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牦牛Bos grunniens是中国青藏高原及其毗邻高山、亚高山高寒地区的特有珍稀牛种之一[1]。作为牦牛肉加工过程中产生的主要副产物，牦牛骨钙质丰富，是目前市面上优质的小分子骨胶原肽来源[2]。多肽螯合钙是第3代具有活性结构的生物钙补钙制剂，稳定性好，抗干扰能力强，吸收效果好，生物利用度高。甘林火等[3]发现：L-亮氨酸螯合钙的生物利用度比葡萄糖酸钙要高，具有缓释、药效时间长、不需要消耗胃酸等特点。植物来源的精油可以作为调味剂和天然防腐剂，肉桂精油具有清除自由基、抗油脂氧化的作用和较强的抗菌能力[4]，是对抗常见食源性病原体的最有效精油之一[5]，主要成分为肉桂醛，此外还含有丁子香酚、芳樟醇和α-pine烯等[6]。HUANG等[7]发现：肉桂精油抗菌活性高，能有效抑制微生物生长，延长草鱼Ctenopharyngodon idellus鱼片保质期。OJAGH等[8]发现富含肉桂油的壳聚糖涂层延长了虹鳟鱼Oncorhynchus mykiss冷藏期间的保质期。本研究利用牦牛骨资源，制备包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物，探讨其对水产品中的优势腐败菌维氏气单胞菌Aeromonas veronii的缓释抑菌作用，为水产品的防腐保鲜提供新思路。
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木瓜蛋白酶购自安琪酵母股份有限公司；维氏气单胞菌由中国农业大学食品科学与营养工程学院水产品加工实验室提供；牦牛骨购自国肽生物科技(北京)有限公司；肉桂精油购自江西恒城天然香料油有限公司。肉桂精油的添加使用遵照GB 2760−2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》的相关规定[9]。
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参考魏洁琼等[10]方法并稍作修改。破碎后的牦牛骨粒经高压灭菌锅蒸煮3.0 h；冷却后除去油脂，过滤得到骨渣和滤液。骨渣∶盐酸(1.0 mmol·L−1)以1∶50(m∶V)酸溶15 h[11]，蒸发浓缩，EDTA滴定后用去离子水稀释得到2.0 mmol·L−1的可溶性牦牛骨钙，备用。滤液浓缩，冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白；去离子水溶解，调节至60 ℃，pH 7.0[12-13]，木瓜蛋白酶(4 000×16.67 nkat·g−1)酶解2.0 h[14]，95 ℃水浴灭酶20 min，冷却后离心，取上清液浓缩后冷冻干燥，即为牦牛骨蛋白肽。
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参照HONG等[15]方法并稍作修改。牦牛骨胶原蛋白肽用去离子水溶解成10.0 g·L−1蛋白肽溶液，离心去除沉淀。在使用均质仪(德国IKA)均质的同时向牦牛骨蛋白肽溶液中逐滴加入牦牛骨钙溶液，得到牦牛骨蛋白肽-钙螯合物。量取10 mL牦牛骨蛋白肽溶液，分别加入0(对照)、10、15、20、25、30 μL肉桂精油，在均质的同时逐滴加入1 mL 0(对照)、0.5、1.0、2.0 mmol·L−1牦牛骨钙溶液，得到包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物[16]。
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参照XIE等[17]方法，通过分子量排阻的高效液相色谱法(SE-HPLC)，使用液相色谱仪(日本岛津)测定牦牛骨蛋白肽分子量[18]。仪器参数：TSK凝胶G2000SWXL柱(7.8 mm×300 .0 mm)，进样量25.0 μL，流速0.5 mL·min−1，紫外检测器波长214 nm。以三氟乙酸-水-乙腈(体积比为0.1∶54.9∶45.0)为流动相。标准物为细胞色素C(12.362 kDa)，抑肽酶(6.5114 kDa)，杆菌肽(1.423 kDa)，Gly-Gly-Tyr-Arg(四肽，0.451 kDa)和Gly-Gly-Gly(三肽，0.189 kDa)。将混合标准溶液进样，以标准物分子量(M)的对数值为纵坐标，保留时间(t)为横坐标，建立保留时间和分子量对数之间的标准曲线。
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使用Q-Exactive高分辨质谱仪(美国赛默飞)对样品进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)全扫描，质荷比为100~1 990 Da[19]。使用Peaks studio 8.0软件结合Mascot MS/MS搜索SwissProt蛋白质数据库，鉴定牦牛骨多肽序列[20]。
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根据AKBARI等[16]和ZHANG等[21]方法稍作修改，使用可见分光光度计每隔10 min测定1次牦牛骨蛋白肽原始溶液、牦牛骨蛋白肽-钙螯合物和去离子水乳化的牦牛骨蛋白肽(对照)的吸光度(600 nm)，计算相对浊度，研究蛋白肽钙螯合物的稳定性。计算公式为：相对浊度=(Ax−A0)/A0×100%。其中：Ax为不同条件下制得的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物(或对照)的吸光度，A0为牦牛骨蛋白肽原始溶液的吸光度。
每隔2 h测定1次包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的吸光度(600 nm)[22]，以牦牛骨蛋白肽-钙螯合物为对照，研究肉桂精油对螯合物稳定性的影响。
使用ZS90纳米粒径电位分析仪(英国，马尔文)在25 ℃下通过动态光散射(DLS)测定螯合物的平均粒径和多分散指数(PDI)[21]。
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采用感官评价法和抑菌活性测定缓释效果。取包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物和去离子水稀释的等比例肉桂精油样品各1份，室温下静置24 h后，参考朱红梅等[23]进行感官评价。感官指标评分表如表1所示。参照周子雄等[24]的方法并稍作修改测定抑菌活性。活化过夜的维氏气单胞菌菌液[25-26]调整至106 CFU·mL−1，取4份25 mL受试菌菌悬液，分别加入100 μL已灭菌的包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物、牦牛骨蛋白肽-钙螯合物、肉桂精油和去离子水(对照)，震荡混匀。每隔2 h测定1次菌悬液吸光度(600 nm)，检测螯合钙的抑菌效果。抑菌率=(Ac−At)/Ac×100%。其中：Ac为对照组的吸光度，At为不同处理条件下的吸光度。
表 1 感官评价评分标准
Table 1. Standard of sensory evaluation
评分 状态 色泽 香气 异味 协调性 7~9 分散均一，无分层、结块、沉淀 一致，无杂质、霉变 肉桂味浓郁、纯正 气味良好，
无不良风味气味协调 4~6 分散略不均一，无分层、结块、沉淀 不均，有杂质，无霉变 肉桂味较浓郁 稍有异味 气味较协调 1~3 分散不均一，有明显分层、结块、沉淀，
有油滴出现不均，有大量杂质，有霉变 肉桂味不突出 有明显异味 气味不协调 -
所有实验重复3次，数据用平均值±标准差表示。采用RStudio 1.3.1073软件对测定结果进行显著性分析，差异显著水平为0.05。
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标准曲线方程为：lgM=7.013 8+0.226 9t，计算得到不同分子量区间的蛋白肽占总蛋白的比例。由表2可知：酶解后的牦牛骨蛋白肽肽段的分子量均小于3.0 kDa，其中分子量小于1.0 kDa的牦牛骨蛋白肽占全部肽段的95.867%，说明牦牛骨蛋白肽多为小分子肽。
表 2 牦牛骨蛋白肽的分子量
Table 2. Molecular weight of yak bone peptides
t/min 分子量/kDa 占比/% ＜15.579 ≥3.0 0 15.579~＜16.363 2.0~＜3.0 0.040 16.363~＜17.688 1.0~＜2.0 4.094 17.688~＜18.508 0.5~＜1.0 34.211 ≥18.508 ＜0.5 61.656 -
LC-MS/MS测序发现：牦牛骨蛋白肽主要成分为胶原Ⅰ蛋白α1链和α2链，分别含肽段336和285条，肽段覆盖率为55%。共测得945个肽段序列信息，相对分子量为306~1 032 Da，组成肽段的氨基酸为7~37个。对其中分子量小于1.0 kDa且可信度较高的33条蛋白肽段(表3)进一步的分析，牦牛骨蛋白肽可用于制备具备缓释杀菌功能的钙螯合物。
表 3 牦牛骨蛋白肽部分多肽序列鉴定结果
Table 3. Identification of partial peptides sequences of yak bone peptides
主要肽段 可信度 分子量/Da 质核比 功能 GPVGPVG 40.23 581.317 3 582.324 1 SVPGPMG 32.33 643.299 9 644.306 6 VPGPMGP 31.42 653.320 7 654.326 5 APGPVGPAG 34.80 721.375 9 722.382 3 AP(+15.99)GPVGPAG 31.27 737.370 8 738.377 4 羟基化 FP(+15.99)GADGVA 34.14 748.339 1 749.345 7 羟基化 VP(+15.99)GPMGPS 33.76 756.347 6 757.356 1 羟基化 SDGSVGPVG 36.97 773.355 5 774.362 2 SP(+15.99)GN(+0.98)IGPAG 33.70 785.355 5 786.362 5 羟基化 GAAGPTGPIG 30.08 796.407 9 797.415 6 TPGPQ(+0.98)GIAG 30.34 797.391 9 798.399 9 脱酰胺 LPQPPQE 31.34 807.412 7 808.419 7 IQ(+0.98)GPP(+15.99)GPAG 30.19 809.391 9 810.398 9 脱酰胺，羟基化 AP(+15.99)GPQ(+0.98)GFQ 31.21 817.360 6 818.366 5 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GPVGPAG 33.96 820.407 9 821.415 4 羟基化 GP(+15.99)AGPIGPVG 34.90 836.439 1 837.445 6 羟基化 GPVGPTGPVG 37.77 836.439 2 837.445 6 TP(+15.99)GPQGLLG 31.36 854.449 8 855.456 9 羟基化 GASGPP(+15.99)GFVG 31.32 860.402 8 861.412 9 羟基化 GPQ(+0.98)GPVGPVG 31.77 864.434 1 865.440 8 脱酰胺 GIQGPP(+15.99)GPAG 30.73 865.429 3 866.436 9 羟基化 AGPSGPAGPTG 36.13 867.408 6 868.415 5 GPP(+15.99)GLQ(+0.98)GVQ 33.31 868.429 0 869.436 0 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GPMGPPG 42.39 878.395 6 879.402 2 羟基化 TGPIGPP(+15.99)GPA 41.22 878.449 8 879.457 6 羟基化 GPP(+15.99)GPIGNVG 33.95 879.445 0 880.452 9 羟基化 GPP(+15.99)GPIGN(+0.98)VG 32.42 880.429 0 881.436 0 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GFP(+15.99)GAVG 34.44 886.418 5 887.424 9 羟基化 VGPAGPN(+0.98)GFA 40.33 886.418 5 887.425 0 脱酰胺 AGPP(+15.99)GPTGPAG 31.53 893.424 3 894.431 5 羟基化 AAGPP(+15.99)GPTGPA 34.87 907.439 9 908.446 5 羟基化 VGPAGPN(+0.98)GFAG 38.51 943.439 9 944.445 9 脱酰胺 APGAPGPVGPAG 30.84 946.487 2 947.493 7 -
由图1可知：除加入去离子水并乳化的牦牛骨蛋白肽(对照)外，不同浓度牦牛骨钙溶液制成的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的相对浊度存在显著差异(P＜0.05)。随牦牛骨钙溶液浓度增加，蛋白肽-钙螯合物相对浊度增加，但不同沉降时间下相对浊度变化不大，说明鳌合效果良好，螯合物稳定，可以用于混合乳液的制备，后续研究选用2.0 mmol·L−1牦牛骨钙溶液制备鳌合物。由图2可知：除牦牛骨蛋白肽-钙螯合物(对照)外，添加不同体积肉桂精油制成的包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的吸光度存在显著差异(P＜0.05)。当添加的肉桂精油大于20 μL时，螯合物吸光度随时间急剧下降，稳定性较差；添加的肉桂精油小于20 μL时，螯合物吸光度变化不大，说明稳定性较好。因此后续研究以10 mL牦牛骨蛋白肽中加入20 μL肉桂精油为螯合时肉桂精油的适宜添加量。
图 1 牦牛骨钙溶液浓度对牦牛骨蛋白肽-钙螯合物稳定性的影响
Figure 1. Stability of yak bone peptides-calcium chelate prepared by different yak bone calcium solution
图 2 不同肉桂精油添加量对包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物稳定性的影响
Figure 2. Stability of yak bone peptides-calcium chelate prepared by different ratio of cinnamon essential oil
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由图3可知：牦牛骨蛋白肽的粒径为167.8 nm，牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的粒径为368.2 nm，包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的粒径为780.2 nm，三者差异显著(P＜0.05)；牦牛骨蛋白肽、牦牛骨蛋白肽-钙螯合物及包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的多分散指数没有显著性差别(P＞0.05)，且包埋肉桂精油的螯合物多分散指数小于0.2，螯合物分散性较好。
图 3 螯合物的粒径和多分散指数
Figure 3. Particle size and polydispersity coefficient of emulsion of cinnamon essential oil and yak bone peptides-calcium chelate
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由表4可知：包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的总体评分为7.22分，即该螯合物表观状态良好，分散均一，无分层，色泽一致，无杂质，肉桂香浓郁、风味纯正，气味较协调，无不良气味，其中“香气”项的分值显著高于肉桂精油稀释液(P＜0.05)。
表 4 感官评价结果
Table 4. Artificial sensory evaluation results
感官特性 包埋肉桂精油的牦牛骨
蛋白肽-钙螯合物/分肉桂精油稀释液/分 感官特性 包埋肉桂精油的牦牛骨
蛋白肽-钙螯合物/分肉桂精油稀释液/分 状态 7.60±0.70 b 8.65±0.47 a 异味 7.10±0.99 b 8.00±0.67 a 色泽 8.15±0.34 a 8.25±0.59 a 协调性 6.10±0.88 b 8.15±0.34 a 香气 7.15±1.00 a 4.35±0.82 b 平均 7.22 7.48 说明：不同字母表示样品间差异显著(P＜0.05) -
由图4可知：在2 h后，对照和牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的吸光度明显上升，维氏气单胞菌大量繁殖；相比之下，牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的吸光度值增速更快，12 h抑菌率为−13.70%，推测是牦牛骨蛋白肽为菌的繁殖提供营养。肉桂精油稀释液和包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物都表现出了良好的抑菌效果，12 h抑菌率分别为70.24%和77.33%。螯合物对维氏气单胞菌的6 h抑菌率为61.41%，且6 h后抑菌率始终高于肉桂精油稀释液，说明螯合物抑菌效果较为稳定。
图 4 肉桂精油和螯合物对维氏气单胞菌的抑菌效果
Figure 4. Bacteriostatic effect of cinnamon essential oil and yak bone peptides-calcium chelate on Aeromonas veronii
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人体从外界摄取的蛋白类营养物质被分解后多以小分子肽的形式被吸收利用，肽的螯合能力受分子量影响；相比之下，小分子肽内部活性基团和螯合位点暴露程度较大，与钙离子的接触机率也较大[27]。本研究中得到的多数牦牛骨蛋白肽分子量小于1.0 kDa，属于小分子肽，因此适用于钙螯合物的制备。
本研究发现：大量牦牛骨蛋白肽在pH小于7时带负电荷，有利于蛋白肽侧链与钙离子间的静电吸引，当负电荷被钙离子中和时，中性蛋白肽受到疏水作用影响，形成蛋白肽-钙螯合物。同时，牦牛骨蛋白肽中还存在大量的脯氨酸(P)和甘氨酸(G)；HAINES-BUTTERICK等[28]发现：脯氨酸和甘氨酸通常依次出现在β-折叠的边缘链或β-发夹中，这种蛋白质超二级结构有助于形成球形结构[29]，可被应用于药物的释放[30]。因此，牦牛骨蛋白肽可用于制备具缓释杀菌功能的钙螯合物。
浊度是评价多肽螯合钙螯合程度的重要指标之一[21]，与螯合物粒径正相关；当悬浮液浊度达到原始分散体的50%且随着钙离子浓度增加不再形成沉淀物时，被认为螯合钙形成良好[19]。AKBARI等[16]发现：随着钙离子浓度增加，螯合物的粒径增加。ZHANG等[21]发现：高浓度钙离子可以平衡肽的负电荷，形成沉淀或附聚物(肽-钙螯合物)。本研究中，随着牦牛骨钙溶液浓度增加，相对浊度显著升高，且未生成沉淀物，与AKBARI等[16]结论一致；因此，使用2.0 mmol·L−1牦牛骨钙溶液可形成螯合钙，且稳定性良好。
多分散指数(PDI)可用来表征纳米乳液粒子的分布情况，PDI越小表示乳液粒子分布越均匀[31]。本研究中，通过高速剪切法向牦牛骨蛋白肽溶液中加入牦牛骨钙溶液，粒径明显增加，PDI较小，说明有新的物质形成，即生成了肽-钙螯合物，且分散性较好；继续加入肉桂精油，乳液粒径出现显著增加，推断是形成了包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物。
人工感官评定是最基础的食品质量评价方法[32]。本研究制备的包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物在各项评价中表现良好，且“香气”项分值显著高于肉桂精油稀释液，与肉桂精油稀释液相比，静置24 h后肉桂香更浓郁，认为螯合物有一定的缓释作用。
微生物是食物腐败的主要原因，抑制微生物生长是延长保质期和提高水产品质量的有效方法，气单胞菌是水产品中的优势腐败菌[33]。本研究中，包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物对气单胞菌表现出明显的抑菌效果，与HUANG等[7]结果相符。随时间增长，螯合物抑菌效果逐渐优于肉桂精油稀释液，说明螯合物具有缓释效果，延长了抑菌时间，有助于延长水产品的货架期。
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本研究利用牦牛骨资源制备包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物；通过分析螯合物相对浊度，确定制备条件；通过测定牦牛骨蛋白肽分子量，分析牦牛骨蛋白肽序列，确认牦牛骨蛋白肽适用于螯合物的制备，并推断螯合物形成机制为牦牛骨蛋白肽的负电荷与钙离子间产生静电吸引作用，受疏水作用影响形成球形肽-钙螯合物；通过测定粒径、多分散指数和浊度，表征螯合物特性，确认螯合物的形成；通过测定抑菌率和感官评价实验，验证包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物抑菌效果良好，且具有缓释作用，为新型抑菌剂的开发提供思路。
Preparation and antibacterial effect of yak bone protein peptide-calcium chelate embedded with cinnamon essential oil
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摘要:
目的 为充分利用牦牛Bos grunniens骨资源，改善其利用率低下，浪费严重的现状；研究包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的形成机制及抑菌效果。 方法 牦牛骨经高温蒸煮，分离出蛋白质和骨渣。酶解蛋白质得到牦牛骨胶原蛋白肽，酸溶骨渣得到可溶性牦牛骨钙。通过肉桂精油与牦牛骨胶原蛋白肽混合均质形成肉桂精油-牦牛骨蛋白肽乳液，乳液与牦牛骨钙通过高速剪切法获得包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物。测定螯合钙浊度、粒径、多分散指数和抑菌率，并进行感官评价。 结果 牦牛骨蛋白肽多为小分子肽(＜1.0 kDa)，适合钙螯合物的制备。pH＜7时多数牦牛骨蛋白肽带负电荷，受疏水作用影响，形成牦牛骨蛋白肽-钙螯合物。牦牛骨蛋白肽由大量的脯氨酸(P)和甘氨酸(G)组成，容易构成多肽二级结构β-转角，利于物质释放。包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物稳定性良好，平均粒径为780.2 nm；分散性良好，多分散指数小于0.2。牦牛骨蛋白肽、肉桂精油和螯合物对维氏气单胞菌Aeromonas veronii的12 h抑菌率分别为−13.70%、70.24%和77.33%，螯合物抑菌效果良好；6 h后螯合物抑菌率超过肉桂精油。感官评价结果发现：螯合物和肉桂精油的香气评分分别为7.15和4.35分，螯合物肉桂味浓郁程度显著高于肉桂精油(P＜0.05)，螯合物有一定缓释效果。 结论 牦牛骨蛋白肽和牦牛骨钙适用于研发复合氨基酸矿物质螯合钙产品，包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物可用于新型抑菌剂的开发。图4表4参33 Abstract:Objective This study aims to explore the formation mechanism and antibacterial effect of yak bone protein peptide-calcium chelate embedded with cinnamon essential oil, so as to make full use of the bone resource and improve its utilization rate and avoid serious waste. Method The yak bone was autoclaved at high temperature to separate protein and bone residue. Yak bone collagen peptide was obtained from enzymatic hydrolysis of protein, and soluble yak bone calcium was obtained from acid-dissolved bone residue. The cinnamon essential oil and the yak bone collagen peptide were mixed and homogenized to form a cinnamon essential oil-yak bone peptide emulsion, and the calcium chelate of yak bone protein peptide encapsulated in cinnamon essential oil was obtained by high speed shear method. The turbidity, particle size, polydispersity index, antibacterial activity of the chelated calcium were determined and organoleptic evaluation was conducted. Result The yak bone peptides were mostly small molecule peptides (less than 1.0 kDa), and were suitable for the preparation of chelated calcium. When pH value was less than 7, many yak bone peptides were negatively charged and were affected by hydrophobicity to form yak bone protein peptide-calcium chelates. The yak bone peptide was composed of a large number of proline (P) and glycine (G), which could easily form the β-turn, one of the polypeptide secondary structures, and facilitate the release of substances. The yak bone protein peptide-calcium chelate embedded with cinnamon essential oil had good stability, with an average particle size of 780.2 nm. The dispersibility was good and the polydispersity index was less than 0.2. The 12 h antibacterial rates of yak bone protein peptide, cinnamon essential oil and chelate against Aeromonas veronii were −13.70%, 70.24% and 77.33%, respectively. The inhibition rate of chelate to Aeromonas was higher than that of cinnamon essential oil after 6 hours. The organoleptic evaluation revealed that the aroma scores of chelate and cinnamon essential oil were 7.15 and 4.35 respectively, and the cinnamon flavor of chelate was significantly stronger than that of cinnamon essential oil (P＜0.05), indicating that the chelate had a certain sustained-release effect. Conclusion Yak bone protein peptide and yak bone calcium are suitable for the development of complex amino acid mineral chelated calcium products, and the yak bone protein peptide-calcium chelate encapsulated with cinnamon essential oil can be used for the development of new antibacterial agents. [Ch, 4 fig. 4 tab. 33 ref.] -
Key words:
- yak bone /
- protein peptide /
- cinnamon essential oil /
- chelate /
- bacteriostasis in vitro
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凤丹Paeonia ostii是中国著名的观赏兼油用、药用牡丹，也是观赏牡丹嫁接的优良砧木，在牡丹种苗产业化生产中具有重要地位[1]。凤丹在传统育苗中主要为露地播种繁殖，种子萌发时间长，萌发率较低[2]。凤丹种子存在双休眠特性[3]，新鲜成熟种子需要经过一段时间的后熟作用，解除下胚轴休眠才能萌发生根，生根后还需解除上胚轴休眠才长成正常成苗。前人研究表明：低浓度的赤霉素（GA3）比吲哚乙酸（IAA）和6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）更适合诱导凤丹种子萌发，凤丹种子萌发率随GA3浓度的升高而下降[4]。栽培牡丹种子生根前，各种物理或化学处理都未能打破上胚轴休眠，只有在种子根长至3 cm时，用赤霉素或低温处理才能有效解除其上胚轴休眠[5]。但有研究表明：GA3处理的种子从开始萌芽到出齐苗所需时间长达82 d，而低温处理的种子出齐苗所需时间仅有46 d左右[6]。因此，本研究将重点探讨低温处理和GA3处理对凤丹种子萌发的影响，寻找促进其萌发的最佳处理方法。穴盘育苗作为现代种苗繁殖方式，可以实现规模化、机械化生产，同时能有效地保护根系，提高出苗率[7]。本试验采用穴盘育苗的方式，用不同方法处理凤丹种子，探索促进凤丹种子萌发的有效方法，期望为牡丹种苗产业化生产提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
种子采自河南栾川。采种时间为2013年9月13日，千粒重471.64 g，实验开始时间为2013年10月21日。50目林木穴盘，规格为25 cm×48 cm×10 cm，穴孔口径为4.5 mm。基质：进口草炭、珍珠岩。
1.2 试验方法
1.2.1 不同处理对凤丹种子生根情况的影响
清水浸种1 h后，取出饱满下沉的种子，用体积分数为0.1%的甲醛消毒30 min后，作以下处理：100 mg·L-1GA3，200 mg·L-1GA3，300 mg·L-1GA3溶液分别浸种24 h。100粒·处理-1，3次重复。对照组清水浸种24 h。
将处理后的种子播进穴盘，覆基质1.5~2.0 cm，穴盘内基质为草炭:珍珠岩（1:1），将穴盘分别置于10，15，20℃的人工气候箱内，保持穴盘内基质湿度基本一致，隔7 d观察1次，记录生根时间。100 d后计算生根率和根长大于5 cm的种子比例。
生根率=（生根种子数/种子总数量）×100%。根长大于5 cm的种子比例=（根长大于5 cm的种子数量/种子总数量）×100%。
1.2.2 不同主根长对生根凤丹种子萌发的影响
将穴盘内主根长1~5 cm的种子和主根长＞5 cm的种子分别于4℃中处理30 d，取出后在20℃温室内进行发芽实验，50粒·处理-1，3次重复。隔3 d观察种子萌发情况，记录种子萌发时间，60 d后统计萌发率。种子萌发以上胚轴伸出1 cm时为标准。萌发时间为种子从温室取出到萌发时的时间。萌发率=（萌发种子数/冷藏种子总数量）×100%。萌发时间和萌发率用DPS 9.50进行ANOVA方差分析。
1.2.3 不同低温处理时间对生根凤丹种子萌发的影响
将生根后根长＞5 cm的种子于4℃中分别处理15，30，45，52 d后取出，移入温室。温室温度为20℃。50粒·处理-1，3次重复。记录种子萌发时间，60 d后统计萌发率。
萌发率=（萌发种子数/冷藏种子总数量）×100%。试验数据用DPS 9.50进行ANOVA方差分析。
1.2.4 下胚轴最膨大处直径及侧根数量对根长＞5 cm凤丹种子萌发的影响
分别测量根长＞5 cm的生根种子的下胚轴最膨大处直径和侧根数量，之后将其于4℃中分别处理30,45，52 d，记录种子萌发的时间，观察前5粒和最后5粒萌发种子下胚轴最膨大处直径和侧根数量对发芽时间的影响。用Excel计算下胚轴最膨大处直径和侧根数量的相关性。50粒·处理-1，3次重复。
相关系数取绝对值后，0~0.09为没有相关性，0.1~0.3为弱相关，0.3~0.5为中等相关，0.5~1.0为强相关。用DPS 9.50进行ANOVA方差分析。
2. 结果与分析
2.1 不同处理对凤丹种子生根情况的影响
图 1可知，10℃条件下，对照及100 mg·L-1 GA3处理种子均不发芽，在200 mg·L-1或300 mg·L-1质量浓度GA3处理下发芽时间也较长，达到70 d以上。在15℃培养条件下，随着GA3质量浓度增加发芽时间缩短；在4种质量浓度GA3处理下，20℃培养箱内发芽时间均较短，但差异不显著。结果显示：20℃和300 mg·L-1综合处理下，生根时间最短，在30 d左右即可开始生根。
不同处理对凤丹种子生根率的影响见图 2。相同温度条件下，种子生根率随GA3质量浓度升高而升高。10℃条件下，对照及100 mg·L-1 GA3处理的种子未生根；200 mg·L-1和300 mg·L-1 GA3处理下，生根率也均低于10%。15℃条件下，200 mg·L-1GA3处理生根率最高，较300 mg·L-1 GA3处理差异显著（P＜0.05），但均低于20℃处理。20℃条件下，300 mg·L-1 GA3处理种子生根率最高，达到92%。
图 2 不同处理对凤丹种子生根率的影响Figure 2. Different treatments on the rooting rate of Paeonia ostii同一处理条件下，一般认为根长越长生根质量越好[8]。播种100 d后统计主根长＞5 cm的幼苗比例，结果如图 3。10℃条件下，不同质量浓度GA3处理，主根长＞5 cm的幼苗均较少或没有。15℃和20℃条件下，随着GA3质量浓度升高，主根长＞5 cm的幼苗比例均呈增长趋势。15℃条件下，200 mg·L-1 GA3质量浓度处理的主根长＞5 cm的幼苗数量最多，优良植株比例占68%。20℃条件下，300 mg·L-1 GA3处理，主根长＞5 cm的种子比例在92%以上，生根质量最好。
图 3 不同处理下主根长>5 cm的种子比例Figure 3. Proportion of seeds with 5 cm longer main root under different treatments综上可知，为了缩短凤丹种子萌发时间，提高种子萌发率和发芽质量，可以用20℃和300 mg·L-1 GA3同时诱导凤丹种子的萌发。
2.2 不同根长对低温条件下生根凤丹种子萌发的影响
HAO等[8]将根长1.5，3.0，4.5，6.0 cm的种子分别进行低温处理，结果表明：只有根长为6.0 cm的种子会萌发，低温处理只能打破根长为6.0 cm的种子的休眠。景新明等[5]认为只有根长大于3 cm的种子经过低温处理后才能萌发。林松明等[6]在打破凤丹种子上胚轴休眠的研究中将根长4 cm作为判断标准。本研究发现，当穴盘透气不良时，根长小于5 cm的种子易腐烂，根长大于5 cm的种子极少有腐烂现象。综合以上因素，本研究选择根长大于5 cm的生根种子作为低温打破上胚轴休眠的试验材料。
第24天时根长大于5 cm的种子上胚轴开始萌发，根长小于5 cm的种子第39天时开始萌发，差异显著（P＜0.05）。至60 d时，根长大于5 cm的种子萌发率达到80.67%，而根长小于5 cm的种子萌发率仅为32.17%，差异显著（P＜0.05）。故需低温处理打破生根凤丹种子上胚轴休眠时，选择根长＞5 cm者效果最佳。
表 1 不同根长对生根凤丹种子萌发的影响Table 1. Effect of different root length on rooted Paeonia ostii根长/cm 萌发时间/d 萌发率/% ≤5 38.67±1.53 a 32.17 ± 1.26 b >5 23.67±1.53 b 80.67 ±2.57 a 2.3 不同低温处理时间对生根凤丹种子萌发的影响
由图 4可知：生根凤丹种子随低温处理时间的增加，萌发所需的时间缩短，处理45 d时所需萌发时间最短，为9 d，此后随着低温处理时间的增加，所需萌发时间增加，但种子萌发率呈上升趋势。处理52 d后萌发率最高，达到84%，但耗时过长，且与低温处理30 d的萌发率差异不大，故以低温处理30 d较好。
图 4 不同低温处理时间对生根凤丹种子发芽的影响Figure 4. Effect of different cold treatments on seed germination of rooted Paeonia ostii低温处理45 d的生根种子需要9 d开始萌发，共耗时54 d，低温处理30 d的生根种子24 d后开始萌发，同样共耗时54 d，2种处理下萌发率差异不大，从生产角度考虑，30 d为适宜的低温处理时间。
2.4 下胚轴最膨大处直径及侧根数量对主根长大于5 cm凤丹种子萌发的影响
生根种子下胚轴最膨大处直径和侧根数量与种子萌发存在一定相关性，统计结果见表 2和表 3。
表 2 相关系数统计Table 2. Statistic table of correlation coefficients最膨大处直径 侧根数量 萌发时间 最膨大处直径 1 侧根数量 0.40 ± 0.13 1 萌发时间 -0.63 ± 0.02 -0.70 ± 0.01 1 表 3 下胚轴最膨大处直径及侧根数量对生根凤丹种子发芽的影响Table 3. Eifect of the largest-hypocotyl diameter and lateral root-number on germination of rooted Paeonia ostii萌发顺序 处理30d 处理45d 处理52d 直径/mm 侧根数量/根 萌发时间/d 直径/mm 侧根数量/根 萌发时间/d 直径/mm 侧根数量/根 萌发时间/d 1 3.23±0.02 5.00±0.00 24.00±1.00 a 3.48±0.02 18.33±0.58 9.00±1.00 a 2.59±0.02 10.00±0.00 15.00 ± 1.00 a 2 3.03±0.03 14.33±0.58 24.33±1.53 a 3.5±0.05 17.00±2.00 9.33±0.58 a 3.34±1.20 11.00±1.00 15.33±0.58 a 3 2.98±0.01 12.00±1.00 27.33±0.58 a 3.5±0.10 11.00±2.00 12.33±0.58 a 3.16±0.05 5.33±0.58 15.33±1.53 a 4 2.41±0.04 13.33±0.58 27.00±1.00 a 3.05±0.08 6.33±1.53 11.67±0.58 a 3.34±0.01 11.33±0.58 18.00±0.00 a 5 2.89±0.03 10.33±1.53 27.33±0.58 a 2.86±0.02 15.33±1.53 12.33±1.53 a 2.9±0.03 8.67±0.58 18.33±0.58 a 46 2.50±0.10 6.00±1.00 51.33±1.53 b 2.74±0.03 7.00±0.00 30.00±0.00 b 2.71±0.11 8.67±1.53 32.67±0.58 b 47 2.91±0.09 6.00±2.00 51.33±0.58 b 2.90±0.02 8.33±0.58 30.33±0.58 b 2.57±0.09 6.00±1.00 32.67±0.58 b 48 2.73±0.20 9.00±3.00 54.00±1.00 b 1.84±0.35 3.33±1.53 32.67±0.58 b 2.67±0.56 5.33±1.53 33.33±0.58 b 49 2.67±0.12 6.00±.002 54.33±1.53 b 2.49±0.10 1.33±0.58 33.33±1.53 b 2.85±0.02 8.00±0.00 36.00±1.00 b 50 2.53±0.05 5.00±1.00 57.00±2.00 b 2.56±0.15 6.33±1.53 36.00±2.00 b 2.82±0.04 2.00±0.00 39.00±2.00 b 表 2显示，最膨大处直径和侧根数量相关系数为0.40，相关性不显著；最膨大处直径和萌发时间的相关系数绝对值为0.63，呈显著负相关；侧根数量和萌发时间的相关系数绝对值为0.70，呈显著负相关。因此，下胚轴最膨大处直径对侧根数量影响较小，随着下胚轴最膨大处直径的增加，所需萌发时间缩短，随着侧根数量增加，所需萌发时间缩短。
表 3显示，同一处理天数下，如30 d，优先萌发的5粒生根种子下胚轴最膨大处直径达到3.0 mm或侧根数量大于10根，自24 d即开始萌发，而最后5粒种子则在51 d后萌发，它们下胚轴最膨大处直径＜3.0 mm且侧根数量小于10根，萌发所需时间明显长于前者。45和52 d处理的生根种子同样有此规律。故初步认定，生根种子下胚轴膨大至3.0 mm或侧根数量大于10根时，可以优先萌发。
3. 讨论
本研究发现，以20℃结合300 mg·L-1GA3处理穴盘内的凤丹种子，生根率最高，生根时间最短。这与刘心民[9]在15℃下处理同样穴盘内凤丹种子生根率最高的结论不一致；4℃处理30 d后可有效打破凤丹种子上胚轴休眠，处理时间越长萌发率越高，出苗整齐度也随之增加。这与张玉刚等[10]的报道基本一致，与郑相穆等[3]认为的凤丹种子低温（5℃）春化阶段所需的临界时间是60 d的研究不一致。但4℃处理时间过长会导致萌发时间延迟。低温打破凤丹种子上胚轴休眠的原理，可能是因为在低温春化期种子的内含物质发生了变化。周仁超等[11]推断紫斑牡丹Paeonia rockii种子萌发需要一定的营养支持，但其胚乳主要为脂类物质，不易水溶，难被胚吸收，低温后某些脂类物质发生了变化，成为易被胚吸收的物质，从而促进了种子的萌发。GA3处理亦能打破凤丹种子上胚轴休眠。林松明等[6]发现：300 mg·kg-1 GA3处理的凤丹种子萌发较快，只需31 d，这低于本实验从低温处理到萌发的54 d，但GA3处理的种子幼苗初期生长势强，生长迅速，且生长速度很快减慢，生长势变弱，而低温处理的种子幼苗萌发后一直保持较强的生长势头，且抗病能力强，从生产优质种苗的角度考虑，合适的低温处理时间是打破凤丹上胚轴休眠的最好方法。
主根长＞5 cm时打破上胚轴所需时间短，萌发率高，与景新明等[12]认为根长＞3 cm时才能打破休眠基本一致，但本实验发现生根的凤丹种子在根长＞5 cm时萌发率更高。林松明[13]的研究表明，根长达到4 cm时，胚的后熟已经完成，并生长到足以感受低温信号的体积，根长6~7 cm时胚中可溶性糖的含量急剧降低，上胚轴不再需要大量营养。这一结果验证了本实验将根长＞5 cm作为判断标准的可靠性。其中主根长＞5 cm且下胚轴最膨大处直径＞3.0 mm，或侧根数量达到10根或以上均可优先萌发。因此凤丹种子穴盘育苗中，20℃结合300 mg·L-1GA3处理，30 d左右即可生根，40 d后多数生根种子主根长＞5 cm，低温处理30 d后，下胚轴最膨大处直径＞3.0 mm或侧根数量达到10根的生根种子移入温室5 d后即可萌发。
采用容器育苗，可以促进凤丹根系的发育，有利于地上部的生长。Durgea等[14]认为，容器苗是所有苗型中最优良的苗型，也是成本最低的育苗体制。实验过程中发现，长时间不生根的种子在穴盘中容易腐烂，特别是根长＜5 cm的生根种子，低温处理移入温室后腐烂率较高，穴盘的透气性、基质含水量过高等原因可能导致这一状况的发生。完善穴盘的透气透水性，加强基质水分管理是将来实验需要改进的地方。
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图 1 牦牛骨钙溶液浓度对牦牛骨蛋白肽-钙螯合物稳定性的影响
Figure 1 Stability of yak bone peptides-calcium chelate prepared by different yak bone calcium solution
图 2 不同肉桂精油添加量对包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物稳定性的影响
Figure 2 Stability of yak bone peptides-calcium chelate prepared by different ratio of cinnamon essential oil
图 3 螯合物的粒径和多分散指数
Figure 3 Particle size and polydispersity coefficient of emulsion of cinnamon essential oil and yak bone peptides-calcium chelate
图 4 肉桂精油和螯合物对维氏气单胞菌的抑菌效果
Figure 4 Bacteriostatic effect of cinnamon essential oil and yak bone peptides-calcium chelate on Aeromonas veronii
表 1 感官评价评分标准
Table 1. Standard of sensory evaluation
评分 状态 色泽 香气 异味 协调性 7~9 分散均一，无分层、结块、沉淀 一致，无杂质、霉变 肉桂味浓郁、纯正 气味良好，
无不良风味气味协调 4~6 分散略不均一，无分层、结块、沉淀 不均，有杂质，无霉变 肉桂味较浓郁 稍有异味 气味较协调 1~3 分散不均一，有明显分层、结块、沉淀，
有油滴出现不均，有大量杂质，有霉变 肉桂味不突出 有明显异味 气味不协调 
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表 2 牦牛骨蛋白肽的分子量
Table 2. Molecular weight of yak bone peptides
t/min 分子量/kDa 占比/% ＜15.579 ≥3.0 0 15.579~＜16.363 2.0~＜3.0 0.040 16.363~＜17.688 1.0~＜2.0 4.094 17.688~＜18.508 0.5~＜1.0 34.211 ≥18.508 ＜0.5 61.656
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表 3 牦牛骨蛋白肽部分多肽序列鉴定结果
Table 3. Identification of partial peptides sequences of yak bone peptides
主要肽段 可信度 分子量/Da 质核比 功能 GPVGPVG 40.23 581.317 3 582.324 1 SVPGPMG 32.33 643.299 9 644.306 6 VPGPMGP 31.42 653.320 7 654.326 5 APGPVGPAG 34.80 721.375 9 722.382 3 AP(+15.99)GPVGPAG 31.27 737.370 8 738.377 4 羟基化 FP(+15.99)GADGVA 34.14 748.339 1 749.345 7 羟基化 VP(+15.99)GPMGPS 33.76 756.347 6 757.356 1 羟基化 SDGSVGPVG 36.97 773.355 5 774.362 2 SP(+15.99)GN(+0.98)IGPAG 33.70 785.355 5 786.362 5 羟基化 GAAGPTGPIG 30.08 796.407 9 797.415 6 TPGPQ(+0.98)GIAG 30.34 797.391 9 798.399 9 脱酰胺 LPQPPQE 31.34 807.412 7 808.419 7 IQ(+0.98)GPP(+15.99)GPAG 30.19 809.391 9 810.398 9 脱酰胺，羟基化 AP(+15.99)GPQ(+0.98)GFQ 31.21 817.360 6 818.366 5 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GPVGPAG 33.96 820.407 9 821.415 4 羟基化 GP(+15.99)AGPIGPVG 34.90 836.439 1 837.445 6 羟基化 GPVGPTGPVG 37.77 836.439 2 837.445 6 TP(+15.99)GPQGLLG 31.36 854.449 8 855.456 9 羟基化 GASGPP(+15.99)GFVG 31.32 860.402 8 861.412 9 羟基化 GPQ(+0.98)GPVGPVG 31.77 864.434 1 865.440 8 脱酰胺 GIQGPP(+15.99)GPAG 30.73 865.429 3 866.436 9 羟基化 AGPSGPAGPTG 36.13 867.408 6 868.415 5 GPP(+15.99)GLQ(+0.98)GVQ 33.31 868.429 0 869.436 0 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GPMGPPG 42.39 878.395 6 879.402 2 羟基化 TGPIGPP(+15.99)GPA 41.22 878.449 8 879.457 6 羟基化 GPP(+15.99)GPIGNVG 33.95 879.445 0 880.452 9 羟基化 GPP(+15.99)GPIGN(+0.98)VG 32.42 880.429 0 881.436 0 羟基化，脱酰胺 GPP(+15.99)GFP(+15.99)GAVG 34.44 886.418 5 887.424 9 羟基化 VGPAGPN(+0.98)GFA 40.33 886.418 5 887.425 0 脱酰胺 AGPP(+15.99)GPTGPAG 31.53 893.424 3 894.431 5 羟基化 AAGPP(+15.99)GPTGPA 34.87 907.439 9 908.446 5 羟基化 VGPAGPN(+0.98)GFAG 38.51 943.439 9 944.445 9 脱酰胺 APGAPGPVGPAG 30.84 946.487 2 947.493 7
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表 4 感官评价结果
Table 4. Artificial sensory evaluation results
感官特性 包埋肉桂精油的牦牛骨
蛋白肽-钙螯合物/分肉桂精油稀释液/分 感官特性 包埋肉桂精油的牦牛骨
蛋白肽-钙螯合物/分肉桂精油稀释液/分 状态 7.60±0.70 b 8.65±0.47 a 异味 7.10±0.99 b 8.00±0.67 a 色泽 8.15±0.34 a 8.25±0.59 a 协调性 6.10±0.88 b 8.15±0.34 a 香气 7.15±1.00 a 4.35±0.82 b 平均 7.22 7.48 说明：不同字母表示样品间差异显著(P＜0.05)
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