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兰科植物Orchidaceae是被子植物中仅次于菊科Asteraceae的第二大科，约800属28 000种，广泛分布于热带和温带地区[1−2]。兰科植物进化水平高，拥有丰富的物种多样性、高度特化的花结构，生存繁衍对生态系统依赖程度高，是研究生态学和分子生物学的重要材料[3−5]。且兰科植物观赏价值极高，具有药理作用，有较高的经济价值，市场需求量大[6]。萼脊蝴蝶兰Phalaenopsis japonica曾被命名为萼脊兰Sedirea japonica，为萼脊兰属Sedirea，近年来根据分子生物学数据萼脊兰属被并入蝴蝶兰属Phalaenopsis [7]。产于中国浙江文成和云南盈江，及日本琉球群岛和朝鲜半岛南部，生于海拔600~1 350 m的疏林树干和山谷崖壁上[8]。按照濒危等级，萼脊蝴蝶兰被世界自然保护联盟(IUCN)评定为易危(VN)，列入濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)附录Ⅱ。其植株较小，叶片革质，总状花序，花期4月中旬至5月底，花形似蝴蝶，有香味，中萼片和花瓣呈淡黄绿色，侧萼片和唇瓣白紫相间，是蝴蝶兰Phalaenopsis aphrodite良好的育种材料。 KIM等[9]将萼脊蝴蝶兰与29个不同品种蝴蝶兰互为父母本进行杂交，得到3个萼脊蝴蝶兰做母本的杂交组合的后代，表型更接近蝴蝶兰。中国对萼脊蝴蝶兰组培快繁、分子生物学等进行了研究[10−12]，然而萼脊蝴蝶兰开花进程观察和繁育系统的研究仍欠缺。
繁育系统是指所有影响后代遗传组成的有性特征总和，主要包含花器官特征和开花进程、花粉活力与柱头可授性、花粉组织化学、杂交指数、人工控制授粉等方面[13]。前人对喇叭唇石斛Dendrobium lituiflorum、长瓣兜兰Paphiopedilum dianthum等植物的繁育系统研究[14−17]，为研究萼脊蝴蝶兰开花进程与繁育系统提供方法学基础。SUETSUGU等[18]通过观察自然条件下的萼脊蝴蝶兰，发现其授粉成功率仅为7.7%，认为萼脊蝴蝶兰可能无法自发进行自花授粉。本研究以温室栽培条件下的萼脊蝴蝶兰植株为研究对象，记录其开花进程，进行人工控制授粉，测定分析其繁育系统，为人工授粉和杂交育种提供依据，以期更好地保护和利用种质资源。
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萼脊蝴蝶兰由野外采集的果实经无菌播种培育而成，随机选出长势良好的100株4年生萼脊蝴蝶兰。试验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所无土栽培温室进行，常年保持温度26~30 ℃。春秋两季开天窗通风，夏季开风机配合水帘降温，冬季暖气供暖。全温室附60%遮阳网，夏季额外再附1层60%遮阳网。夏季每周浇水2次，春秋冬每周浇水1次。
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随机选取10株，统计单株花序数与单花序花数。随机选取盛花期全天开放的花10朵，用直尺和游标卡尺测量植株性状(株高、最大叶长/宽/厚、冠幅、花序长/粗)和花部性状(中萼片长/宽、侧萼片长/宽、花瓣长/宽、唇瓣长/宽、合蕊柱长/宽、子房长/宽、药帽直径)。并在体视显微镜(Olympus SZX7)下观察花部特征形态结构，观察盛花期成熟花粉团，用扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)进行拍照。具体步骤：取样后立即将花粉团投入FAA固定液中(100 mL FAA：体积分数为50%的乙醇 90 mL、冰乙酸 5 mL、甲醛 5 mL)，上下颠倒保证花粉团完全浸入FAA固定液，4 ℃固定24 h，随后对其进行梯度乙醇脱水(体积分数分别为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇各处理15 min)，更换100%乙醇放入冰盒等待干燥。用二氧化碳临界点干燥仪(Leica CPD300)干燥5 h，将样品待观察部位朝上放置在有双面胶的金属台上，用洗耳球轻吹使其粘牢，用离子溅射仪(Hitachi E-1010)对金属台喷金镀膜后，进行扫描电镜观察。
随机选取10 株萼脊蝴蝶兰，观察记录从花蕾显现至枯萎脱落的开花进程。单花花期为花瓣从两侧打开至凋谢的日期，单株花期为单个植株上第1朵花花瓣从两侧开放起至最后1朵花凋谢截止的日期，群体花期为群体内第1朵花花瓣从两侧打开起至群体内最后1朵花凋谢截止的日期。并依据DAFNI标准[19]，用开花尺度和开花特征将开花进程细分为花蕾Ⅰ期、花蕾Ⅱ期、初花Ⅰ期、初花Ⅱ期、盛花期、末花期、凋谢期。
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在晴天上午采集不同开花时期的花粉团，将花粉团置于载玻片上滴加2滴亚历山大染色液[20]，用镊子和解剖针将花粉团分为若干花粉块，立即盖上盖玻片，并在其上方附1层滤纸，用带橡皮铅笔的橡皮端用力按压盖玻片，将花粉块压为单细胞层，染色5 min，用研究级正置显微镜(Olympus BX53)统计花粉活力。以FAA固定液浸泡24 h的花粉团作为对照，在显微镜下无活力的花粉细胞为绿色或淡粉色，有活力则为紫红色。每个开花时期取不同株3个花粉团，制片后取3个视野，统计有活力花粉细胞数和总花粉细胞数(每个视野内至少有50个花粉细胞)。花粉萌发率=萌发的花粉数/视野内总花粉数×100%。
采用联苯胺-过氧化氢法[21]测定萼脊蝴蝶兰柱头可授性。每个开花时期取3个柱头进行试验，将其浸入联苯胺-过氧化氢反应液(1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水的体积比4∶11∶22)中，用体视显微镜(Olympus SZX7)观察并拍照。依据柱头周围是否有气泡出现判别其可授性，气泡越多表明可授性越好。
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随机采取3个盛花期成熟花粉团，将每个花粉团分别置于载玻片上滴加2滴碘-碘化钾染色液[22]，用镊子和解剖针将花粉团分为若干花粉块，立即盖上盖玻片，并在其上方附1层滤纸，用带橡皮铅笔的橡皮端用力按压盖玻片，将花粉块压为单细胞层，染色5 min，用研究级正置显微镜(Olympus BX53)观察花粉细胞染色情况。花粉细胞呈黄橘红色，表示其中含有脂质；呈蓝紫黑色，表示其中含有淀粉。
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依据DAFNI标准[19]，选取10株萼脊蝴蝶兰，测定指标并计算杂交指数。花直径＜1 mm记为0，1~2 mm记为1，2~6 mm记为2，＞6 mm则记为3；花药开裂时间和柱头可授粉期同时或雌蕊先熟记为0，雄蕊先熟记为1；柱头和花药处于同一空间位置记为0，空间分离记为1。三者之和为杂交指数(OCI)。评判标准：OCI为0表示闭花受精型；1表示专性自交型；2表示兼性自交型，有异交可能；3表示兼性异交型，有时需要传粉者；≥4表示异交型，部分自交亲和，多数需要传粉者。
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设置6种授粉方式：自然授粉(不去雄且不套袋)、自然自花授粉(不去雄并套袋)、去雄不授粉、人工自花授粉、人工同株异花授粉、人工异株授粉。每种授粉方式选择10朵初花Ⅱ期的花，授粉前后3 d不浇水，在晴天上午完成各处理，选不同植株重复3次。授粉成功后约7 d花朵凋谢，14 d子房膨大。授粉后100 d，果实成熟，统计结实率，并采摘。结实率=果实数/授粉朵数×100%。
每个授粉方式取3个果实测量各指标。用游标卡尺测量不同授粉方式得到的果实长和宽。将果实用手术刀剖开，把种子拨入2.0 mL离心管内，加蒸馏水1.5 mL，震荡后静置待种子沉底，挑出上层棉絮状物质，并将水吸出。向离心管中注入2.0 mL质量分数2.5%次氯酸钠溶液，常温浸泡75 min，用蒸馏水冲洗3次，再注入2.0 mL蒸馏水留在管中，室温浸泡24 h。用质量分数1% TTC溶液替换蒸馏水，避光浸泡24 h。吸出TTC溶液，蒸馏水冲洗3次，再注入1.0 mL蒸馏水，得到TTC染色后的种子悬浮液。用已剪枪头吸取悬浮液0.1 mL，制片用体视显微镜(Olympus SZX7)观察，种胚为红色即为有活力[23]，在10倍镜下随机选取3个视野统计有活力种子数和种子总数，估算种子活力，种子活力=有活力种子数/种子总数。统计0.1 mL所有种子数，重复3次，并按比例尺测量种子长和宽，单果实种子总数=0.1 mL所有种子数×10。
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利用Excel 2016绘制表格，SPSS 25.0处理数据，Photoshop 2021制图。
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萼脊蝴蝶兰株高13.71 cm，冠幅24.01 cm；单株多为1~2个花序，单花序约10朵花。花由1枚中萼片、2枚侧萼片、2枚花瓣、1枚唇瓣、1个合蕊柱、1个子房组成(图1)。茎短，被宿存叶鞘包裹，叶4~6枚，叶片革质呈长圆倒卵状披针形，先端钝且有稍不等侧2裂，最大叶长13.76 cm、宽3.59 cm。总状花序微下垂，花序长12.61 cm；花苞片淡褐色，宽卵形，凹的，先端钝；萼脊蝴蝶兰呈淡黄绿色，侧萼片表面具褐紫色横向不规则条纹，唇瓣表面具粉紫色不规则斑纹，花具有香气。中萼片长圆形，先端钝，中萼片长14.27 mm、宽6.55 mm；侧萼片比中萼片稍窄，侧萼片长14.64 mm、宽6.46 mm；花瓣长圆状舌形，先端钝，花瓣长12.64 mm、宽6.81 mm；唇瓣3裂，唇瓣长14.91 mm、宽8.92 mm，侧裂片很小，近三角形，中裂片大，匙形，从基部向先端扩大为卵圆形的前部，边缘具不规则的圆齿，正面凹下而背面隆起，浅绿色距从唇瓣根部延伸，末端指向唇瓣中裂片，月牙形，内部光滑无毛，底端具有少量密状物质；合蕊柱淡黄绿色，细圆柱形，合蕊柱长13.01 mm、宽2.58 mm，药帽前端收窄成喙状，顶端增厚成短凸，直径3.31 mm；子房长8.52 mm，淡黄绿色，下位子房。通过电子扫描显微镜观察，萼脊蝴蝶兰花粉团表面不平整，有极多凸起，是由数万个花粉细胞紧密聚集而形成的(图1)。
图 1 萼脊蝴蝶兰的花部特征及花粉团电镜扫描图
Figure 1. Floral syndrome and pollinia of P. japonica
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萼脊蝴蝶兰从4月始零星开放，群体花期4中旬至5月底，单花花期约30 d，单株花期约35 d。依据DAFNI标准，将开花进程划分为7个阶段(图2)。①花蕾Ⅰ期(开花前4~7 d)：花蕾未展开，整体呈不规则椭圆形，萼片和花瓣紧闭，呈淡黄绿色，可见距。②花蕾Ⅱ期(开花前1~4 d)：花蕾变大，准备开放，萼片和花瓣微微分离，侧萼片根部至中部有紫色花纹显现。花蕾长大于1.0 cm，宽大于0.5 cm。③初花Ⅰ期(开花后1~3 d)：花蕾初步开放，萼片和花瓣分离，花直径大于1.5 cm，白紫色唇瓣露出，合蕊柱被唇瓣包裹在内，紫色花纹继续在整个侧萼片延伸。④初花Ⅱ期(开花后4~5 d)：花蕾进一步开放，中萼片向斜上方竖起，侧萼片紫色花纹更加明显，花瓣向外延展，唇瓣展开露出合蕊柱，花直径大于2.5 cm。⑤盛花期(开花后6~25 d)：花蕾完全开放，中萼片直立，侧萼片完全展开，在内面具紫色横向不规则条纹，花瓣向前延伸，白紫相间唇瓣向内隆起，可见合蕊柱顶端明显药帽和中部具黏液柱头腔。⑥末花期(开花后26~30 d)：花逐步失水，由淡黄绿色变为淡黄白色，但仍可见紫色花纹，花器官均卷缩。⑦凋谢期(开花后30~40 d)：花完全失水，呈褐色，自然掉落。
图 2 不同发育阶段的萼脊蝴蝶兰
Figure 2. Development stages of flower of P. japonica
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萼脊蝴蝶兰花粉在花蕾期就具有一定活力，并随着开花进程，花粉活力在盛花期达到最大值84.98% (表1)。显微镜观察发现：萼脊蝴蝶兰花粉为近圆形四合花粉(图3A)，花粉被碘-碘化钾染为黄橘红色(图3B)，说明萼脊蝴蝶兰花粉主要由脂质组成。
表 1 花粉活力与柱头可授性检测
Table 1. Test of pollen viability and stigma acceptability
时期 花粉活力/% 柱头可授性 花蕾Ⅰ期 12.80±0.53 f − 花蕾Ⅱ期 28.23±0.52 d +/− 初花Ⅰ期 46.19±0.56 c + 初花Ⅱ期 74.13±0.91 b ++ 盛花期 84.98±0.95 a ++ 末花期 22.14±0.59 e − 凋谢期 0±0 g − 说明：数值为平均值±标准误。不同小写字母表示不同时期花粉活力之间差异显著(P＜0.05)。−表示柱头不具可授性，+/−指部分柱头具可授性，+表示柱头具可授性，++表示柱头可授性强。 
图 3 花粉活力亚历山大染色(A)和碘-碘化钾花粉组织染色(B)、联苯胺-过氧化氢法柱头可授性检测(C)
Figure 3. Alexander staining (A) and iodide-potassium iodide staining (B) of pollen viability, and benzidine- hydrogen peroxide method of stigma acceptability test (C)
萼脊蝴蝶兰初花Ⅱ期和盛花期时的柱头表面均变蓝且有大量气泡产生(图3C)，表明此阶段可授性最强。从表1可以看出，萼脊蝴蝶兰雌雄同熟，在盛花期花粉活力最强，柱头可授性最强，因此在人工授粉时，应选择盛花期的花朵异株自交。
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萼脊蝴蝶兰花直径约为3 cm (＞6 mm)，记为3；花粉和柱头同步成熟，可同期授粉，记为0；花粉位于合蕊柱顶端，与柱头空间分离，且花粉与柱头腔间的蕊喙发育，阻止自交授粉发生，记为1。由此得出萼脊蝴蝶兰杂交指数为4，其繁育系统是异交型，部分自交亲和，需要传粉者。
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由表2可见：自然授粉、自然自花授粉、去雄不授粉的结实率均为0，人工自花授粉、人工同株异花收粉、人工异株授粉结实率分别为60.00%、80.00%、93.33%，均远高于前3种处理。说明萼脊蝴蝶兰繁育系统是需要传粉者传粉的且自交和异交混合的繁育系统，不存在无融合生殖现象。
表 2 不同处理下结实率
Table 2. Percentage of fertile fruit in different pollination treatments
处理方式 处理花数/朵 结实数/粒 结实率/% 自然授粉 30 0 0 c 自然自花授粉 30 0 0 c 去雄不授粉 30 0 0 c 人工自花授粉 30 18 60.00±1.15 b 人工同株异花授粉 30 24 80.00±0.58 ab 人工异株授粉 30 28 93.33±0.67 a 说明：数值为平均值±标准误；不同小写字母表示不同处理下结实率之间差异显著(P＜0.05)。 萼脊蝴蝶兰授粉成功后，除合蕊柱和子房外，各花器官会在5 d内迅速枯萎，寿命远短于正常花期。授粉后3 d内柱头腔逐渐向内闭合至包裹花粉，约7 d可发现子房开始膨大。授粉后100 d，果实成熟，果实绿色油亮。萼脊蝴蝶兰的种子为粉末状，且与棉絮状物质共同存在于果实中，种子没有胚乳，只有种皮和种胚。由图4和表3可见：人工自花授粉果实较小(图4A)，且种子活力与种子数均较低；人工同株异花授粉果实大小其次(图4B)；而人工异株授粉果实不仅果实体积大(图4C)，其种子大小、种子活力(图4D)、种子数(单果实中种子数量约43 000粒)均最高。由此可得出人工异株授粉得到的果实质量最高。
表 3 不同处理下得到的果实表型
Table 3. Phenotype of fruit obtained under the different pollination treatments
处理方式 果实长/cm 果实宽/cm 种子长/μm 种子宽/μm 种子活力/% 单果实种子总数/粒 人工自花授粉果实 2.33±0.03 c 0.46±0.02 b 135.87±16.73 b 55.58±4.76 a 50.49±0.78 c 3 000±360 c 人工同株异花授粉果实 2.87±0.09 b 0.60±0.04 a 177.45±4.32 a 49.4±3.98 a 65.64±1.79 b 21 000±1 700 b 人工异株授粉果实 3.50±0.17 a 0.67±0.02 a 189.55±3.18 a 62.08±5.16 a 82.69±3.46 a 43 000±1 800 a 说明：数值为平均值±标准误；不同小写字母表示不同处理下结实率之间差异显著(P＜0.05)。 
图 4 不同处理下得到的果实纵切面图和TTC染色法测定种子活力
Figure 4. Longitudinal section view of the fruit obtained under the different pollination treatments and TTC staining seeds
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萼脊蝴蝶兰植株多为1~2个花序，单花序约有10朵花。花由1枚中萼片、2枚侧萼片、2枚花瓣、1枚唇瓣、1个合蕊柱、1个子房组成。单花花期约30 d，单株花期30~40 d，群体花期约45 d，其中单花盛花期为花朵展开后的6~25 d。侧萼片和唇瓣内面白紫相间的横向不规则条纹，与上萼片和花瓣的淡黄绿色形成鲜明对比。通过解剖位于萼脊蝴蝶兰唇瓣后的距，可发现其内部底端中具有少量蜜状物质。这与SUETSUGU等[18]研究相同，他们认定熊蜂属Bombus昆虫是萼脊蝴蝶兰的主要授粉者之一，并得出距内蜜状奖励物质含量与虫媒授粉成功率呈正相关关系，且花距长度与传粉者嘴部长度相关。萼脊蝴蝶兰花粉为四合花粉，即减数分裂形成的4个小孢子不分开而是结合在一起继续发育成成熟花粉。通过碘-碘化钾染色，萼脊蝴蝶兰花粉呈黄橘红色，说明萼脊蝴蝶兰花粉主要由脂质组成。通过扫描电镜对花粉团的观察，发现花粉是由多个花粉细胞紧密聚集而成，这种组成结构相对于由淀粉组成的风媒授粉植株的花粉而言，质量较大，富含营养物质较多。由此确定萼脊蝴蝶兰为虫媒授粉植株[24]
植物能否成功授粉取决于花粉活力与柱头可授性的高低。本研究通过对比不同花粉活力检测方法，得出亚历山大染色法是最适合检测萼脊蝴蝶兰花粉活力的方法。TTC染色法无法明显区别萼脊蝴蝶兰花粉活力，可能是因为萼脊蝴蝶兰对TTC染液不敏感所致，但TTC却能将长瓣兜兰[15]花粉染色，同样，醋酸洋红染色法有活力花粉和无活力花粉颜色差别不大，可能是TTC和醋酸洋红对兰科不同属间花粉的染色度不同所导致；花粉离体萌发法操作较复杂，本研究未采用此方法。本研究发现：萼脊蝴蝶兰花粉与柱头同期成熟，并且活力均先上升后下降，在盛花期达最高，这与细茎石斛Dendrobium moniliforme、葱叶兰Microtis unifolia、镰翅羊耳蒜Liparis bootanensis 等植物相似[25]。值得注意的是，萼脊蝴蝶兰的柱头在初花Ⅱ期和盛花期都具有较高的可授性，后期若进行萼脊蝴蝶兰人工授粉，可选用成熟的花粉对初花Ⅱ期的柱头进行授粉，使植株较早坐果。
在杂交指数估算时，不能以萼脊蝴蝶兰合蕊柱上花粉团与柱头的空间分布判断杂交指数。应着重观察萼脊蝴蝶兰花粉团与柱头腔间的蕊喙是否发育，以此判断植物是否能发生自交授粉。萼脊蝴蝶兰杂交指数为4，说明萼脊蝴蝶兰繁育系统是需要传粉者传粉的且自交和异交混合的繁育系统。
萼脊蝴蝶兰自然授粉、自然自花授粉、去雄不授粉3种处理结实率均为0，说明萼脊蝴蝶兰不能自主自花授粉，需要媒介授粉才能结实，因为其花粉均位于合蕊柱顶端，与柱头空间分离，但温室里没有能为其传粉的昆虫。人工自花授粉、人工同株异花授粉、人工异株授粉结实率分别为60.00%、80.00%、93.33%，且人工异株授粉果实的大小、含种子量、种子活力均高于人工自花授粉果实和人工同株异花授粉果实。这符合自然界杂种优势[26]。
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萼脊蝴蝶兰为总状花序，单花花期约30 d，群体花期为4月中旬至5月底，开放时有香味。雌雄同株，且同步成熟，在盛花期(开花6~25 d )花粉活力与柱头可授性均达到最强，花粉活力高达84.98%。萼脊蝴蝶兰花粉为近圆形四合花粉，主要由脂质组成，适合虫媒授粉。杂交指数为4，其繁育系统是需要传粉者自交和异交混合的交配系统。人工异株授粉的萼脊蝴蝶兰结实率最高(93.33%)，且果实质量最好，单果实中种子数量最大(约43 000粒)，种子活力最高(82.69%)。
Flowering characteristics and breeding system of Phalaenopsis japonica
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摘要:
目的 研究萼脊蝴蝶兰Phalaenopsis japonica的开花特性与繁育特性，为萼脊蝴蝶兰杂交育种提供理论依据，也为濒危蝴蝶兰属Phalaenopsis植物种质资源保护提供研究基础。 方法 以温室条件下栽培的萼脊蝴蝶兰为材料，记录其花器官特性和开花进程，测定花粉活力与柱头可授性，分析花粉组织化学，估算杂交指数并进行人工控制授粉试验。 结果 ①萼脊蝴蝶兰群体花期 4月中旬至5月底，单株花期30~40 d，单花花期约30 d，开放时有香味。花蕾期为开花前1~7 d，初花期为开花后1~5 d，盛花期为开花后6~25 d，末花期为开花后26~30 d，凋谢期为开花后30~40 d。②总状花序，单株花序多为1~2个，单花序约10朵花。③萼脊蝴蝶兰花粉为近圆形四合花粉，主要由脂质组成，适合虫媒授粉。④雌雄同株，且同步成熟，在盛花期(开花6~25 d)花粉活力与柱头可授性均达到最强，花粉活力高达84.98%，杂交指数为4。⑤自然授粉、自然自花授粉、去雄不授粉3种处理后的结实率均为0，而人工自花授粉、人工同株异花授粉和人工异株授粉的结实率高达60.00%、80.00%和93.33%，且人工异株授粉果实质量最好，种子最大，种子活力最高(82.69%)，单果实中种子数量约43000粒。 结论 萼脊蝴蝶兰开花始于4月中旬，结束于5月底，盛花期持续约20 d，其繁育系统属于兼性异交，需要传粉者的类型。图4表3参26 Abstract:Objective This study, with an investigation of the breeding system of the Phalaenopsis japonica, is aimed to provide theoretical basis for P. japonica hybrid breeding and research basis for the preservation and protection of the plant germplasm resources of the endangered Phalaenopsis. Method With P. japonica in greenhouses taken as materials, their floral characteristics and flowering process were recorded for observation before the pollen viability and stigma acceptability were determined, the pollen histochemistry was analyzed, the hybridization index (OCI) was estimated and artificial pollination was tested. Result (1) The P. japonica blossomed from mid April to end of May, and was fragrant and the florescence of single plant lasted for 30 to 40 days and that of a single flower is about 30 days, with the bud stage being 1 to 7 days before flowering, the initial flowering stage being 1 to 5 days after flowering, the full flowering stage being 6 to 25 days after flowering, the final flowering stage being 26 to 30 days after flowering and the flower fading stage being 30 to 40 days. (2) The P. japonica was raceme with each plant having 1 to 2 inflorescences and each inflorescence having about 10 flowers. (3) The P. japonica pollen was nearly circular tetrad pollen which was mainly composed of lipids, suitable for insect pollination. (4) The P. japonica was monoecious and the pollen viability and stigma acceptability reached the highest in the blooming stage (flowering for 6 to 25 days) with the highest pollen viability being 84.98% and OCI of P. japonica being 4. (5) The fruit setting rate of natural pollination, natural self-pollination, and emasculation without pollination were 0 but the fruit setting rate of artificial self-pollination, artificial cross-pollination of the same plant, and artificial cross-pollination of different plant reached 60.00%, 80.00%, and 93.33% respectively. The fruits of artificial cross-pollination between different plants had the highest quality, with the largest seeds, highest viability (82.69%), and largest amount of seeds (about 43000 seeds). Conclusion The flowering of P. japonica starts in mid April and ends at the end of May with the full blooming period lasting for about 20 days and its breeding system is a mixed mating system of self-pollination and cross-pollination that required pollinators. [Ch, 4 fig. 3 tab. 26 ref.] -
中国城镇化进程以中国区域经济发展为主线，其本质是空间层面上要素的流动与资源的配置[1]。近年来，长江三角洲地区城镇化水平明显提高，城市人口急剧增长，客观上导致了城市空间无序扩张、土地利用混乱、生态空间啃食严重等问题的出现。在此背景下，认识城市化进程下绿地空间的动态演变规律，系统研究人类活动对绿地空间的作用，构建合理的绿地空间格局和数量结构，对城市可持续发展和健康人居环境建设具有重要意义。
市域绿地指城市行政管辖范围内，以自然和人工植被为主要存在形态的城市用地，具有维护区域生态环境、提供郊野游憩空间、城镇隔离等重要作用。目前针对市域绿地的研究主要包括3个方面：①市域绿地的界定与规划编制问题探讨[2−3]。②市域绿地面积与空间结构演变分析。相关研究主要基于地理信息系统数据库以及遥感影像技术，运用土地动态度、景观格局指数、归纳演绎等方法，围绕典型区域展开实证研究[4−6]。③绿地演变影响机制研究。目前相关研究主要从定性和定量2个方面探究绿地面积和空间结构产生演变的影响因素[7−8]。研究多是围绕着南京绿色空间(包括林地、草地和耕地)的演变[9−10]展开，聚焦于南京市域绿地研究较少[11−12]，这不利于进一步构建生态安全格局；在研究尺度方面，近年来多聚焦于南京都市圈[13−14]或是南京部分城区[15]；针对南京市域绿地格局演变影响因素的研究较少，且多受数据限制，研究方法多以定性或简单回归为主[16−17]。
2000—2020年，在城市化建设与生态环境建设叠加作用的背景下，南京市域绿地的演变具有复杂性，探究市域绿地面积演变及其影响因素，有利于进一步协调城市经济发展与可持续发展之间的关系。鉴于此，本研究将基于南京市2000—2020年共5期的绿地地理信息数据，分析其动态格局演变过程，探寻演变影响因子及作用机制，以期为南京市域绿地优化与区域可持续发展提供依据与支持，也为其他经济发达地区市域绿地空间构建与管理提供借鉴。
1. 研究区概况
南京市地处长江三角洲西端(31°14′~32°37′N，118°22′~119°14′E)，市域总面积为6 586.02 km2。气候类型为北亚热带湿润气候，四季分明，雨水充沛。位于宁镇扬丘陵地区，低山缓岗(图1)。栖霞山、牛首山、幕府山、狮子山、清凉山、鸡笼山环峙城区。市域内江河湖泊遍布，长江穿城而过，主要河流有秦淮河、滁河等，玄武湖、石臼湖、金牛湖等湖泊星罗棋布，造就以山、水、城、林为大格局的奇致景观。
2. 数据来源与研究方法
2.1 数据来源
本研究所用遥感影像数据来源自美国地质勘探局[USGS，
https://earthexplorer.usgs.gov/ (Earth Explorer)]，采用2000、2005、2010、2015、2020年5个时间节点的Landsat TM/OIL遥感影像，影像分辨率为30 m×30 m，云量皆小于5%。使用中国科学院资源环境科学数据中心(https://www.resdc.cn/ )提供的2015年中国地市行政边界数据对遥感影像进行裁剪。对通过ENVI 5.3预处理后的数据进行目视解译，参照国际地圈生物圈计划(IGBP)的土地利用及覆盖变化(LUCC)分类系统，结合南京实际和研究目的，将土地利用类型分为河流、湖泊、建设用地、林地、草地、耕地和裸地7类(图2)，最终通过总体分类精度以及混淆矩阵对分类准确度验证(表1)。
图 2 2000—2020年南京市土地利用分类示意图Figure 2 Land use classification map in Nanjing from 2000 to 2020表 1 2000—2020年南京市土地利用分类图精度验证统计表Table 1 Accuracy verification statistics of Nanjing land use classification map from 2000 to 2020年份 总体分类精度/% Kappa系数 2000 93.3 0.88 2005 93.3 0.89 2010 92.0 0.85 2015 89.0 0.83 2020 91.3 0.87 将南京市域绿地演变的影响因子分为自然因素和社会经济要素两大类。首先，对自然因素的考虑缘于其在大尺度空间上和较长时间范围内对绿地格局变化的影响。其次，政府在城市化进程当中会通过改变用地性质来指引社会未来发展方向，故社会经济因素的变化会在较小尺度空间上和短时间范围内引起绿地格局的变化[18]。影响机制研究中涉及的数据主要来源于相应年份的《江苏省统计年鉴》和《南京市统计年鉴》。此外，年份久远的个别缺失数据根据当年各区县统计数据进行计算补充。考虑到数据的可获取性以及可定量化，具体影响因子选取如表2所示。
表 2 南京市域绿地演变的影响因子Table 2 Influencing factors on the evolution of Nanjing’s urban green space分类 编号 影响因子 单位 自然因素 1 年降水量 mm 2 年平均气温 ℃ 3 全年日照时长 h 4 总水资源量 亿m3 社会经济要素 5 地区生产总值 亿元 6 人均国内生产总值(GDP) 万元·人−1 7 第一产业产值比例 % 8 第二产业产值比例 % 9 第三产业产值比例 % 10 农林牧渔业总产值 亿元 11 建成区绿化面积 hm2 12 常住人口数量 万人 说明：自然因素数据来源于《南京市统计年鉴(2001—2021)》《江苏省统计年鉴(2001—2021)》，社会经济要素数据来源于《江苏省统计年鉴(2001)》《南京市统计年鉴(2006—2021)》 2.2 研究方法
2.2.1 动态度计算
使用动态度表达研究范围内某种类型的绿地数量在一定时间段内的变化速率。其计算公式为：
$$ I_{\mathrm{R}}=\frac{{S}_{\mathrm{b}}-{S}_{\mathrm{a}}}{{S}_{\mathrm{a}}} \times \frac{1}{{T}} \times 100 \% 。$$ 其中：IR表示研究区在该时间段内单一绿地类型的变化速率，即动态度；Sa为该类绿地在研究时间段起点的面积；Sb为该类绿地在研究时间段终点的面积；T为时间间隔年份。
综合土地动态度反映研究区内绿地总数量在一定时段内的变化速率。其计算公式为：
$$ {R}=\left(\frac{\displaystyle \sum_{{i}=1}^{n}{\Delta S}_{{i-j}}}{2 \displaystyle \sum_{{i}=1}^{{n}} {S}_{{i}}}\right) \times \frac{1}{{T}} \times 100 \% 。$$ 其中：R表示研究区在该时间段内所有绿地类型的变化速率即绿地综合动态度；j为某种绿地类型，Si为研究起始时间第i类绿地的面积；
$ \Delta S_{i-j}$ 为研究时段内第i类绿地转化为第j类绿地的面积绝对值；T为时间间隔年份。2.2.2 景观格局指数分析
景观格局指数是能够高度浓缩景观格局信息，反映其结构组成和空间配置某些方面特征的简单定量指标，景观格局指数分析方法能够揭示市域绿地格局的时空演变特征[19−22]。为了全面系统地对南京市域绿地景观格局结构、特点、动态进行描述，采用斑块数量(NP)、边缘密度(ED)、景观形状指数(LSI)、连接度指数(CONHESION)以及香农多样性指标(SHDI)表明绿地景观格局的水平。基于Fragstats 4.2软件计算各个景观指数，计算方法见参考文献[23]。
2.2.3 偏最小二乘回归模型(PLSR)
PLSR作为一种多元统计回归模型，具有广泛适用性，近年来被大量运用到土地覆被变化的影响机制研究当中[18, 24]。PLSR模型具有以下优点：首先，它可以同时实现主成分分析、相关分析和线性回归分析；其次，它能够排除自变量或因变量指标之间的多重共线性问题，同时适用于样本容量较小的情况。
在PLSR模型中，交叉有效性(Q2)表示模型的预测能力，当Q2＞0.097时，模型具有较强的预测能力。解释能力(
$R_{\rm{Y}}^2 $ )表示模型的稳健性，当$R_{\rm{Y}}^2 $ ＞0.5时，模型具有较好的稳健性。变量投影重要性(VIP)表示各个解释变量的相对重要性，当VIP＜0.5时，变量对于绿地格局演变不重要；当0.5＜VIP＜1.0时，变量对绿地格局演变比较重要；当VIP＞1.0时，变量对绿地格局演变具有较为明显的解释能力，VIP越大，自变量对因变量的解释性越强[25]。回归系数(RC)表示各解释变量与绿地格局演变的正负相关性，当RC＞0时，变量与绿地格局演变呈正相关；当RC＜0时，变量与绿地格局演变呈负相关。使用SIMCA-P软件进行回归模型的构建以及绿地演变影响机制研究。3. 结果与分析
3.1 南京市域绿地演变分析
南京市土地利用类型总体上呈现以耕地、建设用地为主，河流、湖泊、林地、草地及裸地为辅的格局。2000—2020年，研究区域内水域及裸地变化较小，建设用地占比持续大幅度增加，耕地面积不断缩减转移，市域绿地面积变化起伏较为明显(图3)。
图 3 2000—2020年南京市域土地利用面积变化对比图Figure 3 Comparison of land use area changes in Nanjing City area from 2000 to 20202000—2020年，南京市域绿地面积总体呈先减后增的状态。其中，作为市域绿地组成部分的林地与草地在面积上呈现出的变化趋势具有一定的差异性(表3)。2000—2005年，林地和草地的面积均呈减少状态，分别减少了72.47和86.77 km2，两者的变化动态度分别为−2.10%·a−1和−11.46%·a−1，最终市域绿地面积整体减少了159.24 km2，整体面积的变化动态度为−3.78%·a−1。2005年之后，林地面积一直呈现正增长的状态，但与持续下降的草地面积进行综合计算后发现：研究期间市域绿地面积仅增加了11.96 km2，变化动态度为0.07%·a−1。
表 3 不同时期南京市域绿地规模变化Table 3 Changes of green space scale in Nanjing during different periods土地类型 2000—2005年 2005—2010年 2010—2015年 2015—2020年 2000—2020年 变化量/
km2动态度/
(%·a−1)变化量/
km2动态度/
(%·a−1)变化量/
km2动态度/
(%·a−1)变化量/
km2动态度/
(%·a−1)变化量/
km2动态度/
(%·a−1)林地 −72.47 −2.10 72.78 2.35 12.10 0.35 104.73 2.97 117.14 0.85 草地 −86.77 −11.46 −6.94 −2.15 −1.48 −0.51 −9.99 −3.55 −105.18 −3.47 市域绿地 −159.24 −3.78 62.84 1.93 10.62 0.28 94.74 2.49 11.96 0.07 说明：正值表示该类用地面积呈正向增长；负值表示该类用地面积呈负向减少 3.2 南京市域绿地景观格局分析
根据斑块数量指数可知：在2000—2020年南京市域绿地斑块趋于破碎化。结合边缘密度指数和景观形状指数的变化可以看出：绿地景观形状复杂度逐步升高。在景观系统中，土地利用越丰富，破碎化程度越高，其不定性的信息含量也越大，香农多样性指数也就越高。2000—2005年香农多样性指数明显下降，说明这5 a间，市域绿地各斑块类型减少且并呈不均衡化趋势分布，绿地破碎化有一定的缓和。2005—2020年，香农多样性指数稳步上升，说明后期南京市域内部土地利用类型更加丰富，景观破碎度也随之升高。另外，2000—2005年，连接度指数稍有提高，但2005年之后，由于景观破碎度升高，其连接度也持续降低(表4)。
表 4 市域绿地景观格局指数统计Table 4 Pattern index statistics of urban green space landscape年份 斑块数
量/个边缘密度/
(m·hm−2)景观形
状指数连接度
指数香农多样
性指数2000 2 130 9.012 21.525 99.987 0.385 2005 2 993 8.456 19.984 99.987 0.334 2010 6 635 9.618 22.298 99.986 0.355 2015 5 393 9.160 21.369 99.986 0.358 2020 7 690 11.642 26.405 99.986 0.386 3.3 南京市域绿地演变影响机制分析
3.3.1 市域绿地规模演变的影响因素分析
以8项社会经济指标和4项自然影响因素为自变量，以南京市域绿地面积为因变量构建回归模型，对影响市域绿地规模演变的主要因素进行主成分提取。以Q2＞0.097和
$R_{\rm{Y}}^2 $ ＞0.5作为PLSR模型主成分提取的终止条件，市域绿地的总体面积最终以$R_{\rm{Y}}^2 $ =0.808和Q2=0.534在第2主成分处达到模型终止条件。南京市域绿地规模变化的重要解释变量如表5和图4所示。表 5 市域绿地规模与各影响因素的偏最小二乘回归结果Table 5 Results of partial least squares regression of urban green space scale and each influencing factor影响因子 变量投影重要性(VIP) 回归系数(RC) 年降水量 0.80 0.17 年平均气温 1.16 0.35 全年日照时长 0.89 −0.23 总水资源量 1.02 −0.18 地区生产总值 0.75 0.10 人均GDP 0.74 0.08 第一产业产值比例 1.79 0.44 第二产业产值比例 0.83 −0.20 第三产业产值比例 0.77 0.02 农林牧渔业总产值 0.74 0.03 建成区绿化面积 1.24 −0.23 常住人口数量 0.71 0.003 
图 4 各影响因素对南京市域绿地面积的PLSR分析Figure 4 PLSR analysis of each influencing factor on the green space area of Nanjing通过市域绿地面积与各影响因素的PLSR结果分析可知：社会经济指标的变化与自然环境的演变在不同程度上影响着市域绿地面积的演变，其中主要因素(VIP＞1)为年平均气温、总水资源量、第一产业产值比例以及建成区绿化面积。由回归系数可知：与市域绿地面积演变呈正相关(RC＞0)的因素为年平均气温、年降水量、地区生产总值、人均GDP、第一产业产值比例、第三产业产值比例、农林牧渔业总产值以及常住人口数量。除此之外，其余因素均与市域绿地面积变化呈负相关。
其中，第一产业产值比例为市域绿地面积演变最相关的因子，且为正相关，说明以种植业、林业等自然物为生产对象的第一产业规模与城市绿地规模密不可分。同时，这也体现出产业关系转变在城市绿地格局演变中的重要地位。另外，建成区绿化面积指标作为市域绿地面积演变的次相关因子，反而呈现负相关关系，说明相关城市规划政策的制定仍旧只聚焦于城市建成区内的绿地修复，而在城市扩张区域初始发展阶段并不注重绿化建设，体现出城市生态发展地域间的不平衡问题。除此之外，通过对自然条件相关性的评估可以看出，适宜的温度环境以及水资源环境对植物生长有长期性的影响，因此也是城市绿地发展的重要先决条件。
3.3.2 市域绿地格局演变的影响因素分析
将景观格局指数作为因变量，将社会经济指标以及自然影响因素作为自变量进行PLSR分析。以Q2＞0.097和
$R_{\rm{Y}}^2 $ ＞0.5作为PLSR模型主成分提取的终止条件，南京市域绿地总体斑块数量、边缘密度、景观形状指数、连接度指数在第1主成分处已满足模型终止条件，$R_{\rm{Y}}^2 $ 分别为0.781、0.731、0.687、0.891，Q2分别为0.729、0.457、0.380、0.829；香农多样性指数以$R_{\rm{Y}}^2 $ =0.796及Q2=0.525在第2主成分处达到了模型终止条件(表6和图5)。表 6 市域绿地景观格局指数与各影响因素的偏最小二乘回归结果Table 6 Results of partial least squares regression of urban green space landscape pattern index with each influencing factor影响因子 斑块数量 边缘密度 景观形状指数 连接度指数 香农多样性指数 VIP RC VIP RC VIP RC VIP RC VIP RC 年降水量 0.99 0.08 1.21 0.10 1.23 0.09 1.06 −0.09 0.80 0.17 年平均气温 0.49 0.04 1.06 0.08 1.12 0.09 0.79 −0.07 1.14 0.35 全年日照时长 0.96 −0.08 1.22 −0.10 1.25 −0.10 1.07 0.09 0.88 −0.23 总水资源量 1.02 0.08 0.64 0.05 0.59 0.05 0.89 −0.08 1.01 −0.18 地区生产总值 1.04 0.08 1.09 0.09 1.10 0.08 1.10 −0.09 0.75 0.10 人均GDP 1.03 0.08 1.05 0.08 1.05 0.08 1.10 −0.09 0.74 0.08 第一产业产值比例 0.96 −0.08 0.53 −0.04 0.45 −0.03 0.61 0.05 1.80 0.45 第二产业产值比例 0.97 −0.08 1.09 −0.09 1.11 −0.09 1.13 0.10 0.83 −0.20 第三产业产值比例 1.07 0.09 1.03 0.08 1.01 0.08 1.08 −0.09 0.78 0.01 农林牧渔业总产值 1.04 0.08 0.98 0.08 0.96 0.07 1.08 −0.09 0.75 0.03 建成区绿化面积 1.08 0.09 0.82 0.06 0.78 0.06 0.89 −0.08 1.25 −0.23 常住人口数量 1.20 0.10 1.03 0.08 1.01 0.08 1.06 −0.09 0.71 0.00 说明：VIP为变量投影重要性；RC为回归系数 
图 5 各影响因素对南京市域绿地景观格局指数的PLSR分析Figure 5 PLSR analysis of each influencing factor on the landscape pattern index of Nanjing’s urban green space通过南京市域绿地景观格局指数与各影响因素的PLSR结果分析可知：影响南京市域内绿地斑块数量演变的主要影响因子(VIP＞1)为总水资源量、地区生产总值、人均GDP、第三产业产值比例、农林牧渔业总产值、建成区绿化面积以及常住人口数量。大部分的社会经济指标均对绿地斑块数量有重要影响，且除了第一产业产值比例以及第二产业产值比例外，其余因子均与绿地斑块数量呈正相关。其中，常住人口数量具有最大相关性，缘于城市人口增加后必然对于生活环境产生要求，市域内的绿地配置也一定会随人民需求及人口流动产生斑块转移。另外，自然环境条件下的总水资源量有较明显相关性，全年日照时长呈负相关性，可以看出城市的旱涝环境以及日照条件对植物生长存在一定影响，从而导致绿地斑块数量的变化。
影响绿地边缘密度和景观形状指数的主要影响因子(VIP＞1)为年平均气温、年降水量、全年日照时长、地区生产总值、人均GDP、第二产业产值比例、第三产业产值比例以及常驻人口数量。由回归系数可知：全年日照时长、第一产业产值比例以及第二产业产值比例等3个影响因子与边缘密度和景观形状指数演变呈负相关(RC＜0)。值得一提的是，该2项指标均与自然因素有明显相关性，推测为自然环境对植被生长产生影响所致。根据卫星图像识别提取，俯视视角下的树冠形状也是影响市域绿地边缘密度和景观形状指数的重要因素。社会经济指标中的地区生产总值和第二产业产值比例为最相关因子，这说明人类的经济建设活动，尤其是工业生产活动，在带来城市飞速发展的同时，所导致的市域绿地边界的啃食是不可忽视的问题。
影响南京市域绿地连接度水平变化的主要影响因子(VIP＞1)为年降水量、全年日照时长、地区生产总值、人均GDP、第二产业产值比例、第三产业产值比例、农林牧渔业总产值以及常住人口数量。由回归系数可知：全年日照时长、第一产业产值比例以及第二产业产值比例与南京市域绿地连接度变化呈正相关(RC＞0)。大部分社会经济指标因子均与绿地连接度水平有显著相关性，且多呈负相关，说明人类发展活动所带来的城市建设会降低绿地连接性，使绿地更趋破碎化，这将启发规划者在城市当中找到重要生态源点，通过城市添绿工程打通生态廊道，提高市域绿地连通性。
影响南京市域绿地香农多样性指数产生演变的主要影响因子(VIP＞1)为年平均气温、总水资源量、第一产业产值比例以及建成区绿化面积。由回归系数可知：除了全年日照时长、总水资源量、第二产业产值比例以及建成区绿化面积4项影响因子与南京市域绿地香农多样性指数变化呈负相关(RC＜0)外，其余8项影响因子均与其演变呈正相关。
4. 结论与讨论
南京市域绿地空间格局受到社会经济因素的影响，产业结构转型、人口流动、交通道路拓展以及城镇空间扩展削弱了市域绿地斑块的整体性。因此，在发展过程中应加强“见缝插针”式的小微绿地建设，加强生态修复治理。同时，亟需重视建成区外围的绿带、绿廊、绿网的构建，整合市域各类绿地的破碎斑块并构成有机网络体系，提升市域绿地的生态效益。
本研究在数据处理阶段采用了IGBP的LUCC分类系统，与《国土空间调查、规划、用途管制用地用海分类指南(试行)》[26]中的土地分类标准相比较，该分类体系中一级类型为耕地、林地、草地、水域、城乡工矿居民用地、未利用土地共6类，其中林地又包含有林地、灌木林、疏林地及其他林地(指未成林造林地、迹地、苗圃及各类园地)，使用LUCC分类体系可以很好地识别出以林地为主的城乡绿色空间状态[27]。国土空间视角下，城镇化发展与生态空间的矛盾是南京城乡建设的主要矛盾之一[28]。本研究所采用的Landsat数据精度为30 m，能够较好地识别市域绿地的变化情况，但是，随着郊区、非建成区的建设行为管控和土地的精细化管理要求不断提高[3, 29]，今后还需要针对城市外围生态敏感区域提高数据提取精度，对市域绿地的景观连通性与格局优化进行进一步探讨，为城乡生态系统修复、尤其是非建成区生态问题的识别与诊断提出参考性意见。
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图 3 花粉活力亚历山大染色(A)和碘-碘化钾花粉组织染色(B)、联苯胺-过氧化氢法柱头可授性检测(C)
Figure 3 Alexander staining (A) and iodide-potassium iodide staining (B) of pollen viability, and benzidine- hydrogen peroxide method of stigma acceptability test (C)
图 4 不同处理下得到的果实纵切面图和TTC染色法测定种子活力
Figure 4 Longitudinal section view of the fruit obtained under the different pollination treatments and TTC staining seeds
表 1 花粉活力与柱头可授性检测
Table 1. Test of pollen viability and stigma acceptability
时期 花粉活力/% 柱头可授性 花蕾Ⅰ期 12.80±0.53 f − 花蕾Ⅱ期 28.23±0.52 d +/− 初花Ⅰ期 46.19±0.56 c + 初花Ⅱ期 74.13±0.91 b ++ 盛花期 84.98±0.95 a ++ 末花期 22.14±0.59 e − 凋谢期 0±0 g − 说明：数值为平均值±标准误。不同小写字母表示不同时期花粉活力之间差异显著(P＜0.05)。−表示柱头不具可授性，+/−指部分柱头具可授性，+表示柱头具可授性，++表示柱头可授性强。 
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表 2 不同处理下结实率
Table 2. Percentage of fertile fruit in different pollination treatments
处理方式 处理花数/朵 结实数/粒 结实率/% 自然授粉 30 0 0 c 自然自花授粉 30 0 0 c 去雄不授粉 30 0 0 c 人工自花授粉 30 18 60.00±1.15 b 人工同株异花授粉 30 24 80.00±0.58 ab 人工异株授粉 30 28 93.33±0.67 a 说明：数值为平均值±标准误；不同小写字母表示不同处理下结实率之间差异显著(P＜0.05)。
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表 3 不同处理下得到的果实表型
Table 3. Phenotype of fruit obtained under the different pollination treatments
处理方式 果实长/cm 果实宽/cm 种子长/μm 种子宽/μm 种子活力/% 单果实种子总数/粒 人工自花授粉果实 2.33±0.03 c 0.46±0.02 b 135.87±16.73 b 55.58±4.76 a 50.49±0.78 c 3 000±360 c 人工同株异花授粉果实 2.87±0.09 b 0.60±0.04 a 177.45±4.32 a 49.4±3.98 a 65.64±1.79 b 21 000±1 700 b 人工异株授粉果实 3.50±0.17 a 0.67±0.02 a 189.55±3.18 a 62.08±5.16 a 82.69±3.46 a 43 000±1 800 a 说明：数值为平均值±标准误；不同小写字母表示不同处理下结实率之间差异显著(P＜0.05)。
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