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秀珍菇Pleurotus geesteranus是一种常见的食用菌[1]，营养丰富、味道鲜美。但秀珍菇采后易发生病害而造成品质下降，常温下仅能储藏2~3 d[2]。微生物侵染是秀珍菇储藏过程中品质下降的主要原因。秀珍菇由于质地脆嫩，品质易受温度影响，传统低温储藏虽能在一定程度上延长秀珍菇保鲜期，但易产生低温冷害，无法长期保存[3-4]。食用菌采后病害影响其储藏品质，不同种类食用菌的致病菌不同，哈茨木霉Trichoderma harzianum是引发金针菇绿霉病的主要致病菌，托拉斯假单胞杆菌Pseudomonas tolaasii能够引发双孢菇湿泡病等[4]。
植物精油是一类从植物中提取的次生代谢物质，具有广谱的抑菌性，易于生物降解和相对安全的特性，近年来在果蔬采后病害防治领域应用广泛[5-6]，但在食用真菌的防腐保鲜研究较少。具有采后病害控制作用的植物精油主要有香茅Mosla chinensis精油、桉Eucalyptus robusta精油、甜橙Citrus sinensis精油等，在果蔬的防腐保鲜中均有较好的防治效果[7-9]，精油是具有潜在应用价值的生物防治保鲜剂[10-12]，不同的精油对各类果蔬采后致病菌的防治效果不尽相同。本研究对秀珍菇采后储藏中的主要病原菌进行分离鉴定，筛选有效精油对其进行抑制，以期为植物精油的秀珍菇采后保鲜提供理论依据。
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秀珍菇采自浙江杭州临安鼎新农业科技有限公司；精油购于江西国光香料厂(纯度＞99%)，主要来自檀香Santalum album、艾蒿Artemisia argyi、石菖蒲Acorus tatarinowii、甜橙、香茅、洋甘菊Anthemis nobilis、青蒿Artemisia annua、柏木Cupressus funebris、大蒜Allium sativum、橘Citrus reticulata、花椒Zanthoxylum bungeanum、茴香Foeniculum vulgare、桉等植物。
培养基有马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，上海博微生物科技有限公司)和马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB，上海博微生物科技有限公司)。
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主要仪器有LDZX50KBS立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械)、智能光照培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂)、SW-CJ-IC型双人单面净化工作台(苏州苏信环境科技有限公司)、HI2315型高精度电导率仪(北京哈纳科科技有限公司)、Sigma 500扫描电子显微镜(德国)、HZ-2111KA恒温摇床(华利达实验设备公司)。
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用无菌手术刀在秀珍菇发病处切取病害和健康交界处的组织，用体积分数为75%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分后置于PDA平板中心，28 ℃培养3~5 d至组织发病。用无菌接种针挑取病症表面菌丝，置于PDA平板中心，28 ℃培养5 d后，挑取边缘菌丝纯化接种，直至菌落单一。出现单一菌落后，接入PDA斜面试管，用甘油封存后置于4 ℃冰箱保存。
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根据柯赫氏法则，确定秀珍菇致病性。挑取健康无病害，无机械损伤，大小均一的秀珍菇，采用针刺法将纯化后的菌丝回接至秀珍菇表面。置于室温(25 ℃)培养，观察发病情况，以不接菌丝作为对照。发病后进行致病菌的分离纯化，方法同1.3.1。判断发病后纯化的菌株与回接的菌株是否一致，如一致，则进行下一步试验。
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将试管中保存的菌丝活化，接种于PDA平板中，于28 ℃下培养，每天观察菌落特征，产孢后在菌落边缘挑取适量菌丝，在光学显微镜下观察菌丝及孢子形态，并根据其形态学特征初步判断其种属。
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将培养4~5 d的平板，委托上海生工生物技术有限公司进行序列测定。内部转录间隔区(ITS)序列扩增引物为ITS1和ITS4[13]，其引物序列为ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGGC-3′；ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，测序所得rDNA序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上，利用BLAST将ITS序列与数据库中的序列进行对比，寻找同源性较大的物种，下载其序列，利用MEGA软件构建该菌株的系统发育树，并根据其序列的相似度，确定其所属物种。
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将不同种类的精油配制成体积分数为500 μL·L−1的PDA平板，用无菌打孔器在病原菌平板上打取直径6 mm的菌饼，放入平板中央，28 ℃培养至6 d时，用游标卡尺测量菌落直径并记录[14-15]。设置3次重复。
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用无菌打孔器在病原菌平板上打取直径6 mm 的菌饼，放入PDA平板中央，28 ℃培养，定期观察菌落，用游标卡尺测量菌落直径并记录[16-17]，设置3次重复。
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将孢子悬浮液分别混合于体积分数为0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L−1的石菖蒲精油和质量浓度为1.0%的葡萄糖混合溶液中，将上述混合溶液50 µL分别滴入双凹载玻片，置于培养皿中(直径 200 mm)，25 ℃保湿培养，6、12、18 h时在显微镜下观察孢子萌发情况，每个处理镜检孢子数为200 个，以芽管长度超过孢子直径一半计为孢子萌发[18]，设置3次重复。孢子萌发率计算公式为：孢子萌发率=(萌发孢子数/检查孢子总数)×100%
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①丙二醛(MDA)质量摩尔浓度测定。将体积分数为0.1%的吐温80与石菖蒲精油混合充分后乳化，在PDB中加入一定量的孢子悬浮液，使孢子终浓度为109 CFU·L−1。分别抽滤取5 g菌丝在体积分数为0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L−1石菖蒲精油的PBS缓冲液中培养，0、2、4、6、8、10 h后取0.2 g菌丝冰浴研磨，加入1 mL无菌双蒸水提取，4 ℃ 10 000 r·min−1，20 min离心取上清液，采用硫代巴比妥酸法测定吸光度。②相对电导率测定。抽滤取5 g PDB中的菌丝在不同体积分数(0、250、500、750、1 000 μL·L−1)的石菖蒲精油-PBS缓冲液中培养，分别在0、10、20、40、60、120、180 min取样测定电导率，并计算相对电导率[19]，设置3次重复。
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将菌丝(湿质量2 g)加入到体积分数为0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L−1的石菖蒲精油无菌水中，28 ℃下摇床培养，分别于1、2、3、4、5 h后收集上清液测量可溶性碳水化合物、可溶性蛋白和核酸泄漏量[20]，设置3次重复。以蔗糖为标准，使用蒽酮试剂法测量藤仓镰刀菌可溶性碳水化合物的泄漏程度；使用蛋白质检测试剂盒(生工生物技术有限公司，上海)检测可溶性蛋白泄漏程度；通过检测上清液在波长260 nm处的吸光度D(260)来判断核酸的泄漏程度，设置3次重复。
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菌丝固定采用戊二醛、锇酸的双重固定法。取适量0、500 μL·L−1的石菖蒲精油平板上生长的菌丝边缘部分，浸泡于体积分数为3%的戊二醛溶液中，20 ℃固定，过夜后用pH 6.8的PBS缓冲液冲洗15 min，而后用体积分数为1%的锇酸溶液4 ℃固定2 h，再经乙醇梯度脱水、包埋、聚合、切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后置于透射电镜下观察[21]。
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采用GraphPad Prism 8进行绘图，通过SPSS 24.0单因素方差分析进行数据统计及差异显著性分析，显著性水平为0.05。
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如图1A所示：在秀珍菇20 ℃储藏2 d出现病症后，根据组织分离法分离致病菌，按照不同的菌落形态和生长特征，分离到3株致病菌。
图 1 秀珍菇致病菌病症与形态
Figure 1. Pathogen disease and morphology of P. geesteranus
根据科赫氏法则，将分离的3株真菌回接至经过表面灭菌的秀珍菇上进行验证，发现仅1株菌株出现了与病症相似的表现(图1B)。再取回接发病病症处的菌丝进行纯化培养，观察到与其形态一致，证明该菌株为秀珍菇主要致病菌。
由图1C~E可见：菌落规则，圆形，棉絮状或毛毡状，菌丝体初期白色，生长旺盛，后期成淡黄色，菌丝有隔，分枝，大型分生孢子呈镰刀形或纺锤形，有隔膜，呈无色或透明。与镰刀菌属形态学基本一致。将测序所得的序列，利用NCBI网站的BLAST在线对比，将ITS序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行对比分析(图2)，发现ITS序列与KJ605159.1 Fusarium fujikuroi strain GF3、MT982185.1 镰刀菌属Fusarium sp. isolate SZMC27192、MN747996.1 层生镰刀菌Fusarium proliferatumi isolate SC2.2、KF999820.1 Fusarium sp. CHJ2、MN871556.1 甜瓜镰刀菌Fusarium incarnatum clone LS760、MW405882.1 Fusarium proliferatumi isolate、KP893211.1 Fungal sp.、MT530228.1丛赤壳属Nectriaceae sp.、KT351627.1 Fusarium sp. T28、MN947247.1 Fusarium fujikuroi isolate DL3.2、MW599749.1 尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum strain DHRL-04有不同程度的相似，对比发现该菌株与KJ1605159.1 Fusarium fujiuroi strain GF3同源性达99%，基本确定该菌株为藤仓镰刀菌。另外，选取几株同源性不同的序列，下载序列利用Neighbor-Joining方法构建系统发育树。由图2可知：该菌株与藤仓镰刀菌聚为一支，有非常近的亲缘关系。结合形态学特征与生物学鉴定结果分析，确定该致病菌为藤仓镰刀菌。
图 2 ITS基因序列构建的系统发育树
Figure 2. Phylogenetic tree based on ITS sequence
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如图3所示：培养5 d后，藤仓镰刀菌在不同精油平板上的菌落直径不同，菌落直径越小表征菌丝生长越缓慢，则该精油的抑制效果越好。石菖蒲精油在13种精油中对藤仓镰刀菌的抑制效果最佳，故选择石菖蒲精油进一步研究。
图 3 植物精油对藤仓镰刀菌的抑制率
Figure 3. Inhibition rate of plant essential oil against F. fujikuroi
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由图4可知：250 μL·L−1的石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝生长有明显的抑制效果，培养4 d后不同体积分数处理的菌丝生长存在显著差异(P＜0.05)，1 000 μL·L−1的石菖蒲精油能完全抑制藤仓镰刀菌的生长，且转接至无精油PDA平板后依旧不生长。可确定石菖蒲精油对藤仓镰刀菌的半数效应体积分数(抑菌率达50%的体积分数为半数效应体积分数，EC50)为500 μL·L−1，最小抑菌体积分数为1 000 μL·L−1。
图 4 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝生长的影响
Figure 4. Effects of A. tatarinowii essential oil on mycelial growth of F. Fujikuroi
如图5所示：随着石菖蒲精油体积分数的升高，藤仓镰刀菌孢子萌发率显著降低(P＜0.05)。处理18 h以后，对照组孢子萌发率达85.7%，而750和1 000 μL·L−1石菖蒲精油处理组孢子萌发率分别为4.2%和0，孢子萌发抑制率分别为95.1%和100.0%。表明在一定体积分数范围内，石菖蒲精油能显著抑制藤仓镰刀菌孢子的萌发。
图 5 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌孢子的影响
Figure 5. Effects of A. tatarinowii essential oil on colony diameter of F. Fujikuroi
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用相对电导率来表征膜通透率，相对电导率越高，膜通透性越大。如图6A所示：藤仓镰刀菌相对电导率随着石菖蒲精油体积分数的升高而升高。处理组在80 min后显著高于对照组(P＜0.05)。3 h后对照组相对电导率为23.2%，而1 000 μL·L−1石菖蒲精油处理组的相对电导率达55.1%。表明精油处理可显著提高藤仓镰刀菌的相对电导率(P＜0.05)，从而可进一步增加高藤仓镰刀菌的膜通透性。
图 6 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌相对电导率和MDA的影响
Figure 6. Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi Relative conductivity and MDA content
MDA是细胞膜脂过氧化的产物，可以反映细胞膜脂过氧化的程度，是指示膜系统受伤的重要指标之一。如图6B所示：经过石菖蒲精油处理的藤仓镰刀菌，MDA质量摩尔浓度显著高于对照，1 000 μL·L−1石菖蒲精油处理组在10 h后MDA质量摩尔浓度是对照的3倍。表明石菖蒲精油能够破坏细胞脂膜结构，从而导致MDA质量摩尔浓度上升，加速菌丝细胞的膜脂过氧化。
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细胞内容物出现在培养液中说明细胞的质膜受到了破坏，也是细胞膜损伤的重要表征指标。如图7所示：培养液中可溶性蛋白、核酸、可溶性碳水化合物随着精油处理时间的延长都有不同程度的上升。表明经石菖蒲精油处理后，细胞内容物出现不同程度泄漏，且随着精油体积分数的增大而升高。说明精油处理能够破坏脂膜结构，从而导致细胞内容物泄漏。
图 7 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌可溶性碳水化合物、可溶性蛋白、核酸泄漏量的影响
Figure 7. Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi relative soluble carbohydrate, soluble protein content, nucleic acid leakage
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采用扫描电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响，发现未经精油处理的菌丝表面光滑，存在孢子丛(图8A)。精油处理后(图8B)的菌丝皱缩，无孢子产生。进一步说明石菖蒲精油能够破坏藤仓镰刀菌菌丝结构，影响菌丝正常生长，并抑制孢子的产生。本研究结果与顾可飞等[13]发现精油可造成真菌菌丝畸形或使真菌菌丝断裂的结论基本一致。
图 8 扫描电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响
Figure 8. Sem observation of the effect of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi mycelium structure
进一步采用透射电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌细胞超微结构的影响，发现未经精油处理的细胞形态完整，质膜均匀，细胞壁清晰(图9A)。经石菖蒲精油处理的菌丝细胞膜和核膜破坏严重，细胞各结构也有较大破坏(图9B)。表明石菖蒲精油的抑菌机制可能是通过破坏藤仓镰刀菌细胞膜的完整性，暴露和侵蚀细胞器，造成细胞损伤，最终导致细胞死亡。
图 9 透射电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响
Figure 9. Effect of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi mycelium structure observed by transmission electron microscopy
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本研究对秀珍菇的采后致病菌进行分离，根据科赫氏法则确定其致病性，在形态上致病菌菌落呈白色，后期为淡黄色，菌丝有隔有分支，孢子呈镰刀型，在形态学上对比发现其与镰刀菌形态学描述一致；利用rDNA-ITS序列对比和系统发育树分析的方法，发现致病菌与藤仓镰刀菌相似度达99%，由此确定藤仓镰刀菌为秀珍菇采后储藏中的主要致病真菌，该菌在百香果Passiflora eduli[22]、樱桃番茄Lycopersicon esculentum var. cerasiforme[23]等农产品均见报道，是较为常见的致病菌。
研究13种常见植物精油对对藤仓镰刀菌抑制效果时发现：石菖蒲精油对藤仓镰刀菌控制效果最佳，其EC50为500 μL·L−1，最小抑菌体积分数为1 000 μL·L−1。相同体积分数处理下，石菖蒲精油对孢子萌发的抑制率高于对菌丝生长的抑制率，说明藤仓镰刀菌孢子对石菖蒲精油的敏感度更高，这与PEI等[24]探究香芹酚对炭疽菌的抑制效果相似。
经对藤仓镰刀菌培养液中MDA和相对电导率变化情况的观测，发现石菖蒲精油的处理可使藤仓镰刀菌的胞内MDA质量摩尔浓度增加，MDA质量摩尔浓度和相对电导率是表征菌丝细胞膜脂过氧化程度和细胞膜结构破坏程度的重要指标[25]，MDA质量摩尔浓度增加表明石菖蒲精油能够加速藤仓镰刀菌的膜脂氧化，加剧细胞内物质的外泄；而扫描电镜和透射电镜结果也显示藤仓镰刀菌菌丝表面出现褶皱，菌丝细胞壁膜被破坏。LIU等[26]研究表明：香草精油的抗真菌活性是由于其能够破坏细胞膜结构。PEI等[24]发现：香芹酚能够使炭疽菌细胞膜通透性增加。本研究表明：石菖蒲精油能够有效抑制藤仓镰刀菌作用机制，破坏藤仓镰刀菌膜系统结构，引起内容物泄漏，进而导致菌体死亡。
Identification of postharvest pathogenic bacteria and the bacteriostasis of plant essential oil for Pleurotus geesteranus
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摘要:
目的 分离鉴定秀珍菇Pleurotus geesteranus采后的主要致病菌，寻找有效防治真菌病害的植物精油抑菌方法，为秀珍菇采后的保鲜技术提供参考。 方法 以秀珍菇采后分离鉴定的主要病原真菌为防治对象，在常见的13种精油中筛选有效精油，分析精油对采后主要病原菌菌丝生长、孢子萌发、菌丝形态结构及其细胞膜脂过氧化和细胞内容物外泄程度的影响，以不使用精油为对照，研究防治作用机制。 结果 秀珍菇采后主要病原真菌为藤仓镰刀菌Fusarium fujiuroi。在13种备选精油中，石菖蒲Acorus tatarinois精油对藤仓镰刀菌具有良好的抑制效果。石菖蒲精油体积分数为1 000 μL·L−1时能够完全抑制藤仓镰刀菌的生长，且在此范围内体积分数越高，抑菌效果越好。石菖蒲精油能够提高藤仓镰刀菌细胞膜的通透性，当体积分数为1 000 μL·L−1的石菖蒲精油处理3 h后，藤仓镰刀菌相对电导率、丙二醛和细胞内容物泄漏量分别为对照组的2、5和3倍。扫描电镜和透射电镜观察结果表明：石菖蒲精油能改变藤仓镰刀菌菌丝形态并破坏其细胞结构。 结论 石菖蒲精油能够加剧藤仓镰刀菌菌丝细胞膜脂过氧化，破坏菌丝结构，进而加速细胞凋亡，从而抑制藤仓镰刀菌的生长繁殖。图9参26 Abstract:Objective This study, with the main pathogens of Pleurotus geesteranus after harvest isolated and identified, is aimed to investigate the antibacterial activities of plant essential oil that effectively prevent and control fungal diseases so as to provide reference for the development of preservation technology of P. geesteranus after harvest. Method With major pathogenic fungi isolated and identified from P. geesteranus as the research objects of prevention and control, the most effective essential oils were screened out from 13 kinds of common essential oils before an analysis was conducted of their effects on the mycelial growth, conidia germination, mycelial morphology and structure, membrane lipid peroxidation and leakage of cell contents of the main postharvest pathogens in order to study the mechanism of prevention and treatment. The control group was treated without essential oil. Result Among the 13 alternative essential oils, Acorus tatarinowii essential oil had a good inhibitory effect on Fusarium fujiuroi and the growth of F. fujikuroi could be completely inhibited by 1 000 μL·L−1 A. tatarinowii essential oil with the concentration of essential oil positively correlated with the antifungal effect. After the treatment with 1 000 μL·L−1 essential oil for 3 h, the relative conductivity, MDA and cell contents in the cultured liquid of F. fujikuroi were 2 times, 5 times and 3 times of those in the control group, respectively. According to the results of scanning electron microscopy and transmission electron microscopy, the essential oil of A. tatarinowii could change F. fujikuroi mycelium morphology and destroy its cell structure. Conclusion A. tatarinowii essential oil could accelerate the membrane lipid peroxidation of mycelia cells, increase the permeability of cell membrane, destroy the normal physiological function of cells and cause cell death, thereby inhibiting the growth and reproduction of F. fujikuroi. [Ch, 9 fig. 26 ref.] -
森林是陆地生态系统的主体，在全球碳循环中起着十分重要的作用。森林蓄积量作为衡量森林数量的重要的指标之一，能够直观反映森林资源数量和质量，获取森林蓄积量是推算森林生物量和碳储量的必要环节[1-3]。《“十四五”林业草原保护发展规划纲要》明确指出：将增加中国森林蓄积量作为主要目标之一，并将森林蓄积量与森林覆盖率作为两大约束性指标。因此，实现森林资源动态检测、准确获取森林蓄积量等参数信息，已成为当前森林资源调查的迫切需求。激光雷达(light detection and ranging, LiDAR)作为一种新兴的主动式遥感技术，能够从不同空间尺度对生态系统进行高效精准的监测[4]。机载LiDAR发射的激光脉冲能穿透森林冠层并获取树冠上部枝叶的空间信息，通过林分内的空隙，测量冠层结构信息和林下地形信息[5]。而传统方法通过样木、样地等抽样调查进行林分森林参数的推算，调查周期长、成本高且调查范围有限[6-7]。激光雷达在获取森林空间结构因子和地形因子等信息方面具有精度高、范围广等优势。
近年来，基于机载激光雷达的林分蓄积量反演已有许多研究成果，集中在构建参数方法和非参数方法的蓄积量反演模型。PAWE等[8]基于机载LiDAR数据对波兰东南部林区建立多元线性回归蓄积量反演模型，其中均方根误差(root mean square error, RMSE)为15.2%；CHIRICI等[9]以Landsat 5TM、卫星LiDAR数据等预测变量联合气温、降水和地形等辅助变量进行意大利中部地区蓄积量的大尺度反演，其中随机森林回归模型最优，决定系数(R2)为0.69、RMSE为37.2%；陈松等[10]基于Sentinel-2与机载LiDAR数据采用不同回归方法对广西高峰林场界牌、东升分场进行蓄积量反演，构建MLR-Logistic联立模型精度优于随机森林等机器学习方法，R2为0.60、相对均方根误差(relative root mean-squared error, RRMSE)为29.29%；曾伟生等[11]基于机载LiDAR数据，采用线性和非线性参数回归方法对东北林区进行蓄积量反演，其中非线性回归模型R2为0.71~0.82，略优于线性回归。已有多位研究者基于机载LiDAR数据进行林分蓄积量反演模型研究，但对于建模方法中参数回归和非参数回归模型的比较国内研究较少。本研究以广西国有高峰林场桉Eucalyptus树人工林为研究对象，基于机载激光雷达数据及地面调查数据，采用逐步回归、偏最小二乘回归等参数回归和随机森林、支持向量回归等非参数回归进行蓄积量反演模型研建，并通过模型评价指标对以上4种方法进行模型评估，进而选择出拟合优度、泛化能力最优模型。
1. 数据获取与预处理
1.1 研究区概况
研究区位于广西壮族自治区南宁市兴宁区的国有高峰林场，22°51′~23°02′N，108°06′~108°31′E，该区地处亚热带地区，年平均气温约21 ℃，年平均降水量为1 200~1 500 mm，相对湿度为79%，属丘陵地貌，海拔为100~460 m，坡度为6°~35°，具有较厚的赤红壤，适宜亚热带和热带树种生长，森林覆盖率达87%，主要树种为杉木Cunninghamia lanceolata、巨尾桉Eucalyptus grandis × E. urophylla、马尾松Pinus massoniana等。
1.2 样地数据
调查时间为2018年1—2月，研究区内共设置71块桉树样地(图1)，其中激光雷达覆盖范围内共57块样地。样地大小为20 m×20 m、25 m×25 m和25 m×50 m。采用实时动态差分技术(real-time Kinematic，RTK)进行样地定位，记录样地中心点及样地角点。采用每木检尺的方法，使用胸径尺、激光测高仪和皮尺逐一测量样地内树木的胸径、树高等数据。统计样地调查数据得到样地算数平均树高、算数平均胸径、样地面积(表1)。通过广西地区桉树二元材积表对单木材积量进行计算[12]，进而计算得到样地尺度的公顷蓄积量值(V样地)：V样地=V公顷S样地/10 000。其中：V公顷为通过二元材积公式计算得的每公顷蓄积量，S样地为桉树样地面积。
表 1 样地参数统计Table 1 Parameter statistics of sample plots项目 平均树高/m 平均胸径/cm 单位蓄积量/(m3·hm−2) 最大值 30.40 21.10 320.66 最小值 7.48 5.24 17.79 平均值 15.19 12.06 90.47 标准差 4.22 3.55 65.58 1.3 LiDAR数据及预处理
于2018年1月采集机载LiDAR数据，使用有人机并搭载LMS-Q680i激光雷达扫描仪，实际飞行高度为1 000 m，最大扫描角度为30°，波长为1 550 nm，激光脉冲长度为3 ns，采样间隔为1 ns，最大扫描频率为400 KHz，垂直分辨率为0.15 m，点云密度为10 pt·m−2。
使用LiDAR 360软件对机载激光雷达点云进行点云拼接、去噪、地面点分类、基于地面点归一化等预处理，结果如图2所示。根据样地角点以中心点坐标对点云进行裁剪，提取出基于样地尺度特征变量共48个，包括37个点云高度参数、10个密度参数、郁闭度等点云特征变量，具体参数见表2。
表 2 提取点云特征变量Table 2 Extracting point cloud feature variables变量类型 变量名 特征描述 高度变量 Hmax 归一化后所有点的Z值的
最大值Hmin 归一化后所有点的Z值的
最小值Hmedian_z 高度平均偏差 Hstddev 高度标准差 Hkurtosis 高度峰度 Hsqrt_m 高度二次幂均值 Hcurt_m 高度三次幂均值 HP1, HP5$, \cdots, $ HP99 归一化点云高度分布的百
分位数，共15个HA1, HA2$, \cdots, $ HA99 归一化点云累计高度的百
分位数，共15个密度变量 D1, D2$, \cdots, $ D9 将点云从低到高分成10个
相同高度的切片，该层
回波数点在所有返回点
的所占比例，共9个郁闭度 CC 首次回波中，植被点数与
所有点的比值1.4 建模数据准备
使用MATLAB激光雷达覆盖范围内57个样本进行随机抽样，按照3∶1的比例选取42个作为训练样本，15个作为验证样本。以样地实测公顷蓄积量为因变量，筛选后点云特征为自变量，采用逐步回归、偏最小二乘回归、随机森林回归、支持向量回归模型进行拟合 。
2. 研究方法
2.1 变量筛选
2.1.1 基于逐步筛选法优选变量
对于逐步回归，采用逐步筛选法对所有特征变量进行变量筛选；再对筛选出特征变量进行多重共线性检验，计算各变量间容忍度或特征变量间方差膨胀因子(FVI) 2个统计量[13]，对于容忍度≤0.2或FVI≥5的变量进行进一步讨论，确定最优特征变量子集。FVI=1/(1−R2)。其中：R为特征变量间相关系数。
2.1.2 基于随机森林优选变量
对于偏最小二乘回归、支持向量机回归、随机森林回归等方法，使用随机森林中重要性排序对特征变量进行优选。其主要原理为随机森林算法在构建各决策树时，对某一特征变量进行取舍，若此时均方误差(mean square error, MSE)有较大变化，则该特征变量重要性高，最终得到所有特征变量重要性排序。
2.2 蓄积量模型建立方法
2.2.1 逐步回归
逐步回归(stepwise regression, SR)可用于筛选并剔除引起多重共线性的变量，逐步回归建立模型一般形式为：Y=β0+β1X1+β2X2
$+\cdots + $ βiXi+ε。逐步筛选法结合了向前选择变量法和向后选择变量法的优点，对i个自变量X分别与因变量Y建立一元回归模型，计算各变量所对应F值，其中，β0为常数，βi为回归系数，ε为误差项。在建立逐步回归模型时，选择当前未加入模型的预测变量中F的最大值所对应的$ {X}_{i} $ 加入模型，再对已选入预测变量逐个进行t检验，若存在已选入预测变量不再显著，则将其剔除。重复以上步骤，直到既没有显著的解释变量选入回归方程，也没有不显著的解释变量从回归方程中剔除为止，将保留下来的最优子集作为建立模型的特征变量，并将候选变量对应系数保留。2.2.2 偏最小二乘回归
偏最小二乘回归(partial least squares regression, PLSR)结合了主成分分析、典型相关分析的优点，实现了数据降维、信息综合[14]。首先对训练样本进行数据标准化处理，调用plsregress函数提取主成分与自变量和因变量组合。分别计算自变量和因变量提取出成分的贡献率进而计算得到累计贡献率，当度量因子Q2h≥0.097 5停止主成分的提取[15]。统计主成分对个数并建立各自变量与因变量的线性表达式，最后根据所建立的各主成分对模型，整理得到PLSR模型。
2.2.3 支持向量机回归
支持向量机算法(support vector machine, SVM)利用内积核函数代替高维空间的非线性映射, 不涉及大数定律和概率测度等有关问题, 且SVM的决策函数仅有少数支持向量决定，该算法在解决小样本多维度回归和分类问题时泛化能力强，具备较好的“鲁棒性”。VAPNIK[16]在SVM分类的基础上引入了不敏感损失函数，得到了支持向量机回归算法(support vector regression, SVR)。
使用Libsvm工具箱实现SVR算法，采用网格搜索法(grid search)对常用的4种核函数进行参数寻优[17]，即线性、多项式、RBF (径向基核函数)、sigmoid (多层感知机核函数)。同时进行十折交叉验证，保证回归模型中惩罚系数(C)与gamma值(g)达到最优。
2.2.4 随机森林回归
随机森林回归(RFR)算法采用自助采样法(bootstrap sampling)，在以决策树构建Bagging集成的基础上，对样本和特征变量进行随机选择[18]。调用TreeBagger函数进行RFR算法建模，通过对决策树数量(ntree)和最小叶子点数进行参数寻优，直到袋外(out-of-bag，OOB)误差的MSE达到最小，保证模型预测性能达到最优，将寻优结果作为RFR模型的建模参数，用于模型构建。
2.3 模型评估方法
本研究使用决定系数(R2)、均方根误差(RMSE)和平均绝对误差(MAE)对林分蓄积量估测模型进行定量的精度验证和评价。其计算公式为：
$$\quad\;\;\, {R}^{2}=1-\frac{\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^{{n}} {({y}_{i}-{\hat{y}}_{i})}^{2}}{\displaystyle\sum\limits _{i=1}^{n}{({y}_{i}-{\bar{y}}_{i})}^{2}} \text{；} $$ $$ {E}_{\mathrm{R}\mathrm{M}\mathrm{S}}=\sqrt{\frac{\displaystyle\sum \limits_{i=1}^{n}{({y}_{i}-{\hat{y}}_{i})}^{2}}{n}} \text{；} $$ $$ {E}_{\mathrm{M}\mathrm{A}}=\frac{1}{n}\displaystyle\sum\limits _{i=1}^{n}\left|({y}_{i}-{\hat{y}}_{i})\right| 。 $$ 其中：
$ {y}_{i} $ 、$ {\bar{y}}_{i} $ 、$ {\hat{y}}_{i} $ 分别为实测蓄积量值、实测蓄积量均值、模型预测蓄积量值；ERMS为均方根误差；EMA为平均绝对误差；n为验证样本数量。进行评估模型时，R2越趋近于1，代表拟合程度越高；ERMS越小，代表真实值与模型预测值之间离散程度越小；EMA越小，代表真实值与模型预测值之间的误差越小。3. 结果与分析
3.1 变量筛选结果
3.1.1 逐步筛选法
在采用逐步筛选法进行偏F检验时，取偏F检验拒绝域的临界值为F进＞F出，F进为选入变量时的临界值、F出为删除变量时的临界值。本研究设定F进为0.10，F出为0.11，筛选特征变量结果为D9、HP95、Hmax、Hkurtosis。
对筛选出的变量进行双变量相关性分析，根据相关系数(R)计算各变量间方差膨胀因子(FVI)。计算结果如表3，Hmax与HP95之间FVI为250.25，FVI大于5，认为两者之间存在共线性。因此分别以D9、Hmax、Hkurtosis和D9、HP95、Hkurtos为建模因子。
表 3 各特征变量间的方差膨胀因子Table 3 FVI calculation of each variable变量 D9 Hmax HP95 Hkurtosis D9 2.46 2.69 1.00 Hmax 2.46 250.25 1.01 HP95 2.69 250.25 1.01 Hkurtosis 1.00 1.01 1.01 3.1.2 基于随机森林筛选变量
对所有的48个特征变量进行重要性排序，调用随机森林中OOBPermutedVarDeltaError参数，得到所有特征变量的重要性。选择重要性大于0.2的变量作为建模因子，筛选结果如图3，包括8个高度变量、2个密度变量，其中Hcurt重要性最高，达0.52；D6重要性相对最低，为0.22。
3.2 模型建立与评价
3.2.1 逐步回归法
根据特征变量优选结果，分别建立以D9、Hmax、Hkurtosis和D9、HP95、Hkurtos为建模因子的多元线性模型:
$$ Y_{\rm{1}} = 470.232D_{\rm{9}} + 4.897H_{\rm{P95}} + 1.453H_{\rm{kurtosis}} - 56.903 \text{；} $$ $$ Y_{\rm{2}} = 482.214D_{\rm{9}} + 4.855H_{\text{max}} + 1.461H_{\rm{kurtosis}} - 65.01 。 $$ 使用SPSS 26对Y1、Y2模型进行初步评估，计算2种模型的相关系数(R)、R2以及标准估算误差(SE)，结果如表4。结果表明Y2中R2、SE均优于Y1，因此选定Y2作为逐步回归模型。
表 4 逐步回归模型初步评估Table 4 Preliminary evaluation of stepwise regression model模型 R R2 调整后R2 SE Y1 0.950 0.902 0.894 18.460 Y2 0.953 0.908 0.900 17.904 3.2.2 偏最小二乘回归
利用PLSR提取的主成分F1、F2与因变量Y关系分别为F1=5.840Y+b和F2=0.271Y+b，b为常数，得到最小二乘回归模型为：
$$ \begin{split} Y=\;&-42.571{-1.344H}_{{\rm{A}}25}-0.513{H}_{{\rm{A}}30}+1.450{H}_{{\rm{curt}}}+\\ \;&1.134{H}_{{\rm{mean}}}+0.705{H}_{{\rm{P}}20}+1.088{H}_{{\rm{P}}25}+{1.337H}_{{\rm{P}}30}+\\ \;&{1.523H}_{{\rm{P}}40}+24.647{D}_{6}+{445.634D}_{9} 。 \end{split} $$ 3.2.3 支持向量机回归
调用meshgrid函数对C、gamma进行参数寻优并采用十折交叉验证，调用svmtrain函数，分别构建4种不同核函数的SVR模型并进行模型训练，训练结果如表5。得到拟合结果最优模型为RBF-SVR，其C为8，gamma为0.125。RBF-SVR模型R2为0.85，RMSE为29.24 m3·hm−2，MAE为94.98 m3·hm−2，选定该模型作为本研究的SVR模型。
表 5 SVR不同核函数拟合结果Table 5 Fitting results of different kernel functions of SVR核函数 R2 RMSE/(m3·hm−2) MAE/(m3·hm−2) 线性 训练样本 0.89 18.62 14.49 验证样本 0.83 30.43 24.73 多项式 训练样本 0.74 34.34 23.06 验证样本 0.78 52.33 33.54 RBF 训练样本 0.95 13.09 11.65 验证样本 0.85 29.24 23.96 sigmoid 训练样本 0.80 24.91 17.79 验证样本 0.77 35.91 25.71 3.2.4 随机森林回归
本研究采用穷举法对决策树数量和最小叶子点数进行参数寻优。分别设置决策树数量和最小叶子点数最小值为50和2，每次递增10和1，对寻优过程循环，通过观察OOB误差的MSE变化，直到寻找到本模型最优参数，寻优结果如图4。最终确定决策树数量为90，叶子节点数量为2，将寻优结果作为建模参数，输入训练样本，完成RFR模型构建。
3.2.5 模型评价
使用验证样本对各模型的预测性能进行评估，结果如表6、图5。可以看出不同的回归模型均表现出较好的拟合结果，其中拟合结果最优模型为RFR模型，模型评价结果R2为0.95，RMSE为12.64 m3·hm−2，MAE为8.00 m3·hm−2，RBF-SVR模型其次，R2为0.94，RMSE为13.09 m3·hm−2，MAE为11.65 m3·hm−2。将验证样本带入模型，检验模型的预测能力，结果显示各模型预测能力与模型的拟合效果一致。通过传统方法的划分训练样本与验证样本，存在一定的偶然性与不确定性，为了进一步确保各模型的稳定性与泛化能力，采用留一法交叉验证(leave-one-out cross validation，LOOCV)对本研究中各模型进行再次评估[19]，如图6所示：RBF-SVR模型表现最优，R2为0.88，RMSE为21.35 m3·hm−2，MAE为16.62 m3·hm−2，与其他模型相比，R2高出0.03~0.07，RMSE减少2.58~5.17 m3·hm−2，MAE减少0.79~3.32 m3·hm−2。
表 6 蓄积量反演模型评估Table 6 Evaluation of growing stock volume inversion model模型 样本 R2 RMSE/(m3·hm−2) MAE/(m3·hm−2) SR 训练样本 0.91 17.03 13.27 验证样本 0.82 33.33 24.03 PLSR 训练样本 0.90 17.63 13.49 验证样本 0.80 34.53 27.76 RBF-SVR 训练样本 0.94 13.09 11.65 验证样本 0.85 29.24 23.96 RFR 训练样本 0.95 12.64 8.00 验证样本 0.88 28.11 19.48 
图 5 各模型训练结果与验证结果散点图Figure 5 Scatter diagram of training results and verification results of each model4. 讨论
本研究采用SR、PLSR等参数回归方法与RFR、SVR等非参数回归方法进行广西高峰林场桉树人工林的蓄积量反演模型研建，通过对点云特征变量筛选、建模因子优选、参数寻优等方法保证各模型达到最优性能，在此基础上采用留一法对各模型进行交叉验证，保证了模型的稳定性与泛化能力，并将该结果作为本研究各模型性能评估的最终结果。研究结果如下：①核函数为RBF的SVR在4种模型中预测精度最高(ΔR2为0.03~0.07、ΔRMSE为2.58~5.17 m3·hm−2、ΔMAE为0.79~3.32 m3·hm−2)，采用SVR模型在解决林业激光雷达领域的回归预测问题已有广泛应用，肖越[20]结合Landsat 8、高分2号(GF-2)共2种光学遥感数据与极化SAR数据进行旺业甸林场尺度的蓄积量反演，采用SVR模型拟合精度最高(R2为0.48，RMSE为57.27 m3·hm−2)，与MLR、RFR等方法相比，ΔR2为0.10~0.11、ΔRMSE为5.30~6.00 m3·hm−2。赵勋等[21]基于机载激光雷达进行广西高峰林场林分平均树高估测中，通过随机森林特征变量筛选，采用SVR相比较RFR方法，R2增加0.01、RMSE减少0.06 m。以上研究结果与本研究一致，进一步表明解决基于LiDAR点云特征变量的林分蓄积量反演问题时，结合随机森林筛选特征变量与支持向量机回归可作为有效建模方法。
②本研究采用2种方法对特征变量进行筛选，逐步回归法保证入选的特征变量显著且各变量之间不存在共线关系，随机森林则通过计算各特征变量对建模时的贡献度排序进而筛选变量。肖越[20]利用逐步回归法从遥感特征变量中筛选出建模因子用于蓄积量回归模型构建；周蓉等[22]在基于Landsat 8 遥感影像反演地上生物量的研究中，采用随机森林重要性排序方法从遥感因子中筛选出特征变量用于构建模型。这2种方法均广泛应用于构建模型前的变量筛选，合理地选择模型筛选方法，更有利于回归模型构建。
③本研究旨在选取最优桉树蓄积量反演模型，参数方法SR中逐步筛选法已对变量进行筛选，故SR模型不再采用随机森林进行特征变量筛选。在本研究模型评估中，SR模型评估结果均优于PLSR模型，袁钰娜等[23]对东北林区4种不同针叶林蓄积量反演所建立的回归模型中，PLSR模型的拟合结果和预测精度均优于SR (ΔR2为0.05~0.15，ΔRMSE为2.6%~4.2%)，与本研究结果不一致，但由于2种回归方法并未使用同一变量筛选方法，因此，不能直接认为在解决预测回归问题时前者更加可靠，对于以上2种回归方法的模型性能与预测能力需进一步讨论。
④本研究在林场尺度通过较少样本进行桉树林分蓄积量反演，非参数方法总体预测精度较高且RBF-SVR模型略优于RFR模型。SVR核心思想为将低维空间中的向量用非线性函数映射到一个高维特征空间，进而寻求线性回归超平面并解决低维空间中的非线性问题[24]，支持向量机回归解决多维度小样本回归预测问题相较随机森林回归更有优势。在反演尺度较大且训练样本较多的林分蓄积量反演问题时，采用支持向量机回归方法训练效率将明显下降，此时选择随机森林回归将更适用。
⑤本研究采用逐步筛选法筛选出的4个特征变量中，点云密度变量被选择1次；在采用随机森林筛选的10个变量中，点云密度变量被选择2次，且密度变量D9在重要性排序中位于第3位。点云密度变量作为本研究中重要解释变量之一，该类型变量能够描述林分中树木的水平结构信息，与树高(垂直结构变量)等参数结合可解释林分空间结构信息。孙忠秋等[25]加入林分郁闭度作为水平结构的解释变量，与仅用点云高度参数相比较，RMSE下降0.27 m3·hm−2、MAE下降0.08 m3·hm−2，该变量对模型预测性能有一定提升。本研究将郁闭度作为候选变量，但在逐步筛选法中又将其剔除，因为在基于随机森林法的重要性排序中，林分郁闭度参数在48个候选变量中排名第44位。由此可见，在林业激光雷达应用中，将林分密度用于衡量林分水平结构信息更加可靠。
5. 结论
本研究通过2种参数回归方法(逐步回归、偏最小二乘回归)与2种非参数方法(随机森林回归、支持向量机回归)对林分蓄积量进行估测。在采用传统方法划分训练样本与验证样本的结果中，非参数方法模型精度均优于参数回归方法；采用留一法对各模型预测精度进行交叉验证时，表现最优模型RBF-SVR属于非参数回归方法，表明解决林业激光雷达领域中的回归预测问题时，非参数方法相较参数方法更有优势。本研究中蓄积量反演模型已在广西高峰林场内取得较好模型精度，但对于大尺度反演森林蓄积量的适用性有待进一步论证。
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图 3 植物精油对藤仓镰刀菌的抑制率
Figure 3 Inhibition rate of plant essential oil against F. fujikuroi
图 4 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝生长的影响
Figure 4 Effects of A. tatarinowii essential oil on mycelial growth of F. Fujikuroi
图 5 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌孢子的影响
Figure 5 Effects of A. tatarinowii essential oil on colony diameter of F. Fujikuroi
图 6 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌相对电导率和MDA的影响
Figure 6 Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi Relative conductivity and MDA content
图 7 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌可溶性碳水化合物、可溶性蛋白、核酸泄漏量的影响
Figure 7 Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi relative soluble carbohydrate, soluble protein content, nucleic acid leakage
图 8 扫描电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响
Figure 8 Sem observation of the effect of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi mycelium structure
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