下载:
下载:
-
秀珍菇Pleurotus geesteranus是一种常见的食用菌[1]，营养丰富、味道鲜美。但秀珍菇采后易发生病害而造成品质下降，常温下仅能储藏2~3 d[2]。微生物侵染是秀珍菇储藏过程中品质下降的主要原因。秀珍菇由于质地脆嫩，品质易受温度影响，传统低温储藏虽能在一定程度上延长秀珍菇保鲜期，但易产生低温冷害，无法长期保存[3-4]。食用菌采后病害影响其储藏品质，不同种类食用菌的致病菌不同，哈茨木霉Trichoderma harzianum是引发金针菇绿霉病的主要致病菌，托拉斯假单胞杆菌Pseudomonas tolaasii能够引发双孢菇湿泡病等[4]。
植物精油是一类从植物中提取的次生代谢物质，具有广谱的抑菌性，易于生物降解和相对安全的特性，近年来在果蔬采后病害防治领域应用广泛[5-6]，但在食用真菌的防腐保鲜研究较少。具有采后病害控制作用的植物精油主要有香茅Mosla chinensis精油、桉Eucalyptus robusta精油、甜橙Citrus sinensis精油等，在果蔬的防腐保鲜中均有较好的防治效果[7-9]，精油是具有潜在应用价值的生物防治保鲜剂[10-12]，不同的精油对各类果蔬采后致病菌的防治效果不尽相同。本研究对秀珍菇采后储藏中的主要病原菌进行分离鉴定，筛选有效精油对其进行抑制，以期为植物精油的秀珍菇采后保鲜提供理论依据。
-
秀珍菇采自浙江杭州临安鼎新农业科技有限公司；精油购于江西国光香料厂(纯度＞99%)，主要来自檀香Santalum album、艾蒿Artemisia argyi、石菖蒲Acorus tatarinowii、甜橙、香茅、洋甘菊Anthemis nobilis、青蒿Artemisia annua、柏木Cupressus funebris、大蒜Allium sativum、橘Citrus reticulata、花椒Zanthoxylum bungeanum、茴香Foeniculum vulgare、桉等植物。
培养基有马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，上海博微生物科技有限公司)和马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB，上海博微生物科技有限公司)。
-
主要仪器有LDZX50KBS立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械)、智能光照培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂)、SW-CJ-IC型双人单面净化工作台(苏州苏信环境科技有限公司)、HI2315型高精度电导率仪(北京哈纳科科技有限公司)、Sigma 500扫描电子显微镜(德国)、HZ-2111KA恒温摇床(华利达实验设备公司)。
-
用无菌手术刀在秀珍菇发病处切取病害和健康交界处的组织，用体积分数为75%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分后置于PDA平板中心，28 ℃培养3~5 d至组织发病。用无菌接种针挑取病症表面菌丝，置于PDA平板中心，28 ℃培养5 d后，挑取边缘菌丝纯化接种，直至菌落单一。出现单一菌落后，接入PDA斜面试管，用甘油封存后置于4 ℃冰箱保存。
-
根据柯赫氏法则，确定秀珍菇致病性。挑取健康无病害，无机械损伤，大小均一的秀珍菇，采用针刺法将纯化后的菌丝回接至秀珍菇表面。置于室温(25 ℃)培养，观察发病情况，以不接菌丝作为对照。发病后进行致病菌的分离纯化，方法同1.3.1。判断发病后纯化的菌株与回接的菌株是否一致，如一致，则进行下一步试验。
-
将试管中保存的菌丝活化，接种于PDA平板中，于28 ℃下培养，每天观察菌落特征，产孢后在菌落边缘挑取适量菌丝，在光学显微镜下观察菌丝及孢子形态，并根据其形态学特征初步判断其种属。
-
将培养4~5 d的平板，委托上海生工生物技术有限公司进行序列测定。内部转录间隔区(ITS)序列扩增引物为ITS1和ITS4[13]，其引物序列为ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGGC-3′；ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，测序所得rDNA序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上，利用BLAST将ITS序列与数据库中的序列进行对比，寻找同源性较大的物种，下载其序列，利用MEGA软件构建该菌株的系统发育树，并根据其序列的相似度，确定其所属物种。
-
将不同种类的精油配制成体积分数为500 μL·L−1的PDA平板，用无菌打孔器在病原菌平板上打取直径6 mm的菌饼，放入平板中央，28 ℃培养至6 d时，用游标卡尺测量菌落直径并记录[14-15]。设置3次重复。
-
用无菌打孔器在病原菌平板上打取直径6 mm 的菌饼，放入PDA平板中央，28 ℃培养，定期观察菌落，用游标卡尺测量菌落直径并记录[16-17]，设置3次重复。
-
将孢子悬浮液分别混合于体积分数为0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L−1的石菖蒲精油和质量浓度为1.0%的葡萄糖混合溶液中，将上述混合溶液50 µL分别滴入双凹载玻片，置于培养皿中(直径 200 mm)，25 ℃保湿培养，6、12、18 h时在显微镜下观察孢子萌发情况，每个处理镜检孢子数为200 个，以芽管长度超过孢子直径一半计为孢子萌发[18]，设置3次重复。孢子萌发率计算公式为：孢子萌发率=(萌发孢子数/检查孢子总数)×100%
-
①丙二醛(MDA)质量摩尔浓度测定。将体积分数为0.1%的吐温80与石菖蒲精油混合充分后乳化，在PDB中加入一定量的孢子悬浮液，使孢子终浓度为109 CFU·L−1。分别抽滤取5 g菌丝在体积分数为0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L−1石菖蒲精油的PBS缓冲液中培养，0、2、4、6、8、10 h后取0.2 g菌丝冰浴研磨，加入1 mL无菌双蒸水提取，4 ℃ 10 000 r·min−1，20 min离心取上清液，采用硫代巴比妥酸法测定吸光度。②相对电导率测定。抽滤取5 g PDB中的菌丝在不同体积分数(0、250、500、750、1 000 μL·L−1)的石菖蒲精油-PBS缓冲液中培养，分别在0、10、20、40、60、120、180 min取样测定电导率，并计算相对电导率[19]，设置3次重复。
-
将菌丝(湿质量2 g)加入到体积分数为0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L−1的石菖蒲精油无菌水中，28 ℃下摇床培养，分别于1、2、3、4、5 h后收集上清液测量可溶性碳水化合物、可溶性蛋白和核酸泄漏量[20]，设置3次重复。以蔗糖为标准，使用蒽酮试剂法测量藤仓镰刀菌可溶性碳水化合物的泄漏程度；使用蛋白质检测试剂盒(生工生物技术有限公司，上海)检测可溶性蛋白泄漏程度；通过检测上清液在波长260 nm处的吸光度D(260)来判断核酸的泄漏程度，设置3次重复。
-
菌丝固定采用戊二醛、锇酸的双重固定法。取适量0、500 μL·L−1的石菖蒲精油平板上生长的菌丝边缘部分，浸泡于体积分数为3%的戊二醛溶液中，20 ℃固定，过夜后用pH 6.8的PBS缓冲液冲洗15 min，而后用体积分数为1%的锇酸溶液4 ℃固定2 h，再经乙醇梯度脱水、包埋、聚合、切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后置于透射电镜下观察[21]。
-
采用GraphPad Prism 8进行绘图，通过SPSS 24.0单因素方差分析进行数据统计及差异显著性分析，显著性水平为0.05。
-
如图1A所示：在秀珍菇20 ℃储藏2 d出现病症后，根据组织分离法分离致病菌，按照不同的菌落形态和生长特征，分离到3株致病菌。
图 1 秀珍菇致病菌病症与形态
Figure 1. Pathogen disease and morphology of P. geesteranus
根据科赫氏法则，将分离的3株真菌回接至经过表面灭菌的秀珍菇上进行验证，发现仅1株菌株出现了与病症相似的表现(图1B)。再取回接发病病症处的菌丝进行纯化培养，观察到与其形态一致，证明该菌株为秀珍菇主要致病菌。
由图1C~E可见：菌落规则，圆形，棉絮状或毛毡状，菌丝体初期白色，生长旺盛，后期成淡黄色，菌丝有隔，分枝，大型分生孢子呈镰刀形或纺锤形，有隔膜，呈无色或透明。与镰刀菌属形态学基本一致。将测序所得的序列，利用NCBI网站的BLAST在线对比，将ITS序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行对比分析(图2)，发现ITS序列与KJ605159.1 Fusarium fujikuroi strain GF3、MT982185.1 镰刀菌属Fusarium sp. isolate SZMC27192、MN747996.1 层生镰刀菌Fusarium proliferatumi isolate SC2.2、KF999820.1 Fusarium sp. CHJ2、MN871556.1 甜瓜镰刀菌Fusarium incarnatum clone LS760、MW405882.1 Fusarium proliferatumi isolate、KP893211.1 Fungal sp.、MT530228.1丛赤壳属Nectriaceae sp.、KT351627.1 Fusarium sp. T28、MN947247.1 Fusarium fujikuroi isolate DL3.2、MW599749.1 尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum strain DHRL-04有不同程度的相似，对比发现该菌株与KJ1605159.1 Fusarium fujiuroi strain GF3同源性达99%，基本确定该菌株为藤仓镰刀菌。另外，选取几株同源性不同的序列，下载序列利用Neighbor-Joining方法构建系统发育树。由图2可知：该菌株与藤仓镰刀菌聚为一支，有非常近的亲缘关系。结合形态学特征与生物学鉴定结果分析，确定该致病菌为藤仓镰刀菌。
图 2 ITS基因序列构建的系统发育树
Figure 2. Phylogenetic tree based on ITS sequence
-
如图3所示：培养5 d后，藤仓镰刀菌在不同精油平板上的菌落直径不同，菌落直径越小表征菌丝生长越缓慢，则该精油的抑制效果越好。石菖蒲精油在13种精油中对藤仓镰刀菌的抑制效果最佳，故选择石菖蒲精油进一步研究。
图 3 植物精油对藤仓镰刀菌的抑制率
Figure 3. Inhibition rate of plant essential oil against F. fujikuroi
-
由图4可知：250 μL·L−1的石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝生长有明显的抑制效果，培养4 d后不同体积分数处理的菌丝生长存在显著差异(P＜0.05)，1 000 μL·L−1的石菖蒲精油能完全抑制藤仓镰刀菌的生长，且转接至无精油PDA平板后依旧不生长。可确定石菖蒲精油对藤仓镰刀菌的半数效应体积分数(抑菌率达50%的体积分数为半数效应体积分数，EC50)为500 μL·L−1，最小抑菌体积分数为1 000 μL·L−1。
图 4 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝生长的影响
Figure 4. Effects of A. tatarinowii essential oil on mycelial growth of F. Fujikuroi
如图5所示：随着石菖蒲精油体积分数的升高，藤仓镰刀菌孢子萌发率显著降低(P＜0.05)。处理18 h以后，对照组孢子萌发率达85.7%，而750和1 000 μL·L−1石菖蒲精油处理组孢子萌发率分别为4.2%和0，孢子萌发抑制率分别为95.1%和100.0%。表明在一定体积分数范围内，石菖蒲精油能显著抑制藤仓镰刀菌孢子的萌发。
图 5 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌孢子的影响
Figure 5. Effects of A. tatarinowii essential oil on colony diameter of F. Fujikuroi
-
用相对电导率来表征膜通透率，相对电导率越高，膜通透性越大。如图6A所示：藤仓镰刀菌相对电导率随着石菖蒲精油体积分数的升高而升高。处理组在80 min后显著高于对照组(P＜0.05)。3 h后对照组相对电导率为23.2%，而1 000 μL·L−1石菖蒲精油处理组的相对电导率达55.1%。表明精油处理可显著提高藤仓镰刀菌的相对电导率(P＜0.05)，从而可进一步增加高藤仓镰刀菌的膜通透性。
图 6 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌相对电导率和MDA的影响
Figure 6. Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi Relative conductivity and MDA content
MDA是细胞膜脂过氧化的产物，可以反映细胞膜脂过氧化的程度，是指示膜系统受伤的重要指标之一。如图6B所示：经过石菖蒲精油处理的藤仓镰刀菌，MDA质量摩尔浓度显著高于对照，1 000 μL·L−1石菖蒲精油处理组在10 h后MDA质量摩尔浓度是对照的3倍。表明石菖蒲精油能够破坏细胞脂膜结构，从而导致MDA质量摩尔浓度上升，加速菌丝细胞的膜脂过氧化。
-
细胞内容物出现在培养液中说明细胞的质膜受到了破坏，也是细胞膜损伤的重要表征指标。如图7所示：培养液中可溶性蛋白、核酸、可溶性碳水化合物随着精油处理时间的延长都有不同程度的上升。表明经石菖蒲精油处理后，细胞内容物出现不同程度泄漏，且随着精油体积分数的增大而升高。说明精油处理能够破坏脂膜结构，从而导致细胞内容物泄漏。
图 7 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌可溶性碳水化合物、可溶性蛋白、核酸泄漏量的影响
Figure 7. Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi relative soluble carbohydrate, soluble protein content, nucleic acid leakage
-
采用扫描电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响，发现未经精油处理的菌丝表面光滑，存在孢子丛(图8A)。精油处理后(图8B)的菌丝皱缩，无孢子产生。进一步说明石菖蒲精油能够破坏藤仓镰刀菌菌丝结构，影响菌丝正常生长，并抑制孢子的产生。本研究结果与顾可飞等[13]发现精油可造成真菌菌丝畸形或使真菌菌丝断裂的结论基本一致。
图 8 扫描电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响
Figure 8. Sem observation of the effect of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi mycelium structure
进一步采用透射电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌细胞超微结构的影响，发现未经精油处理的细胞形态完整，质膜均匀，细胞壁清晰(图9A)。经石菖蒲精油处理的菌丝细胞膜和核膜破坏严重，细胞各结构也有较大破坏(图9B)。表明石菖蒲精油的抑菌机制可能是通过破坏藤仓镰刀菌细胞膜的完整性，暴露和侵蚀细胞器，造成细胞损伤，最终导致细胞死亡。
图 9 透射电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响
Figure 9. Effect of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi mycelium structure observed by transmission electron microscopy
-
本研究对秀珍菇的采后致病菌进行分离，根据科赫氏法则确定其致病性，在形态上致病菌菌落呈白色，后期为淡黄色，菌丝有隔有分支，孢子呈镰刀型，在形态学上对比发现其与镰刀菌形态学描述一致；利用rDNA-ITS序列对比和系统发育树分析的方法，发现致病菌与藤仓镰刀菌相似度达99%，由此确定藤仓镰刀菌为秀珍菇采后储藏中的主要致病真菌，该菌在百香果Passiflora eduli[22]、樱桃番茄Lycopersicon esculentum var. cerasiforme[23]等农产品均见报道，是较为常见的致病菌。
研究13种常见植物精油对对藤仓镰刀菌抑制效果时发现：石菖蒲精油对藤仓镰刀菌控制效果最佳，其EC50为500 μL·L−1，最小抑菌体积分数为1 000 μL·L−1。相同体积分数处理下，石菖蒲精油对孢子萌发的抑制率高于对菌丝生长的抑制率，说明藤仓镰刀菌孢子对石菖蒲精油的敏感度更高，这与PEI等[24]探究香芹酚对炭疽菌的抑制效果相似。
经对藤仓镰刀菌培养液中MDA和相对电导率变化情况的观测，发现石菖蒲精油的处理可使藤仓镰刀菌的胞内MDA质量摩尔浓度增加，MDA质量摩尔浓度和相对电导率是表征菌丝细胞膜脂过氧化程度和细胞膜结构破坏程度的重要指标[25]，MDA质量摩尔浓度增加表明石菖蒲精油能够加速藤仓镰刀菌的膜脂氧化，加剧细胞内物质的外泄；而扫描电镜和透射电镜结果也显示藤仓镰刀菌菌丝表面出现褶皱，菌丝细胞壁膜被破坏。LIU等[26]研究表明：香草精油的抗真菌活性是由于其能够破坏细胞膜结构。PEI等[24]发现：香芹酚能够使炭疽菌细胞膜通透性增加。本研究表明：石菖蒲精油能够有效抑制藤仓镰刀菌作用机制，破坏藤仓镰刀菌膜系统结构，引起内容物泄漏，进而导致菌体死亡。
Identification of postharvest pathogenic bacteria and the bacteriostasis of plant essential oil for Pleurotus geesteranus
-
摘要:
目的 分离鉴定秀珍菇Pleurotus geesteranus采后的主要致病菌，寻找有效防治真菌病害的植物精油抑菌方法，为秀珍菇采后的保鲜技术提供参考。 方法 以秀珍菇采后分离鉴定的主要病原真菌为防治对象，在常见的13种精油中筛选有效精油，分析精油对采后主要病原菌菌丝生长、孢子萌发、菌丝形态结构及其细胞膜脂过氧化和细胞内容物外泄程度的影响，以不使用精油为对照，研究防治作用机制。 结果 秀珍菇采后主要病原真菌为藤仓镰刀菌Fusarium fujiuroi。在13种备选精油中，石菖蒲Acorus tatarinois精油对藤仓镰刀菌具有良好的抑制效果。石菖蒲精油体积分数为1 000 μL·L−1时能够完全抑制藤仓镰刀菌的生长，且在此范围内体积分数越高，抑菌效果越好。石菖蒲精油能够提高藤仓镰刀菌细胞膜的通透性，当体积分数为1 000 μL·L−1的石菖蒲精油处理3 h后，藤仓镰刀菌相对电导率、丙二醛和细胞内容物泄漏量分别为对照组的2、5和3倍。扫描电镜和透射电镜观察结果表明：石菖蒲精油能改变藤仓镰刀菌菌丝形态并破坏其细胞结构。 结论 石菖蒲精油能够加剧藤仓镰刀菌菌丝细胞膜脂过氧化，破坏菌丝结构，进而加速细胞凋亡，从而抑制藤仓镰刀菌的生长繁殖。图9参26 Abstract:Objective This study, with the main pathogens of Pleurotus geesteranus after harvest isolated and identified, is aimed to investigate the antibacterial activities of plant essential oil that effectively prevent and control fungal diseases so as to provide reference for the development of preservation technology of P. geesteranus after harvest. Method With major pathogenic fungi isolated and identified from P. geesteranus as the research objects of prevention and control, the most effective essential oils were screened out from 13 kinds of common essential oils before an analysis was conducted of their effects on the mycelial growth, conidia germination, mycelial morphology and structure, membrane lipid peroxidation and leakage of cell contents of the main postharvest pathogens in order to study the mechanism of prevention and treatment. The control group was treated without essential oil. Result Among the 13 alternative essential oils, Acorus tatarinowii essential oil had a good inhibitory effect on Fusarium fujiuroi and the growth of F. fujikuroi could be completely inhibited by 1 000 μL·L−1 A. tatarinowii essential oil with the concentration of essential oil positively correlated with the antifungal effect. After the treatment with 1 000 μL·L−1 essential oil for 3 h, the relative conductivity, MDA and cell contents in the cultured liquid of F. fujikuroi were 2 times, 5 times and 3 times of those in the control group, respectively. According to the results of scanning electron microscopy and transmission electron microscopy, the essential oil of A. tatarinowii could change F. fujikuroi mycelium morphology and destroy its cell structure. Conclusion A. tatarinowii essential oil could accelerate the membrane lipid peroxidation of mycelia cells, increase the permeability of cell membrane, destroy the normal physiological function of cells and cause cell death, thereby inhibiting the growth and reproduction of F. fujikuroi. [Ch, 9 fig. 26 ref.] -
沙棘Hippophae rhamnoides又名醋柳，是胡颓子科Elaeagnaceae沙棘属Hippophae的落叶性灌木[1]。作为药食同源植物的沙棘不仅在食疗、医药、农林牧渔等领域具有较大的经济价值，在水土保持、恢复生物链及防风固沙中也具有极大的生态价值[2-5]。生长过程中沙棘根部会遭受土壤中放线菌、细菌的侵染形成根瘤。部分菌种会在根瘤中高度富集发挥固氮、促生长、抵御逆境胁迫、防止有害病菌侵染等功能[6-8]。传统的微生物研究方法主要以培养基进行分离纯培养，再进而探究其培养特征、显微结构、生理特性等[9]。而自然界中90%以上的微生物为不可培养微生物，且现有培养基与培养技术不适应未知菌群的生长，或部分菌群生长缓慢、丰度较小等情况都会对菌群的多样性评估产生影响[10]。以二代高通量测序为基础的16S rDNA技术通过对编码原核核糖体小亚基rRNA的DNA序列进行测序，不仅克服了传统方法难以获得不可培养菌株的弊端，还能对样品中的物种相对丰度进行排序，并分析各群组样品中发挥重要作用的优势物种，解析样品中微生物之间的相互作用。该技术对研究沙棘根瘤内生菌微生物多样性与环境关系以及微生物资源的开发利用有重要的理论和现实意义[11-16]。
本研究通过16S rRNA测序技术对沙棘根瘤内生菌进行物种注释、分类学分析、α多样性分析、β多样性分析、组间差异显著性分析，比较高通量测序和纯培养方法的差异与优劣，为发掘具有应用价值的根瘤内生菌资源提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料采集
采样地为内蒙古自治区巴彦淖尔市磴口县中国林业科学研究院沙漠林业实验中心试验林场(40°29′34″N，106°74′06″E)。该研究区海拔为1 054 m，年平均气温为7.4 ℃。2020年7月，选取人为干扰因素较少的沙漠边缘地带采集沙棘根瘤样品。在每个样地10 m×10 m的区域内用网格法定9个点，运用梅花形采样法在边角及中心共5个点分别采集根瘤样品并进行混合，共设计6组重复样，分别命名为M1、M2、M3、M4、M5、M6。
1.2 沙棘根瘤内生菌的分离培养
1.2.1 沙棘根瘤内生菌的分离
依据文献[17-18]的方法进行修改，使其更加适宜沙棘根瘤内生菌的分离。详细步骤如下：选取新鲜饱满的根瘤，冲洗掉土粒泥沙，将根瘤团用解剖刀分割成带有单柄的瘤瓣，用纱布包裹，先用体积分数为95%的酒精溶液浸泡30 s，再用体积分数为10%的次氯酸钠溶液表面灭菌5 min，取出后用无菌水冲洗数次。在灭菌滤纸上，用无菌解剖刀先切取根瘤头部，再将其均分成2~3份薄片，置于固体培养基中28 ℃恒温暗处静置培养。根据相关研究，本研究选取BAP[19]、S[20]、JA[19]、高氏一号培养基[19]进行分离培养。
1.2.2 沙棘根瘤内生菌的鉴定
提取纯培养的沙棘根瘤内生菌DNA后，对16S rDNA全长进行PCR扩增。序列引物采用YU等[21]设计的细菌通用引物(引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR总反应体系为50 μL，包括10×缓冲液(KOD buffer) 5 μL、2 mmol·L−1三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液(dNTPs) 5 μL、基因组DNA (genomic DNA) 1 μL、上游引物(forward primer) (10 μm) 1 μL、下游引物(reverse primer) (10 μm) 1 μL、DNA聚合酶(KOD DNA polymerase) 1 μL、超纯水(ddH2O) 36 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳，确定有特异扩增后，进行PCR产物回收和测序注释，并参考文献[22-25]进行比对校验。
1.3 沙棘根瘤内生菌的高通量测序分析
1.3.1 建库测序
提取沙棘根瘤总DNA后，根据16S rDNA保守区设计引物(引物序列335F：5′-CADACTCCTACGGGAGGC-3′，769R：5′-ATCCTGTTTGMTMCCCVCRC-3′)，在引物末端加上测序接头，便于建库时添加能区分样本的碱基序列的条码/索引(barcode/index)。再进行PCR扩增并对其产物进行紫外分光光度计定量及混样、过柱纯化和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序[26]。高通量测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别分析转化为原始测序序列，结果以FASTQ (简称为fq)文件格式存储[27]。
1.3.2 测序数据处理
首先使用 Trimmomatic v.0.33软件[28]，对测序得到的原始测序序列进行过滤；其次使用cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的高质量测序序列；然后使用FLASH v1.2.7软件[29]，按照最小重叠(overlap)长度为10 bp、重叠区允许的最大错配比率为0.2的要求，对每个样品高质量的一小段短的基因测序片段(reads)进行拼接，得到的拼接序列即原始序列质控后的高质量测序序列(clean reads)；最后使用UCHIME v4.2软件[30]，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。使用Usearch软件对reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，获得分类操作单元(OTU)[31]，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU[32]。以SILVA (
http://www.arb-silva.de/ )为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释，可得到每个特征对应的物种分类信息，进而在各水平(门、纲、目、科、属、种)统计样品群落组成，利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制样品分类学水平下的群落结构图[33]。使用QIIME软件对样品α多样性进行评估和t检验(显著性水平为0.01)。利用Mothur v1.30软件和R语言工具包绘制稀释曲线。基于独立OTU，采用加权分析方法和Bray-Curtis算法，使用QIIME软件进行非加权组平均法(UPGMA)分析，比较各组样品间的物种差异。2. 结果与分析
2.1 分类操作单元(OTU)聚类分析
使用Usearch软件对clean reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，共计获得651个OTU。各样品OTU个数分布较为均匀，样品M1~M6分别为551、583、579、518、593、589个。如图1所示：6组样品中共有的OTU数为417个。M3、M5、M6中分别有4、2、9个特有的OTU，为样品特有OTU，非单个样品特有或所有样品间共有的OTU在图1未做展示。从整体来看，不同地点的各样品间的OTU差异性远小于共性，说明采样方法设计合理。
图 1 沙棘(M1~M6)根瘤样品分类操作单元(OTU)花瓣图Figure 1 Petal image of operational taxonomic unit (OTU) of H. rhamnoides root nodule sample (M1－M6)2.2 测序深度分析与α多样性指数分析
对6组样品测序共获得 810 039对reads，双端reads质控、拼接后共产生617 188条clean reads。其中质量≥20的碱基占总碱基数的比例(Q20)为98.7%，质量≥30的碱基占总碱基数的比例(Q30)为95.4%，表明测序质量较好。从图2可见：各样品稀释性曲线趋向平缓，表明在持续抽样下新物种出现的速率逐渐趋于平缓，此环境中物种数量不会随测序数量的增加而显著增多[34]，说明取样合理，能较好体现6组样品中根瘤内生菌的多样性，可以进行数据分析。M5的Shannon和Simpson指数最大(表1)，说明物种多样性最高。同理，M4的物种多样性最低。物种丰度方面M5与M6差别不大，均有较高水平。M4根瘤样品的物种丰度最低。样点的Shannon指数平均为4.24，Simpson指数平均为0.70，Ace指数平均为585.79，Chao1指数平均为595.47，样本文库平均覆盖率为99.95%。说明采样地的沙棘根瘤内生菌的物种丰富且多样性较大，各物种分配相对均匀，其微生物物种信息得到了充分体现。
表 1 各组样品的α多样性指数Table 1 Alpha diversity index for each group of samples样品 Shannon
指数Simpson
指数Ace
指数Chao1
指数覆盖
率/%M1 2.53 0.47 568.45 598.57 99.95 M2 4.73 0.79 595.09 600.60 99.95 M3 4.28 0.75 600.58 607.45 99.95 M4 2.52 0.44 542.32 543.52 99.94 M5 6.58 0.95 605.66 610.71 99.94 M6 4.82 0.77 602.63 611.97 99.94 平均 4.24 0.70 585.79 595.47 99.95 2.3 传统纯培养与高通量测序分析沙棘根瘤内生菌的群落结构及其差异
通过传统分离方法从BAP、JA、S、高氏一号培养基中得到纯培养菌株96株。所有菌株均可传代培养，但菌株之间培养周期差异较大，培养周期在1~30 d呈离散型分布。对各菌株进行分子鉴定，共有4门8纲8目13科19属。在门的分类水平分别为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes和柔膜菌门Tenericutes。在属的分类水平上，96株菌分属于支原体属Mycoptasma 1株、慢生根瘤菌属Bradyrhizobim 6株、土壤杆菌属Agrobacterium 7株、肠杆菌属Enterobacter 6株、小坂菌属Kosakonia 8株、柠檬酸杆菌属Citrobacter 1株、约克氏菌属Yokenella 1株、欧文氏菌属Erwinia 1株、克罗诺杆菌属Cronobacter 2株、泛菌属Pantoea 1株、莫拉菌属Moraxella 1株、贪噬菌属Variovorax 1株、草螺菌属Herbaspirillum 1株、假单胞菌属Pseudomonas 5株、链霉菌属Streptomyces 14株、小单孢菌属Micromonospora 1株、短杆菌属Brevibacterium 6株、葡萄球菌属Straphylococcus 1株和芽孢杆菌属Bacillus 32株。其中，优势门为变形菌门和厚壁菌门，优势属为芽孢杆菌属和链霉菌属。
高通量测序分析发现：6组样品共有14门34纲89目148科314属。将相对丰度大于0.1%的门与相对丰度前10的属进行汇总(图3、表2、表3)发现：在门的分类水平上，6组样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。其次为拟杆菌门Bacteroidetes、杆菌门Patescibacteria、厚壁菌门、酸杆菌门Acidobacteria。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属Frankia占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。其次为根瘤菌属Rhizobium、类固醇杆菌属Steroidobacter、糖单孢菌属Saccharimonadales、肠杆菌属、泛菌属、欧文氏菌属、假黄色单胞菌属Pseudoxanthomonas、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属、固氮弓菌属Azoarcus、伯克氏菌属Burkholderia、芽单胞菌属Blastomonas、聚集杆菌属Congregibacter、拉恩氏菌属Rahnella、鞘氨醇菌属Chitinophaga、独岛杆菌属Dokdonella、普雷沃氏菌属Prevotella、链霉菌属、Microtrichales属。
表 2 沙棘微生物区系门水平的相对分布Table 2 Relative abundance of microbiota taxa at the level of phylum分类 6组样品在门水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 放线菌门 73.55 47.56 51.24 76.09 27.73 57.68 变形菌门 22.38 41.91 41.63 21.01 60.35 29.82 拟杆菌门 0.89 1.42 1.30 0.40 2.18 4.42 杆菌门 0.31 5.66 3.89 0.73 1.42 1.72 厚壁菌门 2.18 2.74 1.30 1.21 2.18 4.42 酸杆菌门 0.15 0.26 0.42 0.18 1.16 0.53 其他 0.54 0.45 0.22 0.38 0.75 0.60 表 3 沙棘微生物区系属水平的相对分布Table 3 Relative abundance of microbiota taxa at the level of genus分类 6组样品在属水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 弗兰克氏菌属 72.62 44.45 49.50 74.81 20.12 47.41 根瘤菌属 1.17 1.97 2.89 2.04 3.13 4.13 类固醇杆菌属 0.73 0.83 1.05 2.20 7.19 2.87 糖单孢菌属 0.28 5.61 3.85 0.71 1.41 1.68 肠杆菌属 6.93 2.19 1.05 0.08 0.22 0.40 泛菌属 0.63 5.19 4.69 0.01 0.05 0.11 欧文氏菌属 0.60 4.66 3.77 0.10 0.18 0.23 假黄色单胞菌属 0.85 1.98 1.67 0.75 3.56 0.68 鞘脂单胞菌属 0.39 1.06 2.10 1.55 2.10 1.64 假单胞菌属 0.51 1.27 5.60 0.03 0.21 0.09 其他 15.29 30.79 23.83 17.72 61.83 40.76 
图 3 6组根瘤样品的非加权组平均法(UPGMA)聚类树与物种分布柱状图Figure 3 UPGMA clustering tree and the species distribution histogram of the six groups of nodule samples are combined drawing在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。在门水平上，纯培养菌株中占比较高的厚壁菌门在高通量测序中占比并不高。在属水平上，纯培养菌株中占比较高的芽孢杆菌属和链霉菌属皆在高通量测序中占比很低。该对比结果差异性较大，说明高通量测序在微生物多样性分析中占据优势地位，要优于纯培养方法。同时也说明，沙棘根瘤内共生细菌群落结构更为复杂，群落更为稳定。
3. 结论与讨论
3.1 结论
在运用传统方法分离纯培养微生物时，共分离纯培养菌株96株，分属于4门8纲8目13科19属，未获得弗兰克氏菌属的菌株，可能是培养基中弗兰克氏菌属的菌株生长缓慢，易被其他菌群取代，因此仍需探索新的培养基与培养方法以遏制根瘤中其他菌株的繁殖。在微生物多样性分析中，由于环境中的微生物复杂多样，各环境之间组成差异较大，通常采用非加权方法进行分析。该方法简单易操作，主要考虑物种的有无，但未考虑物种的丰度，所以采用非加权的方法难以区别各样品间的差异。
高通量测序分析共检测到14门34纲89目148科314属。在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。与纯培养获得的菌株相比，高通量测序分析结果更加完整地揭示了沙棘根瘤内生菌的微生物多样性。高通量测序表明：在门的分类水平上，样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。
3.2 讨论
张爱梅等[35]和刘志强等[36]分别对甘肃榆中、辽宁通辽、内蒙古赤峰等地沙棘根瘤内生菌微生物多样性做过类似研究，其高通量测序所得的微生物多样性高于本研究结果，说明沙棘根瘤内生菌微生物多样性受地理位置、土壤成分、气候条件、宿主种类及生长环境等多种因素的影响。本研究的沙棘取样于内蒙古乌兰察布沙漠边缘地带，采样地荒漠化土壤与干旱少雨气候对内生菌多样性有特别影响。
属于非豆科Leguminosae植物的沙棘根瘤共生固氮体系是以弗兰克氏菌属为主导的[37]微生物—微生物—植物互作体系。高通量测序分析显示：弗兰克氏菌属所占比例较高，然而本次传统方法分离却未得到纯培养菌株，这可能是由于培养基中缺乏某种信号物质或与其他菌属竞争存在劣势导致的，建议添加制霉菌素、萘啶酮酸和放线菌酮抑制其他菌群的繁殖[18]。非豆科植物结瘤固氮过程，单一属的菌株难以完成此任务。有研究[38]表明：纯培养分离的贪噬菌属是复杂微生物组中维持根生长的核心菌属，并且具有产生和降解生长素的能力，是细菌—细菌—植物通讯网络的关键角色。小单孢菌是植物益生菌，在促进植物生长的同时还可以分泌细胞壁降解酶促进细胞壁的降解，进而便于弗兰克氏菌的侵染[39-40]，但是小单孢菌的快速繁殖也对弗兰克氏菌的生长起到抑制作用。沙棘作为胡颓子科植物，根部结瘤侵染方式为细胞间侵入。研究[41]表明：草螺旋菌属Spirillum、慢生根瘤菌属、肠杆菌属的相关细菌与弗兰克氏菌存在负相关性(即抑制关系)，以上3个菌属均在豆科、禾本科Poaceae植物中发挥固氮相关的重要作用，但在胡颓子科中此类细菌与弗兰克氏菌属相互作用的机制尚未明确。
-
图 3 植物精油对藤仓镰刀菌的抑制率
Figure 3 Inhibition rate of plant essential oil against F. fujikuroi
图 4 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝生长的影响
Figure 4 Effects of A. tatarinowii essential oil on mycelial growth of F. Fujikuroi
图 5 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌孢子的影响
Figure 5 Effects of A. tatarinowii essential oil on colony diameter of F. Fujikuroi
图 6 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌相对电导率和MDA的影响
Figure 6 Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi Relative conductivity and MDA content
图 7 石菖蒲精油对藤仓镰刀菌可溶性碳水化合物、可溶性蛋白、核酸泄漏量的影响
Figure 7 Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi relative soluble carbohydrate, soluble protein content, nucleic acid leakage
图 8 扫描电镜观察石菖蒲精油对藤仓镰刀菌菌丝结构的影响
Figure 8 Sem observation of the effect of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi mycelium structure
-
[1] LIAO Xiyu, ZHU Zhenjun, WU Shujian, et al. Preparation of antioxidant protein hydrolysates from Pleurotus geesteranus and their protective effects on H2O2 oxidative damaged PC12 cells [J/OL]. Molecules, 2020, 25(22): 5408[2021-11-20]. doi:10.3390/molecules25225408. [2] 张志勇. 1-MCP短时处理对采后秀珍菇贮藏品质、能量状态和鲜味的影响[D]. 沈阳: 沈阳农业大学, 2020. ZHANG Zhiyong. Effects of 1-MCP Treatment on Storage Quality, Energy Status and Umami Taste of Pleudodes after Harvest [D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2020. [3] 冯志勇, 王志强, 郭力刚, 等. 秀珍菇生物学特性研究[J]. 食用菌学报, 2003, 10(3): 11 − 16. FENG Zhiyong, WANG Zhiqiang, GUO Ligang, et al. Studies on the biological characteristics of Pleurotus geesteranus [J]. Acta Edulis Fungi, 2003, 10(3): 11 − 16. [4] 杨军, 李钊. 现代物流发展中的食用菌保鲜技术探讨[J]. 中国食用菌, 2020, 39(6): 53 − 55. YANG Jun, LI Zhao. Discussion on edible fungi preservation technology in the development of modern Logistics [J]. Edible Fungi China, 2020, 39(6): 53 − 55. [5] CHOUHAN S, SHARMA K, GULERIA S. Antimicrobial activity of some essential oils-present status and future perspectives [J]. Medicines, 2017, 4(3): 58 − 63. [6] CARDOSO-UGARTE G A, SOSA-MORALES M E. Essential oils from herbs and spices as natural antioxidants: diversity of promising food applications in the past decade [J/OL]. Food Rev Int, 2021[2021-12-01]. doi:10.1080/87559129.2021.1872084. [7] 贾会玲, 韩双双, 黄晓德, 等. 植物精油对植物病原菌的抑菌活性研究进展[J]. 中国野生植物资源, 2018, 37(6): 47 − 52. JIA Huiling, HAN Shuangshuang, HUANG Xiaode, et al. Advances in antifungal activity of plant essential oil against plant pathogens [J] Chin Wild Plant Resour, 2018, 37(6): 47 − 52. [8] 邱夕兰, 彭善丽, 程磊, 等. 植物精油微胶囊的制备及在食品保鲜中的应用[J]. 食品研究与开发, 2021, 42(6): 205 − 210. QIU Xilan, PENG Shanli, CHENG Lei, et al. Preparation of microencapsulation of plant essential oil and its application in food preservation [J]. Food Res Dev, 2021, 42(6): 205 − 210. [9] 王丹, 张静, 翟浩, 等. 蓝莓采后果实致腐菌的分离鉴定及植物精油对其抑制作用的研究[J]. 保鲜与加工, 2020, 20(2): 52 − 56. WANG Dan, ZHANG Jing, ZHAI Hao, et al. Isolation and identification of Fusarium oxysporum from postharvest blueberry fruit and inhibitory effect of plant essential oils [J]. Storage Process, 2020, 20(2): 52 − 56. [10] SPADACCINO G, FRABBONI L, PETRUZZI F, et al. Essential oil characterization of Prunus spinosa L. , Salvia officinalis L. , Eucalyptus globulus L. , Melissa officinalis L. and Mentha x piperita L. by a volatolomic approach [J/OL]. J Pharm Biomed Anal, 2021, 202: 114167[2021-12-02]. doi: 10.1016/j.jpba.2021.114167. [11] 史冬辉, 刘洪波, 杨小丰, 等. 黄山木兰精油对9种植物病原真菌的抑菌活性[J]. 浙江农林大学学报, 2009, 26(2): 223 − 227. SHI Donghui, LIU Hongbo, YANG Xiaofeng, et al. Antifungal activity of the essential oil from Magnolia cylindrica on nine phytopathogenic fungi [J]. J Zhejiang A&F Univ, 2009, 26(2): 223 − 227. [12] 倪蕴琪, 唐静仪, 洪惠. 包埋肉桂精油的牦牛骨蛋白肽-钙螯合物的制备及抑菌效果[J]. 浙江农林大学学报, 2021, 38(3): 597 − 604. NI Yunqi, TANG Jingyi, HONG Hui. Preparation and antibacterial effect of yak bone protein peptide-calcium chelate embedded with cinnamon essential oil [J]. J Zhejiang A&F Univ, 2021, 38(3): 597 − 604. [13] 顾可飞, 刘海燕, 杨海峰, 等. 电子束辐照对羊肚菌营养成分影响分析[J]. 食品工业科技, 2018, 39(12): 55 − 62. GU Kefei, LIU Haiyan, YANG Haifeng, et al. Effection analysis of electron beam irradiation on morels nutrient composition [J]. Sci Technol Food Ind, 2018, 39(12): 55 − 62. [14] 刘瑞玲, 郜海燕, 陈杭君, 等. 红肉火龙果采后病原菌分离鉴定与植物精油抑菌研究[J]. 农业机械学报, 2018, 49(8): 338 − 345. LIU Ruiling, GAO Haiyan, CHEN Hangjun, et al. Isolation, identification and inhibition of pathogens from red pitaya fruit during storage [J]. Trans Chin Soc Agric Mach, 2018, 49(8): 338 − 345. [15] OLIVEIRA T N S, SILVA-FILHO C M S, MALVEIRA E A, et al. Antifungal and antibiofilm activities of the essential oil of leaves from Lippia gracilis Schauer against phytopathogenic fungi [J]. J Appl Microbiol, 2021, 130(4): 1117 − 1129. [16] DIANEZ F, SANTOS M, PARRA C, et al. Screening of antifungal activity of 12 essential oils against eight pathogenic fungi of vegetables and mushroom [J]. Lett Appl Microbiol, 2018, 67(4): 400 − 410. [17] KUMAR P, MISHRA S, KUMAR A, et al. Antifungal efficacy of plant essential oils against stored grain fungi of Fusarium spp. [J]. J Food Sci Technol, 2016, 53(10): 3725 − 3734. [18] 侯绍云. TP-CS-PAA纳米粒抑制枇杷采后病原微生物的研究[D]. 杭州: 浙江工商大学, 2015. HOU Shaoyun. Investigation of TP-loaded CS-PAA Nanoparticles for Inhibiting Pathogens Fungi during the Postharvest of Loquat Fruits [D]. Hangzhou: Zhejiang Gongshang University, 2015. [19] 周灵灵, 高海燕, 李标, 等. R-多糖对荔枝炭疽病菌的抑制作用研究[J]. 中国食品学报, 2011, 11(7): 61 − 66. ZHOU Lingling, GAO Haiyan, LI Biao, et al. Study on the inhibitory action of R-Polysacchsrides against Colletotrichum gloeosporioides of litchi [J]. J Chin Inst Food Sci Technol, 2011, 11(7): 61 − 66. [20] 裴少培. 香芹酚的抑菌效果及其在火龙果保鲜技术中的应用[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2020. PEI Shaopei. Antimicrobial Activity of Carvacrol and Its Application on the Preservation of Pitaya Fruit [D]. Yangling: Northwest A&F University, 2020. [21] 赵璐藐, 郜海燕, 刘瑞玲, 等. 芋艿采后主要病原菌分离鉴定及桧木醇抑菌效果[J]. 食品科学, 2020, 41(12): 136 − 142. ZHAO Lumiao, GAO Haiyan, LIU Ruiling, et al. Identification of dominant postharvest pathogens of taro and antifungal activity of hinokitiol against them [J]. Food Sci, 2020, 41(12): 136 − 142. [22] 冯岩, 谢梓烁, 欧枝凯, 等. 镰刀菌引致的百香果病害研究[J]. 仲恺农业工程学院学报, 2019, 32(4): 13 − 18. FENG Yan, XIE Zishuo, OU Zhikai, et al. Study on diseases of Passiflora edulia caused by Fusarium [J]. J Zhongkai Univ Agric Eng, 2019, 32(4): 13 − 18. [23] KAI Kaikai, WANG Rui, BI Wanling, et al. Chlorogenic acid induces ROS-dependent apoptosis in Fusarium fujikuroi and decreases the postharvest rot of cherry tomato [J/OL]. World J Microbiol Biotechnol, 2021, 37(6)[2021-12-05]. doi:10.1007/s11274-021-03062-x. [24] PEI Shaopei, LIU Ruiling, GAO Haiyan, et al. Inhibitory effect and possible mechanism of carvacrol against Colletotrichum fructicola [J/OL]. Postharvest Biol Technol, 2020, 163: 111126[2021-12-08]. doi: 10.1016/j.postharvbio.2020.111126. [25] CAO Baohua, LIU Jia, QIN Guozheng, et al. Oxidative stress acts on special membrane proteins to reduce the viability of Pseudomonas syringae pv tomato [J]. J Proteome Res, 2012, 11(10): 4927 − 4938. [26] LIU Xiaoman, OUYANG Canbin, WANG Qiuxia, et al. Effects of oil extracts of Eupatorium adenophorum on Phytophthora capsici and other plant pathogenic fungi in vitro [J]. Pestic Biochem Physiol, 2017, 140: 90 − 96. 期刊类型引用(5)
1. 高佩，王彬贤，马亚琼，郭思雨，马玉花. 青海野生中国沙棘根际解磷菌的分离、鉴定及其对蕹菜的促生作用. 江苏农业科学. 2024(11): 247-253 . 
百度学术2. 方宇，刘彩玲，林陈强，陈济琛，贾宪波. 不同紫云英品种根瘤内生细菌的类群和多样性分析. 福建农业学报. 2024(06): 730-737 . 百度学术3. 马福林，马秀芳，刘瑞，马玉花. 西藏沙棘AQP基因的扩增及生物信息学分析. 青海科技. 2023(02): 107-111 . 百度学术4. 马福林，王昌玲，仁增卓玛，刘瑞，冶贵生，马玉花. 西藏沙棘根瘤内生菌假单胞菌属的分离与鉴定. 甘肃农业大学学报. 2023(03): 76-81+90 . 百度学术5. 翟柯尧，刘娟，董玥，李亚涛，贺义才，孙海红，马玉超. 沙棘通过自主选择塑造根瘤内生微生物组. 微生物学通报. 2023(09): 3881-3898 . 百度学术其他类型引用(3)
-
-
链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210819
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 493
- HTML全文浏览量: 153
- PDF下载量: 21
- 被引次数: 8
