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秀珍菇Pleurotus geesteranus是一种常见的食用菌[1]，营养丰富、味道鲜美。但秀珍菇采后易发生病害而造成品质下降，常温下仅能储藏2~3 d[2]。微生物侵染是秀珍菇储藏过程中品质下降的主要原因。秀珍菇由于质地脆嫩，品质易受温度影响，传统低温储藏虽能在一定程度上延长秀珍菇保鲜期，但易产生低温冷害，无法长期保存[3-4]。食用菌采后病害影响其储藏品质，不同种类食用菌的致病菌不同，哈茨木霉Trichoderma harzianum是引发金针菇绿霉病的主要致病菌，托拉斯假单胞杆菌Pseudomonas tolaasii能够引发双孢菇湿泡病等[4]。
植物精油是一类从植物中提取的次生代谢物质，具有广谱的抑菌性，易于生物降解和相对安全的特性，近年来在果蔬采后病害防治领域应用广泛[5-6]，但在食用真菌的防腐保鲜研究较少。具有采后病害控制作用的植物精油主要有香茅Mosla chinensis精油、桉Eucalyptus robusta精油、甜橙Citrus sinensis精油等，在果蔬的防腐保鲜中均有较好的防治效果[7-9]，精油是具有潜在应用价值的生物防治保鲜剂[10-12]，不同的精油对各类果蔬采后致病菌的防治效果不尽相同。本研究对秀珍菇采后储藏中的主要病原菌进行分离鉴定，筛选有效精油对其进行抑制，以期为植物精油的秀珍菇采后保鲜提供理论依据。
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秀珍菇采自浙江杭州临安鼎新农业科技有限公司；精油购于江西国光香料厂(纯度＞99%)，主要来自檀香Santalum album、艾蒿Artemisia argyi、石菖蒲Acorus tatarinowii、甜橙、香茅、洋甘菊Anthemis nobilis、青蒿Artemisia annua、柏木Cupressus funebris、大蒜Allium sativum、橘Citrus reticulata、花椒Zanthoxylum bungeanum、茴香Foeniculum vulgare、桉等植物。
培养基有马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，上海博微生物科技有限公司)和马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB，上海博微生物科技有限公司)。
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主要仪器有LDZX50KBS立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械)、智能光照培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂)、SW-CJ-IC型双人单面净化工作台(苏州苏信环境科技有限公司)、HI2315型高精度电导率仪(北京哈纳科科技有限公司)、Sigma 500扫描电子显微镜(德国)、HZ-2111KA恒温摇床(华利达实验设备公司)。
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用无菌手术刀在秀珍菇发病处切取病害和健康交界处的组织，用体积分数为75%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分后置于PDA平板中心，28 ℃培养3~5 d至组织发病。用无菌接种针挑取病症表面菌丝，置于PDA平板中心，28 ℃培养5 d后，挑取边缘菌丝纯化接种，直至菌落单一。出现单一菌落后，接入PDA斜面试管，用甘油封存后置于4 ℃冰箱保存。
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根据柯赫氏法则，确定秀珍菇致病性。挑取健康无病害，无机械损伤，大小均一的秀珍菇，采用针刺法将纯化后的菌丝回接至秀珍菇表面。置于室温(25 ℃)培养，观察发病情况，以不接菌丝作为对照。发病后进行致病菌的分离纯化，方法同1.3.1。判断发病后纯化的菌株与回接的菌株是否一致，如一致，则进行下一步试验。
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将试管中保存的菌丝活化，接种于PDA平板中，于28 ℃下培养，每天观察菌落特征，产孢后在菌落边缘挑取适量菌丝，在光学显微镜下观察菌丝及孢子形态，并根据其形态学特征初步判断其种属。
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将培养4~5 d的平板，委托上海生工生物技术有限公司进行序列测定。内部转录间隔区(ITS)序列扩增引物为ITS1和ITS4[13]，其引物序列为ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGGC-3′；ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，测序所得rDNA序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上，利用BLAST将ITS序列与数据库中的序列进行对比，寻找同源性较大的物种，下载其序列，利用MEGA软件构建该菌株的系统发育树，并根据其序列的相似度，确定其所属物种。
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将不同种类的精油配制成体积分数为500 μL·L−1的PDA平板，用无菌打孔器在病原菌平板上打取直径6 mm的菌饼，放入平板中央，28 ℃培养至6 d时，用游标卡尺测量菌落直径并记录[14-15]。设置3次重复。
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用无菌打孔器在病原菌平板上打取直径6 mm 的菌饼，放入PDA平板中央，28 ℃培养，定期观察菌落，用游标卡尺测量菌落直径并记录[16-17]，设置3次重复。
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将孢子悬浮液分别混合于体积分数为0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L−1的石菖蒲精油和质量浓度为1.0%的葡萄糖混合溶液中，将上述混合溶液50 µL分别滴入双凹载玻片，置于培养皿中(直径 200 mm)，25 ℃保湿培养，6、12、18 h时在显微镜下观察孢子萌发情况，每个处理镜检孢子数为200 个，以芽管长度超过孢子直径一半计为孢子萌发[18]，设置3次重复。孢子萌发率计算公式为：孢子萌发率=(萌发孢子数/检查孢子总数)×100%
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①丙二醛(MDA)质量摩尔浓度测定。将体积分数为0.1%的吐温80与石菖蒲精油混合充分后乳化，在PDB中加入一定量的孢子悬浮液，使孢子终浓度为109 CFU·L−1。分别抽滤取5 g菌丝在体积分数为0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L−1石菖蒲精油的PBS缓冲液中培养，0、2、4、6、8、10 h后取0.2 g菌丝冰浴研磨，加入1 mL无菌双蒸水提取，4 ℃ 10 000 r·min−1，20 min离心取上清液，采用硫代巴比妥酸法测定吸光度。②相对电导率测定。抽滤取5 g PDB中的菌丝在不同体积分数(0、250、500、750、1 000 μL·L−1)的石菖蒲精油-PBS缓冲液中培养，分别在0、10、20、40、60、120、180 min取样测定电导率，并计算相对电导率[19]，设置3次重复。
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将菌丝(湿质量2 g)加入到体积分数为0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L−1的石菖蒲精油无菌水中，28 ℃下摇床培养，分别于1、2、3、4、5 h后收集上清液测量可溶性碳水化合物、可溶性蛋白和核酸泄漏量[20]，设置3次重复。以蔗糖为标准，使用蒽酮试剂法测量藤仓镰刀菌可溶性碳水化合物的泄漏程度；使用蛋白质检测试剂盒(生工生物技术有限公司，上海)检测可溶性蛋白泄漏程度；通过检测上清液在波长260 nm处的吸光度D(260)来判断核酸的泄漏程度，设置3次重复。
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菌丝固定采用戊二醛、锇酸的双重固定法。取适量0、500 μL·L−1的石菖蒲精油平板上生长的菌丝边缘部分，浸泡于体积分数为3%的戊二醛溶液中，20 ℃固定，过夜后用pH 6.8的PBS缓冲液冲洗15 min，而后用体积分数为1%的锇酸溶液4 ℃固定2 h，再经乙醇梯度脱水、包埋、聚合、切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后置于透射电镜下观察[21]。
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采用GraphPad Prism 8进行绘图，通过SPSS 24.0单因素方差分析进行数据统计及差异显著性分析，显著性水平为0.05。
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如图1A所示：在秀珍菇20 ℃储藏2 d出现病症后，根据组织分离法分离致病菌，按照不同的菌落形态和生长特征，分离到3株致病菌。
图 1 秀珍菇致病菌病症与形态
Figure 1. Pathogen disease and morphology of P. geesteranus
根据科赫氏法则，将分离的3株真菌回接至经过表面灭菌的秀珍菇上进行验证，发现仅1株菌株出现了与病症相似的表现(图1B)。再取回接发病病症处的菌丝进行纯化培养，观察到与其形态一致，证明该菌株为秀珍菇主要致病菌。
由图1C~E可见：菌落规则，圆形，棉絮状或毛毡状，菌丝体初期白色，生长旺盛，后期成淡黄色，菌丝有隔，分枝，大型分生孢子呈镰刀形或纺锤形，有隔膜，呈无色或透明。与镰刀菌属形态学基本一致。将测序所得的序列，利用NCBI网站的BLAST在线对比，将ITS序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行对比分析(图2)，发现ITS序列与KJ605159.1 Fusarium fujikuroi strain GF3、MT982185.1 镰刀菌属Fusarium sp. isolate SZMC27192、MN747996.1 层生镰刀菌Fusarium proliferatumi isolate SC2.2、KF999820.1 Fusarium sp. CHJ2、MN871556.1 甜瓜镰刀菌Fusarium incarnatum clone LS760、MW405882.1 Fusarium proliferatumi isolate、KP893211.1 Fungal sp.、MT530228.1丛赤壳属Nectriaceae sp.、KT351627.1 Fusarium sp. T28、MN947247.1 Fusarium fujikuroi isolate DL3.2、MW599749.1 尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum strain DHRL-04有不同程度的相似，对比发现该菌株与KJ1605159.1 Fusarium fujiuroi strain GF3同源性达99%，基本确定该菌株为藤仓镰刀菌。另外，选取几株同源性不同的序列，下载序列利用Neighbor-Joining方法构建系统发育树。由图2可知：该菌株与藤仓镰刀菌聚为一支，有非常近的亲缘关系。结合形态学特征与生物学鉴定结果分析，确定该致病菌为藤仓镰刀菌。
图 2 ITS基因序列构建的系统发育树
Figure 2. Phylogenetic tree based on ITS sequence
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如图3所示：培养5 d后，藤仓镰刀菌在不同精油平板上的菌落直径不同，菌落直径越小表征菌丝生长越缓慢，则该精油的抑制效果越好。石菖蒲精油在13种精油中对藤仓镰刀菌的抑制效果最佳，故选择石菖蒲精油进一步研究。
图 3 植物精油对藤仓镰刀菌的抑制率
Figure 3. Inhibition rate of plant essential oil against F. fujikuroi
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由图4可知：250 μL·L−1的石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝生长有明显的抑制效果，培养4 d后不同体积分数处理的菌丝生长存在显著差异(P＜0.05)，1 000 μL·L−1的石菖蒲精油能完全抑制藤仓镰刀菌的生长，且转接至无精油PDA平板后依旧不生长。可确定石菖蒲精油对藤仓镰刀菌的半数效应体积分数(抑菌率达50%的体积分数为半数效应体积分数，EC50)为500 μL·L−1，最小抑菌体积分数为1 000 μL·L−1。
图 4 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝生长的影响
Figure 4. Effects of A. tatarinowii essential oil on mycelial growth of F. Fujikuroi
如图5所示：随着石菖蒲精油体积分数的升高，藤仓镰刀菌孢子萌发率显著降低(P＜0.05)。处理18 h以后，对照组孢子萌发率达85.7%，而750和1 000 μL·L−1石菖蒲精油处理组孢子萌发率分别为4.2%和0，孢子萌发抑制率分别为95.1%和100.0%。表明在一定体积分数范围内，石菖蒲精油能显著抑制藤仓镰刀菌孢子的萌发。
图 5 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌孢子的影响
Figure 5. Effects of A. tatarinowii essential oil on colony diameter of F. Fujikuroi
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用相对电导率来表征膜通透率，相对电导率越高，膜通透性越大。如图6A所示：藤仓镰刀菌相对电导率随着石菖蒲精油体积分数的升高而升高。处理组在80 min后显著高于对照组(P＜0.05)。3 h后对照组相对电导率为23.2%，而1 000 μL·L−1石菖蒲精油处理组的相对电导率达55.1%。表明精油处理可显著提高藤仓镰刀菌的相对电导率(P＜0.05)，从而可进一步增加高藤仓镰刀菌的膜通透性。
图 6 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌相对电导率和MDA的影响
Figure 6. Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi Relative conductivity and MDA content
MDA是细胞膜脂过氧化的产物，可以反映细胞膜脂过氧化的程度，是指示膜系统受伤的重要指标之一。如图6B所示：经过石菖蒲精油处理的藤仓镰刀菌，MDA质量摩尔浓度显著高于对照，1 000 μL·L−1石菖蒲精油处理组在10 h后MDA质量摩尔浓度是对照的3倍。表明石菖蒲精油能够破坏细胞脂膜结构，从而导致MDA质量摩尔浓度上升，加速菌丝细胞的膜脂过氧化。
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细胞内容物出现在培养液中说明细胞的质膜受到了破坏，也是细胞膜损伤的重要表征指标。如图7所示：培养液中可溶性蛋白、核酸、可溶性碳水化合物随着精油处理时间的延长都有不同程度的上升。表明经石菖蒲精油处理后，细胞内容物出现不同程度泄漏，且随着精油体积分数的增大而升高。说明精油处理能够破坏脂膜结构，从而导致细胞内容物泄漏。
图 7 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌可溶性碳水化合物、可溶性蛋白、核酸泄漏量的影响
Figure 7. Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi relative soluble carbohydrate, soluble protein content, nucleic acid leakage
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采用扫描电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响，发现未经精油处理的菌丝表面光滑，存在孢子丛(图8A)。精油处理后(图8B)的菌丝皱缩，无孢子产生。进一步说明石菖蒲精油能够破坏藤仓镰刀菌菌丝结构，影响菌丝正常生长，并抑制孢子的产生。本研究结果与顾可飞等[13]发现精油可造成真菌菌丝畸形或使真菌菌丝断裂的结论基本一致。
图 8 扫描电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响
Figure 8. Sem observation of the effect of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi mycelium structure
进一步采用透射电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌细胞超微结构的影响，发现未经精油处理的细胞形态完整，质膜均匀，细胞壁清晰(图9A)。经石菖蒲精油处理的菌丝细胞膜和核膜破坏严重，细胞各结构也有较大破坏(图9B)。表明石菖蒲精油的抑菌机制可能是通过破坏藤仓镰刀菌细胞膜的完整性，暴露和侵蚀细胞器，造成细胞损伤，最终导致细胞死亡。
图 9 透射电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响
Figure 9. Effect of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi mycelium structure observed by transmission electron microscopy
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本研究对秀珍菇的采后致病菌进行分离，根据科赫氏法则确定其致病性，在形态上致病菌菌落呈白色，后期为淡黄色，菌丝有隔有分支，孢子呈镰刀型，在形态学上对比发现其与镰刀菌形态学描述一致；利用rDNA-ITS序列对比和系统发育树分析的方法，发现致病菌与藤仓镰刀菌相似度达99%，由此确定藤仓镰刀菌为秀珍菇采后储藏中的主要致病真菌，该菌在百香果Passiflora eduli[22]、樱桃番茄Lycopersicon esculentum var. cerasiforme[23]等农产品均见报道，是较为常见的致病菌。
研究13种常见植物精油对对藤仓镰刀菌抑制效果时发现：石菖蒲精油对藤仓镰刀菌控制效果最佳，其EC50为500 μL·L−1，最小抑菌体积分数为1 000 μL·L−1。相同体积分数处理下，石菖蒲精油对孢子萌发的抑制率高于对菌丝生长的抑制率，说明藤仓镰刀菌孢子对石菖蒲精油的敏感度更高，这与PEI等[24]探究香芹酚对炭疽菌的抑制效果相似。
经对藤仓镰刀菌培养液中MDA和相对电导率变化情况的观测，发现石菖蒲精油的处理可使藤仓镰刀菌的胞内MDA质量摩尔浓度增加，MDA质量摩尔浓度和相对电导率是表征菌丝细胞膜脂过氧化程度和细胞膜结构破坏程度的重要指标[25]，MDA质量摩尔浓度增加表明石菖蒲精油能够加速藤仓镰刀菌的膜脂氧化，加剧细胞内物质的外泄；而扫描电镜和透射电镜结果也显示藤仓镰刀菌菌丝表面出现褶皱，菌丝细胞壁膜被破坏。LIU等[26]研究表明：香草精油的抗真菌活性是由于其能够破坏细胞膜结构。PEI等[24]发现：香芹酚能够使炭疽菌细胞膜通透性增加。本研究表明：石菖蒲精油能够有效抑制藤仓镰刀菌作用机制，破坏藤仓镰刀菌膜系统结构，引起内容物泄漏，进而导致菌体死亡。
Identification of postharvest pathogenic bacteria and the bacteriostasis of plant essential oil for Pleurotus geesteranus
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摘要:
目的 分离鉴定秀珍菇Pleurotus geesteranus采后的主要致病菌，寻找有效防治真菌病害的植物精油抑菌方法，为秀珍菇采后的保鲜技术提供参考。 方法 以秀珍菇采后分离鉴定的主要病原真菌为防治对象，在常见的13种精油中筛选有效精油，分析精油对采后主要病原菌菌丝生长、孢子萌发、菌丝形态结构及其细胞膜脂过氧化和细胞内容物外泄程度的影响，以不使用精油为对照，研究防治作用机制。 结果 秀珍菇采后主要病原真菌为藤仓镰刀菌Fusarium fujiuroi。在13种备选精油中，石菖蒲Acorus tatarinois精油对藤仓镰刀菌具有良好的抑制效果。石菖蒲精油体积分数为1 000 μL·L−1时能够完全抑制藤仓镰刀菌的生长，且在此范围内体积分数越高，抑菌效果越好。石菖蒲精油能够提高藤仓镰刀菌细胞膜的通透性，当体积分数为1 000 μL·L−1的石菖蒲精油处理3 h后，藤仓镰刀菌相对电导率、丙二醛和细胞内容物泄漏量分别为对照组的2、5和3倍。扫描电镜和透射电镜观察结果表明：石菖蒲精油能改变藤仓镰刀菌菌丝形态并破坏其细胞结构。 结论 石菖蒲精油能够加剧藤仓镰刀菌菌丝细胞膜脂过氧化，破坏菌丝结构，进而加速细胞凋亡，从而抑制藤仓镰刀菌的生长繁殖。图9参26 Abstract:Objective This study, with the main pathogens of Pleurotus geesteranus after harvest isolated and identified, is aimed to investigate the antibacterial activities of plant essential oil that effectively prevent and control fungal diseases so as to provide reference for the development of preservation technology of P. geesteranus after harvest. Method With major pathogenic fungi isolated and identified from P. geesteranus as the research objects of prevention and control, the most effective essential oils were screened out from 13 kinds of common essential oils before an analysis was conducted of their effects on the mycelial growth, conidia germination, mycelial morphology and structure, membrane lipid peroxidation and leakage of cell contents of the main postharvest pathogens in order to study the mechanism of prevention and treatment. The control group was treated without essential oil. Result Among the 13 alternative essential oils, Acorus tatarinowii essential oil had a good inhibitory effect on Fusarium fujiuroi and the growth of F. fujikuroi could be completely inhibited by 1 000 μL·L−1 A. tatarinowii essential oil with the concentration of essential oil positively correlated with the antifungal effect. After the treatment with 1 000 μL·L−1 essential oil for 3 h, the relative conductivity, MDA and cell contents in the cultured liquid of F. fujikuroi were 2 times, 5 times and 3 times of those in the control group, respectively. According to the results of scanning electron microscopy and transmission electron microscopy, the essential oil of A. tatarinowii could change F. fujikuroi mycelium morphology and destroy its cell structure. Conclusion A. tatarinowii essential oil could accelerate the membrane lipid peroxidation of mycelia cells, increase the permeability of cell membrane, destroy the normal physiological function of cells and cause cell death, thereby inhibiting the growth and reproduction of F. fujikuroi. [Ch, 9 fig. 26 ref.] -
森林与湿地、海洋并称为全球三大生态系统，被誉为“地球之肺”“绿色水库”和“物种基因库”[1]。森林生态系统是陆地生态系统中面积最大、组成结构最复杂、生物种类最丰富、适应性最强、稳定性最大、功能最完善、与人类生存发展关系最密切的一种自然生态系统，对改善和维护生态环境起着决定性的作用[2-3]。森林不仅能够为人类提供清新的空气、清洁的水源和舒适宜人的气候环境等生态产品，还能够提供保持水土、涵养水源、防风固沙、调节气候、生物多样性保育等生态服务[4]。CONSTANZA等[5]对全球生态系统服务价值进行较为全面的评估，算出全球陆地生态系统服务功能平均每年的价值高达33万亿美元，相当于当年全世界国民生产总值的1.8倍，不仅在国际上引起了广泛关注，而且掀起了对生态系统服务价值研究的热潮。联合国千年生态系统评估组(millennium ecosystem assessment，MA)开展了全球尺度和33个地区的生态系统与人类福利的研究，对生态系统的内涵、分类、评价基本理论和方法均进行了深入的阐述，极大推进了生态系统服务在世界范围内的理论方法及应用方面的研究[6]。侯元兆等[7]在国外生态服务价值评估的基础上，第1次估算出中国森林资源的价值约13.7万亿元，开创了国内森林生态系统生态服务价值评估的先河。有学者分别从不同尺度对中国、浙江省、泰顺县的森林生态系统服务价值进行评估[8-10]。也有学者分别对草原、湿地、森林等不同类型的生态系统进行价值评估[11-14]。本研究依据LY/T 1721−2008《森林生态系统服务功能评估规范》[15]，对乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的物质量及价值量进行评估，有助于增进人们对森林环境的保护意识以及对自然保护区的重视程度。
1. 研究区概况
乌岩岭国家级自然保护区(27°20′52″~27°48′39″N，119°37′08″~119°50′00″E)地处浙江省泰顺县西北部，总面积约18 861.5 hm2，其中林业用地17 605.1 hm2，占土地总面积的93.3%。乌岩岭在全球陆生生物圈的地带生物群落分类中属于热带、暖温带交错区，由于地理位置处于28°N附近的敏感区，且靠近太平洋，加上保护区西北面高山阻隔，温度偏高。乌岩岭有775属种子植物，其中，包括中国种子植物属的15个分布区类型。乌岩岭国家级自然保护区是中国—日本森林植物亚区华东区与华南区过渡地带，无论是地形、地势、气候等非生物因素和动植物种群都呈现明显过渡性。乌岩岭国家级自然保护区被誉为物种基因库，森林覆盖率为92.8%，其中阔叶林蓄积量达28 万m3以上，所占比例为45%，是华东地区保存最完善的大面积原生性中亚热带常绿阔叶林[16]。
2. 研究方法
2.1 数据来源
数据来源有乌岩岭国家级自然保护区典型森林样地调查数据(2017年)、乌岩岭国家级自然保护区森林资源二类清查数据(2017年)、泰顺县气象局监测数据和中华人民共和国林业行业标准LY/T 1721−2008《森林生态系统服务功能评估规范》。不同类型林分净生产力和土壤年固碳量采用华东地区森林生态系统定位站的观测数据[17]。
2.2 评估内容与指标体系
依据LY/T 1721−2008《森林生态系统服务功能评估规范》，同时结合乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统的实际情况，本次评估选取固碳释氧、涵养水源、积累营养物质、保育土壤、净化大气环境、生物多样性保护等6项服务15项指标(表1)，并从物质量和价值量2个方面对乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务进行评估。
表 1 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务评估指标体系Table 1 Evaluation index system of forest ecosystem service in Wuyanling National Nature Reserve服务类别 评估指标 涵养水源 调节水量、净化水质 保育土壤 固土、保肥 固碳释氧 固碳、释氧 积累营养物质 林木营养积累(氮、磷、钾) 净化大气环境 负离子量、二氧化硫量、氟化物量、氮氧化物量、滞尘量 生物多样性保护 物种保育 2.3 评估方法
参照LY/T 1721−2008《森林生态系统服务功能评估规范》，对以上指标进行评估。乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的物质量结合表2计算得出，价值量结合表3计算得出。林分类型分为针叶林(杉木Cunninghamia lanceolata林、马尾松Pinus massoniana林、柳杉Cryptomeria fortunei林)，常绿阔叶林，针阔混交林，经济林(主要为茶树Camellia sinensis、猕猴桃Actinidia chinensis林)，竹林。
表 2 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务物质量的参数数据Table 2 Material quality parameter data of forest ecosystem services in Wuyanling National Nature Reserve涵养水源 保育土壤 积累营养物质 林分类型 地表径
流量/
mm林分蒸
散量/
mm土壤侵
蚀模数/
(t·hm−2·a−1)土壤
容重/
(t·m−3)土壤
氮/%土壤
磷/%土壤
钾/%土壤
有机
质/%氮/% 磷/% 钾/% 针叶林 马尾松林 5.70 916.08 0.11 1.396 0.090 0.084 1.293 2.156 0.325 0.160 0.680 杉杉木林 5.70 1 072.92 0.16 1.200 0.096 0.082 1.333 2.516 0.324 0.165 0.700 柳杉林 5.70 1 072.92 0.11 0.956 0.081 0.087 1.342 3.270 0.324 0.165 0.700 常绿阔叶林 2.60 667.63 0.14 0.901 0.149 0.088 1.333 3.391 0.237 0.972 1.390 针阔混交林 2.60 966.05 0.13 1.372 0.090 0.075 1.233 3.059 0.280 0.566 1.0325 经济林 6.30 914.69 0.13 1.407 0.154 0.119 1.073 3.139 0.180 0.072 0.390 竹林 6.30 902.20 0.11 1.242 0.138 0.109 1.109 3.256 0.031 0.012 0.562 净化大气环境 生物多样性保护 林分类型 负离子量/
(个·cm−3)平均树
高/m吸收二氧
化硫量/
(kg·hm−2·a−1)吸收氟
化物量/
(kg·hm−2·a−1)吸收氮氧
化物量/
(kg·hm−2·a−1)滞尘量/
(kg·hm−2·a−1)香农-威纳
多样性指数针叶林 马尾松林 6 678 13.75 117.60 4.65 6.0 33 200 2.29 杉木林 4 880 13.36 117.60 4.65 6.0 33 200 0.83 柳杉林 7 335 16.83 117.60 4.65 6.0 33 200 1.62 常绿阔叶林 24 175 14.02 88.65 2.58 6.0 21 655 3.03 针阔混交林 9 825 11.50 152.13 2.58 6.0 21 655 2.03 经济林 877 1.20 152.13 2.58 6.0 21 655 0.45 竹林 11 753 14.06 152.13 2.58 6.0 21 655 0.84 说明：年平均降水量采用保护区2010−2016年生态站监测数据，为2 405.36 mm·a−1；无林地水土流失土壤年侵蚀模数参照中国科 学院观测点泥沙流失量，为17.66 t·hm−2·a−1[18]。土壤氮、土壤磷、土壤钾、土壤有机质、氮、磷、钾均为质量分数 表 3 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务价值量的参数数据Table 3 Value parameter data of forest ecosystem services in Wuyanling National Nature Reserve单位库容
造价/(元·t−1)水质净化费用/
(元·t−1)运输和挖取单位
体积的土方花费/
(元·m−3)磷酸二铵化肥
价格/(元·t−1)氯化钾化肥
价格/(元·t−1)有机质价格/
(元·t−1)固碳费用/
(元·t−1)6.11 2.09 12.60 2 400.00 2 200.00 320.00 1 200.00 氧气制造
费用/(元·t−1)负离子制造
费用/(10−18元·个−1)二氧化硫排
污费/(元·kg−1)氟化物排
污费/(元·kg−1)氮氧化物排
污费/(元·kg−1)滞尘排污费/
(元·kg−1)1 000.00 9.46 1.85 0.69 0.97 0.23 3. 评估结果与分析
3.1 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的物质量
由表4可知：2017年乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统净化大气环境服务的物质量最大，其次为涵养水源的物质量，为3.99×108 m3。
表 4 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的物质量Table 4 Material quality of ecosystem services in Wuyanling National Nature Reserve林分类型 固碳量/
(t·a−1)释氧量/
(t·a−1)固碳释氧量/
(t·a−1)调/净水量/
(m3·a−1)积累营养物质量/
(t·a−1)固土量/
(t·a−1)针叶林 马尾松林 5.96×103 1.19×104 1.78×104 4.75×107 1.16×104 5.62×104 杉木林 2.20×104 4.82×104 7.02×104 7.57×107 4.82×104 9.99×104 柳杉林 9.78×102 2.25×103 3.23×103 2.77×106 2.25×103 3.67×103 常绿阔叶林 3.91×104 9.19×104 1.31×105 1.97×108 2.01×105 1.99×105 针阔混交林 9.84×102 1.97×103 2.95×103 5.71×106 3.10×103 6.97×103 经济林 4.58×101 1.04×102 1.50×102 2.55×105 6.07×101 3.02×102 竹林 2.50×104 6.08×104 8.58×104 7.00×107 3.23×104 8.21×104 均值 1.34×104 3.10×104 4.45×104 5.70×107 4.26×104 6.40×104 合计 9.41×104 2.17×105 3.11×105 3.99×108 2.98×105 4.48×105 林分类型 保肥量/
(t·a−1)负离子量/
(个·a−1)二氧化硫/
(kg·a−1)氟化物/
(kg·a−1)氮氧化物量/
(kg·a−1)滞尘量/
(kg·a−1)针叶林 马尾松林 2.04×105 1.55×1023 3.77×105 1.49×104 1.92×104 1.06×108 杉木林 4.02×105 1.96×1023 6.71×105 2.65×104 3.43×104 1.90×108 柳杉林 1.75×104 1.36×1022 2.46×104 9.72×102 1.25×103 6.94×106 常绿阔叶林 9.88×105 2.02×1024 1.01×106 2.93×104 6.82×104 2.46×108 针阔混交林 3.10×104 2.36×1022 6.04×104 1.03×103 2.38×103 8.60×106 经济林 1.34×103 9.51×1018 2.62×103 8.00×101 1.03×102 3.72×105 竹林 3.78×105 4.06×1023 7.11×105 1.21×104 2.81×104 1.01×108 均值 2.89×105 4.03×1023 4.08×105 1.21×104 2.19×104 9.42×107 合计 2.02×106 2.82×1024 2.85×106 8.49×104 1.53×105 6.59×108 3.2 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的价值量
由表5可知：2017年乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的总价值为100.24×108元·a−1，单位面积生态服务价值为3.92×105元·hm−2·a−1。马尾松林、常绿阔叶林、针阔混交林、杉木林、柳杉林、经济林、竹林生态服务价值分别为1.00×109、5.33×109、1.34×108、1.93×109、7.59×107、5.32×106和1.55×109元·a−1。马尾松林、常绿阔叶林、针阔混交林、杉木林、柳杉林、经济林、竹林的单位面积生态服务价值分别为3.21×105、4.69×105、3.36×105、3.38×105、3.63×105、3.10×105、3.31×105、3.51×105和3.92×105元·hm−2·a−1。
表 5 乌岩岭国家级自然保护区森林生态系统服务的价值量Table 5 Value quality of ecosystem services in Wuyanling National Nature Reserve生态系统服务价值量/(元·a−1) 单位面积
生态服务
价值/
(元·hm−2·a−1)林分类型 固碳释
氧价值生物多样性
保护价值涵养水
源价值积累营养
物质价值保育土
壤价值净化大
气价值生态服务
总价值针叶林 马尾松林 1.90×107 3.20×107 3.90×108 8.15×107 4.50×108 2.76×107 1.00×109 3.21×105 杉木林 7.46×107 1.71×107 6.21×108 3.36×108 8.34×108 4.65×107 1.93×109 3.38×105 柳杉林 3.43×106 1.05×106 2.28×107 1.57×107 3.12×107 1.76×106 7.59×107 3.63×105 常绿阔叶林 1.39×108 2.27×108 1.62×109 1.43×109 1.85×109 7.72×107 5.33×109 4.69×105 针阔混交林 3.15×106 3.97×106 4.68×107 2.20×107 5.54×107 2.30×106 1.34×108 3.36×105 经济林 1.59×105 5.16×104 2.09×106 4.17×105 2.51×106 9.07×104 5.32×106 3.10×105 竹林 9.08×107 1.40×107 5.74×108 1.51×108 6.88×108 2.83×107 1.55×109 3.31×105 均值 4.71×107 4.22×107 4.68×108 2.90×108 5.59×108 2.63×107 1.43×109 3.51×105 合计 3.30×108 2.96×108 3.27×109 2.03×109 3.91×109 1.84×108 1.00×1010 3.92×105 保护区森林生态系统服务价值所占比例分别为保育土壤39.00%、涵养水源32.65%、积累营养物质20.27%、固碳释氧3.29%、生物多样性保护2.95%、净化大气环境1.83%。可见，保育土壤、涵养水源和积累营养物质是乌岩岭森林生态系统主要的服务价值，三者比例之和高达91.92%，占据绝对优势。
保护区不同森林类型生态系统服务价值从大到小依次为常绿阔叶林、杉木林、竹林、马尾松林、针阔混交林、柳杉林、经济林，其对应的生态系统服务价值所占比例分别为53.20%、19.24%、15.43%、9.98%、1.33%、0.76%、0.05%。可见，常绿阔叶林对乌岩岭森林生态系统服务价值贡献在50%以上，占绝对地位。
4. 讨论
乌岩岭国家级自然保护区不同森林类型的生态服务价值与单位面积服务价值的排序并不一致，这说明生态系统服务价值除受各林分面积大小的影响外，还受林分的结构、活力、生态力的影响[19-21]。常绿阔叶林的单位面积生态服务价值远远高于其他林分，因此可在森林总面积保持不变的情况下，通过把针叶林改造成阔叶林等林相改造技术，提高林分质量，优化生态系统的结构，进而增加生态系统服务的产出和价值[22-24]。
乌岩岭国家级自然保护区提供的主要生态服务是保育土壤、涵养水源，这与付梦娣等[10]对泰顺县生态服务的研究一致，但乌岩岭国家级自然保护区的单位面积生态服务价值(3.92×105元·hm−2·a−1)是泰顺县单位面积生态服务价值(1.90×105元·hm−2·a−1)的2倍多。可见，乌岩岭国家级自然保护区对维护泰顺县生态安全具有重要作用。
乌岩岭国家级自然保护区净化大气环境服务价值达1.84×108元，这其中还不包括可吸入颗粒物(PM10)，细颗粒物(PM2.5)等服务价值。可见，保护区在养生保健、预防疾病等方面具有巨大的潜力，十分适合建设成为森林康养基地[25]。借助乌岩岭的生态优势，整合森林康养资源，丰富生态旅游产品的内涵，提高康养的层次和满意度，从而实现保护区的可持续发展，开辟绿水青山转化为金山银山的另一种途径。
自然保护区生态补偿资金的分配与生态系统服务长期脱钩，是造成保护区与周边村民矛盾的重要因素。生态补偿的本质就是对生态系统服务的外溢效益进行补偿[26]。评估生态系统的服务价值可作为生态补偿标准的依据[27]。
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图 3 植物精油对藤仓镰刀菌的抑制率
Figure 3 Inhibition rate of plant essential oil against F. fujikuroi
图 4 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝生长的影响
Figure 4 Effects of A. tatarinowii essential oil on mycelial growth of F. Fujikuroi
图 5 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌孢子的影响
Figure 5 Effects of A. tatarinowii essential oil on colony diameter of F. Fujikuroi
图 6 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌相对电导率和MDA的影响
Figure 6 Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi Relative conductivity and MDA content
图 7 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌可溶性碳水化合物、可溶性蛋白、核酸泄漏量的影响
Figure 7 Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi relative soluble carbohydrate, soluble protein content, nucleic acid leakage
图 8 扫描电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响
Figure 8 Sem observation of the effect of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi mycelium structure
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