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浮皮是宽皮柑橘Citrus reticulata果实在成熟后期或采后储藏过程中普遍发生的一种生理性障碍。所谓浮皮，是指白皮层崩溃，包裹果肉的囊瓣膜(囊衣)与果皮分离后浮起，果皮与囊瓣膜之间产生空隙[1]，同时果皮增厚，外表面粗糙不平，内表面变得松散[2]。浮皮可提高果实的易剥皮性，便于食用，但同时会导致果实采后营养物质大量减少，风味变淡，严重影响果实的品质和储藏性能。影响浮皮的发生因素诸多，如遗传因素、砧木、环境压力和病害等。目前，关于柑橘果实浮皮的研究集中于生理生化和细胞学形态变化，而在分子方面的研究较少[3]。柑橘果实浮皮是一个复杂的生理过程，浮皮发生机制未有定论，也尚未开发出有效的调控技术[4]。椪柑C. reticulata ‘Ponkan’是典型的易浮皮宽皮柑橘，在完熟和采后储藏过程中浮皮现象尤为严重[5]。
乙烯作为一种气态植物生长调节剂，可促进果实成熟并加速果实衰老，其调控呼吸跃变型果实成熟衰老的机制研究已经非常深入。外源乙烯处理能显著提高网纹甜瓜Cucumis melo var. reticulatus果实细胞壁水解酶的活性，从而加速完熟果实硬度下降[6]。非跃变型果实成熟衰老过程产生的乙烯远低于跃变型果实。乙烯曾被认为在非跃变型果实成熟衰老中发挥的作用非常有限[7]。然而，近年来研究表明：非跃变型果实和跃变型果实成熟衰老的某些分子调控途径非常相似，诸多果实品质变化过程也直接受乙烯调控[8]。柑橘属典型非呼吸跃变型果实，在其成熟衰老整个过程中呼吸速率和乙烯释放率均很低。低水平的内源乙烯参与调控了柑橘果实成熟衰老进程，尤其是柑橘果皮颜色的改变[7]。邓丽莉等[9]研究表明：乙烯在柑橘果实褪绿转色过程中，不同部位果皮着色呈现明显的差异。目前大多相关研究集中在果实果肉部分，而对果皮的研究较少。乙烯与柑橘浮皮有着密切的联系，果实中乙烯增加助长浮皮发生。梁颖[10]研究表明：外源乙烯促进了柑橘果皮1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)及乙烯不敏感转录调节基因EIN3的表达，促进了果实中乙烯释放。刘美迎[11]利用外源乙烯处理葡萄Vitis vinifera果实，促使果皮酚类物质显著提升。综上说明乙烯对非跃变型果实果皮也具有调控作用。
1-甲基环丙烯(1-MCP)是乙烯的竞争性抑制剂，能与乙烯受体不可逆结合，阻断乙烯下游调控作用，具有无毒、低量、高效等优点[12]。目前，1-MCP已在苹果Malus pumila[13]、芒果Mangifera indica[14]等果蔬储藏保鲜中广泛应用。杜欣欣等[15]研究发现：使用300 μL·L−1 1-MCP处理青柠檬Citrus aurantiifolia能有效减缓果皮转黄，抑制可溶性固形物(TSS)含量降低和可滴定酸(TA)含量上升，达到最佳保鲜效果。林旭东等[16]通过微孔膜结合1-MCP处理柑橘，可以较好地保持其外观(果梗鲜绿、稳固)、色泽、硬度及品质指标，维持较低的相对电导率，60 d内可以维持柑橘较好的商品价值。王长锋[17]研究发现：适宜的1-MCP处理可延缓椪柑果皮叶绿素降解，延长果实货架期，提高椪柑果实商品性。
鉴于此，本研究拟通过乙烯和1-MCP处理椪柑果实，研究其对采后果实品质和浮皮特性的影响，分析果实白皮层细胞形态和生理变化，为揭示椪柑果实浮皮的发生机制及储藏中浮皮防治提供理论依据。
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椪柑属衢州地方品种，于2017年11月26日采自浙江省衢州市柯城区柴家柑橘专业合作社椪柑种植基地。树体在设施环境下栽培，树龄为10 a，平均树高为2.5 m，树体间距为5.0 m。采摘时，在椪柑树体东、南、西、北4个方位的上、中、下部，随机挑选大小、成熟度基本一致，且无机械损伤和病虫害的果实。
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药品主要有1-MCP (美国罗门哈斯公司，有效成分0.014%)和乙烯气体(杭州悦通气体技术开发有限公司，纯度＞99.99%)。
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在预实验的基础上，确定10.0 μL·L−1乙烯处理4 d，1.0 μL·L−11-MCP处理14 h所得最佳效果。本研究设置3个处理：①对照。将果实置于20 ℃恒温箱储藏。②乙烯处理。将椪柑果实装入密封箱，利用针管加入10.0 μL·L−1乙烯气体后密闭放置4 d。4 d后将椪柑果实装入柑橘保鲜袋，置于20 ℃恒温箱储藏。③1-MCP处理。将1.0 μL·L−11-MCP气体注射入箱内，立即封口密闭，处理14 h。之后装入柑橘保鲜袋，置于20 ℃恒温箱储藏。
每个处理100个果实，3个重复，乙烯和1-MCP处理的储藏期从处理之日算起，分别在处理0、7、14、28、56 d时进行取样。取样时从每个重复中随机挑取10个果实，即每个处理30个果实进行相应指标的测定。
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将样品洗净擦干，用手术刀切开，放入摄影箱观察果实纵切面。浮皮指数参考文献[2]的方法，通过果实纵切面判断浮皮程度。浮皮程度分为浮皮无(0级)，浮皮轻(1级，仅果柄端浮皮)，浮皮中等(2级，果柄端与两侧均浮皮)，浮皮重(3级，全果浮皮) 4个等级。浮皮指数=Σ(浮皮级果数×代表级值)/(调查总果数×浮皮最重一级的代表值)。果实可溶性固形物使用数显折射仪(日本爱拓PAL-1)测定；抗坏血酸(Vc)采用2, 6-二氯靛酚法[18]测定。质量损失率=(初始质量−当次测量质量)/初始质量×100%；果皮率=果皮质量/果实质量×100%。
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采用石蜡切片法[19]，将预处理后的果皮固定材料取出后洗涤、脱水、透明、透蜡、包埋，使用德国莱卡切片机切成厚度8~10 mm的蜡带，在常温蒸馏水中将蜡带固定于载玻片上，42 ℃烤片机展片，采用番红-固绿双染色法染色，中性树胶封片后观察细胞结构。
选取椪柑不同储藏时间的切片各5张，用OLYMPUS BH-2型显微摄影机进行显微结构观察和摄影。在4倍镜下每张切片选取10个位置进行显微测量和细胞学统计，用Image-ProPlus测定果皮白皮层的细胞直径，统计半径250 μm圆形视野中细胞的数目为细胞密度。
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纤维素采用蒽酮试剂法测定[20]；原果胶采用咔唑比色法测定[20]；纤维素酶(Cx)活性以每小时每克鲜质量样品在37 ℃催化羧甲基纤维素水解形成还原糖的微克数表示，单位为μg·h−1·g−1[20]；果胶酯酶(PE)活性采用滴定法进行测定，以单位鲜质量样品在30 min内消耗的氢氧化钠(NaOH)量表示果胶酯酶活性，单位为μg·h−1·g−1[21]；多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性以每小时每克鲜质量样品在37 ℃催化多聚半乳糖醛酸水解生成半乳糖醛酸的微克数表示，单位为μg·h−1·g−1[20]；木质素采用木质素试剂盒(D799081-0100)微量法测定，购于上海生工生物工程有限公司。
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采用SPSS 26.0对各生理指标和酶活进行方差分析，用Origin 2019b作图。
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由图1可知：刚采摘的椪柑果实果蒂处海绵层增厚，已出现浮皮现象，浮皮指数达60.30。随着储藏进程，果实浮皮程度加深，皮肉之间间隙增大，中心柱开始空虚，白皮层变薄且呈绒絮松散状，果皮出现不规则隆起。乙烯处理组果实在第14天出现果实皮肉完全分离，浮皮严重，浮皮指数达100.00。1-MCP处理组果实采后浮皮加剧迟缓，与乙烯处理组和对照相比，皮肉间隙更小；第14天浮皮指数为75.00，至第56天时，仍有肉眼可见的白皮层，果皮无明显隆起现象，果皮形态保持完好，组织致密，果实体积增长缓慢。
图 1 乙烯和1-MCP处理不同储藏期果实纵切面(A)和浮皮指数(B)变化
Figure 1. Changes of fruit longitudinal section (A) and puffiness index (B) during different storage periods under ethylene and 1-MCP treatment
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由图2可知：抗坏血酸质量分数在1-MCP和对照处理中呈先下降后上升又下降的趋势，在乙烯处理一直处于下降趋势。1-MCP处理果实的抗坏血酸质量分数峰值出现在第14天，达6.134 mg·kg−1，对照处理的抗坏血酸质量分数峰值出现在第28天，达6.911 mg·kg−1，到第56天时3个处理之间抗坏血酸质量分数差异不显著。3个处理的果实可溶性固形物质量分数呈上升趋势，与对照相比，乙烯处理组上升更为明显，由最初的1.19 mg·g−1升高至1.47 mg·g−1。在整个储藏期内，各处理的果实质量换失率无显著差异，果皮率不断下降，其中乙烯处理的果皮率最高，对照组最低，这可能是由于乙烯处理后果实生理代谢加速，内部物质消耗速率过快导致的。
图 2 乙烯和1-MCP处理果实品质指标的变化
Figure 2. Quality changes of C. reticulata ‘Ponkan’ fruit treated with ethylene and 1-MCP
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由图3可见：乙烯处理组果皮白皮层细胞在储藏前期快速膨大，第28天时，细胞已经出现裂解、破裂，细胞间隙变大，第56天时，视野内细胞直径较小，且细胞密度低于对照和1-MCP处理。而1-MCP处理后，细胞密度缓慢下降，细胞拉伸、裂解的现象得到缓解，至第56天时，细胞形态完好，细胞密度高于乙烯处理和对照。由图4可知：椪柑果实随着储藏时间的延长，白皮层细胞直径先上升后下降。乙烯处理的白皮层细胞在第28天时出现细胞裂解，白皮层细胞密度和细胞直径下降，白皮层细胞密度从第28天开始显著低于对照和1-MCP处理(P＜0.05)。在0~28 d，1-MCP处理的果皮白皮层细胞直径呈上升趋势，而后细胞直径开始下降，第56天时，白皮层细胞直径显著高于乙烯处理(P＜0.05)。椪柑果皮白皮层细胞密度在各个处理中都呈下降趋势，在第28天时，由于乙烯处理出现细胞裂解的现象，导致细胞密度开始下降，随着细胞间隙的变大，乙烯处理的果皮白皮层细胞密度下降趋势加快，在第56天时，乙烯处理的果皮白皮层细胞密度显著低于对照和1-MCP处理(P＜0.05)。1-MCP处理延缓了果皮白皮层细胞密度的下降。
图 3 乙烯和1-MCP处理不同储藏期果实白皮层细胞变化
Figure 3. Cellular changes of albedo under ethylene and 1-MCP treatment during different storage periods
图 4 乙烯和1-MCP处理果实白皮层细胞直径和细胞密度的变化
Figure 4. Changes of cell diameter and cell density of albedo under ethylene and 1-MCP treatment during storage
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由图5可知：储藏过程中3个处理的纤维素质量分数均呈下降趋势，乙烯处理始终低于对照，1-MCP处理始终高于对照组；第14天时乙烯处理的纤维素质量分数迅速下降并持续显著低于对照和1-MCP处理(P＜0.05)；第56天时乙烯处理的纤维素质量分数下降为51.3 mg·g−1，1-MCP处理的纤维素质量分数是乙烯处理的1.46倍。
图 5 乙烯和1-MCP处理果实白皮层纤维素质量分数和纤维素酶活性的变化
Figure 5. Changes of cellulose content and cellulase activity of albedo under ethylene and 1-MCP treatment during storage
各处理果皮白皮层纤维素酶活性均呈上升趋势；第14天时乙烯处理的纤维素酶活性迅速上升，第28天酶活性显著高于对照和1-MCP处理，第56天时最高，达125.14 μg·h−1·g−1，是对照的1.98倍；1-MCP处理的纤维素酶活性始终略低于对照，但差异不显著。
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由图6可知：随着储藏期的延长，原果胶质量分数逐渐减少，乙烯处理的原果胶质量分数始终低于对照，1-MCP处理的原果胶质量分数始终高于对照组；第56天时，乙烯处理的原果胶质量分数降至92.82 mg·g−1，与1-MCP处理差异显著(P＜0.05)。果皮白皮层果胶酯酶活性总体上呈上升趋势；1-MCP处理的果胶酯酶活性在0~14 d基本不变，第28天时为37.47 μg·h−1·g−1，显著低于对照和乙烯处理(P＜0.05)；乙烯处理的果胶酯酶活性第56天时为97.95 μg·h−1·g−1，显著高于对照和1-MCP处理(P＜0.05)。在整个储藏期内，果皮白皮层多聚半乳糖醛酸酶活性在乙烯处理中上升迅速，而在1-MCP处理中上升缓慢；第56天时乙烯处理的多聚半乳糖醛酸酶活性达150.86 μg·h−1·g−1，是对照的1.87倍，是1-MCP处理的2.33倍，显著高于对照和1-MCP处理(P＜0.05)，且对照与1-MCP处理也达到显著水平(P＜0.05)。
图 6 乙烯和1-MCP处理果实白皮层原果胶质量分数及果胶酶活性的变化
Figure 6. Changes of protopectin content and pectinesterase activity of albedo under ethylene and 1-MCP treatment during storage
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由图7可知：木质素质量分数在3个处理中为上升趋势，其中乙烯处理的上升速度最快，第56天时达523.6 mg·g−1，显著高于对照和1-MCP处理(P＜0.05)；1-MCP处理与对照的木质素质量分数上升相对较为缓慢，且1-MCP处理略低于对照。
图 7 乙烯和1-MCP处理果实白皮层木质素质量分数的变化
Figure 7. Changes of lignin content of albedo in ethylene and 1-MCP treatment during storage
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柑橘作为一类典型的非呼吸跃变型果实，在正常的采后储藏中，果实品质会逐渐下降。本研究发现：在常温储藏下，乙烯处理后的果实浮皮程度显著大于对照，1-MCP处理的浮皮程度小于对照。
可溶性固形物包括可溶性糖、有机酸、维生素、果胶、单宁等易溶于水的物质，是衡量果实品质的重要指标[22]。到第56天时，各处理果实的可溶性固形物质量分数均显著上升，与对照相比，乙烯处理上升显著。乙烯处理能促进柑橘果肉中淀粉的转化[23]，使柑橘果实中的可溶性固形物质量分数升高，果肉变甜，这与秦畅等[24]的研究结果一致。王长锋[17]研究发现：1-MCP处理对可溶性固形物质量分数没有显著影响，这与本研究结果一致。在储藏期间，果实质量换失率均呈上升趋势，且各处理间差异不显著，表明乙烯和1-MCP处理对柑橘果实质量换失率影响较小。此外，乙烯处理后椪柑果皮率高于对照，这可能是由于果肉营养物质向果皮转运引起的[25]。
柑橘浮皮症状主要发生在果皮。IBANEZ等[3]研究发现：柑橘果皮白皮层生理特性活跃，是多数柑橘生理性病害发生的关键部位。浮皮的产生与果皮白皮层细胞结构和形态变化有重要的关系[19, 26]。但浮皮的发生是动态积累的过程，发生的起始时期在外观上未表现出症状，但细胞形态结构已发生变化，这可以通过相关指标来进行判定。本研究通过石蜡切片观察发现：乙烯处理的椪柑果皮细胞密度迅速下降，细胞直径上升趋势明显，白皮层细胞出现破裂、细胞间隙变大，细胞排列松散，单位面积的白皮层细胞密度以及白皮层细胞直径显著降低，浮皮现象加剧。赵迪[26]在温州蜜柑‘宫川’C. unshiu ‘Miyagawa’的浮皮进程中发现：花后110 d，果皮细胞内容物降解，叶绿体及线粒体结构瓦解，叶绿体膨大，基粒片层结构松散、紊乱，果皮细胞表现出一定的衰老特征。花后197 d，‘宫川’果皮整个细胞的原生质体降解呈扁平状，细胞壁与细胞质完全质壁分离。乙烯加速了叶绿体和线粒体的裂解，加快了细胞内容物的降解，使得果皮白皮层细胞出现萎缩、塌陷甚至降解的现象。
果实质地主要取决于纤维素、果胶、木质素等细胞壁物质，它是果实品质的重要指标，又与果实的成熟衰老密切相关。一般果实在成熟衰老过程中，纤维素酶、果胶酯酶和多聚半乳糖醛酸酶等细胞壁降解酶活性增强，果胶、纤维素等细胞壁物质发生降解，从而导致果肉的软化和出汁率的提高[27−28]。木质素作为植物细胞壁的主要组成部分，与纤维素、果胶等物质相互交联，增加了果肉细胞壁机械强度。木质素的积累造成果实口感变差，硬度增加，导致品质下降[29]。朱婉彤等[30]研究表明：乙烯处理后甜瓜Cucumis melo的纤维素、原果胶均低于对照，多聚半乳糖醛酸酶活性、纤维素酶活性在酶活高峰时均高于对照；而1-MCP明显延缓了纤维素及原果胶的下降，降低了纤维素酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶的活性。谢国芳等[31]研究发现：鲜食菜豆Phaseolus vulgaris经乙烯处理，木质素代谢关键酶活性降解，导致木质化细胞团增加，促进木质纤维化，而1-MCP处理则相反。以上研究结果均与本研究结果相似。在本研究中，随着储藏时间的延长，纤维素酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶活性上升，促进纤维素和原果胶不断下降。乙烯可加速果实乙烯生物合成及生理作用，加快果实后熟衰老进程。1-MCP则可延缓果实软化，对果胶物质降解起到了减缓作用。果胶物质、纤维素的降解及细胞壁降解酶活性的升高是采后椪柑果实衰老的重要原因。1-MCP可以有效地延缓椪柑果实的衰老。
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乙烯处理加速了椪柑果实采后生理代谢水平，加重了果实浮皮的发生。1-MCP处理则抑制了储藏期果皮的生理代谢水平，延缓了果皮细胞的衰老，减轻了浮皮障碍的发生。在储藏中若想保持椪柑新鲜，降低浮皮状况，可用1-MCP进行处理。若想使剥皮更加容易，可用乙烯进行处理。
Effects of ethylene and 1-MCP treatment on puffiness and albedo cell wall metabolism of post-harvest Citrus reticulata ‘Ponkan’ fruit
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摘要:
目的 浮皮是宽皮柑橘Citrus reticulata果实在成熟后期或采后储藏过程中普遍发生的一种生理性障碍。椪柑C. reticulata ‘Ponkan’在采后储藏中极易发生浮皮，严重影响商品价值。通过采后处理，为椪柑果实采后浮皮的防范、储藏保鲜技术提供理论依据。 方法 利用乙烯和1-甲基环丙烯(1-MCP)处理椪柑采后果实，测定椪柑在储藏期间果实主要品质指标及浮皮指数的变化，分析果皮白皮层细胞形态和生理变化特征。 结果 ①乙烯处理促进了储藏期果实可溶性固形物质量分数的提高；加速了果皮白皮层细胞密度、纤维素质量分数、果胶质量分数的下降，促使木质素质量分数及细胞壁降解酶(纤维素酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶)活性上升。②1-MCP处理减缓了果皮白皮层细胞密度及纤维素质量分数下降；延缓了木质素质量分数及细胞壁降解酶(纤维素酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶)活性上升；减缓了椪柑果实浮皮指数的上升。 结论 乙烯处理可加速椪柑果实采后生理代谢水平，加重果实浮皮的发生。1-MCP处理可抑制储藏期果皮的生理代谢水平，减轻浮皮障碍的发生。生产中可通过乙烯和1-MCP处理来控制椪柑果实剥皮的难易程度。图7参31 -
关键词:
- 椪柑 /
- 果实采后品质 /
- 浮皮 /
- 乙烯 /
- 1-甲基环丙烯(1-MCP)
Abstract:Objective For the purpose of developing storage and fresh-keep technology, this study is aimed to evaluate different post-harvest methods that target at the prevention of puffiness, a common physiological disorder that occurs in mature or post-harvest storage stages of citrus fruits (Citrus reticulata) which seriously affects its marketability. Method Ethylene and 1-methylcyclopropene (1-MCP) were used to treat the postharvest ‘Ponkan’ fruit, and the main quality indexes and puffing index, as well as the characteristics of albedo cell morphological and physiological changes were studied after treatment. Result (1) Ethylene treatment brought about an increase of soluble solid content during fruit storage, accelerated the decline of cell density, cellulose content, and pectin content of the albedo, while promoting an increase in lignin content and the activity of cell wall-degrading enzymes (cellulases, pectin esterases, and polygalacturonases). (2) 1-MCP treatment slowed down the decrease of albedo cell density and cellulose content, delaying the increase of lignin content and the activity of cell wall degrading enzymes (cellulase, pectin esterase and polygalacturonase), and therefore slowing down the rise of puffiness index. Conclusion Ethylene treatment accelerated the physiological and metabolic level of ‘Ponkan’ fruit during storage and aggravated the occurrence of puffiness whereas 1-MCP treatment inhibited the peel physiological and metabolic level during storage and alleviated the occurrence of puffiness. As a result, the peeling difficulty of the fruit can be controlled by ethylene or 1-MCP treatment during production. [Ch, 7 fig. 31 ref.] -
GRF(general regulatory factor)蛋白质最先由MOORE等[1]在牛脑中发现，并根据淀粉凝胶电泳上的迁移特性命名。GRF蛋白质是一类高度保守的同源或异源的二聚体蛋白质，具有多种功能，广泛存在于真核生物中，如酵母Pichia guilliermondii、拟南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa、花生Arachis hypogaea等。已有研究[2]表明：GRF蛋白质家族通过与磷酸化的靶蛋白质相互作用参与植物信号传导、细胞定位、转录调控和应激反应等多种重要生命活动过程，在植物代谢调控和生物合成反应中发挥着重要作用，如拟南芥GRF蛋白质可以与感光系统中的蛋白质相互作用调节根系生长发育[3]；葡萄Vitis vinifera GRF蛋白质参与冷热应激反应[4]；木薯Manihot esculenta GRF蛋白质主要分布在细胞质中，作用于淀粉合成酶Ⅲ靶蛋白质，对淀粉的合成起到负调控作用[2]；菊花Dendranthema morifolium GRF蛋白质参与开花和周期调控，盐、冷等胁迫响应过程[5]；动物细胞中GRF蛋白质还可通过调节细胞周期，影响细胞凋亡，参与多种信号通路等方式来调控肿瘤进程[6]。GRF活化后可以使G2/M期阻滞从而起到负调控细胞周期，发挥抑制癌基因的作用[7]。在动物中GRF蛋白质的过表达可能转化为一种致癌因子，促进肿瘤的发生[8]，还可能与肿瘤细胞耐药性有关[9]。毛竹Phyllostachys edulis用途广泛，笋和叶具有食用、药用价值；竹材多用于建筑制造、工艺品制作。毛竹林是一种重要的经济林，具有重要生态价值，其固碳作用机制在不同的生长阶段有所差异[10]。毛竹基因组草图已公布，且大量转录组数据也可以从公共数据库中获取[11]。目前根据毛竹全基因组数据进行基因家族分析已取得了一定的成果，如ZF-HD基因家族[12]、B3基因家族[13]、APX基因家族[14]等，也分析了毛竹快速生长期的基因表达[15-16]。但对于毛竹GRF基因家族的全基因组数据分析尚未有相关报道。本研究通过毛竹公开的相关测序结果，利用生物信息学的方法，从基因组及转录组数据入手，对毛竹GRF基因进行全基因组的鉴定与表达分析，拟为进一步明确GRF基因家族在毛竹重要生长发育过程中的功能解析提供依据。
1. 材料与方法
1.1 基因家族来源、鉴定及理化性质分析
毛竹基因组序列、编码序列(CDS)、蛋白质序列和基因组GFF注释文件均从以下站点ftp://parrot.genomics.cn/gigadb/pub/10.5524/100001_101000/100498/[12]下载。从Pfam数据库[17]中下载隐马可夫模型(HMM) PF00244.17的结构域数据，并以此结构域数据为种子模型，用HMMER[18]检索本地毛竹蛋白质数据库。在Excel 2018中，将E-value设置为≤1E−20，对检索结果排序整理，去除重复，获得候选基因。进一步从毛竹全基因组数据库中提取得到GRF家族成员的基因、CDS、蛋白质序列以及基因结构和位置信息；利用在线工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)[19]以及SignalP 4.1[20]在线分析GRF家族各成员理化性质等。
1.2 家族进化分析
依据毛竹、拟南芥、水稻GRF家族成员蛋白质序列，分别通过ClustalW多重比对，用MEGA 7.0软件邻位连接(neighbor-Joining, NJ)法构建种内和种间系统进化树，自检值取1 000次抽样[21]。
1.3 基因结构、基序和保守结构域预测
根据毛竹全基因组的GFF注释文件基因位置信息，分析毛竹GRF家族的基因结构并绘制基因结构图；利用在线网站NCBI Conserve Domain(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和MEME(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)对GRF家族成员的保守结构域(domain)和基序(motif)进行预测[22]，并通过TBtools[23]将结果可视化。
1.4 启动子分析
提取毛竹GRF基因上游1 500 bp序列作为启动子序列信息，通过在线预测软件PlantCare[24]预测毛竹GRF基因的顺式作用元件，并整理预测结果，富集顺式作用元件，利用TBtools上的Simple Biosequence viewer功能进行可视化分析。
1.5 染色体定位及共线性分析
利用MCScanX[25]获取GRF家族种内、种间共线性关系，并用TBtools软件Amazing Super Circos[26]和Multipe Synteny Plot分别对种内和种间的结果可视化。
1.6 基因表达分析
选取NCBI SRA数据库中毛竹不同组织器官：根(登录号为ERR105075、ERR105076)，花序(登录号为ERR105069、ERR105070、ERR105071)，叶(登录号为ERR105067、ERR105068、ERR105075)，鞭(登录号为ERR105073、ERR105074)和笋不同生长高度：0.2 m(登录号为SRR6131114、SRR131113、SRR6131115)，0.5 m(登录号为SRR131117、SRR6131118、SRR5710699)和1.0 m(登录号为SRR5710701、SRR5710702、SRR5710697)的转录组数据，分别计算毛竹GRF基因的TPM(transcripts per million reads)值表示基因的表达丰度。为方便统计，对每个表达数值取以2为底的对数(log2)，使用TBtools Amazing Heatmap绘制基因表达热图，用对数转换预处理数据，再用正态标准化的方法处理数据。
1.7 蛋白质三级结构同源模建
利用SWISSMODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)在线软件[27]预测GRF蛋白质的3D结构。模建结果使用SAVES v5.0(https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/)[19]进行评估。
2. 结果与分析
2.1 基因家族成员鉴定及理化特性分析
根据植物GRF隐马可夫模型(PF00244.17)搜索毛竹相关基因组数据，获得相关GRF家族成员，然后通过E-value(≤1E−20)筛选、保守结构域、基序特征分析，去除相同转录本重复，最终筛选得到13个GRF家族成员(表1)。将获得13个GRF家族成员按照其在scaffold的分布先后顺序命名为PeGRF01~PeGRF13。进一步对PeGRF作蛋白质特性分析，13个GRF蛋白质中长度最短的为PeGRF10(256个氨基酸)，最长的为PeGRF09(293个氨基酸)，平均长度266.8个氨基酸；各GRF蛋白质等电点最小的为4.70(PeGRF02)，最大的为5.29(PeGRF01)，平均等电点为4.82；各GRF蛋白质分子量最小的为PeGRF04(28.65 kD)，最大的为PeGRF09(32.41 kD)，平均分子量为29.79 kD。
表 1 毛竹GRF基因及其蛋白质理化特性Table 1 Characteristics of PeGRF family genes and their deduced proteins基因登录号 基因名称 等电点(pI) 平均分子量/kD 内含子数量/个 氨基酸数量/个 PH02Gene26029.t1 PeGRF01 5.29 32.20 5 286 PH02Gene21972.t1 PeGRF02 4.70 29.68 4 262 PH02Gene06378.t1 PeGRF03 4.79 29.14 4 263 PH02Gene19868.t1 PeGRF04 4.82 28.65 3 261 PH02Gene15394.t1 PeGRF05 4.76 31.08 4 274 PH02Gene31988.t1 PeGRF06 4.73 29.94 6 270 PH02Gene44376.t1 PeGRF07 4.79 29.15 4 263 PH02Gene09923.t1 PeGRF08 4.86 29.28 4 261 PH02Gene25395.t2 PeGRF09 4.72 32.41 5 293 PH02Gene13806.t1 PeGRF10 4.76 29.02 4 256 PH02Gene13908.t1 PeGRF11 4.82 29.15 4 260 PH02Gene26176.t1 PeGRF12 4.84 28.76 3 263 PH02Gene15240.t1 PeGRF13 4.75 28.77 4 256 2.2 GRF基因家族分类与进化树构建
利用MEGA 7.0对13个毛竹GRF、14个拟南芥GRF和8个水稻GRF的氨基酸序列比对后，采用NJ法进行系统聚类分析(图1)，绝大部分毛竹基因家族成员和水稻处于同一分支，表明毛竹与水稻的进化关系较近。
图 1 毛竹(Pe)、拟南芥(At)和水稻(Os)GRF家族系统进化树分析Figure 1 Phylogentic analysis of GRF gene family from Phyllostachys edulis (Pe), Arabidopsis thaliana (At) and Oryza sativa (Os)2.3 GRF家族基因结构、基序及保守结构域
对毛竹GRF基因结构分析发现：内含子数量存在差异，非ε组成员都包含4个外显子和3个内含子，它们在位置上高度保守。ε组成员都具有不同于非ε组的内含子-外显子结构，具有2个额外的N-末端内含子[21]。利用NCBI-CDD对毛竹GRF基因进行保守结构域分析，PeGRF蛋白质均包含14/3/3结构域，毛竹GRF基因家族14/3/3结构域存在一定的保守性，但该结构域的分布位置有一定分化。利用MEME在线工具对该基因家族的保守基序预测，基数设置为10，结果显示(图2)：Motif1~6在每个家族成员中均出现，属于高度保守结构，其余基序在家族成员中出现的频率及所在位置均存在一定的差异。
2.4 启动子特征
如图3所示：筛选出的部分典型的顺式调控元件，除核心启动子TATA-box(5个)和CAAT-box(16个)外，还有与激素相关的顺式调控元件，包括与赤霉素相关的GARE-motif(5个)、P-box(3个)，与生长素有关的AuxRR-core(3个)、TGA-element(6个)，与脱落酸有关的ABRE(42个)，与水杨酸有关的TCA-element(5个)；与外部条件有关的顺式调控元件，包括参与低温响应的LTR(2个)和光响应的G-box(48个)。推测毛竹GRF蛋白质家族可能参与激素和非生物胁迫响应，家族基因表达模式可能有所不同。
图 3 PeGRF基因家族启动子的上游顺式作用元件Figure 3 Upstream cis-acting elements of promotor from PeGRF gene family2.5 染色体分布及共线性分析
利用毛竹基因组GFF注释文件提取PeGRF在scaffold上的分布特征，结果显示：毛竹GRF基因在scaffold上分布不均匀，不同的scaffold基因分布密度不同，scaffold7、14、16、18和21仅包含1个PeGRF，scaffold3、13、15和22上分别包含2个。
利用TBtools工具，将毛竹GRF基因种内和种间的共线性关系进行了可视化分析。从图4A中可以看出：除PeGRF02、PeGRF03和PeGRF07不存在种内共线性关系外，其余家族基因成员间均有显著的共线性关系，说明GRF基因家族存在基因复制现象，推测在进化过程中GFR基因可能通过复制进行家族成员数量的扩张。但PeGRF不存在串联重复基因。物种间的共线性关系是反映不同物种来源于同一个祖先的现象。从图4B可以看出：毛竹与水稻的共线性关系要明显多于拟南芥，这可能与水稻和毛竹同属于禾本科Gramineae，进化关系较近有关。
图 4 毛竹PeGRF家族染色体分布(A)及共线性分析(B)Figure 4 Chromosomal distribution of PeGRF genes in Ph. edulis (A) and their collinear relationships (B)Sca表示scaffold；CHR和Chr表示染色体(chromosome)2.6 GRF家族基因表达模式
本研究基于毛竹RNA-Seq转录组数据，对毛竹不同组织(叶、花序、鞭及根)以及不同生长高度(0.2、0.5、1.0 m)的毛竹笋中的GRF表达量绘制热图。由图5可以看出：除PeGRF10，PeGRF09在不同组织和生长高度保持较低的表达量外，其他成员均有较高的表达量。在毛竹不同组织中，根和花序的表达量相对于叶和鞭要稍高；非ε组的GRF基因均有较高的表达。在竹笋的不同生长阶段，非ε组的GRF基因保持较高的表达水平；ε组不同的基因表达量有增有减，如PeGRF05在竹笋生长各个阶段均有较高的表达量，且随生长进程表达量不断增高；PeGRF06表达量随生长进程呈下降趋势。推测不同家族成员在参与组织器官发育的过程中发挥不同的作用，但其中的内在分子机制还值得进一步研究。
图 5 毛竹GRF基因家族表达水平热图分析Figure 5 Heatmaps of expression level of PeGRF family genes in Ph. edulis2.7 GRF家族蛋白质空间三级结构
由图6所示：毛竹GRF蛋白质由2个单体连接而成，每个单体由反向平行的9个α螺旋组成，每个单体都存在与配体(FSC3、FEC4)相互作用的结合位点，2个FSC配体均与壳梭孢素有关，单体间构成同源或异源二聚体，总体呈“W”型[28-29]。
图 6 毛竹GRF家族蛋白质SWISSMODEL同源模建的三维空间结构Figure 6 Predicted 3D protein structure of the GRF family from Ph. edulis by SWISSMODEL红色为α螺旋，黄色为配体(FSC3、FEC4)3. 讨论
物种基因组全序列的测定推动了生物信息学的迅速发展，在海量数据的基础上，利用生物信息学手段，对物种基因家族进行高效的统计分类和分析，预测基因家族的结构、功能及作用机制，将极大地推动相关功能基因的挖掘和农艺性状遗传的改良进程[30]。随着2018年第2版毛竹基因组数据的公布以及大量毛竹转录组数据的共享，毛竹GRF基因家族的生物信息学分析成为可能[11]。本研究通过全基因组数据分析发现：毛竹GRF家族成员共13个，数量多于水稻，可能的原因是毛竹染色体经过加倍，基因组数据远大于水稻；另外，共线性分析进一步证实：正是通过基因复制扩增，毛竹GRF在数量上有优势。毛竹GRF基因家族各成员间的理化性质存在一定的差异，但均含有14/3/3蛋白质结构域，其中有6种基序在每个成员中均出现。根据基因结构将PeGRF分为ε组和非ε组，其中ε组可能保留了祖先的蛋白质功能，这与PIOTROWSKI等[31]和WANG等[32]的研究结果相似。
大量研究表明GRF蛋白质参与激素信号的转导。如在拟南芥的研究中发现：GRF参与油菜素类激素(BR)调控细胞核发育的途径[33]；在烟草Nicotiana tabacum中，GRF参与赤霉素(GA)生物合成调控[34]；在水稻中，GRF表达同脱落酸(ABA)密切相关[35]。本研究发现：毛竹GRF顺式作用元件存在许多激素相关元件。由此可以推测毛竹GRF蛋白质可能介导激素信号的转导过程。但毛竹GRF同其他激素的相互关系还需进一步验证。
GRF蛋白质参与了植物的生长发育，特别是在花器官的发育中具有重要作用。PERTL等[36]证实随着百合Lilium brownii var. viridulum花粉管的生长，GRF蛋白质的表达量也明显增加。李兵娟[37]也证实雷竹Phyllostachys violascens GRF基因参与开花调控机制。本研究通过转录组数据分析发现：GRF蛋白质在花序组织中高表达，且表达量明显高于竹叶和竹鞭，这表明毛竹GRF基因可能参与花序的发育和调控。除此之外，在研究毛竹GRF顺式作用元件时还发现其启动子区域存在许多光响应元件，结合光周期对植物开花的作用机制以及在模式植物水稻上的研究[38]，GRF基因可能是通过光响应元件接受外界环境信号从而触发其高表达，最终影响毛竹花的发育。由于受毛竹花发育相关材料的限制，该假设将在后续实验验证。
毛竹GRF蛋白质是以一个螺旋结构为主的同源二聚体，二聚体界面内包着多个疏水残基和多个极性残基，外周则由盐桥连接，三级结构呈“W”型，每个单体分别含有2个凹槽，可能用于结合配体靶蛋白质。毛竹GRF蛋白质序列在进化谱系中高度保守，并且与配体结合的氨基酸残基极端保守，这同SEHNKE等[28]发现的结果相似。另外，虽然毛竹GRF蛋白质的N端和C端同源性较低，但可能通过碱性簇维持空间构象的稳定[28]。PAUL等[39]在研究拟南芥GRF蛋白质时发现，GRF蛋白质还可以通过结合磷酸化的蛋白质，参与重力反应等生理过程。GRF蛋白质在进化上高度保守，毛竹PeGRF可能也具有相似的分子作用机制。但毛竹GRF蛋白质生物学功能与上述空间结构之间的关系还需进一步的探索。
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图 1 乙烯和1-MCP处理不同储藏期果实纵切面(A)和浮皮指数(B)变化
Figure 1 Changes of fruit longitudinal section (A) and puffiness index (B) during different storage periods under ethylene and 1-MCP treatment
图 2 乙烯和1-MCP处理果实品质指标的变化
Figure 2 Quality changes of C. reticulata ‘Ponkan’ fruit treated with ethylene and 1-MCP
图 3 乙烯和1-MCP处理不同储藏期果实白皮层细胞变化
Figure 3 Cellular changes of albedo under ethylene and 1-MCP treatment during different storage periods
图 4 乙烯和1-MCP处理果实白皮层细胞直径和细胞密度的变化
Figure 4 Changes of cell diameter and cell density of albedo under ethylene and 1-MCP treatment during storage
图 5 乙烯和1-MCP处理果实白皮层纤维素质量分数和纤维素酶活性的变化
Figure 5 Changes of cellulose content and cellulase activity of albedo under ethylene and 1-MCP treatment during storage
图 6 乙烯和1-MCP处理果实白皮层原果胶质量分数及果胶酶活性的变化
Figure 6 Changes of protopectin content and pectinesterase activity of albedo under ethylene and 1-MCP treatment during storage
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