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昆虫在生长发育过程中，体内许多酶发挥着重要作用，如昆虫中肠上皮细胞能形成和分泌消化酶，将食物中的糖类、蛋白质和脂肪等营养物质消化分解成小分子物质供生长发育需要[1−3]。乳酸脱氢酶(LDH)是参与糖酵解的重要酶类，可将丙酮酸催化成乳酸并释放腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，从而完成葡萄糖的酵解过程。丙酮酸激酶(PK)可调节细胞中腺嘌呤核苷三磷酸、腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)和糖酵解的中间产物，对糖酵解速率的控制起关键作用[4]。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)是昆虫体内重要的保护酶，SOD能够清除超氧阴离子自由基(${\mathrm{O}}_2^{\;\cdot -} $)，形成过氧化氢( H2O2 )，而过氧化物酶、过氧化氢酶又具有分解H2O2的作用。在这3种酶的共同作用下，细胞内的自由基维持较低水平，保护昆虫不受伤害[5−6]。羧酸酯酶(CarE)、酸性磷酸酶(ACP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是昆虫体内重要的解毒酶，能分解代谢农药、植物次生代谢产物等外源毒物，维持昆虫正常生理生化活动[7−9]。
昆虫是变温动物，温度的变化能直接影响其体内酶的活性[10]，如在不同温度处理下，桃小食心虫Carposina niponensis体内超氧化物歧化酶活性差异均达到显著水平，在22 ℃时活性最低，28 ℃时活性达最高，34 ℃时活性急剧下降。过氧化物酶和过氧化氢酶活性均低于超氧化物歧化酶活性，整体呈先上升后下降趋势，在28 ℃时活性最高[11]。经过34、36、38 ℃高温处理后，褐飞虱Nilaparvata lugens若虫体内过氧化氢酶活性有随温度升高而升高的趋势，但以36 ℃处理影响最大，高于36 ℃则过氧化氢酶活性受抑制；若虫体内超氧化物歧化酶活性明显高于对照，超氧化物歧化酶活性随温度升高而缓慢上升[12]。酶活性的高低决定了昆虫生理代谢能力的强弱，从而对昆虫发生数量和消长动态产生重要影响[13−15]。研究环境温度对昆虫酶活性的影响，可以为深入探讨昆虫与环境适应性的生理生化机制提供参考。
金银花尺蠖Heterolocha jinyinhuaphaga属鳞翅目Lepidoptera尺蛾科Geometridae昆虫，别名拱腰虫，是金银花Lonicera japonica主要食叶害虫之一，常将金银花叶片咬成缺刻或孔洞，受害严重的地块金银花叶片被全部吃光，常造成金银花的大面积减产，甚至成片死亡，给金银花生产带来严重损失[16−20]。笔者在前期研究了温度对金银花尺蠖幼虫消化酶活性的影响[21]，在此基础上继续研究温度对金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾、雄蛾体内乳酸脱氢酶、过氧化物酶、羧酸酯酶、酸性磷酸酶活性的影响，分析金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾、雄蛾对不同环境温度的生理生化适应性，为深入研究金银花尺蠖对环境适应性的生理生化机制提供科学依据。
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金银花尺蠖幼虫采集于安徽省明光市三界镇，在人工气候箱(RXZ-288A型)中用新鲜的金银花叶片饲养。人工气候箱的光周期设置为白天14 h∶黑暗10 h，温度设置为(25±1) ℃，相对湿度设置为70%±7%。
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前期研究表明：25 ℃左右是金银花尺蠖取食的最适温度[22]。试验设16、19、22、25、28、31、34 ℃等7个恒温处理，光照周期设置为白天14 h∶黑暗10 h，相对湿度设置为70%。取刚孵化第1天的金银花尺蠖幼虫，单头放在各个罐头瓶中，并放入新鲜金银花叶片(用湿棉花包裹叶片基部以保持叶片新鲜，待叶片不新鲜时更换叶片)，用纱布罩住瓶口并用橡皮筋扎紧，定期观察，记载各虫态出现的时间，一直饲养到成虫阶段。成虫羽化后，喂质量分数为10%的蔗糖水。每个温度下1次饲养50头幼虫，试验重复6次。
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每处理挑取大小一致的金银花尺蠖5龄幼虫、蛹(化蛹7 d)、雌蛾(羽化3 d)、雄蛾(羽化3 d)各10头，雌蛾、雄蛾剪去翅膀及附肢。用去离子水将虫体洗干净，滤纸擦干，冰浴中加入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS) 5 mL，迅速研磨成匀浆，离心15 min (−4 ℃，12 000 r·min−1)，取上清液作酶液。制备乳酸脱氢酶、过氧化物酶、羧酸酯酶、酸性磷酸酶所用的磷酸盐缓冲液浓度分别为0.1 mmol·L−1、0.2 mmol·L−1、0.1 mol·L−1、0.1 mol·L−1，pH分别为7.5、7.0、7.6、7.0。以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白，采用考马斯亮蓝G-250染色法测定样品中酶蛋白质量。
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采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶活性。在代谢中磷酸烯醇式丙酮酸和腺嘌呤核苷二磷酸生成腺嘌呤核苷三磷酸和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、丙酮酸生成乳酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)[23]。由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在340 nm处有最大吸收峰值，添加一定量的酶液，观察还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应过程中340 nm处吸光度值减少量，下降越多表明乳酸脱氢酶的活性越高。因此，将乳酸脱氢酶与丙酮酸以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸反应后，测340 nm处的吸光度[D(340)]变化，便可得到该酶的酶活性。在25 ℃，pH 7.5条件下，以吸光度降低值[ΔD(340) min−1]下降为1的酶量为1个单位。通过定量测定酶蛋白质量计算酶活性(×16.67 μkat·g−1)。
将丙酮酸溶液(2.5 mg丙酮酸用29 mL 磷酸盐缓冲液溶解)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸液(3.5 mg 纯还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸用1 mL 磷酸盐缓冲液溶解)放在25 ℃水浴锅中进行预热。取1只比色皿，加入3 mL磷酸盐缓冲液 (0.1 mol·L−1，pH 7.5)，置于分光光度计中作对照；另取1只比色皿，加入2.9 mL丙酮酸溶液和0.1 mL还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液，混匀后测吸光度，再迅速加入稀释20倍的酶液10 μL，开始计时，每30 s记录1次数据，持续测定3 min。用吸光度值对时间制作线性反应图，计算吸光度降低值(ΔD(340) min−1)。每个处理重复6次，根据下列公式计算乳酸脱氢酶活性：乳酸脱氢酶活性(×16.67 μkat·g−1)＝{[ΔD(340) min−1×稀释倍数] / [加入的酶量(10 μL)×10−3]}。
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采用愈创木酚比色法测定过氧化物酶活性[9]。在试管中加入1 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mmol·L−1，pH 7.0)，1 mL过氧化氢(H2O2，质量分数为30%)，0.9 mL愈创木酚(30 mmol·L−1)和0.1 mL酶溶液，让混合物反应5 min后，在470 nm波长下测定吸光度[D(470)]。对照组加入等量的蒸馏水代替酶溶液。每个处理重复6次。将1 mg酶引起的每分钟D(470)变化定义为1个酶活性单位(16.67 nkat)，酶活性单位为16.67 μkat·g−1。过氧化物酶活性按以下公式计算：过氧化物酶活性(16.67 μkat·g−1) = ΔD(470)/ [t×W×(V0/V)]。其中：ΔD(470)是吸光度随反应时间的变化，t是反应时间(min)，V是酶溶液体积(mL)，V0是反应混合物体积(mL)，W是酶溶液中的蛋白质质量浓度(g·L−1)。
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采用紫外分光光度法测定羧酸酯酶活性[24]。将10 μL酶液、400 μL α-乙酸萘酯(300 μmol·L−1)、30 μL毒扁豆碱(10 μmol·L−1)和560 μL 磷酸盐缓冲液(0.1 mol·L−1，pH 7.6)置于试管中。用振荡器振荡(30 ℃) 30 min后，在反应混合物中加入100 μL显色剂(质量分数为1%的固蓝B盐∶质量分数为5%的十二烷基硫酸钠溶液= 2∶5)以终止反应。15 min后在600 nm波长下测定反应混合物的吸光度[D(600)]。建立α-萘酚的标准曲线，用于计算产量。每分钟1 mg酶催化1 μmol的产物被定义为1个酶活性单位(16.67 nkat) ，酶活性单位为16.67 μkat·g−1。对照组加入等量的蒸馏水代替酶溶液。每个处理重复6次。羧酸酯酶活性按照以下公式计算：羧酸酯酶活性(16.67 μkat·g−1)= P/[t×W×(V0/V)][24] ，其中：P为产物量(μmol)，t为反应时间(min)，V为酶液体积(mL)，V0为反应混合物体积(mL)，W为酶溶液中蛋白质质量浓度(g·L−1)。
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用50 μL酶液测定酸性磷酸酶活性。方法按试剂盒说明书(苏州康明生物技术有限公司)。酶活性单位(16.67 nkat)定义为：在37 ℃下，每分钟1 mg蛋白质催化1 μmol苯酚生成的产物。酶活性单位为16.67 μkat·g−1。每个处理重复6次。
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采用SPSS 23软件进行方差分析，采用Duncan氏新复极差法在0.05水平上进行差异显著性检验。
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不同温度下金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾的乳酸脱氢酶活性均不相同(图1)。温度为16 ℃时乳酸脱氢酶活性分别为12.88×16.67、10.37×16.67、14.47×16.67和13.09×16.67 μkat·g−1。当温度为16~34 ℃时，随着温度的升高，乳酸脱氢酶活性不断上升，在22 ℃时最高，分别为17.93×16.67、15.25×16.67、19.63×16.67和18.81×16.67 μkat·g−1，比16 ℃增加了39.21%、47.06%、35.66%和43.70%。温度进一步升高，乳酸脱氢酶活性则开始下降，34 ℃时下降到最低，为9.87×16.67、8.26×16.67、12.52×16.67和10.66×16.67 μkat·g−1。在幼虫中，除19和25 ℃外，22 ℃时的乳酸脱氢酶活性与其他温度相比差异显著(F6,14=7.807，P=0.001)；除19和25 ℃外，蛹在22 ℃时的乳酸脱氢酶活性与其他温度相比差异显著(F6,14=7.96，P=0.001)；除25 ℃外，雌蛾在22 ℃时的乳酸脱氢酶活性与其他温度相比差异显著(F6,14=6.18，P=0.002)；雄蛾在22 ℃时的乳酸脱氢酶活性与其他温度相比差异显著(F6,14=10.338，P＜0.001)。
图 1 金银花尺蠖乳酸脱氢酶活性随温度的变化
Figure 1. LDH activity changes of H. jinyinhuaphaga with temperature
在相同温度下，金银花尺蠖雌蛾的乳酸脱氢酶活性最高，其次是雄蛾，然后是幼虫，蛹最低。16 ℃ (F3,8 =4.128，P=0.048)、19 ℃ (F3,8 =2.256，P=0.039)、22 ℃ (F3,8 =2.537，P=0.032)和25 ℃ (F3,8 =2.407，P=0.043)时，雌蛾的乳酸脱氢酶活性与蛹的差异达显著水平，与幼虫和雄蛾差异不显著。28 ℃(F3,8 =5.286，P=0.027)和34 ℃(F3,8 =7.244，P=0.011)时，雌蛾的乳酸脱氢酶活性与幼虫和蛹差异显著，与雄蛾差异不显著。31 ℃时，雌蛾的乳酸脱氢酶活性与幼虫、蛹和雄蛾差异显著(F3,8 =12.223，P=0.002)。
方差分析表明：温度、虫态对金银花尺蠖的乳酸脱氢酶活性均有显著影响(P＜0.001)，但温度和虫态的交互作用对金银花尺蠖的乳酸脱氢酶活性没有显著影响。
对不同温度下金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾的乳酸脱氢酶活性的变化趋势进行回归分析，得出乳酸脱氢酶活性与温度的回归模型分别为：y1= 0.004 9x3−0.420 2 x2 +11.263 0x−80.093 0 (R2=0.911 5)，y2= 0.005 1x3−0.441 2x2 + 11.886 0x−88.184 0 (R2 = 0.968 8)，y3= 0.003 3x3−0.302 0x2 + 8.550 0x−58.898 0 (R2 =0.884 2 )，y4= 0.005 6x3−0.478 5x2 + 12.823 0x−92. 872 0 (R2 = 0.917 0 )， y1、y2、y3、y4分别为金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾体内乳酸脱氢酶活性，x为温度。对模型进行计算，得出金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾的乳酸脱氢酶活性最高的最适温度分别为21.45、21.44、22.32和21.56 ℃。
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不同温度下金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾的过氧化物酶活性均不相同(图2)。16 ℃时过氧化物酶活性最低，分别为27.31×16.67、24.62×16.67、30.49×16.67和29.59×16.67 μkat·g−1。温度为16~34 ℃时，随着温度的升高，过氧化物酶活性呈先上升后下降的趋势，在25 ℃时最高，分别为34.63×16.67、31.83×16.67、37.19×16.67和36.87×16.67 μkat·g−1，比16 ℃时增加了26.80%、29.29%、12.68%和24.60%。之后，过氧化物酶活性逐渐下降，34 ℃时下降为28.53×16.67、25.58×16.67、31.62×16.67和30.51×16.67 μkat·g−1。 除28 ℃外，幼虫在25 ℃时的过氧化物酶活性与其他温度相比差异显著(F6,14=7.336，P=0.001)；除22和28 ℃外，蛹(F6,14=8.339，P=0.001)、雌蛾(F6,14=6.996，P=0.001)和雄蛾(F6,14=12.456，P＜0.001)在25 ℃时的过氧化物酶活性与其他温度相比差异显著。
图 2 金银花尺蠖过氧化物酶活性随温度的变化
Figure 2. POD activity change of H. jinyinhuaphaga with temperature
在相同温度下，金银花尺蠖雌蛾的过氧化物酶活性最高，其次是雄蛾，然后是幼虫，蛹最低。16 ℃(F3,8 =9.392，P=0.005)、19 ℃ (F3,8 =6.914，P=0.013)、22 ℃ (F3,8 =12.877，P=0.002)和34 ℃ (F3,8 =11.565，P=0.003)时，雌蛾的过氧化物酶活性与幼虫和蛹差异达显著水平，与雄蛾差异不显著。25 ℃ (F3,8 =9.962，P=0.004)和28 ℃ (F3,8 =3.358，P=0.046)时，雌蛾的过氧化物酶活性与蛹差异显著，与幼虫和雄蛾差异不显著。31 ℃时，雌蛾的过氧化物酶活性与幼虫和蛹差异显著(F3,8 =7.301，P=0.011)，与雄蛾差异不显著。
方差分析表明：温度、虫态对金银花尺蠖的过氧化物酶活性均有显著影响(P＜0.001)，但温度和虫态的交互作用对金银花尺蠖的过氧化物酶活性没有显著影响。
对不同温度下金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾的过氧化物酶活性的变化趋势进行回归分析，得出过氧化物酶活性与温度的回归模型分别为：y1=−0.001 1x3 + 0.018 8x2 +1.360 7x+5.033 1 (R2= 0.875 1)，y2=−0.001 2x3+ 0.013 5x2 + 1.707 1x−1.454 7 (R2 = 0.970 4)，y3=−0.000 3x3−0.044 2x2 + 2.901 1x−3.728 5 (R2 = 0.917 0)，y4 =−0.000 3x3−0.049 5x2 + 3.133 4x−7.085 0 (R2 = 0.892 0)，y1、y2、y3、y4分别为金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾体内过氧化物酶活性，x为温度。对模型进行计算，得出金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾的过氧化物酶活性最高的最适温度分别为26.16、25.94、25.67和25.54 ℃。
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不同温度下金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾羧酸酯酶活性均不相同(图3)。温度为16℃时最低，羧酸酯酶活性分别为18.64×16.67、15.93×16.67、20.48×16.67和19.42×16.67 μkat·g−1。温度为16~34 ℃时，羧酸酯酶活性呈先上升后下降的趋势，28 ℃时最高，分别为26.78×16.67、23.36×16.67、29.44×16.67和28.32×16.67 μkat·g−1，比16 ℃增加了43.67%、46.64%、43.75%和45.83%。之后，羧酸酯酶活性开始下降，34 ℃下降为23.39×16.67、 20.88×16.67、 25.37×16.67和24.11×16.67 μkat·g−1。 除25和31 ℃外，幼虫(F6,14=11.407，P＜0.001)和雌蛾(F6,14=9.11，P＜0.001)在28 ℃时的羧酸酯酶活性与其他温度相比差异显著；除25、31和34 ℃外，蛹在28 ℃时的羧酸酯酶活性与其他温度相比差异显著(F6,14=7.397，P=0.001)；除25 ℃外，雄蛾在28 ℃时的羧酸酯酶活性与其他温度相比差异显著(F6,14=6.93，P＜0.001)。
图 3 金银花尺蠖羧酸酯酶活性随温度的变化
Figure 3. CarE activity change of H. jinyinhuaphaga with temperature
在相同温度下，金银花尺蠖雌蛾的羧酸酯酶活性最高，其次是雄蛾，然后是幼虫，蛹最低。16 ℃(F3,8 =4.908，P=0.032)、19 ℃(F3,8 =4.713，P=0.035)、22 ℃(F3,8 =5.981，P=0.019)、25 ℃(F3,8 =7.884，P=0.009)、28 ℃(F3,8 =8.581，P=0.007)、31 ℃(F3,8 =6.842，P=0.013)和34 ℃(F3,8 =3.881，P=0.046)时，雌蛾的羧酸酯酶活性与蛹的差异达显著水平，与幼虫和雄蛾差异不显著。
方差分析表明：温度、虫态对金银花尺蠖的羧酸酯酶活性均有显著影响(P＜0.001)，但温度和虫态的交互作用对金银花尺蠖的羧酸酯酶活性没有显著影响。
对不同温度下金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾的羧酸酯酶活性的变化趋势进行回归分析，得出羧酸酯酶活性与温度的回归模型分别为：y1=−0.125 8x3 +1.096 2x2−0.830 8x+18.516 0 (R2=0.978 8)，y2=−0.094 7x3+ 0.826 0x2−0.417 2x+ 15.646 0 (R2 = 0.953 5)，y3=−0.125 8x3 +1.031 4x2−0.308 5x+ 19.816 0 (R2 =0.951 8 )，y4=−0.136 4x3−1.151 9x2−0.703 1x+18.957 0 (R2 = 0.942 7)，y1、y2、y3、y4分别为金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾体内羧酸酯酶活性，x为温度。对模型进行计算，得出金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾的羧酸酯酶活性最高的最适温度分别为29.20、29.65、28.93和28.92 ℃。
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不同温度下金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾的酸性磷酸酶活性均不相同(图4)。温度为16℃时酸性磷酸酶活性分别为6.57×16.67、3.46×16.67、9.56×16.67和8.45×16.67 μkat·g−1。温度为16~34 ℃时，酸性磷酸酶活性随着温度的升高呈先上升后下降的趋势，在25 ℃时最高，分别为13.82×16.67、11.37×16.67、15.43×16.67和14.38×16.67 μkat·g−1，比16 ℃增加了110.35%、228.61%、61.40%和70.18%。之后，酸性磷酸酶活性开始下降，34 ℃下降为7.13×16.67、5.54×16.67、9.39×16.67和7.57×16.67 μkat·g−1。在幼虫(F6,14=11.404，P＜0.001)和蛹(F6,14=17.869，P＜0.001)中，25 ℃时的酸性磷酸酶活性与其他温度相比差异显著；除22和28 ℃外，雌蛾(F6,14=8.989，P＜0.001)和雄蛾(F6,14=9.749，P＜0.001)在25℃时的酸性磷酸酶活性与其他温度相比差异显著。
图 4 金银花尺蠖酸性磷酸酶活性随温度的变化
Figure 4. ACP activity change of H. jinyinhuaphaga with temperature
在相同温度下，金银花尺蠖雌蛾的酸性磷酸酶活性最高，其次是雄蛾，然后是幼虫，蛹最低。16 ℃(F3,8 =16.284，P=0.001)、19 ℃(F3,8 =14.893，P=0.001)、28 ℃(F3,8 =5.641，P=0.023)和31 ℃(F3,8 =7.329，P=0.011)时，雌蛾的酸性磷酸酶活性与幼虫和蛹的差异达显著水平，与雄蛾差异不显著。22 ℃(F3,8 =7.668，P=0.01)、25 ℃(F3,8 =5.7，P=0.022)和34 ℃(F3,8 =3.815，P=0.048)时，雌蛾的酸性磷酸酶活性与蛹的差异达显著，与幼虫和雄蛾差异不显著。
方差分析表明：温度、虫态对金银花尺蠖的酸性磷酸酶活性均有显著影响(P＜0.001)，但温度和虫态的交互作用对金银花尺蠖的酸性磷酸酶活性没有显著影响。
对不同温度下金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾的酸性磷酸酶活性的变化趋势进行回归分析，得出酸性磷酸酶活性与温度的回归模型分别为：y1=0.007 8x3−0.743 8x2 +5.600 6x+1.208 6 (R2 = 0.867 8 )，y2 =−0.027 8x3−0.295 2x2 + 4.294 7x−0.941 4 (R2 = 0.888 1 )，y3 =0.002 2x3−0.588 1x2 + 4.547 5x+ 5.292 9 (R2 = 0.909 6)，y4 =−0.026 4x3−0.287 7x2 + 3.665 1x+ 4.860 0 (R2 = 0.937 0)， y1、y2、y3、y4分别为金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾体内酸性磷酸酶活性，x为温度。对模型进行计算，得出金银花尺蠖幼虫、蛹和雌蛾和雄蛾的酸性磷酸酶活性最高的最适温度分别为25.05、26.39、24.86和25.24 ℃。
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温度是影响昆虫生理代谢过程的重要环境因子，温度的变化能直接影响昆虫体内酶的活性，从而引起体内一系列生理变化。不同温度下金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾体内乳酸脱氢酶、过氧化物酶、羧酸酯酶和酸性磷酸酶的活性均不一样，温度为16~34 ℃时，这4种酶活性均随着温度的升高表现为先上升后下降的趋势。乳酸脱氢酶活性在22 ℃时最高，34 ℃时最低；过氧化物酶活性在25 ℃时最高，16 ℃最低；羧酸酯酶活性在28 ℃时最高，16 ℃时最低；酸性磷酸酶活性在25 ℃时最高，幼虫和蛹在16 ℃时最低，雌蛾和雄蛾在34 ℃时最低，说明这4种酶对温度的敏感性不同。其他昆虫也类似，如中华真地鳖Eupolyphaga sinensis体内的过氧化物酶活性在30 ℃时最高，在34 ℃时最低[25]；桃小食心虫体内，过氧化物酶活性在28 ℃时最高，在34 ℃时最低[11]。但星豹蛛Pardosa astrigera雌成蛛、雄成蛛体内过氧化物酶活性在5 ℃时最低，30 ℃以下随温度的升高变化平缓，且在20 ℃时略有下降，而在35 ℃时急剧升高，均达最大值[26]，表明不同生物体内过氧化物酶活性受温度的影响存在差异。
糖酵解途径是昆虫体内重要的能量代谢途径，可以产生大量丙酮酸和少量的腺嘌呤核苷三磷酸，乳酸脱氢酶可催化丙酮酸生成乳酸并释放腺嘌呤核苷三磷酸，从而完成葡萄糖的酵解过程。25 ℃时乳酸脱氢酶活性最高，说明金银花尺蠖在此温度下糖代谢途径速率高，有利于生长发育。过氧化物酶是保护酶，25 ℃时过氧化物酶活性最高，说明金银花尺蠖在此温度下分解H2O2的能力强，保护自身免受氧化伤害。羧酸酯酶和酸性磷酸酶是解毒酶，28 ℃时羧酸酯酶活性最高，25 ℃时酸性磷酸酶活性最高，说明此时金银花尺蠖解毒能力最强，能够清除大量的外源毒物。这与金银花尺蠖的生长气候条件相吻合。金银花在春季和夏初季节生长迅速，尤其在夏季多雨期，而金银花尺蠖体内这些酶活性恰好在22~28 ℃时最高，有利于糖代谢的进行和对外源毒物的清除，加速生长发育，导致其大发生。在夏末高温天气，这些酶活性下降，金银花尺蠖的代谢减弱，生长发育受阻，虫口数量下降。到10月，环境温度下降，低于适宜温度，这些酶活性又开始下降，金银花尺蠖的代谢减弱，开始以蛹越冬。
在同一温度下，金银花尺蠖雌蛾体内的乳酸脱氢酶、过氧化物酶、羧酸酯酶和酸性磷酸酶活性最高，蛹体内这4种酶活性最低。这可能是雌蛾除了完成生长发育外，还要承担产卵和繁殖后代的任务，代谢旺盛，需要更高的酶活性，而金银花尺蠖以蛹越冬，蛹的生存环境相对稳定，耗能少，代谢弱，酶的活性也就最低。
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本研究设置7个不同温度(16、19、22、25、28、31和34℃)，测定了金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾在不同温度下乳酸脱氢酶、过氧化物酶、羧酸酯酶和酸性磷酸酶的活性。结果表明：温度能影响金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾提体内乳酸脱氢酶、过氧化物酶、羧酸酯酶和酸性磷酸酶的活性。
Effect of temperature on the activity of four enzymes in Heterolocha jinyinhuaphaga
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摘要:
目的 探究温度对金银花尺蠖Heterolocha jinyinhuaphaga体内酶活性的影响。 方法 试验用金银花尺蠖采自安徽省滁州市三界镇，于室内饲养，试验的光周期为白天14 h∶黑暗10 h，相对湿度为70%。测定了金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾在不同温度(16、19、22、25、28、31和34 ℃)下乳酸脱氢酶、过氧化物酶、羧酸酯酶和酸性磷酸酶的活性。 结果 不同温度下金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾体内的4种酶活性均存在差异，在16~34 ℃，4种酶活性均随着温度的升高表现为先上升后下降的趋势。幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾体内的乳酸脱氢酶活性在22 ℃最高，分别为17.93×16.67、15.25×16.67、19.63×16.67和18.81×16.67 μkat·g−1；过氧化物酶活性在25 ℃最高，分别为34.63×16.67、31.83×16.67、37.19×16.67和36.87×16.67 μkat·g−1；羧酸酯酶活性在28 ℃最高，分别为26.78×16.67、23.36×16.67、29.44×16.67和28.32×16.67 μkat·g−1；酸性磷酸酶活性在25℃最高，分别为13.82×16.67、11.37×16.67、15.43×16.67和14.38×16.67 μkat·g−1。根据回归模型，得出金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾的乳酸脱氢酶活性最高的最适温度分别为21.45、21.44、22.32和21.56 ℃，过氧化物酶活性最高的最适温度分别为26.16、25.94、25.67和25.54 ℃，羧酸酯酶活性最高的最适温度分别为29.20、29.65、28.93和28.92 ℃，酸性磷酸酶活性最高的最适温度分别为25.05、26.39、24.86和25.24 ℃。方差分析表明：温度和虫态的交互作用对金银花尺蠖4种酶活性没有显著影响。 结论 温度能影响金银花尺蠖幼虫、蛹、雌蛾和雄蛾体内乳酸脱氢酶、过氧化物酶、羧酸酯酶和酸性磷酸酶的活性。图4参26 Abstract:Objective The objective is to investigate the effect of temperature on enzyme activity in Heterolocha jinyinhuaphaga. Method The experimental insects were collected from Sanjie Town, Chuzhou City in Anhui Province and reared in a laboratory. The photoperiod was 14 h of daylight and 10 h of darkness, and the relative humidity was 70%. The activity of lactate dehydrogenase (LDH), peroxidase (POD), carboxylesterase (CarE) and acid phosphate (ACP) was measured in larvae, pupae, female and male moths of H. jinyinhuaphaga at different temperatures (16, 19, 22, 25, 28, 31, and 34 ℃). Result There were differences in the activity of four enzymes in larvae, pupae, female and male moths of H. jinyinhuaphaga at different temperatures. At 16−34 ℃, the activity of the four enzymes increased first, and then decreased with increasing temperature. LDH activity in larvae, pupae, female, and male moths was the highest at 22 ℃ (17.93×16.67, 15.25×16.67, 19.63×16.67 , and 18.81×16.67 μkat·g−1, respectively), POD activity was the highest at 25 ℃ (34.63×16.67, 31.83×16.67, 37.19×16.67, and 36.87×16.67 μkat·g−1, respectively), CarE activity was the highest at 28 ℃ (26.78×16.67, 23.36×16.67, 29.44×16.67, and 28.32×16.67 μkat·g−1, respectively), ACP activity was the highest at 25 ℃ (13.82×16.67, 11.37×16.67, 15.43×16.67, and 14.38×16.67 μkat·g−1, respectively). According to the established regression model, the optimal temperatures for the highest LDH activity in larvae, pupae, female, and male moths were found to be 21.45, 21.44, 22.32 and 21.56 ℃, respectively, the optimal temperatures for the highest POD activity were 26.16, 25.94, 25.67and 25.54 ℃, respectively, the optimal temperatures for the highest CarE activity were 29.20, 29.65, 28.93 and 28.92 ℃, respectively, the optimal temperatures for the highest ACP activity were 25.05, 26.39, 24.86 and 25.24 ℃, respectively. Two-way ANOVA showed that the interaction between temperature and insect stage had no significant effect on the activity of four enzymes. Conclusion Temperature can affect the activity of LDH, POD, CarE and ACP in larvae, pupae, female and male moths of H. jinyinhuaphaga. [Ch, 4 fig. 26 ref.] -
Key words:
- Heterolocha jinyinhuaphaga /
- temperature /
- enzyme activity
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近年来，人类对土地和矿物资源的过度开发利用以及对农药和化肥的不合理使用，破坏了原生态土壤[1-2]，引起了土壤质量严重下降，甚至导致了土壤污染，其中重金属是土壤污染的主要来源之一[3]。农田中土壤重金属具有潜伏性强、难去除、毒害性高等特点，不仅可以通过积累影响土壤和农产品质量，阻碍植物生长，还可以通过食物链被人体吸收，威胁人体健康[1, 4]。果园土壤作为生产果品的载体，其中有毒有害重金属不仅会对树体生长和果实产量产生影响，而且会影响果品质量安全并带来生态风险。
麦尔哈巴·图尔贡等[5]研究发现：镉是吐鲁番盆地葡萄Vitis vinifera种植园土壤中污染水平及生态风险级别最高的重金属，而且受不合理施肥影响最大。王敏等[6]研究认为：早期铜矿开采以及长期过度施肥，特别是磷肥和有机肥的过度施用是香榧Torreya grandis‘Merrillii’多种重金属超标的重要原因。潜在生态风险评价表明：浙江省会稽山脉附近的香榧集中种植区土壤整体处于轻度危害状态，其中以镉的潜在风险最大[6]。ZINICOVSCAIA等[7]研究摩尔多瓦苹果Malus pumila种植园土壤中37种元素的富集情况，并通过计算富集因子、污染因子、地累积指数和污染负荷指数等评价重金属元素对土壤污染的生态风险，发现矿区土壤中的砷等处于严重超标状态，而且具有较高的潜在生态风险等级。DONG等[8]对白水县苹果种植园土壤中8种重金属元素进行测定，并采用单因素污染指数、内梅罗综合指数和潜在生态风险指数等方法评价土壤重金属存在的潜在风险，发现随着经营年限的增加，苹果园土壤中镍、铜、砷和汞的含量逐渐升高，表明人工干预促进了土壤重金属的积累，存在严重的生态风险性。YAN等[9]以重庆市黔江地区5个猕猴桃Actinidia chinensis品种为研究对象，测定了土壤和果实中8中重金属元素的含量，结果发现：猕猴桃种植园重金属从岩石向土壤，从土壤向果实迁移显著，其中锌和铬是果实中超标较严重的元素，存在中等潜在生态风险。由此可知：果园土壤重金属污染来源多样，危害极大，不仅是人类目前面临的重要环境问题之一，而且对食品安全具有极大威胁[10]。
柿Diospyros kaki适应性强，分布范围广，为中国重要的传统木本粮食树种，也是国家目前重点支持的特色经济林树种之一[11]。河南省柿栽培历史悠久，是中国柿主产区之一，柿产量长期位居中国前3位。位于太行山区的济源市、安阳市和三门峡市是河南省柿的主产区，占据该省总产量的72.0%，已成为当地农村经济发展和农民增收的支柱之一。但果农在生产中，为了追求产量，过度使用化肥和农药，引起土壤质量明显退化。另外，济源市、安阳市和三门峡市均为重要的矿产区，农业生产和矿产开采提高了土壤重金属污染风险，对柿产品带来潜在安全隐患和生态安全风险[12]。为探讨河南省柿主产区土壤重金属污染情况及生态风险，本研究调查了河南省柿主产区代表性果园土壤样品，测定其中砷、镉、铬、铜、铅和汞等6种重金属元素的质量分数；采用污染负荷指数、潜在生态风险指数和生态风险预警指数法，对柿园土壤重金属来源及潜在生态风险进行评估，以期为河南省柿主产区土壤环境安全评价和重金属污染防治提供科学依据，为其他柿产区土壤重金属研究提供参考。
1. 材料和方法
1.1 研究区域概况
研究区域属于豫西北的太行低山丘陵地区(33°31′~36°21′N，110°21′~114°59′E)，平均海拔为705.0 m。该区气候属暖温带季风性大陆气候，光热资源较丰富，年平均气温为14.1 ℃，年平均日照时数为2 370.0 h，年平均降水量为600 mm，年平均蒸发量为1700 mm，无霜期为200 d，年辐射总量为518 kJ·cm−2。山体以沉积岩为主，土壤以褐土为主，pH 7.0~8.5。
1.2 样品采集与检测
2020年11月柿果采收后，在济源、安阳和三门峡等3个河南省柿主产区，选取正常经营、果树病虫害较轻、果品质量上乘的果园90个(每个产区30个)。在每个果园中间位置设置1个25 m×25 m的样地，并在样地内按照“对角线五点采样法”采集200 g土样，采样深度为0~20 cm。将采集的样品装入清洁自封袋，记录采样点的立地条件、土壤情况、农户施药和施肥管理情况等[13]。
土样在室内常温下风干，拣出杂物，磨碎并充分混合，过100目尼龙筛后用于检测土壤样品中的砷、汞、镉、铬、铜与铅的质量分数及土壤pH[14]。测试过程中加入国家标准土壤参比物质(GSS-12)进行质量控制，各重金属的回收率均在国家标准参比物质的允许范围内[1]。各个参数以每个果园5个点的平均值代表该果园的表征值。
1.3 土壤重金属污染及生态风险评价方法
以河南省太行山果树种植园土壤重金属的背景值(重金属砷、汞、铅、镉、铬、铜的背景值分别为7.79、0.049、19.60、0.374、63.80、19.70 mg·kg−1，以下简称“背景值”)为评价依据[15]，采用单因子污染指数(contamination factor，CF)和污染负荷指数(pollution load index，IPL)对柿园土壤重金属进行污染评价[16]。以GB 15618—2018《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准(试行)》中的国家农用地土壤污染风险筛选值[重金属砷、汞、铅、镉、铬、铜污染风险筛选值(pH＞7.5)分别为25.00、3.400、170.00、0.600、250.00、100.00 mg·kg−1，简称“筛选值”]为评价依据[14]，采用综合潜在生态风险指数(potential ecological risk index，IR)评价土壤重金属污染的潜在生态风险，并采用生态风险预警指数(ecological risk warning index，IER)对土壤生态风险进行预警评估[1, 3, 13]，其中砷、汞、铅、镉、铬、铜的毒性系数分别为10.0、40.0、5.0、30.0、2.0和5.0，潜在生态风险指数分级标准[17]见表1。
表 1 土壤重金属污染评价指标及其分级标准Table 1 Evaluation indexes and grading standards of soil heavy metal pollutionCF IPL 污染等级 E IR 风险等级 IER 预警等级 (0, 1] (0, 1] 无 (0, 40] (0, 150] 轻微 (−∞, 0] 无需 (1, 2] (1, 2] 轻度 (40, 80] (150, 300] 中等 (0, 1] 预警 (2, 3] (2, 3] 中度 (80, 160] (300, 600] 较强 (1, 3] 轻度 (3, +∞) (3, +∞) 重度 (160, 320] (600, 1200] 很强 (3, 5] 中度 (320, +∞) (1200, +∞) 极强 (5, +∞) 重度 说明：CF为单因子污染指数；IPL为污染负荷指数；E为各重金属单项潜在生态风险指数；IR综合潜在生态风险指数；IER为生态风险 预警指数 1.4 数据处理
采用Excel 2019对数据进行初步整理和计算，采用SPSS 20.0进行数据统计分析和K-S正态分布检验，属于正态分布的数据用Pearson相关性分析，非正态分布的用Spearman进行相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 河南省柿主产区土壤重金属质量分数特征
由表2可知：砷和汞质量分数在安阳产区土壤中最高，分别为13.84和0.105 mg·kg−1，三门峡产区土壤中砷质量分数仅为2.34 mg·kg−1；铅和镉质量分数在济源产区土壤中最高，分别为54.80和0.492 mg·kg−1；铬和铜质量分数在三门峡产区土壤中最高，分别为53.10和38.01 mg·kg−1，分别是济源产区的1.36和1.30倍。这说明6种重金属在河南省3个柿主产区土壤中的积累特征不同。与背景值相比，砷仅在三门峡产区低于背景值，汞在3个主产区均高于背景值，且汞在整个主产区高达背景值的2.00倍；铅在三门峡和济源产区是背景值的2.00~3.00倍；镉仅在济源产区超过背景值，而铜在3个主产区均高于背景值，其中在三门峡产区最高，为背景值的2.00倍。6种重金属质量分数平均值在3个主产区均低于筛选值，但砷在安阳产区，铅和镉在济源和三门峡产区以及铬和铜在安阳和三门峡产区均存在某些柿园大于筛选值，处于污染状态，其中镉在济源产区甚至高达筛选值的3.07倍。这说明不同重金属在3个产区的积累程度不同。方差分析表明：砷、铅、镉和铬在3个主产区的F值分别为59.70、6.60、8.50、5.85，说明它们的积累程度均达极显著差异(P＜0.01)。
表 2 河南柿主产区土壤重金属质量分数统计Table 2 Statistics of the heavy metals in soils from the main D. kaki producing area in Henan Province产区 参数 质量分数/(mg·kg−1) 产区 参数 质量分数/(mg·kg−1) 砷 汞 铅 镉 铬 铜 砷 汞 铅 镉 铬 铜 安阳产区 均值 13.84 0.105 16.87 0.167 46.34 29.79 济源产区 均值 13.33 0.092 54.80 0.492 39.15 29.24 标准差 6.70 0.072 5.57 0.076 24.33 19.70 标准差 3.67 0.087 55.75 0.516 8.25 10.64 极小值 1.55 0.020 5.34 0.000 17.09 2.56 极小值 2.97 0.015 7.04 0.048 14.82 6.10 极大值 25.12 0.373 25.45 0.335 93.87 111.04 极大值 21.36 0.399 276.45 1.839 51.07 53.14 三门峡产区 均值 2.34 0.099 37.74 0.277 53.10 38.01 整个主产区 均值 9.84 0.099 36.47 0.312 46.20 32.35 标准差 2.30 0.097 42.18 0.131 9.38 19.72 标准差 7.01 0.085 42.97 0.336 16.63 17.50 极小值 1.22 0.032 9.64 0.081 35.29 18.71 极小值 1.22 0.015 5.34 0.000 14.82 2.56 极大值 14.12 0.543 204.00 0.847 87.12 128.90 极大值 25.12 0.543 276.45 1.839 93.87 128.90 2.2 河南省柿主产区土壤重金属质量分数的变异系数及频率分布
土壤重金属质量分数变异分为小(0~0.15)、中(0.16~0.35)和高(＞0.36)等3类[18-19]。由表3可知：6种重金属在河南省杮主产区的变异均达到高度等级，仅砷在济源、铅在安阳、铬在济源和三门峡产区为中等变异。这说明6种重金属元素在河南省柿主产区的空间变异程度较高，分布存在一定的随机性。依据Grubbs准则剔除90个果园土壤重金属数据异常值[3]，然后绘制河南省柿主产区土壤6种重金属质量分数的频次分布图(图1)。砷和铬的偏度和峰度均在[−1, 1]附近，且中位数都较接近均值(表3)，铬总体符合的近正态分布，砷存在一定的偏正态分布。汞、铅、镉和铜的中位值都小于均值，且偏度分别为2.72、3.32、2.60和2.95，说明样本的铅、镉质量分数左偏，为右尾分布，表明多数柿园土壤的铅、镉质量分数较低，也印证了河南省柿主产区重金属空间分布变异较大的特征。
图 1 河南省柿主产区土壤重金属质量分数分布频次Figure 1 Frequency distribution of the heavy metals in soils from the main producing area of D. kaki of Henan Province表 3 河南省柿主产区土壤重金属变异系数和分布频次Table 3 Coefficients of variation and frequency distribution of the heavy metals in soils from the main producing area of D. kaki of Henan Province参数 产区 砷 汞 铅 镉 铬 铜 变异系数 安阳产区 0.48 0.69 0.33 0.45 0.53 0.66 济源产区 0.28 0.94 1.02 1.05 0.21 0.36 三门峡产区 0.98 0.98 1.12 0.47 0.18 0.52 整个主产区 0.71 0.86 1.18 1.08 0.36 0.54 中位数 整个主产区 11.41 0.08 22.42 0.21 44.72 29.47 偏度 整个主产区 0.25 2.72 3.32 2.60 0.77 2.95 峰度 整个主产区 −0.98 9.79 12.94 6.74 1.23 13.60 2.3 河南省柿主产区土壤重金属来源分析
相关性分析法可以用来解析土壤中重金属来源[3]。对河南省柿主产区土壤重金属质量分数的Pearson相关分析(表4)表明：铅与汞、镉、铜，以及汞与镉表现为极显著相关(P＜0.01)。铜与砷、镉、铬，以及砷与铬达显著相关(P＜0.05)。推断铅和汞、镉、铜可能来自相同的途径，铜与砷、镉、铬的来源也有很大的相似性。整体而言，铅和铜可能是这6种重金属积累的主导元素，或是诱导其他元素在土壤中积累的主要元素，而6种元素间也呈现出相互伴随的复杂积累效应。
表 4 河南省柿主产区土壤重金属之间相关系数矩阵Table 4 Correlations matrix of the heavy metals in soils from the main producing area of D. kaki of Henan Province重金属 pH 砷 汞 铅 镉 铬 铜 pH 1.000 砷 0.177 1.000 汞 −0.119 0.105 1.000 铅 −0.116 0.123 0.410** 1.000 镉 −0.184 0.170 0.397** 0.784** 1.000 铬 −0.191 −0.237* 0.176 0.006 −0.042 1.000 铜 −0.085 −0.209* 0.085 0.299** 0.218* 0.264* 1.000 说明：* 表示显著相关(P＜0.05)，** 表示极显著相关(P＜0.05) 土壤重金属质量分数数据经KMO和巴特力(Bartlett)检验及因子分析和主成分分析表明：第1主成分可解释总方差的37.1%，主要包括铅、镉和汞，其中铅的载荷更是高达0.900；第2主成分可解释34.4%的总方差，其中铬和铜是主要变量，两者载荷分别为0.730和0.608 (表5)。主成分散点图表明(图2)：汞、铅和镉以及铬和铜分别具有高度相似的同源性。这与相关性分析的结果一致。
表 5 河南省柿主产区土壤重金属主成分分析Table 5 Principal component analysis of the heavy metals in soils from the main producing area of D. kaki of Henan Province项目 因子 砷 汞 铅 镉 铬 铜 方差贡献率/% 累计贡献率/% 因子载荷 第1主成分 0.173 0.648 0.900 0.880 0.124 0.418 37.1 37.1 第2主成分 −0.726 0.006 −0.078 −0.173 0.730 0.608 34.4 71.5 
图 2 河南省柿主产区土壤重金属主成分分析散点图Figure 2 Spatial scatter plot of principal component analysis for the heavy metals in soils from the main producing area of D. kaki of Henan Province2.4 河南省柿主产区土壤重金属污染分析
根据分级标准对河南省柿主产区土壤重金属进行污染评价。结果(表6)可知：3个产区土壤单因子污染指数(CF)最大的重金属分别为：安阳汞(2.13)、济源铅(2.80)和三门峡汞(2.02)。另外，安阳产区所有柿园均处于无镉污染状态，76.67%的柿园也处于无铬污染状态，而砷和汞的污染比例均高达83.33%，其中重度污染的比例达到13.33%。济源产区柿园砷、铅和汞的污染比例较高，其中铅的重度污染比例高达30%。三门峡产区大部分柿园表现为无污染或仅轻度污染，但也分别有16.67%、13.33%和6.67%的柿园处在汞、铅和铜的重度污染状态。从整个主产区来看，汞和铜是最主要的重金属污染元素，镉和铬最低。
表 6 不同区域单因子污染指数值及污染等级样点百分比Table 6 Percentages of sites at different pollution levels in the total sample sites各重金属污染指数 安阳产区 济源产区 平均值 标准差 无/% 轻度/% 中度/% 重度/% 平均值 标准差 无/% 轻度/% 中度/% 重度/% CF,砷 1.78 0.86 16.67 50.00 20.00 13.33 1.71 0.47 6.67 63.33 30.00 0 CF,汞 2.13 1.46 16.67 36.67 33.33 13.33 1.87 1.76 43.33 26.67 13.33 16.67 CF,铅 0.86 0.28 63.33 36.67 0 0 2.80 2.84 10.00 53.33 6.67 30.00 CF,镉 0.45 0.20 100 0 0 0 1.32 1.38 66.67 3.33 13.33 16.67 CF,铬 0.73 0.38 76.67 23.33 0 0 0.61 0.13 100 0 0 0 CF,铜 1.51 1.00 30.00 53.33 10.00 6.67 1.48 0.54 20.00 63.33 16.67 0 IPL 0.95 0.34 76.67 20.00 3.33 0 1.32 0.70 50.00 36.67 10.00 3.33 各重金属污染指数 三门峡产区 整个主产区 平均值 标准差 无/% 轻度/% 中度/% 重度/% 平均值 标准差 无/% 轻度/% 中度/% 重度/% CF,砷 0.30 0.29 96.67 3.33 0 0 1.26 0.90 40.00 38.89 16.67 4.44 CF,汞 2.02 1.97 26.67 46.67 10.00 16.67 2.01 1.73 28.88 36.67 18.89 15.56 CF,铅 1.93 2.15 30.00 53.33 3.33 13.33 1.86 2.19 34.45 47.78 3.33 14.44 CF,镉 0.74 0.35 96.67 3.33 0 0 0.83 0.90 87.78 2.22 4.44 5.56 CF,铬 0.83 0.15 96.67 3.33 0 0 0.72 0.26 91.11 8.89 0 0 CF,铜 1.93 1.00 3.33 73.33 16.67 6.67 1.64 0.89 17.78 63.34 14.44 4.44 IPL 0.96 0.35 50.00 50.00 0 0 1.08 0.52 58.89 35.56 4.44 1.11 土壤重金属污染负荷指数(IPL)表明(表6)：河南省柿主产区IPL为1.08，说明河南省柿主产区土壤整体处于重金属轻度污染状态，其中济源产区IPL值最大(1.32)，安阳和三门峡表现为无污染。从污染等级的比例来看，安阳产区无污染柿园最多，达到76.67%，济源产区土壤重金属污染程度最高。
2.5 河南省柿主产区土壤重金属污染的生态风险分析
以筛选值作参比标准，计算河南省柿主产区各柿园土壤重金属潜在生态风险指数(E)及综合潜在生态风险指数(IR) [3]。结果发现：在3个产区，汞的生态风险指数最高，达80.31，铬最低(仅1.45)，说明汞处于较强风险的等级。3个产区的IR最大值为济源产区的581.24，最小值为三门峡产区126.99。这说明：3个产区均为轻微生态风险等级，其中济源产区风险最高，三门峡产区最低，但各产区均出现了处于中等及较强生态风险等级的柿园(表7)。
表 7 不同区域潜在生态风险指数及污染等级样点百分比Table 7 Percentages of sites at different risk levels in the total sample sites各重金属
风险指数安阳产区 济源产区 平均值 标准差 轻微/% 中等/% 较强/% 很强/% 极强/% 平均值 标准差 轻微/% 中等/% 较强/% 很强/% 极强/% E砷 17.76 8.60 100 0 0 0 0 17.11 4.71 100 0 0 0 0 E汞 85.25 58.44 20.00 33.33 36.67 10.00 0 74.86 70.39 43.33 26.67 23.33 3.33 3.33 E铅 4.30 1.42 100 0 0 0 0 13.98 14.22 96.67 3.33 0 0 0 E镉 13.44 6.07 100 0 0 0 0 39.50 41.40 66.67 10 23.33 0 0 E铬 1.45 0.76 100 0 0 0 0 1.23 0.26 100 0 0 0 0 E铜 7.56 5.00 100 0 0 0 0 7.42 2.70 100 0 0 0 0 IR 129.77 63.51 73.33 23.33 3.33 0 0 154.10 121.43 66.67 23.33 10 0 0 各重金属
风险指数三门峡产区 整个主产区 平均值 标准差 轻微/% 中等/% 较强/% 很强/% 极强/% 平均值 标准差 轻微/% 中等/% 较强/% 很强/% 极强/% E砷 3.00 2.95 100 0 0 0 0 12.63 9.00 100 0 0 0 0 E汞 80.83 78.84 26.67 46.67 16.67 6.67 3.33 80.31 69.07 30.00 35.56 25.56 6.67 2.22 E铅 9.63 10.76 96.67 3.33 0 0 0 9.30 10.96 97.78 2.22 0 0 0 E镉 22.22 10.48 96.67 3.33 0 0 0 25.05 26.92 87.78 4.44 7.78 0 0 E铬 1.66 0.29 100 0 0 0 0 1.45 0.52 100 0 0 0 0 E铜 9.65 5.00 100 0 0 0 0 8.21 4.44 100 0 0 0 0 IR 126.99 85.31 76.67 20.00 3.33 0 0 136.95 92.95 72.22 22.22 5.56 0 0 2.6 河南省柿主产区土壤重金属生态风险预警分析
土壤生态风险预警分析是基于环境生态风险评估中而发展来的，它更侧重于对土壤系统、农林植物及其产品可能存在的生态风险研究，具有精准、定量和定性评价的优点[3]。以筛选值作参比标准，计算河南省柿主产区土壤重金属污染生态风险预警等级(IER)，结果如表8。整个主产区IER平均值为2.33，为轻度预警，其中济源产区IER最大(3.79)，为中度预警，三门峡和安阳产区均为轻度预警等级。6种重金属中，仅汞在安阳和三门峡产区以及铅在济源产区表现为轻度预警等级，且这2种重金属均存在处于重度预警的柿园，其中济源产区处于汞和铅重度预警的柿园高达20%。这也与各元素在整个主产区的CF、IPL、E以及IR等的格局基本一致。
表 8 不同区域生态风险预警指数及预警级别样点百分比Table 8 Percentages of sites at different warning levels in the total sample sites各重金属
预警指数安阳产区 济源产区 平均值 标准差 无需/% 预警/% 轻度/% 中度/% 重度/% 平均值 标准差 无需/% 预警/% 轻度/% 中度/% 重度/% IER,砷 0.78 0.86 16.67 50.00 33.33 0 0 0.71 0.47 6.67 63.33 30.00 0 0 IER,汞 1.13 1.46 16.67 36.67 36.67 6.67 3.33 0.87 1.76 43.33 26.67 23.33 0 6.67 IER,铅 −0.14 0.28 63.33 36.67 0 0 0 1.80 2.84 10.00 53.33 16.67 6.67 13.33 IER,镉 −0.55 0.20 100 0 0 0 0 0.32 1.38 66.67 3.33 26.67 3.33 0 IER,铬 −0.27 0.38 76.67 23.33 0 0 0 −0.39 0.13 100 0 0 0 0 IER,铜 0.51 1.00 30.00 53.33 13.33 3.33 0 0.48 0.54 20.00 63.33 16.67 0 0 IER 1.45 2.36 33.33 13.33 33.33 10.00 10.00 3.79 6.14 33.33 23.33 6.67 10.00 26.67 各重金属
预警指数三门峡产区 整个主产区 平均值 标准差 无需/% 预警/% 轻度/% 中度/% 重度/% 平均值 标准差 无需/% 预警/% 轻度/% 中度/% 重度/% IER,砷 −0.70 0.29 96.67 3.33 0 0 0 0.26 0.90 40.00 38.89 21.11 0 0 IER,汞 1.02 1.97 26.67 46.67 16.67 6.67 3.33 1.01 1.73 28.89 36.67 25.56 4.44 4.44 IER,铅 0.93 2.15 30.00 53.33 6.67 0 10 0.86 2.19 34.44 47.78 7.78 2.22 7.78 IER,镉 −0.26 0.35 96.67 0 3.33 0 0 −0.17 0.90 87.78 1.11 10.00 1.11 0 IER,铬 −0.17 0.15 96.67 3.33 0 0 0 −0.28 0.26 91.11 8.89 0 0 0 IER,铜 0.93 1.00 3.33 73.33 20.00 3.33 0 0.64 0.89 17.78 63.33 16.67 2.22 0 IER 1.75 3.98 43.33 23.33 13.33 6.67 13.33 2.33 4.51 36.67 20.00 17.78 8.89 16.67 3. 讨论
3.1 河南省柿主产区土壤重金属来源
土壤重金属来源主要有成土母质和人类活动[20]，其中人类活动引起的土壤污染主要包括工业废弃物、肥料和农药以及采用重金属超标的水灌溉农田等[21-22]。河南省柿整个主产区土壤中铅、铜、汞和砷质量分数约为背景值的1.26~2.01倍，铬和镉均低于背景值，说明铅、铜、汞和砷受人为因素影响更大，也有可能是土壤本身理化性质不同[20]。在一定区域内，相关性强的重金属可能具有相同来源途径[23-25]。从相关分析与主成分分析结果来看，铅、镉和汞之间分别呈现为极显著性相关，铬和铜呈现为显著性相关，说明铅、镉、汞三者以及铜与铬两者可能具有相同的来源，这与河南省典型工业区周边农田[13]、新疆地区辣椒Capsicum annuum种植基地[3]以及吉林省果树基地[21]等研究结果一致。
汞和铅是燃煤排放的标志物，空气中的汞和铅以大气沉降的方式进入土壤[13]。铅和铜是农药、化肥以及农家有机肥等的标志性元素之一[2]，也是电池等工业生产的废气原料[13]。河南省3个柿主产区土壤6种重金属质量分数及其主要特征差异较大，这说明各产区重金属来源存在较大差异，这种差异可能是人类活动的差异引起的[25]。砷受人类活动，特别是农药和水肥影响较大[7, 26]。安阳是河南省重工业基地之一，冶金建材、煤炭化工以及化肥农药生产等是安阳市的主产业，也是导致安阳产区土壤重金属砷和汞质量分数较高的主要原因。济源市有铅都之称，铅和铜分别是济源和三门峡的支柱产业，导致了济源产区土壤铅等重金属质量分数升高，而铅、锌、砷和镉等也是近10 a来国内金属冶炼引起的土壤污染的高浓度重金属[27]。安阳和济源农药和农家肥的施用量约为三门峡的1.8倍，灌溉水中砷和汞含量严重超标，当地政府把治理水中重金属砷作为重中之重的民生项目。安阳是全国重要的化肥生产基地，域内有多个国家重点化肥、化工生产企业，安阳产区的果园施肥以复合肥为主。济源产区的果园在生产中施用了较多的腐熟不彻底的牲畜粪便等农家肥，而且使用了含有较多无机砷的杀菌剂和除草剂。以上这些人类活动都对土壤中砷和铜等重金属的富集具有重要的促进作用[7, 25-26]，也与3个产区土壤重金属含量特征相一致。
3.2 河南省柿主产区土壤重金属污染及风险特征
虽然60%的柿园土壤处于铜、汞、铅和砷污染状态，但从土壤重金属污染负荷指数来看，河南省柿主产区目前处于轻度污染(1.0＜IPL＜2.0)状态，其中济源产区污染较为严重，砷是该产区重金属污染贡献最大的元素之一。这与砷是河南省典型工业城市土壤重金属污染最重要的元素的结论一致[13]。总体来看，6种重金属在各个产区的污染程度不同，但汞是安阳和三门峡产区重金属污染最主要的来源，铅是济源产区污染最严重的重金属元素。不同重金属元素在吐鲁番盆地葡萄园土壤[5]以及新疆焉耆盆地辣椒地土壤[3]的污染特征也不同，这可能是各产区土壤背景值及人类活动特征不同有关[6]。
汞是6种重金属中生态风险等级最高的元素，表现为较强的风险等级(E＞80)，70%的柿园处于汞污染的中等风险及以上等级，镉次之。但济源产区23.33%的柿园均处于镉较强污染风险等级之上，在3个主产区中最高。各元素对IR和IER的贡献率与各元素的污染程度并不完全一致，如镉污染程度相对较低，但济源产区重金属污染风险等级最高，这不仅与不同产区的人为干扰活动存在差异相关[28]，还可能与不同重金属元素毒性系数相差较大有关。一般来说，元素毒性系数越高，其潜在生态风险指数越大[17]；各元素的背景值及国家标准值也是重要影响因素[29]。另外，有些重金属虽然在土壤中的污染程度较高，但其容易伴随其他颗粒物迁移进入土壤中矿化埋藏[30]，使其对生物的毒性降低，从而降低了潜在生态风险[5, 28]。
4. 结论
河南省柿主产区土壤砷主要受农业生产活动的影响，汞、铅和铜则受工业活动影响较大。河南省整个柿主产区土壤重金属污染为轻微风险等级，生态风险预警属于轻度预警等级，但济源产区土壤重金属污染水平、潜在生态风险程度与生态风险预警等级均达到中等水平。汞是河南省柿主产区土壤污染程度最严重的重金属，也是生态风险等级和预警级别最高的重金属元素。
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图 1 金银花尺蠖乳酸脱氢酶活性随温度的变化
Figure 1 LDH activity changes of H. jinyinhuaphaga with temperature
图 2 金银花尺蠖过氧化物酶活性随温度的变化
Figure 2 POD activity change of H. jinyinhuaphaga with temperature
图 3 金银花尺蠖羧酸酯酶活性随温度的变化
Figure 3 CarE activity change of H. jinyinhuaphaga with temperature
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