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微胶囊是由微小的颗粒或液滴被涂层包围而产生的具有许多特性的胶囊[1]，被广泛用于载运对光照、温度等外界环境敏感的生物活性物质。微胶囊通常形成核壳结构包埋活性物质，壁材具有阻挡光线、氧气、水等的物理屏障作用，因此可以保护核心材料免受不利外部环境条件的影响[2]。近几年，壁材材料引起了人们的关注，包括蛋白质、海藻酸盐、多糖、抗性淀粉和美拉德产物等。海藻酸钠可被高碘酸盐氧化形成多个功能醛基团，通常被称为海藻酸二醛(ADA)。海藻酸二醛的醛基官能团非常活跃，可以与氨基发生反应形成席夫碱，促进与含氨基聚合物的共价交联[3]。蛋白-多糖二元复合物在包埋生物活性物质方面显示出巨大的潜力，不仅可以将蛋白的优异乳化特性和多糖的稳定作用相结合，还可以提升复合物在不同温度、离子强度和pH下的稳定性[4]。COPADO等[5]制备了酪蛋白酸钠-乳糖共聚物微胶囊，微胶囊表现出良好的分散性，经过美拉德反应的酪蛋白酸钠-乳糖共聚物提高了奇亚籽油的氧化稳定性。JIA等[6]通过美拉德反应制备了乳清蛋白(WPI)分离物-低聚糖共聚物，并用于包埋番茄红素，包埋率和包封产率分别达94%和86%。共聚物微胶囊不仅提高了番茄红素的储藏稳定性和氧化稳定性，还将番茄红素的生物利用度从16%提高到60%。
本研究主要探讨WPI和ADA共聚物间的共价交联对微胶囊中姜黄素(CUR)稳定性和释放特性的影响。通过测定褐变强度、接枝度、粒径、Zeta电位和流变性能探究不同WPI和ADA质量比下共聚物乳液的理化性质；利用傅里叶红外光谱(FTIR)和X射线衍射光谱(XRD)分析WPI-ADA共聚物的结构变化特征，通过热重分析(TGA)研究WPI-ADA共聚物微胶囊的热稳定性；最后测定姜黄素在胃肠道模拟消化中的释放特性，以期提高姜黄素的生物利用度并为新型运载体系提供理论基础。
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WPI和CUR购自上海麦克林生化科技有限公司；海藻酸钠购自南京化学试剂有限公司；四硼酸钠、2-巯基乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；人工胃液、人工小肠液、中链甘油三酯(MCT)、邻苯二甲醛(OPA)购自上海源叶生物科技有限公司。
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将WPI与ADA以1∶0、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3的质量比分散在去离子水中(分别记为ck、W3A1、W2A1、W1A1、W1A2和W1A3)，得到固形物质量分数为100 mg·g−1的溶液。将溶液在人工气候箱(温度为65 ℃，相对湿度为90%)中保持24 h，在−80 ℃预冷后进行冷冻干燥，得到WPI-ADA共聚物。
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WPI-ADA共聚物分散在去离子水中。测定304 nm处吸光度用于证明Amadori化合物的形成[7]，测定294 nm处吸光度证明美拉德反应早期产物和中间产物的存在，测定420 nm处吸光度证明美拉德反应终产物的存在[8]。
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接枝度是评估美拉德反应幅度的关键指标。美拉德反应的发生可以通过游离氨基的含量进一步确定，因此反应体系中的接枝程度可以反应WPI游离氨基的变化[9]。根据ZHANG等 [10]的方法测定接枝度。将80.0 mg OPA加入2.0 mL甲醇中，然后与50.0 mL四硼酸钠缓冲溶液(0.1 moL·L−1，pH=9.7)、5.0 mL十二烷基硫酸钠(0.2 kg·L−1)和200.0 μL β-巯基乙醇混合。用去离子水定容到100.0 mL获得OPA试剂。将200.0 μL样品溶液(2 g·L−1)和4.0 mL OPA试剂混合并在35 ℃下保持5 min。测定340 nm处的吸光度获得游离氨基的含量。空白对照为4.0 mL OPA试剂和200.0 μL去离子水的混合物。
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通过红外光谱仪(Nicolet iS20)测定红外光谱图。干燥后的ADA、WPI和WPI-ADA共聚物在400~
4000 cm−1内测定收集红外光谱信号，分辨率为4 cm−1。 -
将1 mg·g−1 CUR溶于MCT中，避光过夜搅拌。同时，将不同比例的WPI-ADA共聚物分散于去离子水中，室温下搅拌24 h，4 ℃过夜水合。将水相和油相以19∶1的质量比混合，通过高速性高剪切分散乳化机(FA25)将溶液以10 000 r·min−1剪切3 min得到粗乳液，使用超声波细胞粉碎机(JY-99-IIDN)超声10 min (开3 s，关3 s)制备乳液，制备过程中使用冰浴。形成的乳液于−80 ℃预冷后进行冷冻干燥，得到WPI-ADA微胶囊。
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测试前用去离子水将乳液稀释100倍，利用粒径仪(Nano ZS)在室温下测定乳液粒径、PDI和电位。
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使用旋转流变仪(HR-1)测定乳液的流变特性。设置应变为0.5%，在角频率1.0~100.0 rad·s−1下记录储能模量(G′)和损耗模量(G″)。选定直径40 mm的平行板，调整间距为500 μm，在剪切速率为0.01~100.00 s−1内记录样品的黏度值。通过Herschel-Bulkley模型分析剪切速率与剪切应力之间的关系：
$$\sigma=\sigma_0+K \times \gamma^n。$$ (1) 式(1)中：σ为剪切应力(Pa)；σ0为屈服应力(Pa)；K为稠度系数(Pa·sn)；γ是剪切速率(s−1)，n为流动行为指数。
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使用数码显微镜(BA310)观察水包油(O/W)乳液的微观结构。
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为了量化微胶囊中CUR的总量，将制备好的微胶囊溶解在蒸馏水中，用乙醇提取CUR。根据CUR溶液的标准曲线，在425 nm处测定总CUR质量浓度(M0)。将微胶囊分散在无水乙醇中，在425 nm处测定游离CUR质量浓度(M1)。包埋率(E)通过以下公式得到：
$${E}=\frac{M_0-M_1}{M_0} \times 100 \%。$$ (2) 式(2)中：M0为总CUR质量浓度(mg·L−1)，M1为游离CUR质量浓度(mg·L−1)。
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使用X射线衍射仪(Ultima Ⅳ)得到WPI-ADA微胶囊的XRD图谱，扫描角度范围为5~80°，扫描速度为2°·min−1。
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将WPI-ADA微胶囊样品加入Tarsus热重分析仪(TG 209 F3)的铝盘中，测试温度为30~600 ℃，升温速率为10 ℃·min−1。
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根据欧盟委员会(EU)10/2011号法规，以体积分数为50%的乙醇为食品模拟剂[11]，根据已报道的方法，使用透析袋进行微胶囊的体外释放实验 [12−14]。将微胶囊样品与模拟胃液(SGF，2 g·L−1 氯化钠，3.2 g·L−1胃蛋白酶)混合并将pH调至1.2，将该溶液装入透析袋置于乙醇释放介质中。模拟胃消化结束后，将溶液pH调整至7.0以抑制胃蛋白酶活性。随后，收集模拟胃消化产物与模拟肠液(SIF，10 g·L−1胰蛋白酶，6.8 g·L−1磷酸二氢钾)混合，并将pH调至7.4，将溶液装入透析袋置于乙醇释放介质中。体外释放均在37 ℃，100 r·min−1下进行，在预定的时间间隔内取样，并更换相同量的释放介质以保持相同体积的释放介质。释放介质中CUR的质量浓度通过在425 nm处吸光度得到。
$$ \text{释放率}\text=\frac{{{m}}_{{t}}}{{{m}}_{\text{∞}}}\times 100\% 。 $$ (3) 式(3)中：mt为在时间t时释放的CUR质量浓度(mg·L−1)，m∞为微胶囊中CUR的质量浓度(mg·L−1)。
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所有数据以平均值±标准差表示，采用单因素方差进行显著性分析，使用DPS数据处理系统进行Tukey事后检验显著性分析，使用Origin Pro 2022 b绘图。
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如图1所示：除了W2A1处理组在420 nm处的吸光度外，其他处理组在294、304和420 nm处的吸光度均比ck显著增加(P＜0.05)。吸光度随着WPI和ADA质量比的降低而增加，这与观察到的接枝度变化一致。同时，所有处理组在294 nm处的吸光度均高于304 和420 nm处。由图2可知：随着WPI∶ADA从3∶1变化到1∶3，WPI-ADA共聚物的接枝度从15.5%增加到56.1%。这表明在一定的范围内，高ADA能够促进与WPI的美拉德反应，使接枝度增加。
图 1 WPI-ADA共聚物在294、304和420 nm处的吸光度
Figure 1. Absorbance at 294, 304 and 420 nm of WPI-ADA conjugates
图 2 WPI-ADA共聚物接枝度
Figure 2. Grafting degree of WPI-ADA conjugates
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如图3所示：美拉德反应导致处理组的FTIR图谱发生条带的位置和强度的变化。WPI的特征峰在1 649、1 541和1 392 cm−1出现，分别对应的是C=O拉伸振动，C—N拉伸振动和N—H弯曲振动(酰胺Ⅰ)，N—H弯曲振动和C—N拉伸振动(酰胺Ⅱ)以及C—N拉伸振动和N—H弯曲振动(酰胺Ⅲ)。随着WPI与ADA的比例从0∶1到1∶3，处理组的FTIR图谱表现出不同程度的蓝移或者峰强的改变。WPI的特征峰从1 649 cm−1移至1 621 cm−1，从1 541 cm−1移至1 534 cm−1(W1A1)，该峰的强度逐渐变弱直至消失，位于酰胺Ⅲ带的特征峰从1 392 cm−1移至1 409 cm−1，并且该峰强度逐渐增强。这是美拉德反应诱导的蛋白结构变化所导致的结果。
图 3 ADA、WPI及WPI-ADA共聚物的FTIR图
Figure 3. FTIR spectra of ADA, WPI and WPI-ADA conjugates
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如表1和图4所示：与ck相比，处理组的粒径从415.4 nm降低到325.9 nm，PDI从0.356降低到0.215，这表明共聚物能够形成更小更均匀的液滴。乳液Zeta电位的绝对值反映了其静电相互作用的强度，这对保持乳液稳定性至关重要。处理组比ck有着更高的电位绝对值，ck的电位为−25.0 mV，处理组的Zeta电位绝对值为39.7~43.9 mV，说明处理组的稳定性较好。
表 1 WPI-ADA乳液的粒径、PDI和Zeta电位
Table 1. Particle size, PDI and Zeta Potential of WPI-ADA emulsions
处理 粒径/nm PDI值 Zeta电位/mV ck 415.4 ± 3.0 d 0.356 ± 0.001 d −25.0 ± 0.4 d W3A1 369.4 ± 2.5 c 0.354 ± 0.042 d −39.7 ± 1.4 c W2A1 370.5 ± 4.9 c 0.323 ± 0.004 cd −41.4 ± 1.0 bc W1A1 366.7 ± 4.3 c 0.286 ± 0.022 bc −42.1 ± 0.0 abc W1A2 335.1 ± 0.8 b 0.258 ± 0.014 ab −43.9 ± 1.2 ab W1A3 325.9 ± 2.0 a 0.215 ± 0.009 a −44.2 ± 0.9 a 说明：不同小写字母表示同一指标不同处理间差异显著(P＜0.05)。 
图 4 WPI-ADA乳液的光学显微镜图
Figure 4. Optical microstructure images of WPI-ADA emulsions
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如图5A所示：在测试的剪切速率范围内，所有乳液都表现出非牛顿假塑性流体的剪切稀化行为。这种行为可以通过剪切过程中缠绕的聚合物网络的断裂来解释，其中断裂的分子间纠缠速率大于重组的分子间纠缠速率，导致分子间流动阻力更小，使乳液的表观黏度降低。储能模量G′反映样品的固体状行为，损耗模量G″反映样品的液体状行为。如图5B所示：在所有样品中观察到溶液-凝胶过渡点，证实了乳液到凝胶的转变。图5C显示了测量的剪切应力与剪切速率数据与Herschel-Bulkley模型具有良好的相关性 (R2＞0.99)。剪切速率与剪切应力显示出非线性关系，并且所有乳液的n＜1，证实了乳液为非牛顿流体，且n值随着WPI的增加从0.988 1降低到了0.774 8，这表明与牛顿流体的行为偏差逐渐增加。ADA比例的增加导致σ0值从0.154 8 Pa (ck)降低到1.713 2×10−5 Pa (W1A3)。
图 5 WPI-ADA乳液表观黏度(A)、频率扫描曲线(B)和剪切应力(C)
Figure 5. Apparent viscosity (A), frequency sweeps curves (B) and stress (C) of WPI-ADA emulsions
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由图6可知：WPI在20°出现衍射峰，ADA在14°和24°出现宽峰，峰形宽阔而柔和，这意味着WPI和ADA具有无定形结构。CUR的衍射图出现尖锐而强烈的结晶峰(8.8°、12.2°、17.2°、21.1°和24.6°)，但是在微胶囊中CUR的特征峰(图6B)消失。
图 6 CUR、WPI、ADA(A)和WPI-ADA微胶囊(B)的XRD谱图
Figure 6. XRD patterns of CUR, WPI, ADA (A) and WPI-ADA microcapsules (B)
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微胶囊的失重曲线由3个阶段组成(图7)：第1阶段(0~200 ℃)对应游离水和结合水的损失，这一阶段的质量损失为2.13%~5.15%；微胶囊在第2阶段(200~400 ℃)显示出较快的质量损失，可归因于蛋白的分解和多糖的解聚；第3阶段的质量损失是多糖和蛋白的碳化所导致的。所有样品在第2阶段损失了大部分的质量，其中，ck的质量损失最大，达82.13%，处理组的失重比为55.62%~77.71%。ck在600 ℃时的残渣残余量是15.71%，处理组的残渣残余量是19.05%~24.99%。
图 7 WPI-ADA微胶囊的TGA曲线(A)和DTG曲线(B)
Figure 7. TGA (A) and DTG curve (B) of WPI-ADA microcapsules
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ck、W3A1、W2A1、W2A2、W1A2和W1A3微胶囊的包埋率分别为83.9%、87.8%、91.0%、91.5%、93.4%和95.4%。由图8可知：所有微胶囊表现出相似的释放曲线，首先表现出较高的释放速率，然后缓慢释放至平衡阶段。与ck相比，在模拟胃液(图8A)和模拟肠液(图8B)中，处理组中的CUR释放更缓慢，且释放时间从12 h延长至24 h。CUR在模拟肠液中的释放速率大于模拟胃液，表明处理组能够保护CUR免受模拟胃液环境降解，并在模拟肠液条件下释放，有望靶向肠道，促进肠道细胞摄取，从而提高CUR的生物利用度。
图 8 CUR在模拟胃液(A)和模拟肠液(B)条件下的释放曲线
Figure 8. Release profiles of CUR under simulated gastric fluid (A) and simulated intestinal fluid (B) conditions
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本研究结果表明：除了W2A1处理组在420 nm处的吸光度外，其他处理组在294、304和420 nm处的吸光度均比ck显著增加(P＜0.05)，表明中间物质的形成，其中一部分进一步聚合产生棕色物质[15]。同时，处理组在294 nm处的吸光度均高于在304和420 nm处的吸光度。这表明处理组早期-中期美拉德产物的含量很高，这与DELGADO-ANDRADE等[16]的研究一致。FTIR图谱显示：WPI酰胺Ⅰ带特征峰发生蓝移，该峰的强度逐渐变弱直至消失；位于酰胺Ⅲ带的特征峰发生红移，并且该峰强度逐渐增强，这是美拉德反应诱导的蛋白结构变化所导致的结果。此外，处理组的1 000~1 160 cm−1(C—O拉伸)和3 200~3 600 cm−1(O—H拉伸)的吸收强度增加，这是糖化蛋白形成的典型特征[9]。
乳液粒径、PDI和Zeta电位显示：与ck相比，处理组形成了更小更均匀的液滴。这可能是由于美拉德反应使蛋白变性，导致表面疏水性和柔韧性增加，共聚物到界面的迁移率增加，界面张力降低，快速吸附在液滴表面形成黏弹性厚层，从而获得更小、分布更均匀的油滴[17]。处理组的电位绝对值高于ck，这与JIANG等[18]研究一致。由WPI-羧甲基纤维素共聚物稳定的乳液的Zeta电位显著高于由WPI稳定的乳液，这可能是美拉德反应使NH3+水平降低，而共聚物提供的阴离子羧基浓度增加所导致的。流变特性显示：糖基化减少了水相中ADA聚集体的形成，降低了流动阻力和乳液水相中的黏度[19]。与ck相比，处理组的G′值较低，这可能与偶联物难以形成凝胶网络的二硫键有关[20]。同样，CONSOLI等[21]发现酪蛋白酸钠-玉米淀粉水解物偶联物乳液的黏度低于对照乳液(酪蛋白酸钠-玉米淀粉水解物加热时间为0 h)的黏度。也有研究表明糖基化产生的空间位阻通过二硫键和疏水键的子间缔合来抑制凝胶状结构的形成[22]。
微胶囊射线衍射图中CUR的特征峰消失，表明CUR以无序的结晶相或无定形的分子分散在微胶囊中[23]。热重分析数据显示：处理组的减重更慢，残余质量保持更高，这证明了WPI与ADA通过美拉德反应增强了样品的热稳定性，这可能与接枝子区域抗断裂的化学键强度增加有关[24]。包埋率与接枝度结果表现出相似的趋势，表明较高的接枝度可能对微胶囊包埋率产生积极影响，这与JIA等[6]的研究结果一致。体外模拟消化实验显示：微胶囊初始的较高释放速率可归因于微胶囊表面或微胶囊网络中弱结合的CUR的释放，随后的缓慢释放阶段可归因于壁材降解导致的CUR释放[25]。在模拟胃液和模拟肠液中，处理组中CUR缓慢持续释放，这一现象是由于美拉德反应制备的共聚物增强了WPI的稳定性并降低了胃蛋白酶对CUR的敏感性，导致CUR释放速率降低和释放量减少[26]。此外，WPI和ADA之间的共价连接导致静电斥力不能充分解离WPI和ADA，但能够使复合结构松散，使胰酶接触并逐渐水解WPI，因此WPI和ADA的糖基化能够延缓模拟肠液中CUR的释放，但不能完全阻止WPI被胰酶消化，从而最终释放CUR[27]。
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在共价相互作用下，WPI-ADA 共聚物能够改善微胶囊的理化性质和姜黄素的释放特性。褐变强度、接枝度、傅里叶红外光谱分析证实了美拉德反应的发生，随着WPI∶ADA质量比从1∶3到3∶1，共聚物的接枝度从15.5%增加到56.1%，并且在美拉德反应过程中有高分子量物质的形成。随着共聚物中ADA比例的增加，乳液粒径从415.4 nm减小到325.9 nm。共聚物制备的乳液表现出假塑性流体的特征，与 Herschel-Bulkley 模型有良好的相关性。WPI-ADA 共聚物微胶囊具有较高的包封率(87.8%~95.4%)，WPI-ADA 共聚物的应用也增强了微胶囊的热稳定性。将微胶囊暴露于模拟胃肠道条件后，姜黄素在模拟胃液和模拟肠液中的释放时间都由12 h延长到24 h。本研究为开发基于蛋白-多糖美拉德产物修饰微胶囊体系和疏水性活性物质的递送提供了参考。
Fabrication and controlled release characteristics of whey protein-alginate dialdehyde microcapsule
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摘要:
目的 以乳清蛋白(WPI)和海藻酸二醛(ADA)为原料制备WPI-ADA共聚物微胶囊，研究WPI和ADA之间的相互作用及对微胶囊中姜黄素控释效果的影响，为开发姜黄素的包埋体系提供理论依据。 方法 采用湿热法制备WPI-ADA共聚物，利用接枝度、褐变程度和红外光谱分析探究WPI和ADA之间的相互作用，研究不同比例共聚物对乳液粒径、电位、流变性、X射线衍射、热重分析等理化特性的影响，以及共聚物对微胶囊中姜黄素的释放特性的影响。 结果 制备微胶囊最佳的WPI和ADA质量比为1∶3。接枝度、褐变强度和傅里叶红外光谱分析证实了共轭物的形成。在共价结合作用的驱动下，WPI-ADA乳液粒径从415.4 nm减小到325.9 nm，微胶囊包埋率从83.9%增加到95.4%。此外，WPI-ADA共聚物微胶囊表现出较好的热稳定性。体外模拟消化实验结果表明，WPI-ADA共聚物微胶囊对姜黄素表现出缓释行为，且在模拟胃液和模拟肠液中达到最大释放量的时间由12 h延长至24 h。 结论 在共价相互作用下，WPI-ADA共聚物能够改善微胶囊的理化性质和姜黄素的释放特性，可用于修饰微胶囊体系和疏水性活性物质的递送。图8表1参27 Abstract:Objective This study used whey protein (WPI) and alginate dialdehyde (ADA) to prepare WPI-ADA copolymer microcapsules, and the interactions between WPI and ADA and their effects on the controlled release of curcumin in the microcapsules were investigated to provide a theoretical basis for the development of the encapsulation system of curcumin. Method WPI-ADA copolymers were prepared using a wet-heat method, and the interaction between WPI and ADA was explored through analysis of grafting degree, browning intensity, and infrared spectroscopy. The effects of different proportions of copolymers on the emulsion were studied in terms of particle size, zeta potential, and rheological properties. The influence of copolymers on microcapsules was investigated using X-ray diffraction, thermogravimetric analysis, and the release characteristics of curcumin. Result The results indicated that the optimum mass ratio of WPI and ADA for preparing microcapsules was 1∶3. Grafting degree, browning intensity and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) analyses confirmed the formation of conjugates. Driven by covalent binding, the particle size of WPI-ADA emulsion decreased from 415.4 nm to 325.9 nm, and the microcapsule encapsulation efficiency increased from 83.9% to 95.4%. Additionally, WPI-ADA copolymer microcapsules exhibited good thermal stability. In vitro simulated digestion experiments demonstrated that WPI-ADA copolymer microcapsules exhibited certain controlled release capabilities, extending the time for maximum curcumin release from 12 hours to 24 hours in simulated gastric fluid and intestinal fluid. Conclusion Under covalent interaction, WPI-ADA copolymers can improve the physicochemical properties and curcumin release properties of microcapsules, and can be used to modify the microcapsule system and the delivery of hydrophobic active substances. [Ch, 8 fig. 1 tab. 27 ref.] -
在遗传转化获得抗性植株时，转化体的抗性筛选是遗传转化能否取得成功的关键步骤。通常在选择培养基中加入合适种类和浓度的筛选剂，使其产生一定的筛选压起到抗性筛选的作用。转化体内选择标记基因的表达产物可对特定筛选剂产生抗性，使转化受体材料继续保持正常的生长发育[1]。目前的研究中，卡那霉素、潮霉素等抗生素被普遍作为筛选剂使用[2-3]。但是由于水稻Oryza sativa胚性愈伤组织对抗生素具有生理抗性，以抗生素为选择标记进行抗性筛选，不能起到很好的筛选效果，且经抗生素筛选后的转化体在分化和再生阶段易受抑制或产生白化苗[4-6]。以草甘膦作为筛选剂可以提高选择的灵敏度，消除转化体生理抗性对筛选结果的影响，克服了以往研究中抗生素筛选的局限性。可遗传的草甘膦抗性基因突变率低，并可在后代中稳定表达，因此进行抗草甘膦作物的培育是可行的[7]。籼稻Oryza sativa subsp. indica和粳稻Oryza sativa subsp. japonica是栽培稻的2个亚种，随着水稻遗传转化技术的发展，大部分粳稻品种已经建立了成熟的遗传转化体系，并成功引入抗虫、抗病、生长发育调控等诸多有利基因[8]。而大多数籼稻品种组培特性不佳，愈伤组织诱导率低，继代过程易褐化且分化再生频率低，导致籼稻的遗传转化效率低，有的品种甚至难以转化。尤其是对生产上广泛推广、农艺性状优良的重要品种而言，其改良与育种进程受到严重限制[9]。CHAN等[10]于1992年尝试利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法转化籼稻幼根愈伤组织，对转化体进行Southern印记杂交，结果表明：目的基因片段已成功转入转化体细胞中。后经酶活性检测，目的基因可在转化体中稳定表达。1994年，HIEI等[11]为建立高效稳定的农杆菌遗传转化体系，采用了“双超元”载体，并通过在菌液添加乙酰丁香酮(As)活化Vir基因提高转化效率等方法，推进了遗传转化技术在籼稻中的研究应用。目前，虽然已有转抗草甘膦基因的籼稻遗传转化体系的报道，但是转化效率低，还未建立一个高效的转化体系[12]。基于此，本研究选取具有成功再生体系的籼稻‘中恢161’ Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’为材料，利用农杆菌介导法，转入草甘膦抗性基因(CP4)，探索适合的草甘膦质量浓度用于抗性筛选，并对农杆菌介导的转化过程进行了合理优化，建立‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。
1. 材料与方法
1.1 材料
籼稻‘中恢161’成熟胚；农杆菌菌株EHA105；含CP4基因的表达载体p1300-HC。
1.2 方法
1.2.1 成熟胚胚性愈伤组织的诱导和增殖
将成熟种子去壳，进行消毒[13]，接种于诱导培养基R1[NB(N6+B5)+3.0 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite]上，接种20 粒·皿−1。放入培养条件为28 ℃，光照16 h/黑暗8 h的组培室中诱导培养。5~7 d后，可观察到幼芽处有淡黄色愈伤组织，统计每皿的出愈数和出愈率。15 d后，剥下色泽鲜黄、结构紧密、生理状态良好的胚性愈伤组织，分散平铺于新鲜配制的胚性愈伤组织增殖培养基R1上进行增殖培养。继代2~4次后，增殖并产生大量的胚性愈伤组织，可用做后期转化的受体材料。
1.2.2 胚性愈伤组织的草甘膦敏感性测试
设置5组草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L−1)，重复3次，设空白对照，接种20块·皿−1。15 d后，观察胚性愈伤组织的色泽、是否增殖等外观形态，统计胚性愈伤组织褐化率，选出合适的草甘膦质量浓度范围作为筛选压。
1.2.3 胚性愈伤组织的遗传转化和抗性筛选
利用悬浮培养基R2(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮)将培养好的含CP4基因表达载体的农杆菌菌株EHA105稀释至D(600)为0.5~0.8，用其侵染胚性愈伤组织[14]。将转化好的胚性愈伤组织用无菌滤纸吸干多余的菌液，适当干燥后，用灭菌镊子夹取愈伤组织分散地平铺在铺有1层无菌滤纸的共培养培养基R3(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮+4.0 g·L−1Gelrite)上，20 块·皿−1。于25 ℃培养室中暗培养2~3 d。取出共培养后的愈伤组织，用含100 mg·L−1羧苄青霉素的无菌蒸馏水清洗3~4次，直至清洗液澄清透明。适度干燥后，用镊子夹取愈伤组织整齐均匀地平铺在筛选培养基R4(NB+3 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite+0.5 g·L−1头孢霉素+不同质量浓度草甘膦)上。抗性筛选培养基中草甘膦质量浓度分别为300、350和400 mg·L−1。
1.2.4 分化、生根、移栽成活
将抗性愈伤组织系移至分化培养基R5(NB+0.5 mg·L−1 NAA+3.0 mg·L−16-BA+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite)上进行分化培养。约15~25 d，部分抗性愈伤组织长出绿点。待绿点进一步分化形成小苗，并长至2 cm左右时将其转移至生根培养基R6(1/2NB+20.0 g·L−1蔗糖+0.1 g·L−1肌醇+8.0 g·L−1琼脂)上生根培养。待幼苗生长出大量的茁壮根系，可将其从生根培养基中取出，小心洗净其根系附着的培养基，置于培养箱中炼苗，增强幼苗对环境的适应性，1周后将健壮的幼苗移至大棚成活。
1.2.5 转基因植株的分子检测和CP4基因试纸条检测蛋白表达
利用TPS法提取转基因植株叶片DNA。利用CP4基因引物(CP4-F: TTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG, CP4-R: TCCTTCATGTTCGGCGGTCTC)进行CP4基因的PCR扩增，目的片段大小为400 bp。扩增后的产物经质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，统计阳性率。取阳性植株叶片，利用CP4基因表达检测试纸条进行再生植株抗性检测。
2. 结果和分析
2.1 草甘膦抗性筛选最适质量浓度
图1和图2所示：‘中恢161’的胚性愈伤组织在不含草甘膦的培养基中可正常生长且大量增殖，未发生褐化现象；在含100 mg·L−1草甘膦的培养基中，绝大多数胚性愈伤组织可正常生长增殖，褐化率低，仅为5.00%，未起到选择作用；在含200 mg·L−1草甘膦的培养基中褐化率为16.67%，选择效果不明显；在含300 mg·L−1草甘膦的培养基中，褐化率为41.67%，且与200 mg·L−1相比差异显著(P＜0.05)，选择效果好，适合作为筛选压；在含400 mg·L−1草甘膦的培养基中，大部分胚性愈伤组织发生褐化，少部分正常生长，褐化率为65.00%，选择效果明显；在含500 mg·L−1草甘膦的培养基中，胚性愈伤组织基本发生褐化，褐化率为91.67%，显著高于其他质量浓度下的褐化率(P＜0.05)，说明选择压过大。结果表明：草甘膦质量浓度为300~400 mg·L−1时，胚性愈伤组织褐化率约50%，具有很好的筛选效果。
图 1 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化率Figure 1 Browning rate of O.sativa subsp.indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days
图 2 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化情况Figure 2 Browning rate of O. sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days2.2 抗性愈伤组织和转基因植株的分子检测
转化后的胚性愈伤组织在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，分别获得200、113、和84块抗性愈伤组织，提取抗性愈伤组织DNA进行CP4基因的PCR检测，阳性愈伤组织的PCR扩增产物经电泳可获得长度为400 bp的条带，与预期相符，表明CP4基因已成功整合到转化体内。进行3个草甘膦质量浓度抗性筛选后愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%。共获得67株再生植株，提取再生植株叶片DNA进行CP4基因的PCR检测。其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%(图3)。
图 3 籼稻‘中恢161’再生植株CP4基因的PCR检测Figure 3 PCR result of CP4 gene from glyphosate-resistance plants2.3 CP4基因试纸条检测蛋白表达
抗性检测结果(图4)表明：检测的43株PCR阳性植株中，有25株表现为CP4基因表达，表达率为58.13%。
2.4 ‘中恢161’成熟胚遗传转化体系的建立
遗传转化再生过程如图5所示：对籼稻‘中恢161’成熟胚进行胚性愈伤组织诱导，约7 d可诱导出胚性愈伤组织(图5A)。胚性愈伤组织进行2~4次继代增殖(图5B)，约40 d后进行遗传转化。转化后的胚性愈伤组织在选择培养基上进行抗性筛选(图5C~D)，一段时间后，抗性愈伤组织系会出现增殖(图5E)。约50 d后，抗性愈伤组织于R5培养基上进行分化培养，约15~25 d，长出绿点(图5F)。1个月左右，长出小苗(图5G)。小心取出转移至R6培养基进行生根培养(图5H)。约15 d，幼苗长出大量的茁壮根系，将其从培养基中移出，小心洗净根部培养基。置于培养箱中炼苗，炼苗1周后可移至大棚成活。对再生植株进行CP4基因的PCR检测，保留阳性植株。从诱导胚性愈伤组织至获得抗草甘膦再生植株的整个过程需要4~6个月。
图 5 CP4基因转化籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织的各个阶段Figure 5 Various stages of transforming CP4 gene into embryogenic callus of O.sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’3. 结论与讨论
3.1 草甘膦抗性筛选及其优势
本研究建立了以草甘膦抗性基因CP4为选择标记的‘中恢161’遗传转化体系。非转化体的EPSPS酶活性较低，草甘膦可与S3P形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体而竞争性抑制EPSPS酶活性，植物体内蛋白质合成受阻，生长受到抑制，不能正常生长分化[15]。而转化体抗草甘膦基因CP4的表达产物EPSPS酶具有高催化活性和低草甘膦亲和力不易与草甘膦结合，故能够进行正常的生长分化。因此，通过草甘膦筛选可获得转抗草甘膦基因CP4的再生植株。相较于以抗生素抗性基因为选择标记，草甘膦抗性基因不仅能作为筛选标记也能作为目的基因，使受体植物获得除草剂抗性，而且草甘膦比潮霉素等抗生素便宜[7]。不同植物细胞对草甘膦的抗性存在差异，选择合适的草甘膦质量浓度作为抗性筛选的筛选压是影响转化效率的关键因素。本研究将转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，进一步分化、成苗，共获得67株再生植株，进行CP4基因的PCR检测，其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%，达到很好的选择效果。
3.2 籼稻遗传转化体系的优化
3.2.1 受体材料的选择及胚性愈伤组织的代龄
能否成功进行遗传转化的重要前提是选择适合的植物材料作为转化受体。水稻幼胚分裂能力强，易形成大量优质胚性愈伤组织，但受季节的影响，水稻幼胚利用不便，且在组织培养过程中易受微生物污染，转化效率不高，因此作为转化体存在一定的困难[16]。成熟胚方便储存与利用，不受季节限制和胚性愈伤组织诱导率较高，通常被作为遗传转化和再生的良好的外源体材料。苏军[17]比较了不同代龄的胚性愈伤组织，发现第4、5代的胚性愈伤组织转化效率较高，并且分化能力也较强。早代愈伤组织不易接受外源遗传物质。但晚代愈伤组织容易出现质地软、水渍化等现象，影响遗传转化成功率。本研究选择胚性愈伤组织代龄为3~4代，可有效减少愈伤组织老化、色泽暗黄、结构松散和褐化率高等问题，有效提高了遗传转化效率。
3.2.2 转化过程的优化
为提高遗传转化效率，本研究采取一系列措施对转化过程进行合理优化。①转化阶段选用色泽鲜黄、外观形态良好、结构紧致的愈伤组织与农杆菌共培养，淘汰外观发白发软发褐的愈伤组织。②在共培养基R2和悬浮培养基R3中加入100 μmol·L−1乙酰丁香酮，可诱导农杆菌Vir基因的活化，从而促进外源基因的整合，极大提高转化效率[18]。③农杆菌菌液经悬浮培养液R3稀释后，D(600)为0.5~0.8。此时为最适菌液浓度，既不会使农杆菌在转化体表面过多繁殖影响其正常生长，又具一定的侵染能力，提高了转化效率。④黑暗条件下共培养2~3 d为适合的共培养时长。共培养时间过短，目的基因不能成功整合至转化体细胞内[19-20]。
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图 1 WPI-ADA共聚物在294、304和420 nm处的吸光度
Figure 1 Absorbance at 294, 304 and 420 nm of WPI-ADA conjugates
图 5 WPI-ADA乳液表观黏度(A)、频率扫描曲线(B)和剪切应力(C)
Figure 5 Apparent viscosity (A), frequency sweeps curves (B) and stress (C) of WPI-ADA emulsions
图 6 CUR、WPI、ADA(A)和WPI-ADA微胶囊(B)的XRD谱图
Figure 6 XRD patterns of CUR, WPI, ADA (A) and WPI-ADA microcapsules (B)
图 7 WPI-ADA微胶囊的TGA曲线(A)和DTG曲线(B)
Figure 7 TGA (A) and DTG curve (B) of WPI-ADA microcapsules
图 8 CUR在模拟胃液(A)和模拟肠液(B)条件下的释放曲线
Figure 8 Release profiles of CUR under simulated gastric fluid (A) and simulated intestinal fluid (B) conditions
表 1 WPI-ADA乳液的粒径、PDI和Zeta电位
Table 1. Particle size, PDI and Zeta Potential of WPI-ADA emulsions
处理 粒径/nm PDI值 Zeta电位/mV ck 415.4 ± 3.0 d 0.356 ± 0.001 d −25.0 ± 0.4 d W3A1 369.4 ± 2.5 c 0.354 ± 0.042 d −39.7 ± 1.4 c W2A1 370.5 ± 4.9 c 0.323 ± 0.004 cd −41.4 ± 1.0 bc W1A1 366.7 ± 4.3 c 0.286 ± 0.022 bc −42.1 ± 0.0 abc W1A2 335.1 ± 0.8 b 0.258 ± 0.014 ab −43.9 ± 1.2 ab W1A3 325.9 ± 2.0 a 0.215 ± 0.009 a −44.2 ± 0.9 a 说明：不同小写字母表示同一指标不同处理间差异显著(P＜0.05)。 
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20240243
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