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毛竹Phyllostachys edulis是中国亚热带地区分布最广泛的竹种，约占中国竹林种植面积的73.76%，具有极高的生态价值和经济价值。但在非生物胁迫下，毛竹林的种植面积显著减少[1]。毛竹在生长发育过程中经历多种胁迫后会引发一系列生理生化变化，最终影响毛竹的正常生长[2]。
毛竹基因组由超过63.24%的转座子(TE)组成[3]。TE可以通过2种主要机制在基因组内移动：复制-粘贴和剪切-粘贴。反转录转座子(Ⅰ类)通过RNA中间体利用复制-粘贴机制，而DNA转座子(Ⅱ类)直接作为DNA片段利用剪切-粘贴或复制-粘贴机制在基因组内移动[4−5]。TE是真核生物基因组的动态组成部分，可以被激活或沉默。TE受表观遗传变化的影响较大[6−7]，可以通过塑造表观基因组促进植物对非生物胁迫的适应性反应。对水稻Oryza sativa研究表明：高盐和低温胁迫可诱导基因转录起始位点100 bp内插入TE[8]。转座子受逆境胁迫更容易发生转录[9]。大麦Hordeum vulgare基因组中的BARE-1反转录转座子具有转录活性，拷贝数与基因组大小、温度、水分、土壤类型、海拔等呈正相关[10]。
不确定编码潜力转录本(TUCP)[11]是一类具有明显组织特异性，与基因间长链非编码RNA表达模式相似，但序列保守性明显更高的一种转录本[12]。TUCP可以作为非编码调节因子，翻译成小肽或在转录调节、细胞分化等多种生物活动中发挥作用[13]。越来越多的真核生物基因组TUCP被高通量测序鉴定出来，如棉花Gossypium spp.[14]、人类Homo sapiens [15]、罗非鱼Oreochromis mossambicus[16]、山羊Capra hircus[17]和杜仲Eucommia ulmoides[18]等。在拟南芥Arabidopsis thaliana、水稻和玉米Zea mays中，TE衍生的TUCP参与低温和盐的胁迫反应，并影响种子发芽和幼苗绿化率[19]。棉花中TUCP参与光合作用并影响生长发育过程[14]。高温胁迫影响TUCP转录从而使红枣Ziziphus jujuba基因表达产生了整体性改变[20]。
目前，对毛竹转座子衍生TUCP (TE-TUCP)表达的综合分析尚未见报道。鉴于此，本研究调查非生物胁迫下毛竹幼苗TE-TUCP活性的变化及附近基因的差异表达情况，以期为转座子参与毛竹抗逆分子机制提供参考。
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采用单株母竹的毛竹种子进行水培育苗，每盆1株毛竹幼苗，每组3盆，培养至毛竹幼苗五叶一心期。处理过程如下：首先，在25 ℃暗培养箱中培养幼苗3 d，以避免可见光下紫外线的影响。接着，对第1组幼苗进行冷胁迫处理(C4)，即在4 ℃下处理16 h；对第2组幼苗进行热应激处理(H42)，即在42 ℃下处理4 h；对第3组幼苗进行紫外线胁迫处理(UV)，在30 W紫外线下处理2 h；第4组幼苗未经以上任何胁迫处理，作为对照组(ck)；对第5组幼苗进行盐胁迫处理(Sa)，水培培养基中配置浓度为200 mmol·L−1氯化钠溶液培育幼苗3 d；对第6组幼苗多次浇水，保持与第5组等体积的水培培养基，培育幼苗3 d，作为盐胁迫处理的对照组(wa)。所有样品均在当天10:00采集后在液氮中冷冻保存。
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利用DING等[21]对毛竹幼苗4个胁迫处理(低温、高温、高盐、紫外照射)的全转录组数据(登录号：PRJNA826540)，分析和鉴定基因表达水平。
用Trimmomatic[22]软件进行质量控制；使用Hisat 2[23]软件将质控后获得的干净数据(clean reads)与毛竹参考基因组[3]进行序列比对获得bam类型文件；利用featureCounts软件[24]计数，得到每个基因在各个样本中的原始计数(raw counts，RC)。将原始计数导入R中，利用DESeq 2[25]进行差异表达分析。在读取计数值后，对表达值进行归一化，并计算差异倍数(FC)。根据log2|FC|＞0和P＜0.05选择差异表达基因。
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利用相同的全转录组测序数据，分析和鉴定TUCP表达水平。具体步骤如下：①数据预处理。首先使用Cuffmerge软件[26]，对各样品拼接得到的转录本进行合并，去掉其中链方向不确定的转录本，得到本次测序完整的转录组信息。之后，对合并的转录本集合进行TE-TUCP的筛选。②转录本外显子(exon)个数筛选。过滤转录本拼接结果中大量低表达量、低可信度的单外显子转录本，选择exon≥2个的转录本。③转录本长度筛选。选择长度＞200 bp的转录本。④mRNA剔除。通过Cuffcompare软件，筛除具有编码能力的mRNA，将余下的拼接转录本中，与毛竹基因组编码基因exon区域有重叠的转录本作为后续分析的RNA。⑤转录本表达量筛选。通过Cuffquant计算每条转录本的表达量，选择RC≥1的转录本。⑥针对拼接得到的转录本，剔除mRNA转录本后，综合CNCI[27]、PFAM[28]、CPC2[29]等编码潜能分析方法，进行RNA编码能力分析，将3个软件均表明无编码能力的转录本定义为lncRNA (long non-coding RNA)；其余有部分编码能力，且至少包含1个开放阅读框(ORF)且非lncRNA转录本的即为TUCP。
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利用ZHOU等[30]鉴定的毛竹基因组转座子，使用RepeatMasker[31]鉴定毛竹参考基因组[3]中的转座子，分析已鉴定的转座子在毛竹基因组中的分布和含量。
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使用bedtools (
https://github.com/arq5x/bedtools2 )[32]分析TE和TUCP关系，以确定TE是否与TUCP重叠。与TE序列重叠超过60%的TUCP被鉴定为TE衍生的，简称为TE-TUCP。为了评估TE-TUCP的表达模式，使用StringTie[33]的合并函数组装TE转录本，合并至少1 bp的重叠区域，直到没有交集。随后，使用Gffcompare评估组装TE转录本的质量[34]，最后估计TE-TUCP的表达丰度。将组装后的数据利用featureCounts软件对bam类型的输入文件进行计数，得到表达矩阵。使用tximport R包[35]将featureCounts输出的表达矩阵转换为DESeq2所需的格式。然后使用DESeq2[25]识别差异表达的TE-TUCP。P＜0.05且log2|FC|＞0为显著差异表达的TE-TUCP。将能转录出至少1个TE-TUCP的转座子定义为TUCP-TE；否则，定义为nonTUCP-TE。 -
使用perl脚本check_GCbG_PlusForTE.pl程序分别筛选TUCP-TE和nonTUCP-TE附近5 000 bp差异表达基因。使用OmicShare (https://www.omicshare.com/tools/)上的Gogsea对差异表达基因进行基因本体(GO)富集分析。组间样本基因表达差异筛选标准为：log2|FC|＞0且P＜0.05。保留前30条GO条目，通过矩阵点图显示结果。
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为了验证转录组测序结果的准确性，使用天根生化科技有限公司的RNA提取试剂盒(DP441)提取总RNA。利用TaKaRa Bio公司的反转录试剂盒(RR047A)合成cDNA，用RT-qPCR检测相对转录水平。从鉴定的差异表达TE-TUCP中随机挑选4个TE-TUCP及其附近基因，利用PrimerPremier 6设计RT-qPCR引物，使用翌圣生物科技股份有限公司的Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)(11201ES)进行RT-qPCR试验，反应体系和程序参照试剂说明书，以毛竹肌动蛋白(Actin)作为内参基因。每个RT-qPCR设置3个生物重复和3个技术重复。采用2−∆∆Ct计算相对基因表达水平[36]。使用Graphpad可视化绘图。
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毛竹幼苗全转录组测序数据共获得1 749 524个转录本。在这些转录本的基础上使用Cuffmerge进行数据预处理，保留1 008 312个转录本。通过表达量筛选，获得567 404个表达量至少为1的转录本。
如图1所示：CPC2预测出6 434个TUCP，CNCI预测出73 035个TUCP，PFAM预测出26 040个TUCP，共预测出87 409个TUCP。对TUCP的结构分析表明：TUCP的平均长度为759.73 bp，比mRNA的平均长度短，但比lncRNA的平均长度(241.02 bp)长。
图 1 TUCP筛选结果
Figure 1. Results of TUCP screening
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通过RepeatMasker对毛竹参考基因组注释，共得到991 865条转座子。根据上述鉴定的87 409个TUCP在基因组的位置和转座子在基因组的位置，共有57 627个TUCP与TE序列重叠超过60%，命名为TE-TUCP。其中来源反转录转座子(RE)的TE-TUCP非常丰富，占73.60%。
如表1所示：鉴定的转座子中，TE-TUCP中有17 265个来源于LTR/Copia超家族，23 980个来源于LTR/Gypsy超家族。LTR/Copia和LTR/Gypsy来源的TUCP数量占所有TE-TUCP的71.57%，说明LTR-TE-TUCP含量丰富，可能与LTR/Copia和LTR/Gypsy在毛竹基因组含量丰富(54.97%)[37]有关。DNA-TE-TUCP占所有转座子来源的TUCP的20.75%。其中DNA/CMC-EnSpm类型转座子(66.39%)和DNA/MULE-MuDR类型转座子(55.56%)在TUCP-TE中增加，可能是非生物胁迫导致。
表 1 毛竹TE-TUCP转座子来源
Table 1. Sources of TE-TUCP transposons in Ph. edulis
转座子来源分类 TUCP-TE/
个nonTUCP-TE/
个数量合
计/个DNA 45 115 160 DNA/CMC-EnSpm 2 994 1 516 4 510 DNA/hAT 4 18 22 DNA/hAT-Ac 745 907 1 652 DNA/hAT-Tag1 17 26 43 DNA/hAT-Tip100 228 209 437 DNA/MULE-MuDR 2 368 1 894 4 262 DNA/PIF-Harbinger 112 154 266 DNA/TcMar-Stowaway 153 452 605 LINE/L1 1 040 1 050 2 090 Low_complexity 4 9 13 LTR 68 1058 1126 LTR/Caulimovirus 6 39 45 LTR/Copia 8 456 8 809 17 265 LTR/Gypsy 10 662 13 318 23 980 Other/centromeric 2 2 4 RC/Helitron 241 427 668 Simple_repeat 112 341 453 SINE/L1 6 6 12 SINE 2 2 未知 12 12 合计 27 263 30 364 57 627 -
从图2可见：C4与ck处理组共筛选出261个上调TE-TUCP，246个下调TE-TUCP (图2A)。H42与ck处理组共筛选出199个上调TE-TUCP，127个下调TE-TUCP (图2B)。UV与ck处理组共筛选出270个上调TE-TUCP，178个下调TE-TUCP(图2C)。Sa与wa处理组共筛选出97个上调TE-TUCP，66个下调TE-TUCP (图2D)。TE-TUCP表现出胁迫特异性表达模式，在冷、盐胁迫下下调个数多于上调个数，在热和紫外胁迫下上调个数多于下调个数。
图 2 毛竹TE-TUCP表达模式分析
Figure 2. Analysis of TE-TUCP expression pattern in Ph. edulis
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对TUCP-TE附近4 646个基因研究发现：C4与ck处理组共筛选出758个上调基因，833个下调基因(图3A)，差异表达基因占所有附近基因的34.24%。H42与ck处理组共筛选出358个上调基因，334个下调基因(图3B)，差异表达基因占所有附近基因的14.89%。UV与ck处理组共筛选出739个上调基因，596个下调基因(图3C)，差异表达基因占所有附近基因的28.73%。Sa与wa处理组共筛选出320个上调基因，201个下调基因(图3D)，差异表达基因占所有附近基因的11.21%。
图 3 毛竹TUCP-TE附近基因表达模式分析
Figure 3. Analysis of gene expression patterns in the vicinity of Ph. edulis TUCP-TE
对nonTUCP-TE附近2 456个基因研究发现：C4与ck处理组共筛选出474个上调基因，496个下调基因(图4A)，差异表达基因占所有附近基因的39.50%。H42与ck处理组共筛选出287个上调基因，225个下调基因(图4B)，差异表达基因占所有附近基因的20.85%。UV与ck处理组共筛选出475个上调基因，383个下调基因(图4C)，差异表达基因占所有附近基因的34.93%。Sa与wa处理组共筛选出217个上调基因，130个下调基因(图4D)，差异表达基因占所有附近基因的14.13%。可见，除了低温处理外，高温、高盐、紫外照射处理组TUCP-TE附近5 000 bp距离内基因差异表达数量均比nonTUCP-TE高，表明高温、高盐、紫外照射可以促进TUCP-TE附近差异基因表达，但是低温会抑制TUCP-TE附近差异基因表达。
图 4 毛竹nonTUCP-TE附近基因表达模式分析
Figure 4. Analysis of gene expression patterns in the vicinity of Ph. edulis nonTUCP-TE
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在附近5 000 bp距离内，分别取TUCP-TE和nonTUCP-TE差异表达基因合集2 592、1 591个基因进行GO富集分析。如图5所示：与nonTUCP-TE相比，非生物胁迫下，TUCP-TE附近5 000 bp距离内差异表达基因，除了共同显著富集在细胞、细胞组分、细胞内、细胞内组分、代谢过程外，还额外显著富集在与非生物胁迫相关的催化活性、水解酶活性、对辐射反应、对光刺激反应、对渗透胁迫的反应等方面。表明非生物胁迫可以促进毛竹TUCP-TE附近相关基因的表达。
图 5 GO富集分析
Figure 5. GO enrichment analysis
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如图6所示：nonTUCP-TE附近1 500 bp内的差异表达基因比TUCP-TE相同距离内差异表达基因的数量多，且在越靠近nonTUCP-TE的位置，差异表达基因集中。在附近1 500 bp内，TUCP-TE附近越靠近TUCP，差异表达基因就数量越少，而在距离2 000~3 000 bp内，TUCP-TE附近差异表达基因数量较多。说明基因的表达潜能与邻近TE-TUCP的表达潜能互相抑制。2 000~3 000 bp是TE-TUCP对基因影响较明显的范围。同时，TUCP-TE附近差异表达基因平均表达量为757.1，低于nonTUCP-TE (1 245.5)。TUCP-TE附近差异表达基因表达水平与nonTUCP-TE相比，整体水平上表达峰更低，说明非生物胁迫可能会抑制TE-TUCP附近基因的整体表达水平。
图 6 TE-TUCP与基因距离、基因表达水平统计散点图
Figure 6. Scatterplot of TE-TUCP versus gene distance and gene expression level statistics
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为了验证转录组测序数据分析结果的准确性，从鉴定的差异表达TE-TUCP中随机挑选4个TE-TUCP及其附近基因，分别是TE-TUCP1和PH02Gene02823、TE-TUCP2和PH02Gene14564、TE-TUCP3和PH02Gene16722，以及TE-TUCP4和PH02Gene25649。引物见表2。如图7所示：TE-TUCP和邻近基因的RT-qPCR结果与转录组分析结果一致，说明转录组测序数据分析结果是可靠的。
表 2 引物序列信息
Table 2. Primer sequence information
引物名称 序列(5′→3′) 引物名称 序列(5′→3′) TE-TUCP1-F AACAAGGCAGCGCAGCAGAC TE-TUCP3-R AACTAATGGAAGCGGACGCACG TE-TUCP1-R TTGGCGGCACCTTAGGCTGA PH02Gene16722-F CGAATGGCAGGAGGAGCAGAGA PH02Gene02823-F CTCCACGCCCATCAACACCAAG PH02Gene16722-R TCTTGCCCTTGCCGAAGTGGA PH02Gene02823-R ACTGAGGAGGGAGGAGGCAACT TE-TUCP4-F AGGCAGATTCCGCAGGTGGTT TE-TUCP2-F ATGGTGTTGGTGGTGTGCGTG TE-TUCP4-R ATTCACCAGCATCCAGCTTGGC TE-TUCP2-R CGGCAGATTGCGTGCGTACATA PH02Gene25649-F AATTGCACCTGCCTGCTGGATG PH02Gene14564-F GGAAGGTCAGGCACCAACGATG PH02Gene25649-R ACCTCCCGTCACTGGTCCTTTG PH02Gene14564-R AGCCACCACTGCTACCGTAGTC Actin-F ATACGCTTCCTCACGCTATTCTT TE-TUCP3-F AGCCACGGATTCAGCAACAAGG Actin-R CCGAGCTTCTCCTTTATGTCCCT 
图 7 4个TE-TUCP及其邻近4个基因的RT-qPCR表达分析
Figure 7. RT-qPCR expression analysis of 4 TE-TUCP and four nearby genes
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植物基因组中转座子含量丰富，毛竹基因组共鉴定出TE序列991 865条，占基因组大小的63%[3]。在桑树Morus alba基因组共检测到TE序列286 122条，占基因组大小的32%[38]，玉米基因组中转座子占比70%[39]，高粱Sorghum bicolor基因组中转座子占比55%[40]，水稻基因组中转座子占比26%[41]。可见，TE在植物基因组中占比较高。
本研究表明：毛竹共鉴定出87 409个TUCP，它们的平均长度比mRNA的平均长度短，但比lncRNA的平均长度长。TUCP、mRNA和lncRNA之间的ORF长度具有相同的规律。这与其他植物研究结果相似[14, 17]。
含有应激响应顺式调控元件的TE通过表观遗传修饰对环境胁迫表现出快速反应。例如，番茄Solanum lycopersicum基因组中属于Ty1/Copia超家族的反转录转座子在干旱胁迫和脱落酸(ABA)作用下被激活[42]。番茄和烟草Nicotiana tabacum中的TE可被低温特异性触发和激活[43]。以上研究表明：TE衍生的TUCP能在非生物胁迫下调控自身转录和附近基因的表达。毛竹57 627个TE-TUCP，65.9%来自TE。TE-TUCP主要来源于Ty1/Copia和Ty3/Gypsy超家族。TE-TUCP表现出胁迫特异性表达模式，在冷、盐胁迫下下调数量大于上调数量，在热胁迫和紫外胁迫下上调数量大于下调数量。
本研究发现：低温胁迫抑制TUCP-TE附近基因差异表达，高盐胁迫促进TUCP-TE附近基因差异表达，TE-TUCP与附近基因的表达潜能互相抑制，这与之前拟南芥中TUCP与附近基因转录水平呈负相关结果一致[19]。另外，高温胁迫也能促进TUCP-TE附近基因差异表达。红枣转录组研究表明：TUCP改变了附近基因表达以适应高温环境[20]。本研究还发现：紫外胁迫下，TE-TUCP促进光刺激反应相关基因差异表达。棉花中TUCP参与光合作用并影响生长发育过程[14]。GO富集分析结果显示：TE-TUCP通过调控关键基因在非生物胁迫反应中发挥重要作用。这与TE在非生物胁迫下可重新激活转录从而应对环境条件变化的结论相一致[44]。
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本研究在4种胁迫处理的转录组数据中，共识别出57 627个毛竹TE-TUCP。这些TE-TUCP在面对不同的非生物胁迫时，展现出了各自独特的表达模式。它们主要源自Ty1/Copia和Ty3/Gypsy这2个超家族。基因自身的表达潜力与邻近的TE-TUCP的表达潜力之间存在着一种相互抑制的现象。此外，非生物胁迫还会通过调控TE-TUCP的转录情况，来影响周边基因的表达，从而帮助毛竹适应这些胁迫条件。
Effects of abiotic stress treatments on the transcriptional activity of transposable element-derived TUCP in Phyllostachys edulis
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摘要:
目的 转座子(TE)是真核细胞基因组的重要组成部分，在毛竹Phyllostachys edulis基因组超过63%时，易受胁迫诱导激活。分析非生物胁迫下，来源于转座子的不确定编码潜力转录本(TUCP)的表达模式，为转座子参与毛竹抗逆分子机制提供参考。 方法 采用生物信息学技术和手段，在低温、高温、高盐、紫外照射等4种胁迫处理下，研究毛竹TE-TUCPs及转座子邻近基因的转录特性和转录模式。通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)验证转录组来源的TE-TUCPs差异表达数据的可靠性。 结果 在毛竹4个胁迫处理转录本中，共鉴定出57 627个TE-TUCPs。TE-TUCPs应对不同非生物胁迫表现出特异性表达模式。高温、高盐、紫外照射处理可以促进具有转录活性的TE-TUCPs附近基因差异表达，但是低温会抑制具有转录活性的TE-TUCPs附近基因差异表达。 结论 TE-TUCPs主要来源于Ty1/Copia和Ty3/Gypsy超家族。基因的表达潜能与近距离的TE-TUCPs表达潜能互相抑制。TE-TUCPs转录情况会受到非生物胁迫作用来调控附近基因的表达以适应胁迫影响。图7表2参44 -
关键词:
- 毛竹 /
- 转座子(TE) /
- 不确定编码潜力转录本(TUCP) /
- 非生物胁迫
Abstract:Objective Transposable elements (TE), an essential component of eukaryotic genomes are prone to activation under stress when they account for over 63% of the Phyllostachys edulis genome. This study, with an analysis of the expression patterns of transcripts of uncertain coding potential (TUCP) from transposable elements under abiotic stress, is aimed to provide insights into the molecular mechanisms of TEs in stress resistance in Ph. edulis. Method First, bioinformatics techniques were employed to investigate the transcriptional characteristics and patterns of TE-TUCPs, and neighboring genes in Ph. edulis under 4 stress treatments: low temperature, high temperature, high salinity, and UV irradiation. Then the reliability of the differentially expressed TE-TUCPs, data derived from the transcriptome was validated using RT-qPCR. Result A total of 57 627 TE-TUCPs were identified from the transcripts of Ph. edulis under 4 stress treatments. These TE-TUCPs exhibited specific expression patterns in response to different abiotic stresses. High temperature, high salinity, and UV irradiation promoted differential expression of genes neighboring TE-TUCPs with transcriptional activity, whereas low temperature suppressed such differential expression. Conclusion TE-TUCPs were primarily derived from the Ty1/Copia and Ty3/Gypsy superfamilies. The expression potential of genes and that of nearby TE-TUCPs were mutually inhibitory and the transcription of TE-TUCPs was regulated by abiotic stress to modulate the expression of neighboring genes in response to stress. [Ch, 7 fig. 2 tab. 44 ref.] -
桂花Osmanthus fragrans为木犀科Oleaceae木犀属Osmanthus，是中国十大传统名花之一，也是园林造景常用植物。根据开花时间不同，桂花可以分为秋桂和四季桂；根据花色差异，秋桂又可以分为丹桂、金桂和银桂。已有研究分析了桂花不同花色品种呈色物质成分，证实类胡萝卜素的种类及其质量分数是决定桂花花色的最主要因素[1−2]。目前，桂花类胡萝卜素的定性定量及其代谢途径中相关催化酶基因已被陆续分离得到[3−5]。桂花不同花色品种花瓣所含的类胡萝卜素中，β-胡萝卜素相对含量最高[1]。桂花番茄红素β-环化酶OfLCYB具备使番茄红素两端环化转化为β-胡萝卜素的能力，且OfLCYB对番茄红素的底物亲和性强于其他番茄红素环化酶，是桂花类胡萝卜素代谢途径中的关键催化酶[6−7]。沈子又等[8]分离得到了OfLCYB基因启动子，发现其启动子序列均包含有TATA-box、CAAT-box响应元件及水杨酸、赤霉素、脱落酸等激素响应元件等，但目前有关桂花OfLCYB基因上游转录因子的筛选及鉴定鲜见报道。
已有研究认为：ERF[9]、MYB[10]、NAC[11]等转录因子参与调控植物类胡萝卜素代谢。AP2/ERF转录因子家族具有众多的家族成员。根据AP2/ERF结构域的数目和序列特征，AP2/ERF家族转录因子分为AP2、ERF、CBF/DREB、RAV和Soloist这5个亚组，其中ERF类转录因子仅含有1个AP2/ERF结构域。ERF转录因子通过结合下游靶基因的GCC (GCCGCC)或DRE (CCGAC)序列[12]调节基因的表达，参与调节植物生长发育、生物或非生物胁迫应答、调控果实成熟等。此外，在拟南芥Arabidopsis thaliana[9]、番茄Solanum lycopersicum[13]和苹果Malus domestica[14]中还发现B2亚组的ERF转录因子具有调控植物类胡萝卜素合成的功能。拟南芥B2亚组ERF转录因子包括At3g16770.1(AtERF72/AtRAP2.3)、At1g72360.2 (AtERF73)、At1g53910.1 (AtERF74/AtRAP2.2)等5个成员。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。在黄龙胆Gentiana lutea[16]中，GlLCYB、GlLCYE、GlZEP、GlPDS、GlZDS、GlBCH基因的启动子上均存在ATCTA作用元件，说明ATCTA元件广泛存在于类胡萝卜素合成基因启动子上，表明B2亚组的ERF转录因子可能对一系列类胡萝卜素代谢基因具有调控作用。
本研究以桂花丹桂品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhong Gui’为材料，首先对OfLCYB基因启动子的ATCTA顺式作用元件进行分析，再对桂花B2亚组的ERF转录因子基因进行序列分析和表达分析，利用酵母单杂交技术筛选和鉴定与OfLCYB互作的关键B2亚组的OfERF转录因子，不仅可以扩展桂花花色研究领域，同时为揭示桂花类胡萝卜素代谢的调控网络提供理论依据，为桂花品种培育和种质创新提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料
选择浙江农林大学桂花资源圃生长状况良好的地栽桂花品种‘堰虹桂’为材料，分别采集‘堰虹桂’的新鲜嫩叶以及顶壳期(S1)、铃梗期(S2)、初花期(S3)、盛开期(S4)的花瓣样品[17]，每个样品3次生物学重复，取样时间均为10:00。上述叶片与花瓣样品快速采集后放入液氮冷冻，随后保存于−80 ℃超低温冰箱，供后续使用。
1.2 方法
1.2.1 OfLCYB启动子序列分析、克隆及OfLCYB基因表达分析
根据诺禾致源的Ultraclean plant DNA purification Kit试剂盒操作说明提取‘堰虹桂’的嫩叶鲜样DNA。借助PlantCARE数据库(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )分析启动子顺式作用元件。根据OfLCYB的启动子序列信息[8]设计引物，以‘堰虹桂’嫩叶DNA为模板扩增得到其启动子。以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以OfLCYB基因序列设计表达引物，以桂花OfACT基因[18]为内参基因，按照TB Green® Premix Ex TM TapⅡ说明进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析。引物序列见表1。利用参照基因的2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。表 1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences引物名称 引物序列(5′→3′) LCYB-PRO-GW-F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGCTTCTTGTTGTTGTACG LCYB-PRO-GW-R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCAATTTTGGCATGTTCTTAG OfLCYB-qF GAAAGGAGACGCCAAAGGGAG OfLCYB-qR GGAAGAAATAGCCGAGATGATAAGA 说明：小写字母表示部分attB序列。 1.2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
使用天根公司RNA perp Pure Plant Kit试剂盒，根据产品说明提取‘堰虹桂’不同时期的花瓣RNA。随后用紫外分光光度计和质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量。按照PrimeScriptTM RT Master Mix说明书将检验合格的盛花期RNA进行反转录。
应用Prot-Param在线软件 (
http://web.expasy.org/protparam/ ) 预测所编码蛋白的分子量、理论等电点、不稳定系数等；采用MEGAX软件中的邻位相邻法(NJ)进行同源聚类，建立系统发育树，并采用Bootstrap法(重复1 000次) 评估检测系统进化树。运用DNAMAN 7.0对4个OfERF基因推测所得的序列进行多序列比对分析。1.2.3 B2亚组OfERFs表达分析
以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以筛选得到的桂花B2亚组OfERFs序列设计引物，以桂花OfACT为内参基因。分析方法参照1.2.1。引物序列见表2。
表 2 OfERFs基因RT-qPCR引物序列Table 2 RT-qPCR primer sequences of OfERFs引物名称 引物序列(5′→3′) 引物名称 引物序列(5′→3′) OfERF73a-qF CTGAAGAGAAACCGCCAACAA OfERF72a-qR GGGTAGTAAACTTCTTGTTGCTGCGTA OfERF73a-qR TTAACGCCATCAGAAGACACAAGT OfERF72b-qF CAAATATCCTATGTTCAGAGG OfERF73b-qF AATTGGGATGCCGCCTCA OfERF72b-qR ATAGCATACCATAACATACCA OfERF73b-qR TTAAATCCCACCAAACATAGCACT OfACT-qF CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT OfERF72a-qF CCAACCCCACCGGCTC OfACT-qR ACCCCATCACCAGAATCAAGAA 1.2.4 OfERFs与OfLCYB启动子酵母互作验证
通过Gateway方法构建pAbAi-OfLCYB-pro载体，之后利用限制性内切酶BstB I线性化质粒pAbAi-OfLCYB-pro、阳性对照p53-AbAi以及阴性对照pAbAi载体。按照Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 User Manual产品说明制备酵母感受态，并将线性化的质粒转入感受态细胞中，涂布于尿嘧啶缺陷培养基(SD/-Ura)酵母板筛选培养基上，28 ℃倒置培养2~3 d。挑取单菌落扩大培养，提取酵母DNA。以粗提酵母DNA为模板，进行PCR检验。用质量分数为0.9% 的无菌氯化钠溶液稀释菌液，D(600)=0.002时，均匀涂布于金担子素A (AbA)不同浓度的SD/-Ura固体培养基上，倒置于28 ℃培养箱内培养2~3 d，以检测AbAr基因本底表达水平。将pGADT7-OfERF72a、pGADT7-OfERF72b、pGADT7-OfERF73a、pGADT7-OfERF73b和pGADT7-53、pGADT7分别转入诱饵菌株pAbAi-OfLCYB-pro和阳性对照p53-AbAi、阴性对照pAbAi的酵母感受态细胞，悬浮液均匀涂布于SD/-Leu缺陷培养基上，倒置于30 ℃培养箱内培养3~5 d，再将长出的单菌落分别在亮氨酸缺陷培养基(SD/-Leu)与含300 μg·L−1的亮氨酸缺陷培养基[SD/-Leu/AbA(300 μg·L−1)]点斑检测其互作情况。
2. 结果与分析
2.1 OfLCYB启动子序列分析及表达分析
由图1可见：桂花OfLCYB基因启动子序列含有2个ATCTA顺式作用元件。
图 1 OfLCYB启动子的ATCTA顺式作用元件分析Figure 1 Analysis of ATCTA cis-acting elements of the OfLCYB promoter通过荧光定量检测‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfLCYB的表达水平(图2)，发现OfLCYB的表达量从顶壳期到盛开期逐渐升高，在盛开期表达量最高。
图 2 OfLCYB在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 2 Expression of OfLCYB at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
通过对桂花转录组数据库分析，筛选获得4个B2亚组ERF有关的Unigene序列。利用MEGAX软件对4个桂花OfERFs氨基酸全长和拟南芥ERF家族的122个成员的氨基酸序列构建系统进化树，结果显示：4个桂花OfERFs与5个拟南芥ERF序列聚集在B2亚组(图3)。其中CL2088.Contig2和CL2088.Contig3聚为一小支，与拟南芥At3g16770.1 (AtERF72)的关系最为接近，将CL2088.Contig2和CL2088.Contig3分别命名为OfERF72a和OfERF72b。此外，CL550.Contig3、Unigene4342与拟南芥At1g72360.2 (AtERF73)关系较近，将CL550.Contig3和Unigene4342分别命名为OfERF73a和OfERF73b。
图 3 桂花B2亚组OfERFs系统发育分析Figure 3 Phylogenetic analysis of OfERFs in subgroup B2 of O. fragrans多序列比对分析发现(图4) ：4个OfERF基因均包含1个AP2保守结构域。4个OfERFs蛋白序列的基本理化性质(表3)分析发现：OfERF72a基因的氨基酸数量为232个，分子量为26 144 Da；OfERF72b基因的氨基酸数量为228个，分子量为25 841 Da；OfERF73a基因的氨基酸数量为386个，分子量为43 632 Da；OfERF73b基因的氨基酸数量为375个，分子量为41 607 Da。4个OfERF的理论等电点为4.63~5.33，均属于偏酸性蛋白质；总平均亲水指数均为负值，都属于亲水性蛋白。OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a不稳定系数分别为43.67、54.42、43.21，判断为不稳定的蛋白质；OfERF73b不稳定系数为38.40，判断为稳定的蛋白质。
图 4 B2亚组OfERFs氨基酸序列比对分析Figure 4 Amino acid multiple sequence alignment analysis of OfERFs of subgroup B2表 3 B2亚组OfERFs基本理化性质分析Table 3 Analysis of basic physicochemical properties OfERFs of subgroup B2基因名称 氨基酸数量/个 分子量/Da 理论等电点 不稳定系数 总平均亲水指数 OfERF72a 232 26 144 5.33 43.67 −0.744 OfERF72b 228 25 841 5.30 54.42 −0.796 OfERF73a 386 43 632 4.63 43.21 −0.739 OfERF73b 375 41 607 5.01 38.40 −0.710 2.3 B2亚组OfERFs表达分析
利用RT-qPCR技术分析‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b相对表达量(图5)发现：从顶壳期到盛开期，OfERF72a、OfERF72b的相对表达量基本呈现逐渐下降的趋势，OfERF73a的相对表达量在顶壳期、铃梗期与盛花期之间差异较小，在初花期相对表达量略有下降。OfERF73b的相对表达量在顶壳期、铃梗期较高，随后在初花期相对表达量显著下降(P＜0.05)。
图 5 B2亚组OfERF在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 5 Expression of OfERF genes of subgroup B2 at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’为了验证OfERFs与OfLCYB之间的关系，用y表示OfERFs的相对表达量取以10为底的对数，用x表示OfLCYB相对表达量取以10为底的对数进行相关性分析(图6)。其中，OfERF72a直线回归方程为y= − 0.987 6x − 0.010 0，决定系数(R2)为0.933 6，P=0.033 8；OfERF72b直线回归方程为y= − 1.208 0x − 0.077 9，R2=0.941 6，P=0.029 6。OfLCYB的表达水平与OfERF72a、OfERF72b呈显著负相关。
图 6 OfERFs与OfLCYB相对表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis of relative expression levels of OfERFs with OfLCYB2.4 酵母单杂交分析B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子互作
为了探究B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子之间是否存在物理互作，同时将阴性对照pAbAi+pGADT7、阳性对照p53-AbAi+pGADT7-Rec-p53以及实验组pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF分别接种于SD/-Leu与SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)的酵母培养基上，于30 ℃倒置培养3~5 d。结果发现(图7)：在SD/-Leu培养基上，酵母均能正常生长，而在SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)培养基上，只有阳性对照与pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF72b正常生长，其余酵母菌均不能生长，表明OfERF72b可以与OfLCYB启动子物理结合。
图 7 OfERF蛋白与OfLCYB启动子互作验证Figure 7 Verification of physical interaction between OfERF proteins and OfLCYB promoter3. 讨论
本研究得到4个桂花‘堰虹桂’B2亚组的OfERFs基因，编码区长度为687~1 161 bp，编码228~386个氨基酸残基。拟南芥B2亚组ERF At1g53910.1、At1g72360.2、At2g47520.1、At3g14230.1以及At3g16770.1分别编码358、262、171、397和248个氨基酸残基[15]。牡丹Paeonia suffruticosa ERF家族中B2亚组基因PsERF1编码区长度为1 158 bp，编码385个氨基酸残基[19]。在番木瓜Carica papaya中，属于B2亚组的基因CpERF4、CpERF6、CpERF9则分别编码431、253、234个氨基酸残基[20]。而在番茄ERF中，其B2亚组的SlERF6、SlERF.E.1、SlERF90、SlERF91、SlERF.A.3分别编码255、260、386、1 454和372个氨基酸残基[21]。由此可以发现：同一物种B2亚组ERF基因编码不同长度的氨基酸序列，推测其不同成员的功能存在差异。
对4个桂花OfERFs基因的氨基酸序列进行系统进化分析，发现OfERFs与拟南芥B2亚组ERF聚集在一起，说明它们的同源性较高。其中2个基因与At3g16770.1 (AtERF72/AtRAP2.3)聚为一支，2个基因与At1g72360.2 (AtERF73/AtRAP2.2)聚为另一小支。据此将4个OfERFs基因分别命名OfERF72a与OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b。桂花OfERF72与OfERF73均存在2个拷贝，说明桂花OfERF基因家族成员在进化和扩张过程中与基因重复事件有着紧密联系。在拟南芥中，AtERF72能够与缺铁反应基因IRT1、HA2和CLH1的启动子区域结合，负调控拟南芥的缺铁响应。与野生型植株相比，AtERF72突变体中铁和镁质量分数显著增加[22]。AtRAP2.3的同源基因SlERF6被证实是番茄中类胡萝卜素合成的负调控因子[13]。此外，在苹果中也有研究证明：AtRAP2.3的同源基因AP2D15可以负调控苹果PSY1和PSY2基因启动子序列中的ATCTA顺式作用元件[14]。拟南芥AtRAP2.2可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上调控基因的表达，过表达AtRAP2.2后导致植物体内类胡萝卜素降低[15]。
桂花花瓣中主要类胡萝卜素为β-胡萝卜素，其生物合成由OfLCYB直接催化生成，是桂花花瓣中类胡萝卜素代谢的重要催化酶[23]。OfLCYB基因启动子中存在2个ATCTA顺式作用元件，推测其响应B2亚组ERF转录因子的调控。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。进一步研究发现：OfERF72a和OfERF72b的表达趋势与OfLCYB基因呈显著负相关。酵母单杂交结果表明：OfERF72b与OfLCYB启动子存在物理结合，表明B2亚组的OfERF72b可能通过结合OfLCYB基因启动子ATCTA顺式作用元件调控其表达。ATCTA元件也存在于桂花OfPSY[24]和OfCCD1[25]等其他类胡萝卜素代谢基因的启动子上，其是否响应B2亚组的ERF转录因子的调控需要进一步研究。
4. 结论
本研究基于桂花‘堰虹桂’转录组数据筛选了4个OfERF基因，OfERF72a与OfERF72b基因表达量均随着开花进程逐渐下降，与OfLCYB基因的表达量显著负相关。OfLCYB基因启动子含有2个ATCTA顺式作用元件，OfERF72b与OfLCYB启动子之间存在互作，表明OfERF72b可能参与调控OfLCYB的表达。
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图 3 毛竹TUCP-TE附近基因表达模式分析
Figure 3 Analysis of gene expression patterns in the vicinity of Ph. edulis TUCP-TE
图 4 毛竹nonTUCP-TE附近基因表达模式分析
Figure 4 Analysis of gene expression patterns in the vicinity of Ph. edulis nonTUCP-TE
图 6 TE-TUCP与基因距离、基因表达水平统计散点图
Figure 6 Scatterplot of TE-TUCP versus gene distance and gene expression level statistics
图 7 4个TE-TUCP及其邻近4个基因的RT-qPCR表达分析
Figure 7 RT-qPCR expression analysis of 4 TE-TUCP and four nearby genes
表 1 毛竹TE-TUCP转座子来源
Table 1. Sources of TE-TUCP transposons in Ph. edulis
转座子来源分类 TUCP-TE/
个nonTUCP-TE/
个数量合
计/个DNA 45 115 160 DNA/CMC-EnSpm 2 994 1 516 4 510 DNA/hAT 4 18 22 DNA/hAT-Ac 745 907 1 652 DNA/hAT-Tag1 17 26 43 DNA/hAT-Tip100 228 209 437 DNA/MULE-MuDR 2 368 1 894 4 262 DNA/PIF-Harbinger 112 154 266 DNA/TcMar-Stowaway 153 452 605 LINE/L1 1 040 1 050 2 090 Low_complexity 4 9 13 LTR 68 1058 1126 LTR/Caulimovirus 6 39 45 LTR/Copia 8 456 8 809 17 265 LTR/Gypsy 10 662 13 318 23 980 Other/centromeric 2 2 4 RC/Helitron 241 427 668 Simple_repeat 112 341 453 SINE/L1 6 6 12 SINE 2 2 未知 12 12 合计 27 263 30 364 57 627 
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表 2 引物序列信息
Table 2. Primer sequence information
引物名称 序列(5′→3′) 引物名称 序列(5′→3′) TE-TUCP1-F AACAAGGCAGCGCAGCAGAC TE-TUCP3-R AACTAATGGAAGCGGACGCACG TE-TUCP1-R TTGGCGGCACCTTAGGCTGA PH02Gene16722-F CGAATGGCAGGAGGAGCAGAGA PH02Gene02823-F CTCCACGCCCATCAACACCAAG PH02Gene16722-R TCTTGCCCTTGCCGAAGTGGA PH02Gene02823-R ACTGAGGAGGGAGGAGGCAACT TE-TUCP4-F AGGCAGATTCCGCAGGTGGTT TE-TUCP2-F ATGGTGTTGGTGGTGTGCGTG TE-TUCP4-R ATTCACCAGCATCCAGCTTGGC TE-TUCP2-R CGGCAGATTGCGTGCGTACATA PH02Gene25649-F AATTGCACCTGCCTGCTGGATG PH02Gene14564-F GGAAGGTCAGGCACCAACGATG PH02Gene25649-R ACCTCCCGTCACTGGTCCTTTG PH02Gene14564-R AGCCACCACTGCTACCGTAGTC Actin-F ATACGCTTCCTCACGCTATTCTT TE-TUCP3-F AGCCACGGATTCAGCAACAAGG Actin-R CCGAGCTTCTCCTTTATGTCCCT
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