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核桃Juglans regia 为胡桃科Juglandaceae胡桃属Juglans植物[1]，其种仁含油量高，有“木本油料之王”的称号[2]。同时，核桃木材坚实，是良好的硬木材料。作为重要的经济林树种，核桃大多种植于土壤贫瘠的山坡沟坎，不与粮争地[3]。然而，核桃树体高大，与其他果树相比对矿质营养元素需求量较高，大量元素与核桃产量和品质形成紧密相关[4]，因此，提高核桃树体对矿质元素的吸收能力对于提高核桃产量和品质至关重要[5]。研究表明：在核桃树各器官中种仁的氮素质量分数最高，核桃树吸收累积的矿质营养元素中氮素被商品核桃(种仁、硬壳)携走的比例也最高，叶片次之[6]。可见，氮素可能是提高核桃产量和品质的关键营养元素。然而，过量施用氮肥会导致严重的环境问题，因此，提高氮素利用效率是提高核桃产量与品质的重中之重[7]。
土壤中氮素主要分为无机氮和有机氮两大类，植物根系能够吸收利用的主要是无机氮，主要以硝态氮和铵态氮形式存在[8−9]。植物根系对无机氮转运调节途径可分为2种，即高亲和力(HATs)和低亲和力(LATs)的氮转运系统[10]，HATs 在外部铵态氮( ${\rm{NH}}_4^ +$)、硝态氮(${\rm{NO}}^ -_3 $)浓度低于 0.5 mmol·L−1时介导吸收大部分的无机氮，而 LATs 则是在 ${\rm{NH}}_4^ + $、${\rm{NO}}_3^ - $浓度高于 0.5或 1.0 mmol·L−1时介导吸收无机氮[10]。植物对铵态氮和硝态氮的吸收主要由铵转运蛋白和硝酸转运蛋白介导。土壤中同时含有植物可吸收利用的硝态氮和铵态氮时，由于植物吸收硝态氮需要先将其还原成铵态氮后才能进行同化利用，消耗的能量更多，所以植物对铵态氮表现出明显的偏好性，而且当植物受盐胁迫及活性氧的伤害时，铵态氮具有缓解作用，因此，介导植物对铵态氮吸收的铵转运蛋白在植物氮同化中起着重要作用[11]。铵转运蛋白基因主要有两大类族，分为AMT1和AMT2。在已知的铵转运蛋白中大部分 AMT1 家族的转运蛋白属于高亲和转运体[12]，如拟南芥Arabidopsis thaliana中有6个编码铵转运蛋白被鉴定，包括5个AMT1家族基因，1个AMT2家族基因。AMT1家族基因中，AtAMT1.1和AtAMT1.3对拟南芥根系铵态氮吸收的贡献率最高，为30%，AtAMT1.2、AtAMT1.5对拟南芥根系高亲和铵态氮吸收的贡献率略低于AtAMT1.1和AtAMT1.3[13]，AtAMT1.4在花粉中特异性表达[14]，在水稻Oryza sativa铵转运蛋白基因家族中AMT1家族有基因3个，其中OsAMT1.1和OsAMT1.2为高亲和力转运体[15]；而 AMT2 家族以低亲和为主，在拟南芥AMT2家族基因中AtAMT2.1 在低亲和范围内适度促进拟南芥根系对铵态氮吸收，主要在铵从根部到地上部运输中发挥作用[16]。AMT2 型蛋白通常在植物的不同组织中包括根、芽和叶中都有表达，如AtAMT2.1基因在拟南芥各器官中均有表达，主要表达在拟南芥的维管束及上皮层[17]，在拟南芥中AtAMT2.1与AtAMT1s之间还存在协同作用。此外，毛果杨Populus trichocarpa PtAMT2.1主要在叶片中，PtAMT2.2在叶柄中高表达。除此之外，玉米Zea mays[18]、番茄Lycopersicon esculentum [19]、欧洲油菜Brassica napus [20]等高等作物均鉴别出了AMT基因，但到目前为止，研究大多集中于高亲和的铵转运蛋白AMT1基因家族，对低亲和的铵转运蛋白AMT2基因家族的研究较少。因此，阐明AMT2的生物学功能和调控机制，对于提高核桃自身的氮效率和提高肥料利用效率都具有重要意义。
本研究以核桃JrAMT2过表达株系为供试材料，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及生理检测的方法鉴定JrAMT2基因在核桃植株体内的表达模式，进一步对核桃JrAMT2基因进行生物学功能分析，为核桃优良品种选育提供理论依据。
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实验材料来自浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室保存的核桃野生型(WT)以及课题组2019年获得的核桃JrAMT2过表达阳性植株 [21]，其中JrAMT2基因构建于PCMBIA1300植物表达载体，载体抗性为卡那霉素(kanmycin，Kan)，利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3103菌株介导将构建好的35S::JrAMT2::GFP过表达载体转化到核桃野生型体细胞胚中，植物筛选标记为潮霉素(hygromycin，Hyg)。本研究所用核桃组培苗为野生型体胚和JrAMT2过表达阳性体胚经脱水萌发获得，温室苗则由上述组培苗经生根、炼苗、驯化获得。
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SOPMA(
https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html )网站在线分析JrAMT2蛋白质二级结构，运用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )在线软件对JrAMT2 蛋白进行跨膜结构域的预测，通过 GSDS(http://gsds.gao-lab.org/ )软件在线分析JrAMT2基因结构。 -
同一JrAMT2过表达阳性体胚萌出的植株为1个株系，选取3个核桃JrAMT2阳性株系，命名为JrAMT2-1、JrAMT2-2、JrAMT2-3，每个株系继代培养至50株以上，培养条件：温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养基为Driver&Kunivuki&McGranahan (DKW)培养基。
采用2步生根法获得核桃驯化植株，选取阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗作为实验材料。第1步进行根诱导，5~8 cm长的光生芽，转移到补充有10 mg·L−1吲哚丁酸钾(K-IBA)的DKW固体培养基，在黑暗中培养7 d，诱导根原基的发生；第2步，不定根诱导结束后将其转移到粗蛭石∶DKW培养基比例(体积比)为3∶2的固体培养基中，温度为25 ℃，湿度为75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养时间为21~28 d，形成不定根，获得核桃不同株系生根植株[22]。
核桃苗不定根形成后取出用清水冲洗，多菌灵浸泡，移栽到泥炭∶蛭石∶珍珠岩比例(体积比)为2∶1∶1的混合土中，将移栽驯化成活后获得的核桃再生植株在温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗的条件下培养[23]，获得核桃不同株系温室植株。
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选用阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗进行绿色荧光蛋白(GFP) 检测、PCR及RT-qPCR验证，引物见表1。从再生植株顶芽开始向下截取 1.5 cm，培养14 d 后观察植株表型，每个株系均5个生物学重复。选取植株顶芽、叶片、茎段混样提取DNA及RNA。 PCR 反应程序为：94 ℃预变性 2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火温度 30 s，68 ℃延伸 2 min，共 32 个循环；68 ℃延伸 7 min，PCR 反应产物进行质量分数为1.2%琼脂糖凝胶电泳。使用 The iQ5 Real-Time PCR Detection System 仪器进行RT-qPCR，测定转基因植株中JrAMT2的相对表达量。反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40 个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 15 s。通过 2−ΔΔCt方法计算定量结果[24]。
表 1 引物
Table 1. Primers
引物 序列(5′→3′) 用途 Actin-F GCCGAACGGGAAATTGTC 内参 Actin-R AGAGATGGCTGGAAGAGG 内参 QJrAMT2-F AGCAAATGGGGTTCCAGGTT 定量 QJrAMT2-R TGTCTCCCGCAGATAGAAGGTA 定量 GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 鉴定 GFP-R TTACTTGTACAGCTCGTCCA 鉴定 JrAMT2-F CATGAATACCACACCGGCCTA 鉴定 取核桃野生型及核桃JrAMT2过表达株系组培苗的根、茎、小叶，根纵切、茎横切临时切片分别放置于体视荧光显微镜(Carl Zeiss Stereo D13covery V12，Axio Cam MRc system)在明场和蓝光(488 nm)激发条件下利用 ZEN lite 成像软件连续拍照[25-26]。
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分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，从顶尖向下剪取1.5 cm茎段，含2~4片复叶，培养14 d，每个株系均5个生物学重复，测量株高及节间数。选取长势相同的核桃野生型及JrAMT2过表达植株采用2步生根法驯化，移栽后用直尺测量统计不同株系生长0、20、40 d的株高、节间长、叶片长度及叶片宽度。
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，培养14 d，采用2步生根法获得核桃生根植株，植株分为地上部分及地下部分2个部分，清洗植株，分别测定地上部分及地下部分鲜质量，于105 ℃下杀青，80 ℃烘干至恒量，称取干质量。使用苏州科铭生物技术有限公司的植物铵态氮(ZATD-1-G)和植物硝态氮(ZXTD-1-G)试剂盒测定地上部分及地下部分铵态氮和硝态氮质量分数，每个株系均5个生物学重复。
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分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，取顶尖向下第2节间处复叶。将该叶片置于0.35 mol·L−1氯化钠中研磨破碎至絮状，取悬液于高倍光学显微镜下观察，找到视野中单个完整的叶肉细胞，观察细胞中的叶绿体, 使用image J软件计算叶绿体表面积与单层细胞表面积比率。每个株系均5个生物学重复。
采用丙酮浸取法测定叶绿素质量分数。分别取0.1 g核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗长势一致的叶片，剪碎，置于15 mL离心管中，加入10 mL体积分数 80%丙酮溶液，于室温黑暗处浸提，直至管内材料褪色变白，以80%丙酮溶液为对照，测定663和646 nm处吸光值，每个株系均5个生物学重复。wt=[(wa+8wb)×Vt×(mFW×1 000)−1]，叶绿素 a 质量分数(wa) =20.3×D(646)，叶绿素 b 质量分数(Cb)=8.04×D(663)。其中：wt为叶绿素质量分数(mg·g−1)，Vt为提取液总体积(mL)，mFW为叶片鲜质量(g)，D(646)和D(663)分别为646和663 nm处的吸光度。
叶绿素荧光测定使用M-PEA(multi-function plant efficiency analyser)多功能植物效率分析仪(英国Hansatech公司)测定。选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系温室苗由上向下第3片叶片暗处理30 min，在饱和脉冲光(5 000 μmol·m−2·s−1) 下进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线) 的测定和绘制。参照SCHANSKE等[27]的方法分析叶绿素荧光诱导动力学参数(JIP-test)。
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利用SPSS 26软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(邓肯法)，显著性水平为0.05。使用GraphPad Prism 7.0软件绘图。
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核桃 JrAMT2基因的全长为 1 464 bp，起始密码子为 ATG，终止密码子为 TGA。经过美国国家生物技术信息中心(NCBI)在线序列比对显示：该基因的序列编码的氨基酸序列属于 Ammonium Transporter Family，编码487个氨基酸(图1)，蛋白分子量为52.458 kD，预测分子式为C2433H3715N601O646S23，含有7 418个原子，理论等电点为7.11，不稳定指数为35.61，脂溶指数为101.56，亲水性平均值为0.472。该段蛋白质中包含20种常见氨基酸：亮氨酸质量分数最高，达到11.7%，其次分别为甘氨酸11.1%，丙氨酸10.9%，缬氨酸8.6%，半胱氨酸质量分数最低，仅为1.0%。JrAMT2蛋白中分别含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys) (表2)。
图 1 JrAMT2基因氨基酸序列
Figure 1. Amino acid sequence of JrAMT2 gene
表 2 JrAMT2基因氨基酸组成
Table 2. Composition of JrAMT2 amino acids
氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 丙氨酸 53 10.90 组氨酸 9 1.80 苏氨酸 27 5.50 精氨酸 11 2.30 异亮氨酸 25 5.10 色氨酸 18 3.70 天冬酰胺 16 3.30 亮氨酸 57 11.70 酪氨酸 17 3.50 天冬氨酸 15 3.10 赖氨酸 18 3.70 缬氨酸 42 8.60 半胱氨酸 5 1.00 甲硫氨酸 18 3.70 吡咯赖氨酸 0 0.00 谷氨酰胺 11 2.30 苯丙氨酸 24 4.90 晒半胱氨酸 0 0.00 谷氨酸 14 2.90 脯氨酸 24 4.90 甘氨酸 54 11.10 丝氨酸 29 6.00 对核桃JrAMT2蛋白跨膜区的预测结果表明：该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋，跨膜螺旋区段分别位于24~46、59~81、129~151、158~180、195~214、227~244、254~276、288~310、314~333、346~368和398~420，推测JrAMT2属于跨膜蛋白，并在N端存在信号肽(图2A)。
图 2 核桃JrAMT2基因生物信息学分析
Figure 2. Bioinformatics analysis of JrAMT2 gene in J. regia
对JrAMT2 蛋白二级结构的预测结果显示：JrAMT2的氨基酸组成中有4种构象，其中 α- 螺旋有 201 个氨基酸，占比 43.12%；延伸链有 93个氨基酸，占比19.10%；β- 转角有 30个氨基酸，占比 6.16%；无规则卷曲有154个氨基酸，占比 31.62%。JrAMT2 铵转运蛋白主要由 α- 螺旋和无规则卷曲组成(图2B)。
对JrAMT2基因结构的分析显示：JrAMT2基因由4个外显子，3个内含子组成。与拟南芥AtAMT2基因相比，拟南芥基因结构多了1个外显子和1个内含子，与山核桃Carya cathayensis CcAMT2基因[28]、栓皮栎Quercus suber QsAMT2基因[29]相比，外显子和内含子数量相同，同源性较高(图2C)。
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在成功构建35S::JrAMT2::GFP的过表达载体并通过农杆菌介导转化核桃体胚后，对同一无性系JrAMT2体胚经脱水萌发获得的再生植株进行阳性鉴定。利用PCR技术，以核桃JrAMT2过表达植株3个株系(JrAMT2-1、JrAMT2-2和JrAMT2-3) DNA为模板，进行外源GFP基因(729 bp)的PCR验证，检测到大小约为 750 bp的电泳条带，与GFP基因大小符合(图3A)；进行目的基因JrAMT2加外源GFP基因全长(2193 bp)的PCR验证，检测到大小为2000 bp的电泳条带，与目的基因大小符合(图3B)；以核桃JrAMT2过表达植株3个株系的cDNA为模板，利用实时定量PCR技术对JrAMT2基因表达量进行检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株3个株系JrAMT2基因相对表达量分别为野生型的10.58、12.80和14.94倍，显著上调(图3C)，表明核桃JrAMT2过表达植株中JrAMT2基因稳定表达。
图 3 PCR 和RT-qPCR 对核桃组培苗的JrAMT2基因的检测
Figure 3. Detection of JrAMT2 gene in J. regia tissue culture seedlings by PCR and qRT-PCR
对获得的过表达株系进行GFP荧光阳性鉴定，分别将核桃过表达及野生型幼苗(图4A)的小叶、茎、根置于荧光体视显微镜下在波长为488 nm蓝光激发下拍摄。结果显示：过表达植株的小叶、茎、根表面呈现均匀的绿色荧光，其中腋芽处荧光更明亮(图4B1~6)，野生型核桃幼苗的小叶、茎、根在荧光下拍摄无绿色荧光激发(图4B7~12)，说明JrAMT2蛋白在腋芽处积累。为进一步研究JrAMT2基因在核桃幼苗中的表达，对过表达株系及野生型组培苗的茎段进行横切，根进行纵切后，进行GFP荧光检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株茎段横切中呈现均匀的绿色荧光，其中在维管组织中荧光更明亮，野生型植株茎段横切面无绿色荧面光(图4B1~12)；核桃JrAMT2过表达植株根段纵切面中呈现均匀的绿色荧光，且在维管组织中荧光更明亮，野生型植株根段纵切面无绿色荧光(图4C1~8)。表明JrAMT2基因在核桃幼苗的根和茎中均可稳定表达，其中JrAMT2蛋白在根和茎的维管束组织中积累。
图 4 铵态氮转蛋白基因JrAMT2在核桃苗中稳定表达
Figure 4. Stable expression of ammonium nitrogen transfer protein gene JrAMT2 in J. regia
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为了进一步研究核桃JrAMT2基因的生物学功能，将3个JrAMT2过表达植株与野生型核桃植株培养14 d。结果表明：与野生型相比，核桃JrAMT2过表达植株均生长旺盛，株高显著增加，节间显著增长(P＜0.05，图5A)。3个JrAMT2过表达株系株高分别为3.87、4.23和4.12 cm，节间长分别为0.33、0.35和0.34 cm，野生型植株株高为3.30 cm，节间长为0.28 cm，与野生型相比，3个JrAMT2过表达株系株高分别增加了17.0%、28.0%和29.0% (图5B)，节间长分别增加了19.0%、25.0%和24.0% (图5C)。综上所述，JrAMT2过表达对核桃幼苗的生长有显著提高作用。
图 5 核桃JrAMT2过表达离体培养植株表型分析
Figure 5. Phenotypic analysis of J. regia JrAMT2 overexpression plant in vitro culture
对核桃JrAMT2过表达植株进一步驯化培养，成功获得核桃JrAMT2过表达温室苗。对其生长表型进行分析(图6A)，定植后培养40 d，核桃JrAMT2过表达温室苗的株高、节间长、叶片长度、叶片宽度增加显著高于野生型(P＜0.05)。培养至第20天时，与野生型相比，核桃JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加21.9%、26.0%和24.6% (图6B)，节间长分别增加41.2%、27.7%和26.3% (图6C)，叶片长度分别增加18.7%、16%和30.7% (图6D)，叶片宽度分别增加41.3%、48.2%和55.1% (图6E)；培养至第40天时，与野生型相比，JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加53.6%、68.2%和62.1%，节间长分别增加37.2%、50.3%和44.8%，叶片长度分别增加了27.8%、34.1%和49.3%，叶片宽度分别增加24.3%、19.5%和29.2%。综上所述，核桃JrAMT2过表达温室苗与野生型相比，株高、节间长、叶片大小均显著增加，进一步证明JrAMT2基因过表达加快了核桃的生长速度。
图 6 核桃JrAMT2过表达阳性温室苗性状分析
Figure 6. Character analysis of J. regia JrAMT2 overexpression positive greenhouse seedlings
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为探究JrAMT2基因在核桃中是否存在差异表达，将核桃野生型及核桃JrAMT2过表达植株进行2步生根，获得核桃JrAMT2过表达生根植株，将其分为地上部分与地下部分。与野生型相比，核桃JrAMT2过表达生根植株地下部分不定根生长旺盛(图7A)。对核桃JrAMT2过表达植株地上部分及地下部分差异分析，分别提取3个核桃JrAMT2过表达株系生根植株地上部分及地下部分RNA，利用实时定量PCR技术，分析地上部分及地下部分JrAMT2基因表达的差异。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的11.94、12.70和15.06倍，地下部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的19.07、23.34和24.00倍(图7B)。对核桃野生型及3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分进行干质量和鲜质量测定。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分鲜质量和干质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加23.45%、33.67%和56.26%，干质量分别增加23.45%、43.89%和56.26%；3个JrAMT2过表达株系地下部分干质量和鲜质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加222.65%、199.24%和344.38%，干质量分别增加222.65%、199.24%和354.33%(图7C)。
图 7 核桃JrAMT2过表达植株氮素吸收分析
Figure 7. Character analysis of the regenerated plants with expression of JrAMT2 in J. regia
基于核桃JrAMT2过表达植株表型变化，本研究进一步测定核桃JrAMT2过表达植株对硝态氮及铵态氮吸收。结果表明：与野生型相比，核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分铵态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别增加59.1%、32.3%和55.1%，地下部分别增加68.1%、61.9%和114.1% (图7D)；核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分硝态氮质量分数显著降低(P＜0.05)，地下部分硝态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别降低10.1%、7.1%和13.6%，地下部分别增加63.5%、75.7%和70.3% (图7E)。综上所述，JrAMT2基因主要作用于核桃地下部分，且JrAMT2基因过表达促进植株地下部分对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部到地上部的运输。
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对核桃JrAMT2过表达植株叶色与叶片细胞叶绿体进行观察。核桃JrAMT2过表达植株叶色与野生型相比颜色较深(图8A)，在显微镜下观察3个核桃JrAMT2过表达植株株系及野生型叶绿体特征发现，3个核桃JrAMT2过表达株系扩张的栅栏叶肉细胞中的叶绿体更致密(图8B)。进一步分析发现：对3个阳性株系进行总叶绿素质量分数测定，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿素质量分数显著高于野生型(P＜0.05)，野生型总叶绿素质量分数为3.53 mg·g−1，核桃JrAMT2过表达阳性植株3个株系总叶绿素质量分数分别为4.64、4.69和6.10 mg·g−1，与野生型相比分别增加了32.6%、34.0%和74.3% (图8C)；JrAMT2过表达株系叶绿体表面积在单层细胞表面积的占比显著高于野生型(P＜0.05)，野生型叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率为0.56，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿体表面积与单层细胞表面积的比值分别为0.67、0.68和0.69，与野生型相比分别增加了19.41%、21.18%和22.94% (图8D)。综上所述，JrAMT2基因过表达提高了叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率及核桃叶肉细胞内叶绿素的积累。
图 8 核桃JrAMT2过表达植株叶绿体及叶绿素质量分数分析
Figure 8. Analysis of chloroplast and chlorophyll content in J. regia with JrAMT2 overexpression
对3个核桃JrAMT2过表达株系进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线测定。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系的O (Fo点)相、K相降低，J点、I点、P (Fm)及J~P点振幅均提高，OJIP曲线较陡，表明JrAMT2基因一定程度上提高了叶片的活性(图9A)。与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系暗适应后的最大荧光强度(Fm)、最大量子产额(Fv/Fm)均提高，Fm分别提高了47.1%、45.9%、50.2%，Fv/Fm分别提高了15.6%、13.4%、14.7%，表明JrAMT2基因一定程度上提高了光系统Ⅱ(PSⅡ)的光化学效率(图9B)。计算归一化处理的OJIP曲线(Vt)[Vt =(Ft−Fo /(Fm−Fo)，Ft为任意时刻t的荧光值]，并计算相对荧光差异ΔVt[ΔVt = Vt处理−Vt对照，用ΔK、ΔJ值分别显示在300 μs和20 ms处的ΔVt值，表示放氧复活体的活性(OEC)]。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系ΔK、ΔJ值下降且＜0 (图9C)，表明JrAMT2基因一定程度上提升了核桃叶片PSⅡ供体侧及受体侧电子传递效率及放氧复活体的活性。
图 9 铵态氮转运蛋白JrAMT2基因表达对核桃叶绿素荧光的影响
Figure 9. Effect of ammonium nitrogen transporter JrAMT2 gene on chlorophyll fluorescence of J. regia
用JIP-test参数对OJIP曲线进行定量分析，结果显示：核桃3个JrAMT2过表达株系在t=0时的最大光化学效率(φPo)、反应中心捕获的光能用于${\rm{Q}}_{\rm{A}}^- $下游电子传递的量子产量(ΨEo)、吸收的能量用于电子传递的量子产量(φEo)上升，分别上升了14.62%、44.59%、65.80%；在J点的相对可变荧光强度(VJ)、最小荧光强度与最大荧光强度比值(Fo/Fm)、反应中心关闭净速率(dV/dto)下降，分别下降了31.03%、35.29%、49.34% (图9D)，表明JrAMT2基因一定程度上提高了PS反应中心的量子比率及产额；对单位PS反应中心比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在t=0 时的单位反应中心捕获的用于电子传递的能量(ETo/RC)、在t=0 时的单位反应中心传递到电子链末端的能量(REo/RC)无明显变化，在t=0 时单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、在t=0 时单位反应中心耗散的能量(DIo/RC)、在 t=0 时单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)显著下降，分别为36.43%、58.67%、27.22%，表明JrAMT2基因一定程度提高了核桃叶片反应中心活性和用于电子传递的能量份额，增强了电子传递能力(图9E)；对单位受光截面比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在 t=tFM(暗适应后达到最大荧光强度时间点)时的单位受光截面耗散的能量(DIo/CSm)无明显变化，在 t=tFM时单位受光截面吸收的能量(ABS/CSm)、在t=tFM时单位受光截面捕获的用于还原QA的能量(TRo/CSm)、在 t=tFM时单位受光截面捕获的用于电子传递的能量(ETo/CSm)、在t=tFM时单位受光截面传递到电子链末端的能量(REo/CSm)上升，分别上升了 47.79%、69.39%、145.10%、303.62%(图9F)，表明JrAMT2基因一定程度提高核桃叶片单位受光截面的电子传递的份额及电子传递效率。综上所述，JrAMT2基因过表达促进核桃的光合作用。
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氮素作为植物生长发育必不可少的营养元素，是核酸、蛋白质、酶、叶绿素、植物激素等的重要组成部分[30]。自然界中可供利用的氮素资源有限，作物高产就需要化肥的投入。中国的化肥投入总量逐渐升高，但化肥利用率很低，给自然环境带来极大的负担 [31−32]，因此合理使用化肥，提高作物对氮素的吸收效率是促进农业生态化发展的重要途径。铵转运蛋白基因AMTs是广泛存在于动物、植物、微生物中用于运输${\rm{NH}}_4^+ $的载体蛋白，从分子层面提高植物对氮素的利用具有重要意义。前人研究发现：在拟南芥中，氮饥饿能诱导AtAMT1.1、AtAMT2.1基因上调表达，并且AtAMT2基因的表达水平随着氮饥饿时间的延长而增加[33-34]。在充足或高氮条件下，观察到拟南芥中AtAMT2.1及水稻根中OsAMT1.2基因表达水平仍上调 [35-36]，其中氮素形态对AMT基因转录水平的调控也取决于AMT基因个体和植物物种。
本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行初步的功能验证，对JrAMT2基因进行生物信息学分析表明：JrAMT2蛋白中含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys)。该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋结构域，与李畅[36]预测的OsAMT2.1蛋白结构域特点相同，且与夏金泽等[37]研究的木薯Manihot esculenta MeAMT2.6基因的蛋白结构相似。AMT2 型蛋白通常在植物的各种组织中表达，包括根、芽和叶。前人研究发现：杜梨 Pyrus betulifolia PbAMT2基因在所有器官中均有表达，但在根部表达最高[38]。在拟南芥中发现：AtAMT2.1基因主要在维管组织中表达，在芽中的表达高于根[15]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行绿色荧光观察发现：JrAMT2蛋白在核桃苗整株均有表达，且在芽及根茎的维管束中荧光更明亮，说明与拟南芥相同，核桃JrAMT2蛋白在所有器官中表达，且主要在维管组织中表达。
在植物生长发育重要阶段充足的氮素营养供给可以促进其生长发育，增加产量，对植物外施氮素能增加植株株高及叶面积[39]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株生长性状分析发现：JrAMT2基因在核桃中过表达对植株生长发育有调控作用，主要表现在过表达植株株高、节间长显著增加。对过表达植株生根驯化结果显示：过表达植株生物量显著增加，根系发达。对核桃JrAMT2过表达植株移栽驯化，定植后植株生长速率显著高于野生型，主要表现在节间伸长快，叶面积增加。AMT2是具有铵吸收功能的铵转运蛋白，且在维管组织表达，暗示着该基因可能参与铵向木质部的装载，介导铵在植物中的长距离运输。研究发现：拟南芥AtAMT2.1除了对根吸收氮素有一定贡献外，主要作用于${\rm{NH}}_4^+ $从根部到茎部的运输[40]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株地上部分和地下部分基因表达测定发现：植株地下部分JrAMT2基因表达量显著高于地上部分，且植株地下部分生物量的增加显著高于地下部分，说明核桃JrAMT2基因主要在地下部分表达。对核桃JrAMT2过表达植株对铵态氮和硝态氮吸收测定结果表明：核桃JrAMT2过表达植株地上部分仅对铵态氮的吸收显著上调，地下部分对铵态氮与硝态氮的吸收均显著上调，说明JrAMT2基因促进植株对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部分到地上部分的运输。氮素营养还会通过影响叶绿素合成和叶绿素荧光参数的变化来参与光能的利用和调控[41]。有研究表明：水稻OsAMT2.1基因敲除株系的光合特性与野生型相比出现下降趋势，同样说明了AMT2基因对植物光合作用有调控作用[36]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数变化的测定结果显示：JrAMT2基因显著提高了核桃的叶绿体表面积与单层细胞表面积比率、叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数中叶片放氧复活体活性、量子产额、电子传递效率。
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JrAMT2作为铵态氮转运基因，促进核桃对铵态氮和硝态氮的吸收，且介导铵态氮从根部到茎部的运输，对核桃生长发育、光合作用等有积极作用，对研究核桃高效利用氮素及良种的筛选有重要意义。
Functional analysis of ammonium nitrogen transporter gene JrAMT2 in Juglans regia
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摘要:
目的 研究高效利用氮素基因铵态氮转运蛋白基因JrAMT2，对核桃Juglans regia的品种改良、快速生长及产量形成有重要意义。 方法 以核桃JrAMT2过表达幼苗为实验材料，对JrAMT2基因进行生物信息学分析。通过基因表达量和表型测定对核桃JrAMT2过表达植株生长发育、氮素吸收、叶绿素质量分数、叶绿素荧光进行理化分析。 结果 JrAMT2基因在核桃JrAMT2过表达植株中稳定表达。与野生型相比，核桃JrAMT2过表达株系的株高、节间长、生物量等生长参数显著提高(P＜0.05)，核桃幼苗的株高、节间长增加，最高可增加68.2%和50.3%，植株地上部分、地下部分生物量显著增加，地上部分最高可增加56.26% (鲜质量)和56.26% (干质量)，地下部分最高可增加344.38% (鲜质量)和354.33% (干质量)；核桃JrAMT2过表达株系地下部分对铵态氮及硝态氮的吸收显著提高(P＜0.05)，最高可提高114.1%和70.3%，其中JrAMT2基因介导了铵态氮从地下部分到地上部分的运输，地上部分铵态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，最高可增加59.1%；核桃JrAMT2过表达植株叶绿体表面积与单层细胞表面积比率、叶绿素质量分数显著增加(P＜0.05)，最高可增加22.94%和74.3%；对叶绿素荧光参数分析，核桃JrAMT2过表达植株叶片放氧复活体活性、量子产额、电子传递效率均显著提高(P＜0.05)。 结论 核桃JrAMT2基因在核桃幼苗生长发育、氮素吸收和光合作用中均有积极显著调控的作用，为进一步研究核桃快速繁育提供一定的理论依据，且为筛选优良品种奠定一定基础。图9表2参41 Abstract:Objective The objective is to study the efficient utilization of nitrogen genes and the ammonium nitrogen transporter protein JrAMT2 gene, which is of great significance for variety improvement, rapid growth, and yield of Juglans regia. Method Using J. regia JrAMT2 overexpression (OE) seedlings as experimental materials, bioinformatics analysis was conducted on JrAMT2 gene. The growth and development, nitrogen absorption, chlorophyll content, and chlorophyll fluorescence of J. regia JrAMT2-OE plants were analyzed through gene expression level and phenotype determination. Result Fluorescence detection, polymerase chain reaction, and fluorescence quantitative PCR were performed on J. regia JrAMT2-OE plants to verify that the JrAMT2 gene is stably expressed in J. regia JrAMT2-OE plants. Compared with the wild type, the plant height, internode length, biomass and other growth parameters of JrAMT2-OE lines significantly increased, and the plant height and internode length of J. regia seedlings increased by 68.2% and 50.3%. The aboveground and underground biomass of JrAMT2-OE lines increased significantly, with a maximum increase of 56.26% (fresh weight) and 56.26% (dry weight) in the aboveground parts, and a maximum increase of 344.38% (fresh weight) and 354.33% (dry weight) in the underground parts. The uptake of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen in the underground part of J. regia JrAMT2-OE significantly increased by 114.1% and 70.3% respectively. The JrAMT2 gene mediated the transport of ammonium nitrogen from the underground part to the aboveground part, and the content of ammonium nitrogen in the aboveground part increased significantly, up to 59.1%. The ratio of chloroplast surface area to monolayer cell surface area and chlorophyll content of JrAMT2-OE increased significantly, with the highest increase of 22.94% and 74.3%. The analysis of chlorophyll fluorescence parameters showed that the activity, quantum yield and electron transfer efficiency of the oxygen-reactive body in the leaves of J. regia JrAMT2-OE plants significantly improved. Conclusion The JrAMT2 gene of J. regia plays a significant role in the growth and development, nitrogen absorption and photosynthesis of J. regia seedlings. [Ch, 9 fig. 2 tab. 41 ref.] -
Key words:
- Juglans regia /
- JrAMT2 /
- ammonium nitrogen transporter protein /
- overexpression /
- photosynthesis
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黄腹角雉Tragopan caboti隶属鸡形目Galliformes雉科Phasinidae角雉属Tragopan，分布于湖南东南部、浙江南部和西南部、江西、福建、广东北部和广西东北部，是中国特产濒危雉类，国家一级重点保护动物，全国估计有4 000只，被列入《中国濒危动物红皮书·鸟类卷》[1]。
自20世纪80年代发现黄腹角雉以来，在浙江乌岩岭国家级自然保护区(1994年之前为省级)对黄腹角雉的研究，主要涉及栖息地和巢址选择、栖息地片段化、食性、人工受精繁殖、越冬与迁移、种群结构与动态、种群生存力分析等方面的内容[2]，这些都为自然保护区黄腹角雉种群的科学保护提供了指导建议。本研究对浙江乌岩岭国家级自然保护区内黄腹角雉的最新分布范围进行了调查和分析，以期对前期保护效果进行评估，并为今后保护工作提供建议。
1. 研究区概况
浙江乌岩岭国家级自然保护区(27°20′52″~27°48′39″N，119°37′08″~119°50′00″E)由原乌岩岭省级自然保护区在1994年扩大范围并经国务院批准而晋升为国家级。扩区、晋级后面积为1 881.6 km2，下辖双坑口、碑排、黄桥、垟溪等4个保护站，涉及乌岩岭林场的国有林，罗阳、司前、竹里、西旸等4个乡镇12个行政村的集体林。属于亚热带海洋性季风气候，以次生植被为主，但保存着大面积完整的原生性常绿阔叶林[3]。宋永昌等[4]认为：乌岩岭地区所保存的常绿阔叶林植被比较完整、典型，被认为是中国亚热带常绿阔叶林东部地区保存较好的地点之一。
保护区动植物资源非常丰富，近年来陆续发现了一批新种、全国新分布种、浙江新分布种[5-11]。珍稀物种较多，国家一级保护植物有5种，国家一级保护动物有8种[3]。国家一级保护动物中，鸟类有黄腹角雉与白颈长尾雉Syrmaticus ellioti。作为全国主要的黄腹角雉保种基地与科研基地，做好黄腹角雉种群的调查、监测是该保护区的重要工作之一。
2. 研究方法
2.1 黄腹角雉分布点调查方法
自2019—2020年，采用样线调查法、红外相机调查法对浙江乌岩岭国家级自然保护区黄腹角雉分布进行了调查。样线布设时最大限度地利用现有护林路及防火线，可利用里程为60 km。对间距超出1 km的区域进行线路加密，加密里程为25 km。样线总长度达85 km，基本遍及保护区的各类典型区域。样线调查结合巡护工作每季度开展1次，调查中携带望远镜、照相机，进行必要的影像与文字记录。红外相机调查主要在双坑口、碑排2个保护站所辖区域开展，2019年在双坑口、2020年在碑排分别布设红外相机100台，布设时间均为1 a，2 a共布设200台次。红外相机的设置及照片判读参照章书声等[12-13]的方法。红外相机位点选择总体上采用随机原则，位点间保持直线距离为500~800 m，尽量呈均匀分布，并确保每平方公里范围至少布设1台红外相机。但在局部位置确定上，则要根据地形、植被情况，尽量选择黄腹角雉可能出现并被监拍到的方位。相机安装高度为0.2~1.5 m(结合地形及相机朝向确定)，每季度更换电池与内存卡。由于保护区地形地貌复杂与人为干扰等因素，红外相机存在遗失与被偷盗情况，在双坑口、碑排保护站所辖区有效收回的相机分别为95、92台。
对发现黄腹角雉分布点的经纬度、海拔、植被类型、个体数量及性别等相关情况进行记录，并对不同分布区(保护站)、不同植被类型与不同海拔范围进行统计。
2.2 黄腹角雉分布范围与分布面积确定
研究表明：黄腹角雉栖息地为海拔800~1 400 m的常绿阔叶林和常绿针阔混交林[14]，全年最大扩散距离为3 km[2, 15]。通过实地调查，结合ArcGIS图像判读，分析各个分布点周边的森林植被类型、海拔高度及地形地貌等相关因素，逐个地块判定黄腹角雉分布的区域范围。如在某一地块发现黄腹角雉，则在同一座山体中自该分布点上至海拔1 400 m，下至海拔800 m范围，植被类型为阔叶林、针阔混交林(包含小面积的其他林种)，距离3 km以内(实际中大都达不到3 km)的地域予以确认为黄腹角雉分布范围。分布点以外较大面积(1 hm2以上)的农用地、毛竹Phyllostachys edulis林、针叶纯林予以排除，被其他地类完全隔离的阔叶林、针阔混交林也不予以确认。将相邻分布地块合并后的分布范围按不同保护站转绘到ArcGIS 10.0软件系统中，自动求算各分布区面积。
3. 结果与分析
3.1 黄腹角雉分布点
总共调查到黄腹角雉分布点69个，其中通过样线调查发现的分布点为54个，通过红外相机拍照发现的分布点为15个。双坑口、碑牌、黄桥、垟溪4个保护站均发现有黄腹角雉分布，分布点分别为37、15、11和6个。各分布点的记录详见表1。
表 1 黄腹角雉野外分布调查记录Table 1 Population quantity of T. caboti分布区 分布点 经纬度 海拔/m 植被类型 数量与性别 调查方式 双坑口 S1 27°40′60″N，119°41′15″E 860 阔叶林 1雄 样线调查 S2 27°40′55″N，119°41′10″E 1 110 阔叶林 1雌1雄 红外相机调查 S3 27°40′54″N，119°40′53″E 1 070 针阔混交林 1雄 样线调查 S4 27°20′42″N，119°40′45″E 1 040 针阔混交林 1雌 样线调查 S5 27°41′23″N，119°40′21″E 1 180 针阔混交林 1雌1雄 样线调查 S6 27°41′19″N，119°39′56″E 1 230 针阔混交林 3雄 样线调查 S7 27°41′29″N，119°39′50″E 1 380 针阔混交林 1雌3幼 红外相机调查 S8 27°41′38″N，119°39′56″E 1 310 针叶林(柳杉) 1雌3幼 样线调查 S9 27°41′46″N，119°40′02″E 1 190 阔叶林 1雌 样线调查 S10 27°41′59″N，119°40′18″E 1 220 针阔混交林 1雌3亚 样线调查 S11 27°42′08″N，119°40′21″E 1 120 针叶林(柳杉) 1雌2幼 红外相机调查 S12 27°42′13″N，119°40′21″E 1 030 针阔混交林 1雄 样线调查 S13 27°42′13″N，119°40′16″E 1 070 针阔混交林 1雌 样线调查 S14 27°41′57″N，119°40′31″E 1 045 针阔混交林 2雄 红外相机调查 S15 27°42′16″N，119°40′09″E 995 阔叶林 1雌 样线调查 S16 27°42′18″N，119°40′03″E 915 阔叶林 1雌1雄 样线调查 S17 27°42′48″N，119°40′13″E 843 针阔混交林 1雌 红外相机调查 S18 27°42′50″N，119°40′05″E 772 阔叶林 1雄 样线调查 双坑口 S19 27°42′30″N，119°39′50″E 680 阔叶林 2雌 红外相机调查 S20 27°41′09″N，119°41′13″E 741 阔叶林 1雌1雄4亚 样线调查 S21 27°43′02″N，119°39′47″E 957 阔叶林 1雌 样线调查 S22 27°42′57″N，119°40′01″E 882 阔叶林 2雌 红外相机调查 S23 27°40′16″N，119°40′16″E 860 针阔混交林 1雄 样线调查 S24 27°41′31″N，119°41′35″E 1 193 毛竹林 2雌2雄 样线调查 S25 27°41′43″N，119°39′27″E 1 221 针阔混交林 1雄 红外相机调查 S26 27°42′03″N， 119°39′06″E 1 300 针阔混交林 2雄 样线调查 S27 27°42′38″N，119°38′52″E 1 065 阔叶林 1雌 红外相机调查 S28 27°42′49″N，119°38′49″E 1 325 针阔混交林 1雄 样线调查 S29 27°42′45″N，119°38′43″E 1 405 针阔混交林 1雌 样线调查 S30 27°42′55″N，119°38′36″E 1 550 针阔混交林 1雌 红外相机调查 S31 27°42′58″N，119°38′40″E 1 495 针阔混交林 2雌1雄 样线调查 S32 27°43′10″N，119°38′50″E 1 135 针阔混交林 1雄 样线调查 S33 27°43′52″N，119°39′36″E 1 210 针阔混交林 1雌2雄 样线调查 S34 27°43′41″N，119°39′51″E 1 155 针叶林(杉木林) 1雌 红外相机调查 S35 27°44′36″N，119°41′10″E 750 阔叶林 1雄 样线调查 S36 27°45′26″N，119°42′48″E 980 阔叶林 1雄 样线调查 S37 27°45′56″N，119°43′32″E 1 100 针阔混交林 1雌2幼 样线调查 碑排 B1 27°40′31″N，119°39′23″E 710 阔叶林 1雌3幼 红外相机调查 B2 27°40′11″N，119°40′11″E 690 阔叶林 1雌 样线调查 B3 27°41′13″N，119°39′52″E 1 270 针阔混交林 1雌3亚 样线调查 B4 27°41′19″N，119°39′43″E 1 170 针阔混交林 1雌2幼 红外相机调查 B5 27°41′36″N，119°39′06″E 1 390 针阔混交林 1雄 样线调查 B6 27°41′12″N，119°38′38″E 1 340 针阔混交林 1雌 样线调查 B7 27°40′39″N，119°39′17″E 782 阔叶林 2雄 样线调查 B8 27°40′7″N，119°39′16″E 760 针阔混交林 1雌 样线调查 B9 27°41′14″N，119°39′22″E 1 070 针叶林(柳杉林) 1雌1雄 红外相机调查 B10 27°40′19″N，119°38′44″E 1 090 针阔混交林 1雌 样线调查 B11 27°39′03″N，119°38′29″E 1 120 阔叶林 1雄 样线调查 B12 27°38′05″N，119°38′32″E 1 170 针阔混交林 2雌 样线调查 B13 27°40′14″N，119°39′57″E 772 阔叶林 1雌2雄 样线调查 B14 27°40′28″N，119°40′31″E 1170 针阔混交林 1雄 红外相机调查 B15 27°40′19″N，119°40′17″E 910 阔叶林 2雄 样线调查 黄桥 H1 27°46′05″N，119°44′39″E 905 针阔混交林 1雌 样线调查 H2 27°46′07″N，119°44′56″E 920 针阔混交林 1雄 样线调查 H3 27°46′02″N，119°44′56″E 830 针阔混交林 2雄 样线调查 H4 27°46′10″N，119°45′35″E 995 针阔混交林 1雌 样线调查 H5 27°46′33″N，119°46′41″E 850 阔叶林 1雌1雄 样线调查 H6 27°46′48″N，119°46′24″E 860 毛竹林 1雌 样线调查 H7 27°46′54″N，119°45′42″E 905 针阔混交林 1雄 样线调查 H8 27°47′19″N，119°47′53″E 720 阔叶林 2雌 样线调查 H9 27°47′02″N，119°48′19″E 835 阔叶林 1雌2幼 样线调查 H10 27°48′11″N，119°49′27″E 910 针阔混交林 1雌2亚 样线调查 黄桥 H11 27°48′29″N，119°48′18″E 775 阔叶林 1雄 样线调查 垟溪 Y1 27°21′51″N，119°45′21″E 705 阔叶林 1雄 样线调查 Y2 27°21′46″N，119°45′18″E 850 针阔混交林 1雄 样线调查 Y3 27°21′54″N，119°45′43″E 903 针阔混交林 2雄 样线调查 Y4 27°22′22″N，119°46′01″E 1010 阔叶林 1雌 样线调查 Y5 27°22′20″N，119°46′18″E 915 针阔混交林 1雄 样线调查 Y6 27°22′15″N，119°45′34″E 720 阔叶林 1雌 样线调查 说明：“亚”即黄腹角雉亚成体，“幼”即黄腹角雉幼体；柳杉Cryptomera fortunei，杉木Cunninghamia lanceolata 按植被类型统计，黄腹角雉在常绿阔叶林分布26只，占37.7%，在针阔混交林分布37只，占53.6%，其他植被类型(针叶林及毛竹林)分布6只，占8.7%。针阔混交林的分布点最多，其次为常绿阔叶林，其他植被类型则较少。按海拔范围统计，黄腹角雉在海拔800~1 400 m分布53只，占76.8%；其他海拔分布16只，占23.6%，其中海拔800 m以下分布13只，占18.8%，海拔1 400 m以上分布3只，占4.4% (表2)。
表 2 黄腹角雉野外分布调查统计表Table 2 Statistical table of distribution of T. caboti分布区 分布数量/只 按植被类型的黄腹角雉分布 按海拔范围的黄腹角雉分布 阔叶林 针阔混交林 其他 800 m以下 800~1 400 m 1 400 m以上 数量/只 占比/% 数量/只 占比/% 数量/只 占比/% 数量/只 占比/% 数量/只 占比/% 数量/只 占比/% 双坑口 37 13 35.1 20 54.1 4 10.8 4 10.8 30 81.1 3 8.1 碑排 15 6 40.0 8 53.3 1 6.7 5 33.3 10 66.7 黄桥 11 4 36.4 6 54.5 1 9.1 2 18.2 9 81.8 垟溪 6 3 50.0 3 50.0 2 33.3 4 66.7 合计 69 26 37.7 37 53.6 6 8.7 13 18.8 53 76.8 3 4.4 调查中发现：在靠近防火线与山脊线的边缘区域、以及与其他植被类型交界的过渡区域，黄腹角雉分布数量相对较多，而核心区域黄腹角雉反而较少，可以初步确定黄腹角雉种群分布存在边缘效应。此外，在低海拔地带及保护区最南面的洋溪分布区，并未发现黄腹角雉依赖性的植物交让木Daphniphyllum macropodum。
3.2 黄腹角雉分布区范围与面积
浙江乌岩岭国家级自然保护区黄腹角雉分布区总面积为55.3 km2。双坑口分布区面积为24.9 km2，东与司前镇黄桥村为界；南面边缘有较多的毛竹林、针叶林，最低海拔为680 m；西与罗阳镇马联村为界；北部主要与景宁畲族自治县为界。主要涉及乌岩岭林场的国有林，及司前镇榅垟村、上地村、叶山村及罗溪源林场的集体林。海拔范围为680~1 550 m。碑排分布区面积为15.2 km2，东与乌岩岭林场为界；南面最低海拔为690 m，分布较多成片的毛竹林、针叶林；西与罗阳镇上垟村为界；北部与景宁畲族自治县及福建省寿宁县为界。主要涉及罗阳镇马联村、五岗村，及马子坑联营场、碑排林场、岭北林场的集体林。海拔为690~1 350 m。黄桥分布区面积为10.7 km2，分为陈吴坑—双坑头、苦杜井—晓燕2个区块。东与文成县交界，南面主要与毛竹林相邻，西与司前镇上地村接壤，北与景宁畲族自治县为界。主要涉及司前镇黄桥村、黄桥联营场、竹里乡茶石村、竹里乡林场的集体林。海拔为720~995 m。垟溪分布区面积为4.5 km2，范围为羊场(地名)周边海拔720 m以上的区域。主要涉及西旸镇洋溪林场的集体林。
4. 讨论
4.1 分布区植被类型与海拔范围
本研究发现：黄腹角雉分布地主要为常绿阔叶林与针阔混交林，这与之前的研究结果[14]基本一致。但也有少数分布点位于针叶林与毛竹林中，这些分布点大都在阔叶林附近，黄腹角雉在这些地块出现可能属于偶然路过。黄腹角雉营巢树以柳杉为主[16]，在柳杉林区域出现则可能与营巢有关。保护区内黄腹角雉海拔分布范围为680~1 550 m，比之前800~1 400 m的海拔范围[15]要广。近年来黄腹角雉向低海拔区域扩散的趋势明显，2019年在保护区以外天关山地区海拔570 m处发现了黄腹角雉，这是浙江省泰顺县迄今为止发现黄腹角雉的最低海拔区域。
4.2 与交让木的相关性
交让木果实与叶子是黄腹角雉赖以越冬的食物，交让木同黄腹角雉的分布密切相关，是其依赖性植物[15]。乌岩岭自然保护区交让木分布在海拔900~1 400 m[17]，但在黄腹角雉低海拔分布地带及垟溪分布区，并没有发现交让木的存在，说明当前黄腹角雉的分布与交让木不具有完全的相关性。本研究分析认为：低海拔地带及地处最南面的垟溪分布区，植物种类都比较丰富，并且在冬季枯萎程度也不高，黄腹角雉具备相对充足的食物来源，即便没有交让木也能越冬生存。观察乌岩岭人工饲养下黄腹角雉对笼舍内所种植交让木的取食情况，发现笼舍内种植的交让木很少被取食。这说明在人工投喂食物充足的情况下，黄腹角雉对交让木并不具有喜好性与依赖性。但在冬季，高山地区食物相对短缺，交让木对黄腹角雉种群越冬无疑具有重要作用。
4.3 种群分布的边缘效应
边缘效应是自然界普遍存在的现象[18]。本研究初步确定黄腹角雉种群分布也具有边缘效应，种群在阔叶林边缘区域分布相对较多，而在核心区域的发现频率则相对较少。这可能与核心区域在植被高度郁闭下群落内部林窗、林隙的减少与消失有关。陈龙斌等[19]认为：林隙在促进森林生态系统物种多样性、结构复杂性和生境多样性等方面具有重要驱动作用。而植被高度郁闭则会产生以下影响：一是由于光照不足，林下植物种类及数量明显下降而导致食物缺乏；二是自然整枝现象严重，树木变得高大通直而不适于营巢；三是林内光线过于阴暗；四是缺乏具有一定空旷度的“飞动”空间。因此，过度郁闭的植被环境可能并不适合黄腹角雉的生存。在森林内部维持适量林窗、林隙等“小尺度边缘”，有可能是今后保护工作需要考虑的方向。而保护区内遍及主要山脊线的防火线，除了在森林防火上发挥功能以外，也为黄腹角雉活动提供了“边缘”地带。防火线周边是近年来发现黄腹角雉较多的地带，说明防火线对黄腹角雉种群生存繁衍具有助益作用，今后应继续予以维护和保留。
其他野生动物也有相类似现象。如华南梅花鹿Cervus nippon kopschi在保护过程中也面临过相类似困境，良好保护下生长茂盛的森林植被并不适于华南梅花鹿栖息[20]。这些实例都说明，对于某些特定的珍稀濒危物种，如果仅仅对栖息地采取单纯保护，有时候反而造成自然演替中适宜栖息环境的变迁乃至丧失。根据保护对象特定的生态学习性采取适当的人工干预，是栖息地保护与改良的必要措施之一。
4.4 分布区域的变化
在1990年，乌岩岭黄腹角雉冬季种群平均密度为7.08只·km−2，种群数量为43只[21]，可推算出当时的分布面积为6.09 km2。当前黄腹角雉分布面积为55.3 km2，为之前的9.1倍，栖息地范围得到了较大扩展。但相对于保护区1 881.6 km2总面积，当前黄腹角雉分布区所占比例为29.3%，种群分布还有进一步的扩展空间。在4个分布区中，双坑口是原乌岩岭省级自然保护区所在地，也是黄腹角雉的传统分布区与主要分布区，此前鸟类专家大多在此区域开展黄腹角雉研究工作。碑排、黄桥、垟溪3个分布区均为乌岩岭1994年晋升国家级保护区时新划入的范围，其中碑排、黄桥这2个分布区与原乌岩岭省级自然保护区相邻，黄腹角雉种群有可能是乌岩岭原有种群向外扩散繁衍的结果，而垟溪分布区与乌岩岭相距遥远，还被多个乡镇分隔，黄腹角雉种群则可以确定为独立存在的种群。
栖息地片段化与典型栖息地丧失对濒危雉类的威胁尤为严峻，是濒危雉类保护工作中必须优先考虑的问题[15]。典型栖息地的急剧缩小和恶化是致危的主要外因之一，历史上阔叶林已被人工针叶林所取代，使黄腹角雉失去赖以生存的条件[14]。此前保护区的研究[22-23]表明：通过“针改阔”能够实现黄腹角雉栖息地的恢复。在一些植被类型由针叶林改造为阔叶林、针阔混交林的地块，已发现了黄腹角雉的活动。而1994年保护区扩大范围后，区内农村集体林也停止了以针叶用材树种(主要为杉木、柳杉及马尾松Pinus massoniana)作为目的树种的传统林业经营活动，在历经多年演替后，原有针叶林地块大都已向亚热带地带性植被常绿阔叶林方向演变，目前大部分已演变为针阔混交林，黄腹角雉栖息环境已在较大空间尺度内得到恢复，栖息地片段化、破碎化状况已得到明显改变，这是种群分布得以扩展的根本原因。而这次调查中发现针阔混交林中黄腹角雉分布点占比较多的原因，除该植被类型分布最为广泛外，还可能与该植被类型在演替进程中尚处于过渡阶段，内部还存在一定数量的林窗、林隙更适合黄腹角雉的生存有关。
近年来在保护区以外地区也数次发现了黄腹角雉，这大概是由于泰顺县多年来实施“生态大搬迁”，森林生态环境总体上得到了较好改善，保护区以外的部分地区也具备了黄腹角雉的栖息条件。而随着生态进一步向好，该濒危雉类的种群还会进一步扩展。
5. 结论
经过多年保护，浙江乌岩岭国家级自然保护区黄腹角雉栖息地环境已得到了较好恢复，栖息地片段化的状况已得到明显改变，野生种群的分布范围得到了较大扩展，这说明该保护区长期以来对黄腹角雉所采取的保护措施，特别是大面积扩大保护范围的措施已取得积极效果。对于所发现的边缘效应等现象要进一步跟进研究，并科学地出台相应的应对措施。
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图 3 PCR 和RT-qPCR 对核桃组培苗的JrAMT2基因的检测
Figure 3 Detection of JrAMT2 gene in J. regia tissue culture seedlings by PCR and qRT-PCR
图 4 铵态氮转蛋白基因JrAMT2在核桃苗中稳定表达
Figure 4 Stable expression of ammonium nitrogen transfer protein gene JrAMT2 in J. regia
图 5 核桃JrAMT2过表达离体培养植株表型分析
Figure 5 Phenotypic analysis of J. regia JrAMT2 overexpression plant in vitro culture
图 6 核桃JrAMT2过表达阳性温室苗性状分析
Figure 6 Character analysis of J. regia JrAMT2 overexpression positive greenhouse seedlings
图 7 核桃JrAMT2过表达植株氮素吸收分析
Figure 7 Character analysis of the regenerated plants with expression of JrAMT2 in J. regia
图 8 核桃JrAMT2过表达植株叶绿体及叶绿素质量分数分析
Figure 8 Analysis of chloroplast and chlorophyll content in J. regia with JrAMT2 overexpression
图 9 铵态氮转运蛋白JrAMT2基因表达对核桃叶绿素荧光的影响
Figure 9 Effect of ammonium nitrogen transporter JrAMT2 gene on chlorophyll fluorescence of J. regia
表 1 引物
Table 1. Primers
引物 序列(5′→3′) 用途 Actin-F GCCGAACGGGAAATTGTC 内参 Actin-R AGAGATGGCTGGAAGAGG 内参 QJrAMT2-F AGCAAATGGGGTTCCAGGTT 定量 QJrAMT2-R TGTCTCCCGCAGATAGAAGGTA 定量 GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 鉴定 GFP-R TTACTTGTACAGCTCGTCCA 鉴定 JrAMT2-F CATGAATACCACACCGGCCTA 鉴定 
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表 2 JrAMT2基因氨基酸组成
Table 2. Composition of JrAMT2 amino acids
氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 丙氨酸 53 10.90 组氨酸 9 1.80 苏氨酸 27 5.50 精氨酸 11 2.30 异亮氨酸 25 5.10 色氨酸 18 3.70 天冬酰胺 16 3.30 亮氨酸 57 11.70 酪氨酸 17 3.50 天冬氨酸 15 3.10 赖氨酸 18 3.70 缬氨酸 42 8.60 半胱氨酸 5 1.00 甲硫氨酸 18 3.70 吡咯赖氨酸 0 0.00 谷氨酰胺 11 2.30 苯丙氨酸 24 4.90 晒半胱氨酸 0 0.00 谷氨酸 14 2.90 脯氨酸 24 4.90 甘氨酸 54 11.10 丝氨酸 29 6.00
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