有重要的意义[5]。稳定性是群落内部各个植物种群、动物种群、微生物种群、土壤环境、气候等相互作用和生物运动的结果，是在群落演替进化过程中形成和表现的[6]。稳定性是植物群落结构与功能的综合特征，是生态系统存在的必要条件和重要功能表现[7]。物种多样性和稳定性是植物群落的2个属性，它们之间的相互关系和相互影响一直受到生态学家的关注[8]。火山喷发为研究植被演替尤其是原生演替提供了难得的条件[9]。五大连池火山处于大小兴安岭和松嫩平原的交错地带，至今历经了7次火山喷发，形成了14座火山，拥有大陆上保存完整、分布集中、形态典型、种类最齐全的新老期火山地质地貌[10]。五大连池火山区生态条件独特复杂，由熔岩裸地到演化中的不同生境内可见低等植物和高等植物(演替中的不同植被生态系列)[11]。五大连池完好的内陆单成因火山地貌，原生而完整的植被演替过程，且地处植被交错区(大小兴安岭植被交错带)，是研究火山干扰和植被演替与生物多样性系统发育等的理想场所[12]。近年来，对火山森林群落的物种多样性有大量研究。如牟长城等[13]研究了长白山林区森林/沼泽交错群落的植物多样性，郝占庆等[14-17]研究了长白山北坡植物群落物种多样性，姜萍等[18]研究了长白山南坡森林群落组成-结构以及树种多样性。然而，对五大连池火山森林群落的多样性和稳定性研究尚未有报道。本研究以五大连池4座老期火山为研究对象，从森林群落多样性指数、年龄结构和优势树种的存活曲线入手，分析森林群落多样性与稳定性，为五大连池火山森林植被的演替、恢复与可持续发展提供科学依据。
1. 研究地区与研究方法
1.1 研究区概况
五大连池火山群(48°30′~48°50′N，126°00′~126°45′E)中心区由新期火山活动形成的巨大熔岩流——石龙、2座年轻火山和巨大的熔岩形成的石龙台地和火山堰湖群构成，四周由老期火山活动形成的玄武岩台地构成，台地上环布12座老期火山和众多熔岩流，是中国第1个以火山自然环境及生态系统为保护对象的自然保护区[19]。
本研究选取东焦得布山(48°39′13ʺN，126°16ʹ30ʺE)、小孤山(48°40′45ʺN，126°22ʹ06ʺE)、尾山(48°47′23ʺN，126°15ʹ26ʺE)和南格拉球山(48°44′13ʺN，126°00ʹ46ʺE)4座老期火山。研究区属温带大陆性季风气候，年平均气温−0.5 ℃，年平均降水量476.3 mm，年均无霜期121 d。研究区主要森林植被类型为温带落叶阔叶混交林，主要包括蒙古栎Quercus mongolica林和落叶阔叶林等。乔木优势树种南坡为蒙古栎和黑桦Betula davurica，北坡为紫椴Tilia amurensis和色木槭Acer mono等。研究区分布有暗棕壤性火山灰土和黑土性火山灰土[20]。
1.2 研究方法
1.2.1 样地设置与植被调查
于2018年7中旬至8月中旬植物生长旺盛期，采用样地调查法，在老期火山东焦得布山(高海拔525 m、中海拔475 m、低海拔425 m)，小孤山(高海拔450 m、中海拔425 m、低海拔400 m)，尾山(高海拔510 m、中海拔470 m、低海拔430 m)和南格拉球山(高海拔580 m、中海拔520 m、低海拔460 m)的南坡和北坡，每坡设置低、中、高3个海拔样地。乔木层共取24个样方，每个样方面积20 m×20 m，分别记录乔木种类、个体数、胸径、树高和群落的总郁闭度及所有乔木层树种的幼苗更新情况，用生长锥钻取胸径≥2.5 cm的乔木；灌木层分别设置4个2 m×2 m的小样方，共96个样方，记录灌木的密度、盖度、高度；草本层分别设置5个1 m×1 m的小样方，共120个样方，记录草本的密度、盖度、高度。
1.2.2 样地资料处理
将野外采取的年轮样芯，带回实验室固定在木槽内自然风干，待木芯完全风干后，用乳白胶固定在木槽上。固定后的芯样用砂粒由粗到细的砂纸打磨抛光，直到年轮清晰可见。用LINTAB年轮分析仪测年[21]。
1.2.3 多样性指数测度方法
采用Margalef、Simpson、Shannon-Wiener和Pielou等指数比较4座火山森林群落的丰富度、多样性和均匀度，多样性指数计算参考文献[3]。采用方差分析法(ANOVA)对各植物群落物种多样性指数进行差异性检验。多样性指数值均为平均值±标准误。植物种类的重要值可体现植物在群落中的相对重要性：乔木层重要值(IV1)=(相对密度+相对优势度+相对高度)/3；灌木和草本层重要值(IV2)=(相对高度+相对盖度+相对密度)/3。
1.2.4 稳定性研究方法
森林群落的年龄结构是群落变化发展的内在依据，因此，通过对森林群落年龄结构分析，可以测度群落的稳定性和动态[22]。优势种或建群种的种群稳定对群落稳定有决定作用[23]。选取群落乔木层年龄结构、乔木层重要值最高种群的年龄结构判定森林群落的稳定性。本研究中龄级划分采用胸径≥2.5 cm(利用年轮样芯测定年龄)的乔木划分，龄级划分标准以20 a为1个龄级，Ⅰ龄级为0~20 a、Ⅱ龄级为20~40 a，Ⅲ龄级为40~60 a，其他龄级以此类推[24]。统计分析后绘制群落的年龄结构图和种群的年龄结构图，以此判断群落的稳定性。
2. 结果与分析
2.1 森林群落结构特征
从表1可见：乔木树种北坡最多的山体为10种，南坡最多的山体为6种，群落树种组成简单。研究区南北坡向上森林群落在结构数量上都有差异，北坡各山体间乔木层和草本层的物种数目相差较大，而南坡各山体间森林群落各层次在结构数量上差异不明显(东焦得布山草本层除外)。
表 1 五大连池火山森林群落的环境特征和数量特征Table 1 Characteristics of the quantitative and environment of forest communities in Wudalianchi Volcanoes研究区 喷发时间/万a 海拔/m 坡向 乔木层 灌木层 草本层 盖度/% 种数 盖度/% 种数 盖度/% 种数 东焦得布山 17~19 531.9 北 60±13 10±1 50±16 12±1 20±4 24±3 南 70±13 6±1 15±6 6±1 30±3 37±2 小孤山 28~34 453.5 北 70±7 5±1 25±2 9±1 5±2 11±1 南 80±2 5±1 10±4 5±1 15±5 23±1 尾山 40~50 516.6 北 75±4 8±1 45±12 7±1 25±12 28±7 南 80±0 4±1 20±6 5±0 20±3 17±3 南格拉球山 70~80 596.9 北 65±0 10±1 40±12 7±1 20±3 14±3 南 60±6 3±1 10±3 4±1 30±9 23±1 说明：盖度和种数为群落内各样方的平均值±标准差 2.2 森林群落物种多样性特征
2.2.1 北坡森林群落物种多样性特征
从图1可见：4座火山北坡森林群落的各层次物种多样性指数有差异。Margalef指数和Shannon-Wiener指数从大到小依次为乔木层、草本层、灌木层，乔木层最大值分别为东焦得布山和尾山，最小值都为小孤山；灌木层最大值都为东焦得布山，最小值分别为南格拉球山和尾山；草本层最大值都为尾山，最小值都为南格拉球山。Simpson指数和Pielou指数从大到小依次为乔木层、灌木层、草本层，乔木层最大值都为尾山，最小值分别为小孤山和东焦得布山；灌木层最大值都为东焦得布山，最小值都为尾山；草本层最大值分别为尾山和东焦得布山，最小值都为南格拉球山。可见，4座火山北坡森林群落物种多样性主要受乔木层的影响；乔木层尾山的多样性指数、优势度指数和均匀度指数都最高，而小孤山的丰富度指数、多样性指数和优势度指数都最低；灌木层东焦得布山4种多样性测度指标都最大，而尾山多样性指数、优势度指数和均匀度都最小；草本层尾山物种的丰富度指数、多样性指数和优势度指数都最高，而南格拉球山4种多样性测度指标都最低。方差分析表明：4座火山北坡间，Margalef在乔木层是极显著差异(P＜0.01)，在草本层是显著差异(P＜0.05)；Shannon-Wiener指数在乔木层是显著差异外(P＜0.05)，其余群落内各层次的各种多样性指数均无显著差异(表2)。
图 1 五大连池火山北坡森林群落物种多样性特征Figure 1 Diversity index of forest communities in north slope of Wudalianchi Volcanoes表 2 五大连池火山森林群落多样性指数的方差分析和变异系数Table 2 One-way ANOVA and variation coefficient of the diversity index of forest communities in Wudalianchi Volcanoes多样性指数 层次 北坡 南坡 南北坡间 平均值 F P 变异系数 平均值 F P 变异系数 F P 变异系数 Margalef指数 乔木层 1.087±0.076 8.436 0.007** 0.234 0.443±0.080 0.235 0.869 0.188 34.135 0.000** 0.505 灌木层 0.588±0.039 0.871 0.495 0.125 0.196±0.058 0.472 0.711 0.455 32.885 0.000** 0.579 草本层 0.644±0.181 4.220 0.046* 0.843 0.899±0.117 3.369 0.084 0.354 1.347 0.259 0.563 Simpson指数 乔木层 0.688±0.027 2.639 0.121 0.107 0.212±0.048 0.097 0.959 0.160 78.882 0.000** 0.573 灌木层 0.432±0.041 1.155 0.385 0.200 0.160±0.049 0.701 0.581 0.562 18.448 0.000** 0.577 草本层 0.409±0.070 3.849 0.057 0.506 0.611±0.038 2.252 0.170 0.154 6.020 0.023* 0.359 Shannon-
Wiener指数乔木层 1.342±0.074 4.687 0.036* 0.168 0.391±0.077 0.080 0.969 0.127 79.321 0.000** 0.611 灌木层 0.716±0.073 1.156 0.384 0.216 0.244±0.073 0.616 0.626 0.526 20.742 0.000** 0.609 草本层 0.750±0.160 3.306 0.078 0.605 1.193±0.110 4.108 0.056 0.264 5.020 0.036* 0.443 Pielou指数 乔木层 0.834±0.026 0.987 0.447 0.063 0.353±0.057 0.116 0.948 0.121 62.497 0.000** 0.443 灌木层 0.728±0.049 1.204 0.369 0.147 0.306±0.091 0.746 0.558 0.582 17.356 0.000** 0.527 草本层 0.615±0.087 3.958 0.053 0.418 0.809±0.026 0.446 0.727 0.044 4.234 0.052 0.280 说明：*表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01) 4座火山北坡间，群落内各层次的物种多样性指数呈不同变化。本研究用变异系数定量表示群落物种多样性指数空间变化程度的差异(表2)。草本层的各种多样性指数变化最大，乔木层的Simpson指数和Pielou指数变化最小。因此，乔木层在物种多样性指数的空间变化上比灌木层和草本层更稳定，草本层表现出最大的空间差异。
对4座火山北坡森林群落内各层次物种多样性指数进行相关分析(表3)表明：乔木层与草本层的各指数均呈正相关性，而乔木层与灌木层、灌木层与草本层之间仅丰富度指数呈正相关性，其他各指数间均呈负相关。说明4座火山北坡森林群落物种多样性主要受乔木层和草本层的影响。
表 3 五大连池火山森林群落层次间多样性指数的相关系数Table 3 Correlation coefficients of the diversity index between forest community layers in Wudalianchi Volcanoes坡向 Margalef指数 Simpson指数 Shannon-Wiener 指数 Pielou指数 乔木层-
灌木层乔木层-
草本层灌木层-
草本层乔木层-
灌木层乔木层-
草本层灌木层-
草本层乔木层-
灌木层乔木层-
草本层灌木层-
草本层乔木层-
灌木层乔木层-
草本层灌木层-
草本层北 0.493 0.312 0.117 −0.146 0.462 −0.342 −0.112 0.552 −0.404 −0.410 0.114 −0.334 南 0.162 0.298 0.222 0.049 −0.243 0.275 0.124 −0.103 0.261 0.128 −0.264 0.476 2.2.2 南坡森林群落物种多样性特征
从图2可见：4座火山南坡森林群落中的各层次物种多样性有差异。Margalef指数、Simpson指数、Shannon-Wiener指数和Pielou指数从大到小依次为草本层、乔木层、灌木层。乔木层Margalef指数、Simpson指数和Shannon-Wiener指数最大值都是东焦得布山，最小值都是南格拉球山；乔木层Pielou指数最大值为小孤山，最小值为东焦得布山。灌木层4种多样性指数最大值都为南格拉球山，最小值都为尾山；草本层Margalef指数、Simpson指数和Shannon-Wiener指数最大值都是东焦得布山，草本层Pielou指数最大值为小孤山，草本层4种多样性指数最小值都为南格拉球山。可见，4座火山南坡森林群落物种多样性主要受草本层和乔木层的影响。乔木层东焦得布山的丰富度指数、多样性指数和优势度指数都最大，而南格拉球山4种多样性指数都最小；灌木层南格拉球4种多样性指数都最大，而尾山4种指数都最小；草本层东焦得布山的丰富度指数、多样性指数和优势度指数都最大，而南格拉球山4种多样性指数都最小。
图 2 五大连池火山南坡森林群落物种多样性特征Figure 2 Diversity index of forest communities in south slope of Wudalianchi Volcanoes4座火山南坡间，群落内各层次的各种物种多样性指数均无显著差异(表2)。4座火山南坡间，灌木层的各种多样性指数变化最大，乔木层的Simpson指数和Shannon-Wiener指数总体上变化最小，草本层的均匀度指数变化最小。因此，乔木层和草本层在物种多样性指数的空间变化上表现出比灌木层更稳定，灌木层表现出最大的空间差异。
对4座火山南坡森林群落内各层次物种多样性指数进行相关分析(表3)表明：乔木层与灌木层、灌木层与草本层各指数均呈正相关，而乔木层与草本层之间仅丰富度指数呈正相关，其他指数均呈负相关。说明4座火山南坡森林群落物种丰富度主要受草本层的影响。
2.2.3 南北坡向间森林群落物种多样性特征比较
由表2可知：4种多样性指数都是乔木层和灌木层北坡高于南坡，草本层北坡低于南坡，说明北坡乔木层和灌木层的物种多样性指数高于南坡，而草本层低于南坡。同时，南北坡向间仅草本层的Margalef指数没有显著差异，其余物种多样性指数均呈极显著(P＜0.01)或显著差异(P＜0.05)。北坡乔木层和灌木层的Simpson指数和Pielou指数的变异系数都低于南坡，而北坡草本层物种多样性指数的变异系数均高于南坡。同时，南北坡向间物种多样性指数的变异系数都较大。
2.3 森林群落稳定性特征
2.3.1 北坡森林群落稳定性特征
从图3可见：4座火山北坡森林群落的年龄结构均为稳定型，群落表现稳定增长状态。小孤山Ⅱ~Ⅵ龄级(40~80 a)的乔木株数占个体总数的69.74%，且无Ⅰ龄级(0~20 a)个体，处于成熟树阶段，群落的稳定性较差，其余3座山Ⅱ~Ⅲ龄级(20~60 a)的乔木株数分别占总数的73.53%(东焦得布山)、56.56%(尾山)和75.90%(南格拉球山)，处于中龄树阶段，群落的稳定性较好。
图 3 五大连池火山北坡森林群落的年龄结构Figure 3 Age structure of forest communities in north slope of Wudalianchi Volcanoes
图 4 五大连池火山北坡紫椴的年龄结构Figure 4 Age structure of T. amurensis in north slope of Wudalianchi Volcanoes
图 5 五大连池火山南坡森林群落的年龄结构Figure 5 Age structure of forest communities in south slope of Wudalianchi Volcanoes由表4可知：在北坡各山体的乔木层中，紫椴的重要值相对较高，其次为色木槭、山槐和黑桦，表明紫椴在北坡各山体的群落中重要性较大。为了更好地分析北坡群落的稳定情况，进一步对北坡乔木层中重要值最大的紫椴的年龄结构进行分析。
表 4 五大连池火山森林群落乔木树种的重要值Table 4 Tree species with importance value of forest communities in Wudalianchi Volcanoes研究区 坡向 重要值 山槐 山杨 紫椴 黑桦 蒙古栎 色木槭 白桦 黄榆 春榆 裂叶榆 黄檗 东焦得布山 北 1.07 0.19 0.74 0.15 − 0.53 0.03 0.09 0.02 0.09 0.06 南 − 0.04 0.35 0.10 2.49 0.02 − − − − 0.01 小孤山 北 − 0.53 1.51 0.18 − 0.68 − − − 0.10 − 南 0.01 − 0.11 0.22 2.65 0.01 − − − − − 尾山 北 0.20 0.32 0.84 0.05 0.31 0.78 0.46 0.03 − − − 南 − − 0.01 0.01 1.67 0.31 − − − − − 南格拉球山 北 0.09 0.23 0.79 0.48 0.40 0.64 0.24 0.04 − 0.28 − 南 − − − 0.15 2.72 0.13 − − − − − 说明：山槐Maackia amurensis，山杨Populus davidiana，白桦Betula platyphylla，黄榆Ulmus macrocarpa，春榆Ulmus japonica， 裂叶榆Ulmus laciniata，黄檗Phellodendron amurense。–表示没有数值 由图4可知：4座火山的紫椴年龄结构均呈稳定型，Ⅱ~Ⅲ龄级个体数分别占总数的80.49%(东焦得布山)、56.76%(小孤山)、78.79%(尾山)和62.22%(南格拉球山)，都处于中龄树阶段，群落的稳定性都较好，为稳定增长种群。群落的发展变化是以各个体的变化以及增减来实现的，年龄结构正是变化的依据，说明4座火山北坡森林群落处于稳定增长型状态。
2.3.2 南坡森林群落稳定性特征
由图5可知：4座火山南坡森林群落的年龄结构均为稳定型，群落处于稳定状态。小孤山Ⅱ~Ⅵ龄级的乔木株数占总数的85.62%，处于成熟树阶段，群落的稳定性较差，其余3座山Ⅱ~Ⅲ龄级的乔木株数分别占总数的80.18%(东焦得布山)、59.16%(尾山)和80.41%(南格拉球山)，都处于中龄树阶段，群落的稳定性较好。
由表4可知：在南坡各山体的乔木层中蒙古栎的重要值较高，其次为紫椴和黑桦，表明蒙古栎在南坡各山体的群落中重要性较大。为了更好地分析南坡群落的稳定情况，进一步对南坡乔木层中重要值最大的蒙古栎的年龄结构进行分析。从图6可见：4座火山蒙古栎的年龄结构均呈稳定型，Ⅲ~Ⅵ龄级个体数分别占总株数的94.44%(东焦得布山)、86.82%(小孤山)、98.52%(尾山)和58.53%(南格拉球山)，均处于成熟树阶段，群落的稳定性都较好，为稳定型种群，说明4座火山南坡森林群落处于稳定状态。
图 6 五大连池火山南坡蒙古栎的年龄结构Figure 6 Age structure of Q. mongolica in north slope of Wudalianchi Volcanoes2.3.3 南北坡向间森林群落物种稳定性特征比较
由图3~6可知：4座火山Ⅱ~Ⅲ龄级(20~60 a)的乔木株数分别占总数的比例均是北坡低于南坡，且北坡的龄级明显多于南坡。同时，北坡重要值最大的树种紫椴的Ⅱ~Ⅲ龄级个体数分别占总数的比例大，而南坡4座火山重要值最大的树种蒙古栎的Ⅲ~Ⅵ龄级个体数分别占总数的比例高达94.44%(东焦得布山)、86.82%(小孤山)、98.52%(尾山)、58.53%(南格拉球山)，且蒙古栎的龄级少于紫椴。综上可知，北坡森林群落的稳定性强于南坡。
3. 讨论
3.1 森林群落结构与物种多样性的关系
从群落结构的角度来研究生物群落的物种多样性是很有意义的，因为森林群落结构是群落中植物与植物之间、植物与环境之间相互关系的可见标志，也是群落其他特征的基础[25-26]。本研究各山体森林群落的乔木层和灌木层物种数北坡较南坡丰富，北坡物种多样性各指数也高于南坡，同时，森林群落结构较复杂的东焦得布山整体上物种多样性指数高。在各山体间南北坡上森林群落乔、灌、草3层物种丰富度和多样性变异都有差别。乔木层的Simpson指数变化都是最小，北坡上草本层的物种多样性各指数变化在各群落间表现出最大的差异，南坡上灌木层的物种多样性指数变化在各群落间表现出最大的差异，其原因在于物种多样性指数不仅受均匀度指数的影响，还受到物种丰富度的制约。各山体北坡森林群落间乔木层和草本层的物种数相差较大，故使群落间丰富度指数在乔木层和草本层分别是极显著差异和显著差异，Shannon-Wiener指数在乔木层是显著差异，且北坡上各森林群落内乔木层与草本层的物种多样性各指数均呈正相关。可见，北坡上乔木种类数量对草本物种有影响，而灌木层的物种数相差较小，导致物种多样性各指数没有显著差异；南坡森林群落间乔木、灌木、草本层物种数目相差不大，群落间各层次的物种多样性各指数均无显著差异，且南坡上各森林群落内乔木层与灌木层、灌木层与草本层的种物种多样性指数均呈正相关。
3.2 森林群落物种多样性与稳定性的关系
物种多样性和稳定性是植物群落的2个属性，它们之间的相互关系和相互影响已引起了国内外许多生态学者的关注[1, 8-9, 26]。均匀度是群落物种多样性研究中重要的概念[27]。以均匀度来考虑物种多样性与群落稳定性的关系时，群落的物种均匀度指数越高，群落的物种间相互差异越不显著，说明群落的稳定性越高，从演替动态的角度来看其稳定性就越高[1]。本研究森林群落物种多样性结果表明：乔木种群对群落具有支配作用，决定着群落的发展趋势，能够反映整个群落的物种多样性动态规律。因此，探知乔木层物种多样性与群落稳定性的问题，更有利于认知森林群落物种多样性与其稳定性之间的关系。高贤明等[1]在暖温带若干落叶阔叶林群落物种多样性及其与群落动态的关系研究发现：3个栎属Quercus林均匀度指数均较高，为0.56~0.76，是比较稳定的群落类型。本研究南北坡向各森林群落内乔木层的物种均匀度指数均较高，分别为0.31~0.41和0.77~0.89，是比较稳定的群落。森林群落的稳定程度和发展趋向，是受群落内外诸种生态学因素所决定。但是不管多方面的因素如何影响，影响的原因何等复杂，最终是以群落中各种群的变化来作为承受其结果的表达。因此，在群落的发展过程中，群落结构和相应种群结构变化可从年龄结构反映出来，相对稳定的森林群落应有相对稳定的种群结构，因而有相对稳定的年龄结构。不同稳定程度的森林群落的年龄结构图与种群的年龄结构图相近[22]。本研究南北坡森林群落的年龄结构都是稳定型，重要值高的蒙古栎和紫椴种群的年龄结构也都是稳定型，这说明南北坡各森林群落处于稳定状态。
3.3 坡向对森林群落多样性和稳定性的影响
在局部地区较小的尺度上，物种丰富度、多样性指数和均匀度指数也受到环境因素的影响。因为物理和生物因子的异质性发生在空间的各个尺度上，即使微生境如1株树或1束灌丛就可产生资源的异质性，从而影响其他生命体的分布(包括种类和数量)[28]。坡向影响了非生物资源分配，对地表接收的太阳辐射量能够产生较大的影响，进而使不同坡向的光、热、水、土等自然因素呈现较大的差异，营造局部小气候，从而使不同坡向的群落结构和群落物种多样性等产生相应的变化。在五大连池老期火山，南坡与北坡植物群落上层的主要生态因子光照和与之相关的水分和温度等生态因子存在一定的差异，耐干旱、瘠薄、喜光惯生长于阳坡的乔木和灌木种类少，耐阴湿惯生于北坡的乔木和灌木种类多，物种多样性增加，但同时北坡灌木种类多且盖度大导致草本植物可获得生长机会减少，致使北坡草本种类少且盖度小，物种多样性较南坡低。综上表明：北坡与南坡群落上层的光照、水分与温度等生态因子的差异导致北坡的乔木层和灌木层的物种多样性各指数均大于南坡，而草本层的物种多样性低于南坡，南北坡向间物种多样性各指数差异显著且变异系数都较大。稳定性与多样性具有更为复杂的关系，植物种的多样性并不能完全代表群落的稳定性，但却是群落稳定性的必要条件[29]。闫东锋等[30]在宝天曼栎属天然林物种多样性与稳定性研究中，通过群落物种多样性与稳定性相关机制的讨论，认为在森林生态系统中，物种多样性高可以导致较强稳定性，两者具有显著的正相关关系，并且发现最稳定的群落及不稳定的群落乔木层多样性指数的最大值分别为1.99和0.46。李凤英等[31]在凉水国家级自然保护区森林群落结构及物种多样性分析研究中发现：红松Pinus koraiensis-白桦Betula platyphylla森林群落乔木层多样性指数为2.08。本研究森林群落乔木层多样性最高值在北坡，为1.49，同时，北坡森林群落的年龄结构也较稳定，重要值显著高的紫椴种群的年龄结构也较稳定。综上所述，五大连池火山北坡森林群落多样性指数较高，且森林群落稳定性更好。
五大连池4座老期火山森林群落结构北坡较南坡丰富，北坡的乔木层和灌木层的物种多样性指数均大于南坡，而草本层的物种多样性低于南坡，南北坡向间物种多样性指数差异显著且变异系数都较大。北坡森林群落多样性指数也较南坡高，且森林群落稳定状态更好。同时，山体间森林群落结构较复杂的东焦得布山整体上物种多样性指数也较高。
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图 1 牦牛骨钙溶液浓度对牦牛骨蛋白肽-钙螯合物稳定性的影响
Figure 1 Stability of yak bone peptides-calcium chelate prepared by different yak bone calcium solution
图 2 不同肉桂精油添加量对包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物稳定性的影响
Figure 2 Stability of yak bone peptides-calcium chelate prepared by different ratio of cinnamon essential oil
图 3 螯合物的粒径和多分散指数
Figure 3 Particle size and polydispersity coefficient of emulsion of cinnamon essential oil and yak bone peptides-calcium chelate
图 4 肉桂精油和螯合物对维氏气单胞菌的抑菌效果
Figure 4 Bacteriostatic effect of cinnamon essential oil and yak bone peptides-calcium chelate on Aeromonas veronii
表 1 感官评价评分标准
Table 1. Standard of sensory evaluation
评分 状态 色泽 香气 异味 协调性 7~9 分散均一，无分层、结块、沉淀 一致，无杂质、霉变 肉桂味浓郁、纯正 气味良好，
无不良风味气味协调 4~6 分散略不均一，无分层、结块、沉淀 不均，有杂质，无霉变 肉桂味较浓郁 稍有异味 气味较协调 1~3 分散不均一，有明显分层、结块、沉淀，
有油滴出现不均，有大量杂质，有霉变 肉桂味不突出 有明显异味 气味不协调 
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表 2 牦牛骨蛋白肽的分子量
Table 2. Molecular weight of yak bone peptides
t/min 分子量/kDa 占比/% ＜15.579 ≥3.0 0 15.579~＜16.363 2.0~＜3.0 0.040 16.363~＜17.688 1.0~＜2.0 4.094 17.688~＜18.508 0.5~＜1.0 34.211 ≥18.508 ＜0.5 61.656
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表 3 牦牛骨蛋白肽部分多肽序列鉴定结果
Table 3. Identification of partial peptides sequences of yak bone peptides
主要肽段 可信度 分子量/Da 质核比 功能 GPVGPVG 40.23 581.317 3 582.324 1 SVPGPMG 32.33 643.299 9 644.306 6 VPGPMGP 31.42 653.320 7 654.326 5 APGPVGPAG 34.80 721.375 9 722.382 3 AP(+15.99)GPVGPAG 31.27 737.370 8 738.377 4 羟基化 FP(+15.99)GADGVA 34.14 748.339 1 749.345 7 羟基化 VP(+15.99)GPMGPS 33.76 756.347 6 757.356 1 羟基化 SDGSVGPVG 36.97 773.355 5 774.362 2 SP(+15.99)GN(+0.98)IGPAG 33.70 785.355 5 786.362 5 羟基化 GAAGPTGPIG 30.08 796.407 9 797.415 6 TPGPQ(+0.98)GIAG 30.34 797.391 9 798.399 9 脱酰胺 LPQPPQE 31.34 807.412 7 808.419 7 IQ(+0.98)GPP(+15.99)GPAG 30.19 809.391 9 810.398 9 脱酰胺，羟基化 AP(+15.99)GPQ(+0.98)GFQ 31.21 817.360 6 818.366 5 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GPVGPAG 33.96 820.407 9 821.415 4 羟基化 GP(+15.99)AGPIGPVG 34.90 836.439 1 837.445 6 羟基化 GPVGPTGPVG 37.77 836.439 2 837.445 6 TP(+15.99)GPQGLLG 31.36 854.449 8 855.456 9 羟基化 GASGPP(+15.99)GFVG 31.32 860.402 8 861.412 9 羟基化 GPQ(+0.98)GPVGPVG 31.77 864.434 1 865.440 8 脱酰胺 GIQGPP(+15.99)GPAG 30.73 865.429 3 866.436 9 羟基化 AGPSGPAGPTG 36.13 867.408 6 868.415 5 GPP(+15.99)GLQ(+0.98)GVQ 33.31 868.429 0 869.436 0 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GPMGPPG 42.39 878.395 6 879.402 2 羟基化 TGPIGPP(+15.99)GPA 41.22 878.449 8 879.457 6 羟基化 GPP(+15.99)GPIGNVG 33.95 879.445 0 880.452 9 羟基化 GPP(+15.99)GPIGN(+0.98)VG 32.42 880.429 0 881.436 0 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GFP(+15.99)GAVG 34.44 886.418 5 887.424 9 羟基化 VGPAGPN(+0.98)GFA 40.33 886.418 5 887.425 0 脱酰胺 AGPP(+15.99)GPTGPAG 31.53 893.424 3 894.431 5 羟基化 AAGPP(+15.99)GPTGPA 34.87 907.439 9 908.446 5 羟基化 VGPAGPN(+0.98)GFAG 38.51 943.439 9 944.445 9 脱酰胺 APGAPGPVGPAG 30.84 946.487 2 947.493 7
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表 4 感官评价结果
Table 4. Artificial sensory evaluation results
感官特性 包埋肉桂精油的牦牛骨
蛋白肽-钙螯合物/分肉桂精油稀释液/分 感官特性 包埋肉桂精油的牦牛骨
蛋白肽-钙螯合物/分肉桂精油稀释液/分 状态 7.60±0.70 b 8.65±0.47 a 异味 7.10±0.99 b 8.00±0.67 a 色泽 8.15±0.34 a 8.25±0.59 a 协调性 6.10±0.88 b 8.15±0.34 a 香气 7.15±1.00 a 4.35±0.82 b 平均 7.22 7.48 说明：不同字母表示样品间差异显著(P＜0.05)
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