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兰科植物Orchidaceae是被子植物中仅次于菊科Asteraceae的第二大科，约800属28 000种，广泛分布于热带和温带地区[1−2]。兰科植物进化水平高，拥有丰富的物种多样性、高度特化的花结构，生存繁衍对生态系统依赖程度高，是研究生态学和分子生物学的重要材料[3−5]。且兰科植物观赏价值极高，具有药理作用，有较高的经济价值，市场需求量大[6]。萼脊蝴蝶兰Phalaenopsis japonica曾被命名为萼脊兰Sedirea japonica，为萼脊兰属Sedirea，近年来根据分子生物学数据萼脊兰属被并入蝴蝶兰属Phalaenopsis [7]。产于中国浙江文成和云南盈江，及日本琉球群岛和朝鲜半岛南部，生于海拔600~1 350 m的疏林树干和山谷崖壁上[8]。按照濒危等级，萼脊蝴蝶兰被世界自然保护联盟(IUCN)评定为易危(VN)，列入濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)附录Ⅱ。其植株较小，叶片革质，总状花序，花期4月中旬至5月底，花形似蝴蝶，有香味，中萼片和花瓣呈淡黄绿色，侧萼片和唇瓣白紫相间，是蝴蝶兰Phalaenopsis aphrodite良好的育种材料。 KIM等[9]将萼脊蝴蝶兰与29个不同品种蝴蝶兰互为父母本进行杂交，得到3个萼脊蝴蝶兰做母本的杂交组合的后代，表型更接近蝴蝶兰。中国对萼脊蝴蝶兰组培快繁、分子生物学等进行了研究[10−12]，然而萼脊蝴蝶兰开花进程观察和繁育系统的研究仍欠缺。
繁育系统是指所有影响后代遗传组成的有性特征总和，主要包含花器官特征和开花进程、花粉活力与柱头可授性、花粉组织化学、杂交指数、人工控制授粉等方面[13]。前人对喇叭唇石斛Dendrobium lituiflorum、长瓣兜兰Paphiopedilum dianthum等植物的繁育系统研究[14−17]，为研究萼脊蝴蝶兰开花进程与繁育系统提供方法学基础。SUETSUGU等[18]通过观察自然条件下的萼脊蝴蝶兰，发现其授粉成功率仅为7.7%，认为萼脊蝴蝶兰可能无法自发进行自花授粉。本研究以温室栽培条件下的萼脊蝴蝶兰植株为研究对象，记录其开花进程，进行人工控制授粉，测定分析其繁育系统，为人工授粉和杂交育种提供依据，以期更好地保护和利用种质资源。
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萼脊蝴蝶兰由野外采集的果实经无菌播种培育而成，随机选出长势良好的100株4年生萼脊蝴蝶兰。试验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所无土栽培温室进行，常年保持温度26~30 ℃。春秋两季开天窗通风，夏季开风机配合水帘降温，冬季暖气供暖。全温室附60%遮阳网，夏季额外再附1层60%遮阳网。夏季每周浇水2次，春秋冬每周浇水1次。
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随机选取10株，统计单株花序数与单花序花数。随机选取盛花期全天开放的花10朵，用直尺和游标卡尺测量植株性状(株高、最大叶长/宽/厚、冠幅、花序长/粗)和花部性状(中萼片长/宽、侧萼片长/宽、花瓣长/宽、唇瓣长/宽、合蕊柱长/宽、子房长/宽、药帽直径)。并在体视显微镜(Olympus SZX7)下观察花部特征形态结构，观察盛花期成熟花粉团，用扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)进行拍照。具体步骤：取样后立即将花粉团投入FAA固定液中(100 mL FAA：体积分数为50%的乙醇 90 mL、冰乙酸 5 mL、甲醛 5 mL)，上下颠倒保证花粉团完全浸入FAA固定液，4 ℃固定24 h，随后对其进行梯度乙醇脱水(体积分数分别为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇各处理15 min)，更换100%乙醇放入冰盒等待干燥。用二氧化碳临界点干燥仪(Leica CPD300)干燥5 h，将样品待观察部位朝上放置在有双面胶的金属台上，用洗耳球轻吹使其粘牢，用离子溅射仪(Hitachi E-1010)对金属台喷金镀膜后，进行扫描电镜观察。
随机选取10 株萼脊蝴蝶兰，观察记录从花蕾显现至枯萎脱落的开花进程。单花花期为花瓣从两侧打开至凋谢的日期，单株花期为单个植株上第1朵花花瓣从两侧开放起至最后1朵花凋谢截止的日期，群体花期为群体内第1朵花花瓣从两侧打开起至群体内最后1朵花凋谢截止的日期。并依据DAFNI标准[19]，用开花尺度和开花特征将开花进程细分为花蕾Ⅰ期、花蕾Ⅱ期、初花Ⅰ期、初花Ⅱ期、盛花期、末花期、凋谢期。
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在晴天上午采集不同开花时期的花粉团，将花粉团置于载玻片上滴加2滴亚历山大染色液[20]，用镊子和解剖针将花粉团分为若干花粉块，立即盖上盖玻片，并在其上方附1层滤纸，用带橡皮铅笔的橡皮端用力按压盖玻片，将花粉块压为单细胞层，染色5 min，用研究级正置显微镜(Olympus BX53)统计花粉活力。以FAA固定液浸泡24 h的花粉团作为对照，在显微镜下无活力的花粉细胞为绿色或淡粉色，有活力则为紫红色。每个开花时期取不同株3个花粉团，制片后取3个视野，统计有活力花粉细胞数和总花粉细胞数(每个视野内至少有50个花粉细胞)。花粉萌发率=萌发的花粉数/视野内总花粉数×100%。
采用联苯胺-过氧化氢法[21]测定萼脊蝴蝶兰柱头可授性。每个开花时期取3个柱头进行试验，将其浸入联苯胺-过氧化氢反应液(1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水的体积比4∶11∶22)中，用体视显微镜(Olympus SZX7)观察并拍照。依据柱头周围是否有气泡出现判别其可授性，气泡越多表明可授性越好。
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随机采取3个盛花期成熟花粉团，将每个花粉团分别置于载玻片上滴加2滴碘-碘化钾染色液[22]，用镊子和解剖针将花粉团分为若干花粉块，立即盖上盖玻片，并在其上方附1层滤纸，用带橡皮铅笔的橡皮端用力按压盖玻片，将花粉块压为单细胞层，染色5 min，用研究级正置显微镜(Olympus BX53)观察花粉细胞染色情况。花粉细胞呈黄橘红色，表示其中含有脂质；呈蓝紫黑色，表示其中含有淀粉。
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依据DAFNI标准[19]，选取10株萼脊蝴蝶兰，测定指标并计算杂交指数。花直径＜1 mm记为0，1~2 mm记为1，2~6 mm记为2，＞6 mm则记为3；花药开裂时间和柱头可授粉期同时或雌蕊先熟记为0，雄蕊先熟记为1；柱头和花药处于同一空间位置记为0，空间分离记为1。三者之和为杂交指数(OCI)。评判标准：OCI为0表示闭花受精型；1表示专性自交型；2表示兼性自交型，有异交可能；3表示兼性异交型，有时需要传粉者；≥4表示异交型，部分自交亲和，多数需要传粉者。
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设置6种授粉方式：自然授粉(不去雄且不套袋)、自然自花授粉(不去雄并套袋)、去雄不授粉、人工自花授粉、人工同株异花授粉、人工异株授粉。每种授粉方式选择10朵初花Ⅱ期的花，授粉前后3 d不浇水，在晴天上午完成各处理，选不同植株重复3次。授粉成功后约7 d花朵凋谢，14 d子房膨大。授粉后100 d，果实成熟，统计结实率，并采摘。结实率=果实数/授粉朵数×100%。
每个授粉方式取3个果实测量各指标。用游标卡尺测量不同授粉方式得到的果实长和宽。将果实用手术刀剖开，把种子拨入2.0 mL离心管内，加蒸馏水1.5 mL，震荡后静置待种子沉底，挑出上层棉絮状物质，并将水吸出。向离心管中注入2.0 mL质量分数2.5%次氯酸钠溶液，常温浸泡75 min，用蒸馏水冲洗3次，再注入2.0 mL蒸馏水留在管中，室温浸泡24 h。用质量分数1% TTC溶液替换蒸馏水，避光浸泡24 h。吸出TTC溶液，蒸馏水冲洗3次，再注入1.0 mL蒸馏水，得到TTC染色后的种子悬浮液。用已剪枪头吸取悬浮液0.1 mL，制片用体视显微镜(Olympus SZX7)观察，种胚为红色即为有活力[23]，在10倍镜下随机选取3个视野统计有活力种子数和种子总数，估算种子活力，种子活力=有活力种子数/种子总数。统计0.1 mL所有种子数，重复3次，并按比例尺测量种子长和宽，单果实种子总数=0.1 mL所有种子数×10。
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利用Excel 2016绘制表格，SPSS 25.0处理数据，Photoshop 2021制图。
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萼脊蝴蝶兰株高13.71 cm，冠幅24.01 cm；单株多为1~2个花序，单花序约10朵花。花由1枚中萼片、2枚侧萼片、2枚花瓣、1枚唇瓣、1个合蕊柱、1个子房组成(图1)。茎短，被宿存叶鞘包裹，叶4~6枚，叶片革质呈长圆倒卵状披针形，先端钝且有稍不等侧2裂，最大叶长13.76 cm、宽3.59 cm。总状花序微下垂，花序长12.61 cm；花苞片淡褐色，宽卵形，凹的，先端钝；萼脊蝴蝶兰呈淡黄绿色，侧萼片表面具褐紫色横向不规则条纹，唇瓣表面具粉紫色不规则斑纹，花具有香气。中萼片长圆形，先端钝，中萼片长14.27 mm、宽6.55 mm；侧萼片比中萼片稍窄，侧萼片长14.64 mm、宽6.46 mm；花瓣长圆状舌形，先端钝，花瓣长12.64 mm、宽6.81 mm；唇瓣3裂，唇瓣长14.91 mm、宽8.92 mm，侧裂片很小，近三角形，中裂片大，匙形，从基部向先端扩大为卵圆形的前部，边缘具不规则的圆齿，正面凹下而背面隆起，浅绿色距从唇瓣根部延伸，末端指向唇瓣中裂片，月牙形，内部光滑无毛，底端具有少量密状物质；合蕊柱淡黄绿色，细圆柱形，合蕊柱长13.01 mm、宽2.58 mm，药帽前端收窄成喙状，顶端增厚成短凸，直径3.31 mm；子房长8.52 mm，淡黄绿色，下位子房。通过电子扫描显微镜观察，萼脊蝴蝶兰花粉团表面不平整，有极多凸起，是由数万个花粉细胞紧密聚集而形成的(图1)。
图 1 萼脊蝴蝶兰的花部特征及花粉团电镜扫描图
Figure 1. Floral syndrome and pollinia of P. japonica
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萼脊蝴蝶兰从4月始零星开放，群体花期4中旬至5月底，单花花期约30 d，单株花期约35 d。依据DAFNI标准，将开花进程划分为7个阶段(图2)。①花蕾Ⅰ期(开花前4~7 d)：花蕾未展开，整体呈不规则椭圆形，萼片和花瓣紧闭，呈淡黄绿色，可见距。②花蕾Ⅱ期(开花前1~4 d)：花蕾变大，准备开放，萼片和花瓣微微分离，侧萼片根部至中部有紫色花纹显现。花蕾长大于1.0 cm，宽大于0.5 cm。③初花Ⅰ期(开花后1~3 d)：花蕾初步开放，萼片和花瓣分离，花直径大于1.5 cm，白紫色唇瓣露出，合蕊柱被唇瓣包裹在内，紫色花纹继续在整个侧萼片延伸。④初花Ⅱ期(开花后4~5 d)：花蕾进一步开放，中萼片向斜上方竖起，侧萼片紫色花纹更加明显，花瓣向外延展，唇瓣展开露出合蕊柱，花直径大于2.5 cm。⑤盛花期(开花后6~25 d)：花蕾完全开放，中萼片直立，侧萼片完全展开，在内面具紫色横向不规则条纹，花瓣向前延伸，白紫相间唇瓣向内隆起，可见合蕊柱顶端明显药帽和中部具黏液柱头腔。⑥末花期(开花后26~30 d)：花逐步失水，由淡黄绿色变为淡黄白色，但仍可见紫色花纹，花器官均卷缩。⑦凋谢期(开花后30~40 d)：花完全失水，呈褐色，自然掉落。
图 2 不同发育阶段的萼脊蝴蝶兰
Figure 2. Development stages of flower of P. japonica
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萼脊蝴蝶兰花粉在花蕾期就具有一定活力，并随着开花进程，花粉活力在盛花期达到最大值84.98% (表1)。显微镜观察发现：萼脊蝴蝶兰花粉为近圆形四合花粉(图3A)，花粉被碘-碘化钾染为黄橘红色(图3B)，说明萼脊蝴蝶兰花粉主要由脂质组成。
表 1 花粉活力与柱头可授性检测
Table 1. Test of pollen viability and stigma acceptability
时期 花粉活力/% 柱头可授性 花蕾Ⅰ期 12.80±0.53 f − 花蕾Ⅱ期 28.23±0.52 d +/− 初花Ⅰ期 46.19±0.56 c + 初花Ⅱ期 74.13±0.91 b ++ 盛花期 84.98±0.95 a ++ 末花期 22.14±0.59 e − 凋谢期 0±0 g − 说明：数值为平均值±标准误。不同小写字母表示不同时期花粉活力之间差异显著(P＜0.05)。−表示柱头不具可授性，+/−指部分柱头具可授性，+表示柱头具可授性，++表示柱头可授性强。 
图 3 花粉活力亚历山大染色(A)和碘-碘化钾花粉组织染色(B)、联苯胺-过氧化氢法柱头可授性检测(C)
Figure 3. Alexander staining (A) and iodide-potassium iodide staining (B) of pollen viability, and benzidine- hydrogen peroxide method of stigma acceptability test (C)
萼脊蝴蝶兰初花Ⅱ期和盛花期时的柱头表面均变蓝且有大量气泡产生(图3C)，表明此阶段可授性最强。从表1可以看出，萼脊蝴蝶兰雌雄同熟，在盛花期花粉活力最强，柱头可授性最强，因此在人工授粉时，应选择盛花期的花朵异株自交。
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萼脊蝴蝶兰花直径约为3 cm (＞6 mm)，记为3；花粉和柱头同步成熟，可同期授粉，记为0；花粉位于合蕊柱顶端，与柱头空间分离，且花粉与柱头腔间的蕊喙发育，阻止自交授粉发生，记为1。由此得出萼脊蝴蝶兰杂交指数为4，其繁育系统是异交型，部分自交亲和，需要传粉者。
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由表2可见：自然授粉、自然自花授粉、去雄不授粉的结实率均为0，人工自花授粉、人工同株异花收粉、人工异株授粉结实率分别为60.00%、80.00%、93.33%，均远高于前3种处理。说明萼脊蝴蝶兰繁育系统是需要传粉者传粉的且自交和异交混合的繁育系统，不存在无融合生殖现象。
表 2 不同处理下结实率
Table 2. Percentage of fertile fruit in different pollination treatments
处理方式 处理花数/朵 结实数/粒 结实率/% 自然授粉 30 0 0 c 自然自花授粉 30 0 0 c 去雄不授粉 30 0 0 c 人工自花授粉 30 18 60.00±1.15 b 人工同株异花授粉 30 24 80.00±0.58 ab 人工异株授粉 30 28 93.33±0.67 a 说明：数值为平均值±标准误；不同小写字母表示不同处理下结实率之间差异显著(P＜0.05)。 萼脊蝴蝶兰授粉成功后，除合蕊柱和子房外，各花器官会在5 d内迅速枯萎，寿命远短于正常花期。授粉后3 d内柱头腔逐渐向内闭合至包裹花粉，约7 d可发现子房开始膨大。授粉后100 d，果实成熟，果实绿色油亮。萼脊蝴蝶兰的种子为粉末状，且与棉絮状物质共同存在于果实中，种子没有胚乳，只有种皮和种胚。由图4和表3可见：人工自花授粉果实较小(图4A)，且种子活力与种子数均较低；人工同株异花授粉果实大小其次(图4B)；而人工异株授粉果实不仅果实体积大(图4C)，其种子大小、种子活力(图4D)、种子数(单果实中种子数量约43 000粒)均最高。由此可得出人工异株授粉得到的果实质量最高。
表 3 不同处理下得到的果实表型
Table 3. Phenotype of fruit obtained under the different pollination treatments
处理方式 果实长/cm 果实宽/cm 种子长/μm 种子宽/μm 种子活力/% 单果实种子总数/粒 人工自花授粉果实 2.33±0.03 c 0.46±0.02 b 135.87±16.73 b 55.58±4.76 a 50.49±0.78 c 3 000±360 c 人工同株异花授粉果实 2.87±0.09 b 0.60±0.04 a 177.45±4.32 a 49.4±3.98 a 65.64±1.79 b 21 000±1 700 b 人工异株授粉果实 3.50±0.17 a 0.67±0.02 a 189.55±3.18 a 62.08±5.16 a 82.69±3.46 a 43 000±1 800 a 说明：数值为平均值±标准误；不同小写字母表示不同处理下结实率之间差异显著(P＜0.05)。 
图 4 不同处理下得到的果实纵切面图和TTC染色法测定种子活力
Figure 4. Longitudinal section view of the fruit obtained under the different pollination treatments and TTC staining seeds
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萼脊蝴蝶兰植株多为1~2个花序，单花序约有10朵花。花由1枚中萼片、2枚侧萼片、2枚花瓣、1枚唇瓣、1个合蕊柱、1个子房组成。单花花期约30 d，单株花期30~40 d，群体花期约45 d，其中单花盛花期为花朵展开后的6~25 d。侧萼片和唇瓣内面白紫相间的横向不规则条纹，与上萼片和花瓣的淡黄绿色形成鲜明对比。通过解剖位于萼脊蝴蝶兰唇瓣后的距，可发现其内部底端中具有少量蜜状物质。这与SUETSUGU等[18]研究相同，他们认定熊蜂属Bombus昆虫是萼脊蝴蝶兰的主要授粉者之一，并得出距内蜜状奖励物质含量与虫媒授粉成功率呈正相关关系，且花距长度与传粉者嘴部长度相关。萼脊蝴蝶兰花粉为四合花粉，即减数分裂形成的4个小孢子不分开而是结合在一起继续发育成成熟花粉。通过碘-碘化钾染色，萼脊蝴蝶兰花粉呈黄橘红色，说明萼脊蝴蝶兰花粉主要由脂质组成。通过扫描电镜对花粉团的观察，发现花粉是由多个花粉细胞紧密聚集而成，这种组成结构相对于由淀粉组成的风媒授粉植株的花粉而言，质量较大，富含营养物质较多。由此确定萼脊蝴蝶兰为虫媒授粉植株[24]
植物能否成功授粉取决于花粉活力与柱头可授性的高低。本研究通过对比不同花粉活力检测方法，得出亚历山大染色法是最适合检测萼脊蝴蝶兰花粉活力的方法。TTC染色法无法明显区别萼脊蝴蝶兰花粉活力，可能是因为萼脊蝴蝶兰对TTC染液不敏感所致，但TTC却能将长瓣兜兰[15]花粉染色，同样，醋酸洋红染色法有活力花粉和无活力花粉颜色差别不大，可能是TTC和醋酸洋红对兰科不同属间花粉的染色度不同所导致；花粉离体萌发法操作较复杂，本研究未采用此方法。本研究发现：萼脊蝴蝶兰花粉与柱头同期成熟，并且活力均先上升后下降，在盛花期达最高，这与细茎石斛Dendrobium moniliforme、葱叶兰Microtis unifolia、镰翅羊耳蒜Liparis bootanensis 等植物相似[25]。值得注意的是，萼脊蝴蝶兰的柱头在初花Ⅱ期和盛花期都具有较高的可授性，后期若进行萼脊蝴蝶兰人工授粉，可选用成熟的花粉对初花Ⅱ期的柱头进行授粉，使植株较早坐果。
在杂交指数估算时，不能以萼脊蝴蝶兰合蕊柱上花粉团与柱头的空间分布判断杂交指数。应着重观察萼脊蝴蝶兰花粉团与柱头腔间的蕊喙是否发育，以此判断植物是否能发生自交授粉。萼脊蝴蝶兰杂交指数为4，说明萼脊蝴蝶兰繁育系统是需要传粉者传粉的且自交和异交混合的繁育系统。
萼脊蝴蝶兰自然授粉、自然自花授粉、去雄不授粉3种处理结实率均为0，说明萼脊蝴蝶兰不能自主自花授粉，需要媒介授粉才能结实，因为其花粉均位于合蕊柱顶端，与柱头空间分离，但温室里没有能为其传粉的昆虫。人工自花授粉、人工同株异花授粉、人工异株授粉结实率分别为60.00%、80.00%、93.33%，且人工异株授粉果实的大小、含种子量、种子活力均高于人工自花授粉果实和人工同株异花授粉果实。这符合自然界杂种优势[26]。
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萼脊蝴蝶兰为总状花序，单花花期约30 d，群体花期为4月中旬至5月底，开放时有香味。雌雄同株，且同步成熟，在盛花期(开花6~25 d )花粉活力与柱头可授性均达到最强，花粉活力高达84.98%。萼脊蝴蝶兰花粉为近圆形四合花粉，主要由脂质组成，适合虫媒授粉。杂交指数为4，其繁育系统是需要传粉者自交和异交混合的交配系统。人工异株授粉的萼脊蝴蝶兰结实率最高(93.33%)，且果实质量最好，单果实中种子数量最大(约43 000粒)，种子活力最高(82.69%)。
Flowering characteristics and breeding system of Phalaenopsis japonica
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摘要:
目的 研究萼脊蝴蝶兰Phalaenopsis japonica的开花特性与繁育特性，为萼脊蝴蝶兰杂交育种提供理论依据，也为濒危蝴蝶兰属Phalaenopsis植物种质资源保护提供研究基础。 方法 以温室条件下栽培的萼脊蝴蝶兰为材料，记录其花器官特性和开花进程，测定花粉活力与柱头可授性，分析花粉组织化学，估算杂交指数并进行人工控制授粉试验。 结果 ①萼脊蝴蝶兰群体花期 4月中旬至5月底，单株花期30~40 d，单花花期约30 d，开放时有香味。花蕾期为开花前1~7 d，初花期为开花后1~5 d，盛花期为开花后6~25 d，末花期为开花后26~30 d，凋谢期为开花后30~40 d。②总状花序，单株花序多为1~2个，单花序约10朵花。③萼脊蝴蝶兰花粉为近圆形四合花粉，主要由脂质组成，适合虫媒授粉。④雌雄同株，且同步成熟，在盛花期(开花6~25 d)花粉活力与柱头可授性均达到最强，花粉活力高达84.98%，杂交指数为4。⑤自然授粉、自然自花授粉、去雄不授粉3种处理后的结实率均为0，而人工自花授粉、人工同株异花授粉和人工异株授粉的结实率高达60.00%、80.00%和93.33%，且人工异株授粉果实质量最好，种子最大，种子活力最高(82.69%)，单果实中种子数量约43000粒。 结论 萼脊蝴蝶兰开花始于4月中旬，结束于5月底，盛花期持续约20 d，其繁育系统属于兼性异交，需要传粉者的类型。图4表3参26 Abstract:Objective This study, with an investigation of the breeding system of the Phalaenopsis japonica, is aimed to provide theoretical basis for P. japonica hybrid breeding and research basis for the preservation and protection of the plant germplasm resources of the endangered Phalaenopsis. Method With P. japonica in greenhouses taken as materials, their floral characteristics and flowering process were recorded for observation before the pollen viability and stigma acceptability were determined, the pollen histochemistry was analyzed, the hybridization index (OCI) was estimated and artificial pollination was tested. Result (1) The P. japonica blossomed from mid April to end of May, and was fragrant and the florescence of single plant lasted for 30 to 40 days and that of a single flower is about 30 days, with the bud stage being 1 to 7 days before flowering, the initial flowering stage being 1 to 5 days after flowering, the full flowering stage being 6 to 25 days after flowering, the final flowering stage being 26 to 30 days after flowering and the flower fading stage being 30 to 40 days. (2) The P. japonica was raceme with each plant having 1 to 2 inflorescences and each inflorescence having about 10 flowers. (3) The P. japonica pollen was nearly circular tetrad pollen which was mainly composed of lipids, suitable for insect pollination. (4) The P. japonica was monoecious and the pollen viability and stigma acceptability reached the highest in the blooming stage (flowering for 6 to 25 days) with the highest pollen viability being 84.98% and OCI of P. japonica being 4. (5) The fruit setting rate of natural pollination, natural self-pollination, and emasculation without pollination were 0 but the fruit setting rate of artificial self-pollination, artificial cross-pollination of the same plant, and artificial cross-pollination of different plant reached 60.00%, 80.00%, and 93.33% respectively. The fruits of artificial cross-pollination between different plants had the highest quality, with the largest seeds, highest viability (82.69%), and largest amount of seeds (about 43000 seeds). Conclusion The flowering of P. japonica starts in mid April and ends at the end of May with the full blooming period lasting for about 20 days and its breeding system is a mixed mating system of self-pollination and cross-pollination that required pollinators. [Ch, 4 fig. 3 tab. 26 ref.] -
随着环境保护要求的不断提高，环保型木材防腐剂越来越受到重视，此类防腐剂多以高效低毒的有机农药为主成分，配合其他助剂制备成有机型或水基型防腐剂[1-2]。三唑类杀菌剂，如丙环唑、戊唑醇、环丙唑醇、氟环唑和苯醚甲环唑等，既可以单独使用，又可以与铜制剂复配[3-4]，是目前常用的木材防腐剂；这些三唑类杀菌剂杀菌谱不尽相同，作用机制也有所差异，应用较广泛的是丙环唑和戊唑醇[5-6]。常见的木材防霉剂有异噻唑啉酮类如卡松、1,2-苯并异噻唑-3-酮(BIT)、4,5-二氯-2-正辛基-3-异噻唑啉酮(DCOI)等，有机碘类如碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)，三唑类等[7]，杀菌谱也不尽相同；常用的仓储水果防霉剂如溴菌腈和抑霉唑[8-9]，防霉活性较高，但较少应用于木材防霉。菊酯类杀虫剂是常见的防治白蚁的药剂，具有用量少、成本较低、废弃物易回收、环境相对友好等优点；高效氯氟氰菊酯在菊酯类杀虫剂中活性较高、稳定性较强、耐雨水冲刷性能较好。因含有大量羟基等亲水基团[10]，木材变色、发霉、腐朽、变形等问题频发，品质降低[11-13]，常用亚麻油、桐油、豆油、核桃油等含甘油三脂肪酸酯的植物油[14]和沥青、石蜡等含长链烷烃的矿物油用作木材防水；现代工业多将植物油与动植物蜡等复配成木蜡油[15]，用作木材的表面防水处理剂。如马红霞等[16]使用56号石蜡制备木材防水剂，当石蜡质量浓度为5%时，防水效率可达54%；由此可见，石蜡可作为良好的木材防水剂。液体石蜡是经原油分馏得到的无色无味的液态烃类混合物，室温下为液态，用作防水剂时可省去加热融化环节，节约了能源和时间。木材在使用过程中需要多重保护，如防腐、防霉、防虫和防水等，存在工序繁琐、成本高昂等问题，为满足木材不同生物危害防治需要，本研究拟制备一种同时具有防腐、防霉、防虫和防水多项功能的水基型有机木材保护复合制剂，通过室内抑菌圈法筛选不同杀菌剂的抑菌活性，从中挑选活性较好、杀菌谱互补的防腐成分与防霉成分进行复配，并筛选两者的最佳配比；将其与杀虫成分和防水成分复配，制备成可以兑水自动乳化的乳油制剂。制备的复合制剂稳定性好，兼具防水、防腐、防霉、防白蚁等性能，同时处理工序简单，可达到常规生物危害防治要求的目的，为木材保护提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 杀菌剂、杀虫剂和防水剂
杀菌剂包括氟环唑(FCZ)、戊唑醇(TEB)、丙环唑(PPZ)、苯醚甲环唑(DCZ)、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)、溴菌腈(BMN)、抑霉唑(IMZ)。杀虫剂为高效氯氟氰菊酯(CLT)。防水剂为液体石蜡(化妆品级)。以上试剂购自上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.2 测试菌种
木材腐朽菌有褐腐菌密粘褶菌Gloeophyllun trabeum、白腐菌彩绒革盖菌Coriolus versicolor。木材混合霉菌有黑曲霉Aspergillus sp.、木霉Trichoderma sp.、青霉Penicillium sp.。木材变色菌可可球二孢Botryodiplodia theobromae。所有菌株均为实验室保存的生物测试标准用菌株。
测试树种为辐射松Pinus radiata。
1.2 试验方法
预实验通过满细胞法确定辐射松边材吸液(水)量为750~850 kg·m−3；根据三唑类药剂防腐有效载药量(200.0~400.0 g·m−3)[17]，换算药剂质量浓度为150.0~300.0 mg·L−1，确定试验用药质量浓度为200.0 mg·L−1。
1.2.1 防腐、防霉成分及配比筛选
通过室内抑菌效果普筛挑选出效果较好且杀菌谱互补的杀菌剂作为防腐和防霉成分。将挑选出的防腐和防霉成分按照不同配比混合进行复配，再次测试室内抑菌效果，确定效果较好的复配比例作为药剂配伍。
1.2.2 室内抑菌圈测试
参照《中华人民共和国药典》的“抗生素微生物检定法”测试抑菌圈。将5种防腐剂(FCZ、TEB、PPZ、DCZ、IPBC)统一配制成质量分数为5.00%的乳油，分别加水稀释到200.0 mg·L−1；防霉剂IMZ配制为400.0 mg·L−1，BMN分别配制为400.0、600.0和800.0 mg·L−1。在各涂满真菌孢子液的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中，分别摆放4个装有0.3 mL待测药液的牛津杯。随着药液的扩散，培养基上的真菌菌丝会受到抑制形成抑菌圈，抑菌圈直径越大，说明药剂抑菌效果越好。
1.2.3 制剂性能测试
乳液稳定性测试。参照GB/T 1603—2001《农药乳液稳定性测定方法》，在100.0 mL室温标准硬水中慢慢加入不同体积样品，边加入边搅拌，加完后继续搅拌30 s；然后在30 ℃恒温水浴中静置1 h，观察不同稀释倍数下样品乳状液分离情况。无浮油、沉淀或沉油则视为乳液稳定性合格。
防水性能测试。将含液体石蜡质量分数为40.00%的复合制剂分别兑水，稀释液体石蜡质量分数为2.00%、4.00%、8.00%，满细胞法处理试块。辐射松边材尺寸为50 mm×20 mm×10 mm，每组8块试块，室温平衡21 d后称质量，然后蒸馏水浸泡30 min，取出试块，称质量，参照GB/T 1934.1—2009《木材吸水性测定方法》计算吸水率；测量弦向尺寸变化，参照GB/T 29901—2013《木材防水剂的防水效率测试方法》计算防水效率。
室内防腐性能测试。参照GB/T 13942.1—2009《木材耐久性能第1部分：天然耐腐性实验室试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍备用，辐射松边材尺寸为20 mm×20 mm×10 mm，每组6块试块，经真空−0.09 MPa处理10 min，常压浸渍10 min，参照标准测试防腐性能。试块质量损失率＜10%，属于Ⅰ级强耐腐；质量损失率为11%~24%，属于Ⅱ级耐腐；质量损失率为25%~44%，属于Ⅲ级稍耐腐；质量损失率＞45%，属于Ⅳ级不耐腐。
室内防霉性能测试。参照GB/T 18261—2013《防霉剂对木材霉菌及变色菌防治效力的试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍，辐射松边材尺寸为50 mm×20 mm×10 mm，每组8块试块，参照标准方法处理试块，测试防霉性能。试块表面无菌丝、霉点时，定义侵染值为0；试块表面感染面积＜1/4，定义为1；试块表面感染面积1/4~1/2，定义为2；试块表面感染面积1/2~3/4，定义为3；试块表面感染面积＞3/4，定义为4。
室内防白蚁测试。参照GB/T 18260—2015《木材防腐剂对白蚁毒效实验室试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍，辐射松边材尺寸为20 mm×20 mm×10 mm，每组5块试块，参照标准方法处理试块，测试室内防白蚁性能。试块蚁蛀程度为完好无损，定义试样完好等级为10；微痕蛀蚀，定义为9.5；轻微蛀蚀，截面面积＜3%的蛀蚀，定义为9；中等蛀蚀，截面面积3%~10%的蛀蚀，定义为8；中等蛀蚀，截面面积10%~30%的蛀蚀，定义为7；严重蛀蚀，截面面积30%~50%的蛀蚀，定义为6；非常严重蛀蚀，截面面积50%~75%的蛀蚀，定义为4；试块几乎完全被蛀毁，定义完好等级为0。
2. 结果与分析
2.1 有效成分筛选
从表1可以看出：5种防腐剂(FCZ、TEB、PPZ、DCZ和 IPBC)对木材腐朽菌(彩绒革盖菌和密粘褶菌)均具有较好的抑制效果，但FCZ、TEB和PPZ对变色菌(可可球二孢)和混合霉菌几乎没有抑制作用，只有DCZ对可可球二孢有抑制效果，因此优选DCZ作为防腐成分。IPBC和IMZ对所测试菌种均有较好的抑制效果，BMN和IMZ虽然对混合霉菌和变色菌有抑制作用，但抑菌圈均小于IPBC。因此，优先IPBC作为防霉成分。
表 1 各杀菌剂的室内抑菌效果Table 1 Result of inhibition zones test by bactericide杀菌剂 质量浓度/
(mg·L−1)抑菌圈大小/mm 彩绒革
盖菌密粘
褶菌可可球
二孢混合
霉菌FCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 TEB 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 PPZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 DCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 11.4 0 IPBC 200.0 ＞45.0 ＞45.0 34.6 21.9 BMN 800.0 37.2 35.4 12.8 10.6 600.0 38.1 29.0 9.0 9.4 400.0 26.8 31.8 8.3 7.1 IMZ 400.0 39.2 41.6 26.9 12.7 将DCZ和IPBC按质量比1∶1、1∶3、3∶1的比例配制混合药剂，测试DCZ+IPBC复配药剂对腐朽菌和霉菌的抑制效果；将其他3种三唑类防腐药剂(FCZ、TEB和PPZ)与IPBC按照质量比1∶1配制复配药剂，作为对照测试抑菌效果。由表2可以看出：DCZ+IPBC复配药剂对木材腐朽菌、变色菌和混合霉菌的抑制效果较好，其中按照1∶1比例复配的药剂效果最高。相其他三唑类与IPBC的复配药剂，抑菌效果亦有所提高。由此确认防腐/防霉复配药剂，DCZ和IPBC按照1∶1进行配制。
表 2 不同三唑类药剂与IPBC复配的抑菌效果Table 2 Result of inhibition zones test by compounded of different preservatives组分 质量浓度/
(mg·L−1)抑菌圈大小/mm 彩绒革
盖菌密粘
褶菌可可球
二孢混合
霉菌DCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 11.4 0 DCZ+IPBC 150.0+50.0 ＞45.0 ＞45.0 22.4 15.1 DCZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 31.0 23.6 DCZ+IPBC 50.0+150.0 ＞45.0 ＞45.0 29.1 23.7 IPBC 200.0 ＞45.0 ＞45.0 30.6 21.9 FCZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 25.7 21.8 PPZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 25.8 22.5 TEB+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 24.0 21.0 为探索CLT对白蚁的防治效果，设计含梯度载药量的辐射松边材室内抗白蚁效果测试，拟定辐射松边材载药量分别为5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 g·m−3。由表3可知：试块中CLT载药量达10.9 g·m−3以上时，白蚁蛀蚀完好值＞8.0，质量损失率＜11%，而未添加药剂处理的对照木材，完好值仅4.6，质量损失率＞40%。因此，设计的复合制剂中防虫成分的目标载药量为7.5~30.0 g·m−3。
表 3 不同CLT载药量木材的白蚁蛀蚀结果Table 3 Result of lab anti-termite test of cyhalothrin载药量/
(g·m−3)白蚁蛀蚀
完好值质量损
失率/%载药量/
(g·m−3)白蚁蛀蚀
完好值质量损
失率/%− 4.6 42.9±14.6 15.5 8.0 10.5±1.4 5.3 8.0 11.3±0.7 21.8 9.1 5.2±1.4 10.9 8.6 5.9±1.5 32.1 8.4 5.1±1.9 说明：−表示未添加药剂 综上，本研究设计制备了含苯醚甲环唑、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、高效氯氟氰菊酯、液体石蜡等多种有效成分的木材保护复合制剂，通过调试乳化剂和助溶剂的用量和配比，最终配制出稳定、均相、透明、入水可自乳化的乳油制剂。制剂制备时按比例称取原药和乳化剂，加入助溶剂，充分溶解混匀后加入液体石蜡，搅拌均匀即可。测试使用的制剂为乳油，组成成分质量分数为0.20%苯醚甲环唑、0.20%碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、0.02%高效氯氟氰菊酯和40.00%液体石蜡。
2.2 制剂性能测试
2.2.1 乳液稳定性测试
制剂兑水稀释250倍，制剂呈乳白色，初入水时呈乳白色团雾状，可自动扩散，摇匀后呈均匀的乳状液，静置1 h未见分层、析油和沉淀，稳定性可保持3~4 h；过夜后破乳，药液表面有大量浮油，颠倒摇匀后可恢复乳液状，不影响正常使用。
2.2.2 防水性能测试
参照标准方法用该制剂处理辐射松边材，经水浸泡30 min后测试试块的吸水率和防水效率。由表4可知：未添加药剂处理的木材，吸水率为54.7%；随着制剂中石蜡质量分数升高，木材试块中石蜡含量相应增加，试块吸水率依次降低，从43.5%下降到26.6%，木材防水效率则随之增强，从44.4%提升到了77.8%。
表 4 防水剂处理后试块的防水性能Table 4 Efficiency of waterproof稀释
倍数制剂中液体石
蜡质量分数/%试块中液体石
蜡含量/(kg·m−3)吸水
率/%防水效
率/%5 8 49.1 26.6±7.4 77.8±19.1 10 4 19.4 35.0±17.3 68.9±22.1 20 2 10.5 43.5±15.1 44.4±20.6 − 0 0 54.7±5.8 0 说明：−表示未添加药剂 2.2.3 室内耐腐性能测试
由表5可知：未处理木材受白腐菌侵染后质量损失率达75.7%，受褐腐菌侵染质量损失率为19.4%，而所有处理试块质量损失率均低于6%，达到强耐腐。制剂稀释20倍后处理试块，试块中DCZ和IPBC载药量超过71.1 g·m−3，试块质量损失率可达1%，达到Ⅰ级强耐腐。值得注意的是，稀释20倍的药液处理后，试块质量损失率低于稀释5倍的药液，原因是高质量浓度制剂处理后，试块内含有大量的液体石蜡，在长达3个月的试验期内，液体石蜡自动扩散到培养基，试块质量损失增加。但取样现场也发现：高质量浓度制剂处理的试块无腐朽菌菌丝附着生长，说明添加防水剂实际进一步提升了制剂的防腐性能。
表 5 制剂处理后试块的室内耐腐性能Table 5 Result of lab sand block test on sapwood P. radiate稀释
倍数彩绒革盖菌 密粘褶菌 试块DCZ+IPBC
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%试块DCZ+IPBC
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%5 311.2+311.2 5.5±0.6 320.6+320.6 3.6±0.3 10 150.9+150.9 2.7±0.2 139.0+139.0 3.4±0.4 20 71.2+71.2 0.6±0.1 71.1+71.1 1.0±0.2 − 0 75.7±4.3 0 19.4±2.1 说明：−表示未添加药剂 2.2.4 室内防霉性能测试
参照标准方法用该制剂处理辐射松边材，测试室内防霉效果。由表6可知：未处理木材的霉菌和变色菌侵染值为4，该制剂稀释5倍时，试块表面的DCZ和IPBC含量均达0.165 g·m−2，处理试块变色菌和混合霉菌侵染值均为0，防治效果优良。在实际使用中可根据木材树种的天然耐腐性及所处环境适当增减制剂的用量，以达到理想的防霉效果。
表 6 室内防霉测试结果Table 6 Result of lab mildew proof test稀释
倍数可可球二孢 混合霉菌 DCZ+IPBC载药
量/(g·m−2)侵染值 DCZ+IPBC载药
量/(g·m−2)侵染值 5 0.165+0.165 0 0.202+0.202 0 10 0.106+0.106 1.5 0.148+0.148 0.5 20 0.045+0.045 4.0 0.048+0.048 3.3 − 0 4.0 0 4.0 说明：−表示未添加药剂 2.2.5 室内抗白蚁测试
由表7可知：不同稀释倍数的制剂处理后，试块质量损失率均＜3%，而未添加抗虫剂的对照试块，质量损失率为42.9%；制剂稀释5倍时，试块载药量达29.1 g·m−3，试块白蚁蛀蚀完好值为9.6；稀释20倍时，试块载药量为7.6 g·m−3， 试块白蚁蛀蚀完好值为8.9，而未处理木材的白蚁蛀蚀后完好值仅为4.7，质量损失率达42.9%，显示该制剂的防治白蚁效果优良。结合表3可知：相比单用高效氯氟氰菊酯时，复合制剂处理材在同等载药量下对白蚁的防治效果要好得多；当高效氯氟氰菊酯质量浓度为15.0、30.0 g·m−3时，该复合制剂防治白蚁的效果远远优于单剂，由此可知其他组分的加入起到了增效作用。
表 7 室内抗白蚁测试结果Table 7 Result of lab anti-termite test稀释
倍数木材中高效氯氟氰菊酯
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%白蚁蛀蚀
完好值5 29.1 2.8±0.5 9.6 10 14.7 2.6±0.3 9.2 20 7.6 2.5±0.7 8.9 − 0 42.9±14.6 4.7 说明：−表示未添加药剂 3. 讨论
针对不同的木材败坏防治需求，本研究制备了一种具有防腐、防霉、防虫、防水多功能的复合制剂，类型为乳油，有效成分为苯醚甲环唑、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、高效氯氟氰菊酯和液体石蜡。
该制剂兑水稀释后呈乳液状，稳定性可保持3~4 h，符合GB/T 1603—2001 《农药乳液稳定性测定方法》的规定。石蜡作为常见的防水剂被广泛应用，多数所使用的时熔点较高的固体石蜡[18]，而该制剂以液体石蜡为防水组分，优点是室温下即为液体，无需加热融化，缺点是液体石蜡密度较小，相较常规药剂，兑水稀释后稳定性差，药液兑水约 4 h 后就会分层破乳；不过，稍微搅拌即可恢复乳状，基本不影响正常使用。该制剂防水性能较好，然而应注意的是防水剂含量很大，大剂量液体石蜡的使用，存在一定的消防隐患，后期应配合表面阻燃处理。石蜡基防水剂的主要防水机制是通过石蜡的疏水作用[19]，石蜡的使用同时增强了木材的尺寸稳定性[20]，石蜡分子量较大，不易进入木材内部，因此需要将其乳化成细小的乳状液，然而，乳化剂的过量使用可能会有石蜡的疏水性降低的风险，需要在以后的开发中引起重视。结合室内耐腐试验菌丝生长状况可以发现：防水剂液体石蜡的加入，可以明显增加药剂的防腐性能，而木材中石蜡的含量很高，当木材与环境中土壤或者水体接触时，石蜡会从木材中自由扩散到环境中，可能会增加药剂流失的风险。
室内防霉测试结果来看，将制剂稀释 5 倍使用，即辐射松试块苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯载药量均为 0.165 g·m −2 时，混合霉菌的生长才能被完全抑制，这与李晓文等[21]的IPBC防霉效果结论一致。室内防霉测试所选的温湿度条件适合霉菌生长，且霉菌的孢子液人为接种，因此，通常可以通过室内防霉测试的药剂，在实际生产中的防霉效果也会很好。
室内防白蚁测试结果可知：制剂稀释 20 倍后，试块受白蚁蛀蚀程度仍较低，质量损失率较小，防蚁性能优异。同时，比较单独使用高效氯氟氰菊酯和添加防水剂后的防白蚁效果可以看出：防水剂的添加明显增加了药剂的防白蚁效果。分析原因可能是石蜡是一种化石能源，白蚁不喜食。
4. 结论
为满足木材不同生物危害防治需要，本研究制备出一种含石蜡水基型有机多功能木材防腐剂，可以一次处理基本满足木材常规保护的要求。该木材保护复合制剂同时具有防腐、防霉、防虫、防水多功能，剂型为乳油，质量分数分别为0.20%的苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、0.02%的高效氯氟氰菊酯和40.00%的液体石蜡。
当环境中生物危害较轻时，可将该复合制剂稀释20倍使用，当生物危害较重时，可将复合制剂稀释5倍甚至直接使用。将制剂稀释5到10倍处理木材，即木材中液体石蜡为25.0~50.0 kg·m−3，苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯为150.0~300.0 g·m−3，高效氯氟氰菊酯载药量为15.0~30.0 g·m−3，可满足多大多数生物危害的防治需求。
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图 3 花粉活力亚历山大染色(A)和碘-碘化钾花粉组织染色(B)、联苯胺-过氧化氢法柱头可授性检测(C)
Figure 3 Alexander staining (A) and iodide-potassium iodide staining (B) of pollen viability, and benzidine- hydrogen peroxide method of stigma acceptability test (C)
图 4 不同处理下得到的果实纵切面图和TTC染色法测定种子活力
Figure 4 Longitudinal section view of the fruit obtained under the different pollination treatments and TTC staining seeds
表 1 花粉活力与柱头可授性检测
Table 1. Test of pollen viability and stigma acceptability
时期 花粉活力/% 柱头可授性 花蕾Ⅰ期 12.80±0.53 f − 花蕾Ⅱ期 28.23±0.52 d +/− 初花Ⅰ期 46.19±0.56 c + 初花Ⅱ期 74.13±0.91 b ++ 盛花期 84.98±0.95 a ++ 末花期 22.14±0.59 e − 凋谢期 0±0 g − 说明：数值为平均值±标准误。不同小写字母表示不同时期花粉活力之间差异显著(P＜0.05)。−表示柱头不具可授性，+/−指部分柱头具可授性，+表示柱头具可授性，++表示柱头可授性强。 
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表 2 不同处理下结实率
Table 2. Percentage of fertile fruit in different pollination treatments
处理方式 处理花数/朵 结实数/粒 结实率/% 自然授粉 30 0 0 c 自然自花授粉 30 0 0 c 去雄不授粉 30 0 0 c 人工自花授粉 30 18 60.00±1.15 b 人工同株异花授粉 30 24 80.00±0.58 ab 人工异株授粉 30 28 93.33±0.67 a 说明：数值为平均值±标准误；不同小写字母表示不同处理下结实率之间差异显著(P＜0.05)。
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表 3 不同处理下得到的果实表型
Table 3. Phenotype of fruit obtained under the different pollination treatments
处理方式 果实长/cm 果实宽/cm 种子长/μm 种子宽/μm 种子活力/% 单果实种子总数/粒 人工自花授粉果实 2.33±0.03 c 0.46±0.02 b 135.87±16.73 b 55.58±4.76 a 50.49±0.78 c 3 000±360 c 人工同株异花授粉果实 2.87±0.09 b 0.60±0.04 a 177.45±4.32 a 49.4±3.98 a 65.64±1.79 b 21 000±1 700 b 人工异株授粉果实 3.50±0.17 a 0.67±0.02 a 189.55±3.18 a 62.08±5.16 a 82.69±3.46 a 43 000±1 800 a 说明：数值为平均值±标准误；不同小写字母表示不同处理下结实率之间差异显著(P＜0.05)。
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