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森林群落内包含着复杂的种间关系，如竞争、寄生、互利共生等[1]。生态位在研究群落物种组成、生物多样性和物种共存等方面有着重要作用[2]，它是植物群落中各种群所能利用各种资源的总和及其与相关种群之间的功能关系，体现了种群在群落中的地位、作用和重要性[3]，以生态位宽度和生态位重叠指数表征分别体现物种在群落中的地位和种间的联系[4]。种间联结是指不同物种在空间分布上的相互关联性，对生物多样性保护和自然植被的恢复具有一定的指导作用，对揭示群落内的种间关系、演替动态有着重要的理论意义和参考价值[5]。种间关系可分为正联结、无联结和负联结等3种。方庆等[6]认为可以保护与细果秤锤树Sinojackia microcarpa正联结性较高的物种，以期达到保护该濒危物种的目的；丁茂等[7]对落叶阔叶林进行动态监测后发现，种对间正关联数量有所增加，植被群落趋向于稳定的正演替方向发展，说明物种间的正联结性的增加能够提高森林群落的稳定性和物种多样性；杨春玉等[8]发现退化的喀斯特森林从乔灌阶段恢复到乔林阶段，物种种间正联结对数持续增加，直至形成顶级群落，解释了森林群落最终是朝着物种间互利共生和结构稳定的方向发展。但这些研究主要集中于低海拔区域，对于中高海拔地区亚热带森林群落的研究则较少。
浙江巾子峰国家森林公园拥有原生亚热带常绿阔叶林，平均海拔800 m以上，人为活动较少，使得该区域保存有较为丰富且处于不同演替阶段的植被群落，开展该区域森林群落生态位和种间联结的研究，对于中高海拔地区常绿阔叶林的生物多样性保护具有积极意义[9]。对于研究区周边植物群落的研究主要集中在常绿阔叶林种群结构与分布格局[10]、物种组成与群落结构[11]、甜槠Castanopsis eyrei种群特征[12]等，而该地区常绿阔叶林的生态位和种间联结性的研究还未见报道。因此，本研究选取浙江巾子峰国家森林公园境内百丈林区常绿阔叶林作为研究对象，在野外调查的基础上，采用Levins生态位宽度(BL)、Shannon生态位宽度(BS)、Pianka生态位重叠指数(Oik)、Schoener系数(Cik)、方差比率(VR)、卡方($ {\chi}^{2} $)检验、Pearson相关系数和Spearman秩相关系数等方法，研究常绿阔叶林群落的木本植物组成以及优势种的生态位和种间联结性的关系，旨在为亚热带常绿阔叶林生物多样性和植被的保护与恢复提供参考。
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浙江巾子峰国家森林公园位于浙江省庆元县(27°27′~27°39′N，118°50′~119°06′E)，属武夷山系洞宫山脉，总面积为5 752 hm2[13]。年均气温为17.2 ℃，最热月平均气温为26.9 ℃，最冷月平均气温为7.0 ℃，年均降水量为1 689.0 mm，相对湿度为75.8%，年均无霜期为256 d，主要植被类型包括常绿阔叶林、常绿-落叶阔叶混交林、针阔混交林、针叶林、毛竹Phyllostachys edulis林等。样地所在地土壤为黄壤。
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参照美国热带森林研究中心(CTFS)的方法[14]，在浙江巾子峰国家森林公园境内的百丈林区(27°38′N，118°91′E)建立了1个1.4 hm2 (140 m×100 m)和6个0.4 hm2 (20 m×20 m)的常绿阔叶林长期监测样地。对样地内所有胸径(DBH)≥1 cm的木本植物进行每木检尺，并记录种名、胸径、树高、枝下高、空间坐标及生活状态等，样地基本情况如表1。
表 1 研究区常绿阔叶林群落样地基本情况
Table 1. Basic situation of survey sites for broadleaf evergreen forest community survey in the study area
样地号 类型 海拔/m 群落类型 样地面积/m2 坡位 密度/(株·hm−2) 平均胸径/cm 郁闭度 1 天然林 1 163 常绿阔叶林 14 000 上 3 698 7.20 75.8 2 天然林 1 163 常绿阔叶林 400 上 2 750 9.87 93.9 3 天然林 1 146 常绿阔叶林 400 中 4 775 8.39 94.5 4 天然林 1 136 常绿阔叶林 400 中 2 100 12.15 90.7 5 天然林 1 151 常绿阔叶林 400 中 4 150 6.25 88.2 6 天然林 1 121 常绿阔叶林 400 中 1 525 16.86 93.4 7 天然林 1 176 常绿阔叶林 400 上 2 300 11.82 94.0 -
依据马克平等[15]的方法计算物种重要值确定优势种。
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依据王刚等[16]的方法计算木本植物优势种的Levins生态位宽度指数(BL)和Shannon生态位宽度指数(BS)。依据郭平平等[17]的方法计算Pianka生态位重叠指数(Oik)；依据SCHOENER[18]的方法计算Schoener系数(Cik)。
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计算方法参照SCHLUTER[19]提出的方差比率法(VR)和检验统计量(W)。参照江常春等[20]的方法，卡方($ {\chi}^{2}) $检验采用YATES连续矫正公式；参照吕增伟等[21]的方法计算Spearman秩相关系数和Pearson相关系数。
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重要值、生态位和种间联结性采用R 4.3.1软件(“spaa”“corrplot”“ggplot”“psych”“vegan”“tidyverse”工具包)[22]和WPS 2021进行数据计算以及绘图。
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调查样地中木本植物共有113种，隶属于31科62属。由表2可知：在该常绿阔叶林群落木本植物中，筛选出重要值$\geqslant $1%的优势种，共21种，重要值总和为80.32%。在木本植物优势种重要值大小排序中，木荷Schima superba的重要值最大，为14.30%，其次为甜槠和黄山松Pinus taiwanensis，分别为12.85%和12.23%。薄叶山矾Symplocos anomala和华中樱Cerasus conradinae的重要值最小，都为1.02%。这21个优势种的BL和BS平均值分别为17.38和3.03。木荷、甜槠、黄山松、锥栗Castanea henryi和野漆树Toxicodendron succedaneum的生态位宽度相对较大，且BL和BS分别大于20.00和3.30。
表 2 优势植物重要值与生态位宽度
Table 2. Important value and niche breadth of dominant plant species
编号 种名 个体数 分布频度 重要值/% Levins生态位宽度(BL) Shannon生态位宽度(BS) sp1 木荷 Schima superba 984 41 14.30 25.91 3.42 sp2 甜槠 Castanopsis eyrei 682 41 12.85 28.20 3.49 sp3 黄山松 Pinus taiwanensis 245 40 12.23 29.67 3.52 sp4 锥栗 Castanea henryi 261 38 6.02 21.39 3.30 sp5 马银花 Rhododendron ovatum 665 38 5.47 19.43 3.23 sp6 麂角杜鹃 Rhododendron latoucheae 500 35 4.30 18.47 3.19 sp7 大萼黄瑞木Adinandra glischroloma var. macrosepala 284 33 2.83 4.85 2.44 sp8 江南山柳 Clethra delavayi 189 35 2.45 17.07 3.17 sp9 野漆树 Toxicodendron succedaneum 112 33 2.21 24.31 3.32 sp10 浙江新木姜子 Neolitsea chekiangensis 157 28 1.91 11.83 2.79 sp11 微毛柃 Eurya hebeclados 152 27 1.87 12.21 2.89 sp12 短柄枹栎 Quercus glandulifera 115 27 1.86 19.59 3.11 sp13 江南越橘 Vaccinium mandarinorum 135 29 1.75 16.06 3.04 sp14 小叶青冈 Cyclobalanopsis gracilis 90 23 1.62 10.83 2.69 sp15 黄背越橘 Vaccinium iteophyllum 100 27 1.53 19.38 3.11 sp16 树参 Dendropanax dentiger 97 23 1.48 10.04 2.64 sp17 云山青冈 Cyclobalanopsis sessilifolia 72 22 1.37 14.64 2.84 sp18 红楠 Machilus thunbergii 50 22 1.15 13.30 2.82 sp19 吴茱萸五加 Gamblea ciliata var. evodiifolia 47 22 1.09 17.96 2.98 sp20 薄叶山矾 Symplocos anomala 43 20 1.02 14.11 2.81 sp21 华中樱 Cerasus conradinae 38 21 1.02 15.70 2.89 -
如图1A所示：浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林木本植物优势种共有210个种对，Oik为0.09~0.84。Oik≥0.5的共有89个种对，占总对数的42.4%，说明这些种对在资源不足时，可能会发生激烈的竞争。Oik＜0.5的共有121对，占总对数的57.6%。
图 1 主要优势树种生态位重叠指数
Figure 1. Niche overlap index of dominant tree species
如图1B所示：群落中木本植物优势种的Cik为0.17~0.74。Cik≥0.5的种对共50对，占总对数的23.8%，这些种对的生态习性较为相似。Cik＜0.5的种对共160对，占总对数的76.2%。
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对木本植物优势种总体关联性分析可知(表3)，方差比率(VR)= 2.84＞1，表明该常绿阔叶林木本植物优势种之间总体联结呈现正联结。卡方临界值χ2(0.95, 41)= 27.33，χ2(0.05, 41)= 56.94，检验统计量(W)= 116.73，不在临界值之间，表明木本植物优势种之间联结显著(P＜0.05)。该群落木本植物优势种种间总体呈现显著正联结(P＜0.05)，该群落处于稳定阶段。
表 3 优势植物总体关联性
Table 3. Overall associations of dominant plant species
方差比率(VR) 检验统计量(W) 卡方临界值(0.95, 41) 卡方临界值(0.05, 41) 检验结果 2.84 116.73 27.33 56.94 显著正联结 -
通过卡方检验观察到的频数与期望频数之间的差异，结果如表4和表5所示。在21个木本植物优势树种组成的210个种对中，39个种对间无关联，占总对数的18.57%；112个种对间呈不显著正联结(P＞0.05)，占总对数的53.33%；49个种对间呈不显著负联结(P＞0.05)，占总对数的23.33%；2个种对间呈极显著正联结(P＜0.01)；8个种对间呈显著正联结(P＜0.05)。
表 4 主要优势树种χ2统计量检验
Table 4. χ2 correlation test of dominant population of dominant tree species
编号 sp1 sp2 sp3 sp4 sp5 sp6 sp7 sp8 sp9 sp10 sp11 sp12 sp13 sp14 sp15 sp16 sp17 sp18 sp19 sp20 sp2 0.00 sp3 0.00 0.00 sp4 0.00 0.00 2.75 sp5 0.00 0.00 2.75 0.42 sp6 0.00 0.00 1.03 3.24 3.24 sp7 0.00 0.00 0.61 0.02 1.92 2.20 sp8 0.00 0.00 1.03 0.01 0.01 4.11 0.13 sp9 0.00 0.00 0.61 0.02 0.02 6.75 0.87 2.20 sp10 0.00 0.00 0.16 0.34 0.34 0.15 0.00 2.30 0.67 sp11 0.00 0.00 0.11 0.36 0.36 1.83 2.16 1.83 0.04 0.00 sp12 0.00 0.00 0.11 3.48 0.36 10.34 5.29 1.83 5.29 0.00 1.43 sp13 0.00 0.00 0.21 0.67 4.57 0.52 3.50 0.06 0.02 0.26 0.19 3.02 sp14 0.00 0.00 0.02 0.05 0.05 0.59 0.00 0.59 0.00 0.02 0.81 0.06 1.50 sp15 0.00 0.00 0.11 0.36 3.48 1.83 2.16 1.83 0.41 2.13 1.43 3.57 6.07 0.06 sp16 0.00 0.00 0.02 0.97 0.05 0.01 0.00 0.01 0.62 0.02 0.06 0.81 0.73 0.79 0.06 sp17 0.00 0.00 0.01 0.02 1.15 1.29 0.03 0.06 0.03 0.10 0.00 0.43 1.78 1.35 0.00 0.53 sp18 0.00 0.00 0.01 0.02 0.02 0.41 0.39 0.06 0.39 0.10 0.00 3.96 1.78 0.28 1.77 0.53 0.04 sp19 0.00 0.00 0.01 0.02 0.02 0.41 2.01 0.06 2.01 0.10 1.77 3.96 0.42 0.01 3.96 1.86 2.10 0.19 sp20 0.00 0.00 0.00 0.00 1.34 1.59 0.10 0.14 0.22 0.01 0.77 0.05 0.86 0.03 0.05 1.17 0.02 0.02 0.02 sp21 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.26 0.22 0.26 0.22 0.61 0.20 0.05 1.28 0.21 0.05 0.21 0.60 0.02 0.02 0.03 说明：sp1. 木荷；sp2. 甜槠；sp3. 黄山松；sp4. 锥栗；sp5. 马银花；sp6. 麂角杜鹃；sp7. 大萼黄瑞木；sp8. 江南山柳；sp9. 野漆树；sp10. 浙江新木姜子；sp11. 微毛柃；sp12. 短柄枹栎；sp13. 江南越橘；sp14. 小叶青冈；sp15. 黄背越橘；sp16. 树参；sp17. 云山青冈；sp18. 红楠；sp19. 吴茱萸五加；sp20. 薄叶山矾；sp21. 华中樱。 表 5 主要优势树种的Spearman秩相关系数、Pearson相关系数检验结果比较
Table 5. Comparison of the results of Spearman rank correlation and Pearson rank correlation test of dominant tree species
检验方法 正联结(相关)/对 负联结(相关)/对 无联结/对 极显著 显著 不显著 总数 极显著 显著 不显著 总数 总数 χ2检验 2 8 112 122 0 0 49 49 39 Spearman秩相关系数 21 14 108 142 1 4 63 68 0 Pearson相关系数 25 14 89 128 1 2 79 82 0 说明：极显著P＜0.01；显著P＜0.05；不显著P＞0.05。 Spearman检验结果如图2A和表5所示。呈正联结的种对有142对，占总种对数的67.6%。其中，呈极显著正联结(P＜0.01)的种对有21对，显著正联结(P＜0.05)的种对有14对。呈负联结的种对有68对，占总种对数的32.4%。其中，呈现显著负联结(P＜0.01)的种对有1对，显著负联结(P＜0.05)的种对有4对。极显著和显著正、负联结比值为7∶1。Spearman秩相关系数分析仍保持与卡方检验相一致的结果。
图 2 相关系数半矩阵
Figure 2. Semi-matrix of correlation coefficients
Pearson检验结果如图2B和表5所示。在210个种对中，呈正联结的有128对，占总对数的60.96%；呈负联结的有82对，占总对数的39.04%。在正联结的128个种对中，呈极显著正联结(P＜0.01)的有25对，显著正联结(P＜0.05)的有14对；在负联结的82个种对中，呈极显著负联结(P＜0.01)的有1对，显著负联结(P＜0.05)的有2对。极显著和显著正、负联结比值为13∶1。Pearson相关系数分析发现，不显著联结(P＞0.05)的种对数仍保持较大一部分，这符合卡方检验结果。
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木本植物优势种的Pearson相关系数与生态位重叠指数的回归分析如图3所示，木本植物优势种种间联结与生态位重叠呈极显著正相关(P＜0.01)。
图 3 主要优势树种Pearson与生态位重叠值的回归分析
Figure 3. Regression analysis of Pearson rank correlation with niche overlap of dominant tree species
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在浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林中，木荷、甜槠和黄山松的重要值、生态位宽度较大。在一个群落中，某一物种的重要值与生态位宽度呈正相关，即重要值越大，其生态位宽度也越大[23]，但叶兴状等[24]研究发现，福建天台山半枫荷Semiliquidambar cathayensis群落中重要值排第2位的半枫荷，其生态位宽度却排第4位。本研究中，黄山松的生态位宽度最大，其次是甜槠和木荷；木荷虽然在该群落中的重要值最大，但其生态位宽度略低于黄山松和甜槠。大萼黄瑞木Adinandra glischroloma var. macrosepala的重要值虽然排在第7位，但其生态位宽度最小，结合实际野外调查，大萼黄瑞木高度聚集分布在同一个样方中，其重要值大小和生态位宽度在一定程度上受到分布频度的影响，这与刘雨婷等[25]的研究结果相似，表明它对该群落环境的适应性和资源的利用能力不全面，竞争性较弱，有可能发展为特化种。
生态位重叠指数和生态位相似比系数可以反映物种对资源的利用程度和环境的适应性[26]。物种的生态位宽度越大，则生态位重叠指数越大，对有共同需求的资源竞争压力也越大[27]。本研究发现，生态位宽度最大的黄山松与甜槠、锥栗、马银花Rhododendron ovatum、麂角杜鹃Rhododendron latoucheae、江南山柳Clethra delavayi、野漆树、短柄枹栎Quercus serrata、江南越橘Vaccinium mandarinorum、黄背越橘Vaccinium iteophyllum和薄叶山矾的生态位重叠指数和生态位相似比系数均超过0.50。吴友贵等[28]发现生态位宽度最大的多脉青冈Cyclobalanopsis multinervis、麂角杜鹃和窄基红褐柃Eurya rubiginosa之间的生态位相似比系数都大于0.7。本研究表明：生态位宽度较小的微毛柃Eurya hebeclados-大萼黄瑞木的生态位重叠值和生态位相似比系数均较大，其值分别为0.82 和0.52，与栾兆平等[29]研究结果相似，即生态位宽度较小的物种，其生态位重叠指数超过了0.90。
种间联结是物种在空间上的不同关系，是物种对环境的适应性和对资源利用相似性的体现[30]。浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林木本植物优势种总体呈显著正联结。结合卡方检验、Spearman秩相关系数和Pearson相关系数可以较好地判断群落中木本植物优势种种对间的联结性，发现呈正联结的种对数大于负联结的种对数，极显著或显著正联结的种对数也大于极显著或显著负联结的种对数，表明该群落属于演替中期，种间的竞争和协作逐渐平衡。可能与该样地海拔较高，人为活动较少有关[26]。张滋芳等[31]认为物种间有相似环境适应性和资源需求，往往会产生正向联系。本研究马银花与麂角杜鹃、黄背越橘，江南越橘与黄背越橘、麂角杜鹃均呈极显著正联结，因为4种植物均为杜鹃花科灌木，有着相似的生态习性；短柄枹栎与锥栗、吴茱萸五加Gamblea ciliataevodiifolia的生态位宽度在木本植物优势种中占据较高位置，也呈极显著正联结，这与张盟等[4]发现有着紧密正联结的物种往往占据较高生态位宽度相似。而红楠Machilus thunbergii-甜槠呈极显著负联结，可能是甜槠多为大径个体，红楠以小径个体为主，高大繁茂的甜槠限制了树高较小的红楠生长。短柄枹栎-木荷呈显著负联结，因为木荷为常绿树种，短柄枹栎为落叶树种，2个物种对光照、水分等需求不同，这与罗敏贤等[32]认为常绿树种和落叶树种生长所需光性不同，会导致物种间呈显著负联结相一致。
植物之间生态位重叠值与种间联结若呈正联结，表明其存在不同程度的生态位重叠，反之亦然[33]。在本研究发现，浙江巾子峰国家森林公园主要优势树种的Pearson相关系数与生态位重叠的回归分析呈极显著正相关，如马银花-麂角杜鹃种对间呈极显著正联结，种对间的Pianka重叠值为0.84，其Pearson相关系数为0.69，呈正向关系，这与郑俊鸣等[34]认为物种种间正联结越强，其生态位重叠指数也越大的研究结果相似。
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浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林属于比较稳定的生态系统，可以选择具有较宽的生态位和适应性较强的树种，如木荷、甜槠、锥栗、马尾松、马银花、麂角杜鹃和短柄枹栎等作为自然植被恢复的优先树种；而对于小叶青冈Cyclobalanopsis gracilis、大萼黄瑞木、薄叶山矾、云山青冈Cyclobalanopsis sessilifolia和红楠等树种，其生态位重叠值和生态位相似系数较低，生态位宽度也较低，应在自然植被恢复和生物多样性保护中进行一定调控。
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巾子峰国家森林公园常绿阔叶林群落物种多样性较丰富，部分物种对资源的需求有一定的相似性；物种总体呈显著正联结，种间关系较松散，各种对间的关联较弱，该群落逐渐趋于平衡阶段，各物种之间竞争较小。因此，在该地区可以选择有相似的生境需求和较宽生态位的优势乡土树种，调控生态位较小的树种，以期实现该地区群落正向演替。
Niche and interspecific connectivity of dominant species of woody plants in evergreen broad-leaved forest of Jinzifeng National Forest Park
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摘要:
目的 探究浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林木本植物优势种的生态位和种间联结性，以期为亚热带常绿阔叶林的生态恢复和生物多样性保护提供参考。 方法 基于样地调查数据，从物种组成、生态位宽度、生态位重叠指数、生态位相似系数、方差比率法、卡方($ {\chi}^{2} $)检验、Pearson相关系数和Spearman秩相关系数等方面研究了21种重要值≥1%的木本植物优势种的生态位和种间联结性。 结果 ①浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林群落中共有木本植物113种，隶属31科62属，主要有壳斗科Fagaceae、蔷薇科Rosaceae、樟科Lauraceae和杜鹃花科Ericaceae等。②木荷Schima superba、甜槠Castanopsis eyrei和黄山松Pinus taiwanensis的重要值与生态位宽度较大，在该群落中处于建群种，与其他木本植物优势种间具有较高的生态位重叠值和生态位相似性系数。21个木本植物优势种的生态位重叠值和生态位相似性系数集中在0.10~0.50。③浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林木本植物优势种间总体呈显著正联结(P＜0.05)。经$ {\chi}^{2} $检验，在210个种对中，有112个种对呈不显著正联结，49个种对呈不显著负联结，仅有2个种对呈极显著正联结(P＜0.01) ，8个种对呈显著正联结(P＜0.05)，39个种对呈无联结。Spearman秩相关检验和Pearson相关检验结果基本一致，不显著联结的种对分别占81.4%和80.0%，种间联结性较弱，正负联结比系数大于1。④主要优势树种间的Pearson相关系数与生态位重叠值的回归分析呈极显著正联结(P＜0.01)。 结论 浙江巾子峰国家森林公园常绿阔叶林群落各物种之间竞争逐渐平衡，处于演替中期，物种丰富。图3表5参34 Abstract:Objective This study explore the ecological niche and interspecific association of the dominant species of woody plants in evergreen broad-leaved forest in Jinzifeng National Forest Park, Zhejiang Province, in order to provide a reference for ecological restoration and biodiversity conservation of subtropical evergreen broad-leaved forest. Method Niche composition, niche width, niche overlap index, niche similarity coefficient, variance ratio method, $ {\chi}^{2} $ test, Pearson correlation coefficient, and Spearman rank correlation coefficient were used to study the niche and interspecific association of 21 dominant species of woody plants with important values ≥1%. Result (1) There were 113 species of woody plants belonging to 31 families and 62 genera in the evergreen broad-leaved forest community in Jinzifeng National Forest Park, including Fagaceae, Rosaceae, Lauraceae, and Ericaceae. (2) The importance values and niche widths of Schima superba, Castanopsis eyrei and Pinus taiwanensis were larger. They were established species in this community, and had higher niche overlap values and niche similarity coefficients with other dominant species of woody plants. The niche overlap values and niche similarity coefficients of 21 dominant species of woody plants were mainly concentrated in the range of 0.10−0.50. (3) The dominant species of evergreen broad-leaved forest woody plants in Jinzifeng National Forest Park showed a significant positive association (P＜0.05). Among 210 species pairs, 112 species pairs showed no significant positive association, 49 species pairs showed no significant negative association, only 2 species pairs showed extremely significant positive association (P＜0.01) , 8 species pairs showed significant positive association (P＜0.05) , 39 species pairs showed no association. Spearman rank correlation test and Pearson correlation test showed no significant association. Species pairs accounted for 81.4% and 80.0%, respectively. The interspecific association was weak, with positive and negative association ratios greater than 1. (4) The regression analysis of Pearson correlation coefficient and niche overlap values of dominant tree species showed a extremely significant positive correlation (P＜0.01). Conclusion The evergreen broad-leaved forest community in Jinzifeng National Forest Park is in the middle stage of succession, and the competition among species is gradually balanced. [Ch, 3 fig. 5 fig. 34 ref.] -
密码子是识别和传递生物体遗传信息、联系蛋白质与DNA之间的重要桥梁，在生物体遗传和变异中起着至关重要的作用[1]。编码同一氨基酸的不同密码子被称为同义密码子。由于基因突变和自然选择的影响，某些同义密码子在蛋白质翻译过程中往往被高频使用，被称为密码子的使用偏好性[2−3]。物种的生物学功能与密码子偏好性密切相关，密码子偏好性不仅可以影响生物编码基因的蛋白质合成速率和翻译速率[4]，还会影响蛋白质结构、折叠程度和mRNA的合成[5]。研究表明：同一物种或亲缘关系相近的物种，具有相似的密码子偏好使用模式[6]，通过分析物种的密码子偏好性可以衡量物种之间的基因表达量，进而探究物种之间亲属关系[7]。通过密码子偏好性的研究，能够更好地阐明物种进化过程中基因的表达规律[8]，为利用基因工程技术改良物种目标基因提供参考依据[9]。
梁山慈竹Dendrocalamus farinosus属竹亚科Bambusoideae牡竹属Dendrocalamus，又名大叶竹和瓦灰竹，是中国西南地区重要的经济竹种[10]，生长速度快，适应性强，竹笋效益高，属于优良的笋竹两用竹种，与硬头黄竹Bambusa rigida都属于竹编和制浆造纸的优质原料[11]。针对梁山慈竹叶绿体基因组密码子使用偏好性的研究鲜见报道。为了更好地挖掘和利用梁山慈竹的潜在经济价值，本研究以梁山慈竹叶绿体基因组序列为研究对象，分析其密码子偏好性使用模式，探究并总结其相关表达基因的密码子偏好性，以期分析影响梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的主要因素，并筛选出最优密码子，为后续梁山慈竹叶绿体基因工程改造等研究提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 叶绿体基因组序列的获取
根据GenBank登录号MZ681865.156在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中搜索并下载梁山慈竹叶绿体基因组序列，共有85条编码序列(CDS)。序列重复或小于300 bp会对密码子偏好性指标的测定产生影响[12]。对基因序列进行筛选，剔除序列长度小于300 bp且重复的序列，获取起始密码子为ATG，终止密码子为TAG、TGA和TAA的序列，最终获得51条CDS序列作为后续分析的样本序列。
1.2 密码子组成分析
运用CodonW1.4.2 (
http://sourceforge.net/projects/codonw )和EMBOSS (http://imed.med.ucm.es/EMBOSS/ )计算有效密码子数(ENC)、适应指数(CAI)、密码子偏性指数(CBI)、最优密码子频率(FOP)以及密码子第3位核苷酸A、T、C、G的含量(分别记为A3、T3、C3、G3)。利用ENC判断密码子偏好性程度，ENC＞35说明密码子偏好性比较弱；反之，说明偏好性强[13]。通过CUSP软件分析并获得密码子鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的比率(GC比率)及GC平均比率(GCall)，使用SPSS 25.0软件对梁山慈竹密码子各位置的GC比率与ENC进行相关分析。1.3 相对同义密码子使用度分析
运用CodonW 1.4.2对同义密码子相对使用度(RSCU)进行分析，即该密码子的实际使用频率与其理论使用频率的比值[14]。当RSCU大于1时，同义密码子中偏好使用该密码子，被称为高频密码子；当RSCU等于1时，密码子无偏好性；当RSCU小于1时，密码子使用偏好性较弱[15]。
1.4 中性绘图分析
中性绘图分析是对影响密码子使用偏好性的关键因素进行分析，X轴为GC3，Y轴为GC1和GC2的平均值，绘制二维散点图对GC3和GC12 (各基因 GC1和GC2的平均值)的相关性进行分析(GC1、GC2、GC3分别代表第1、2、3位密码子的GC比例)。若回归系数接近1，代表GC3和GC12显著相关，碱基组成没有差异，说明突变是决定密码子偏好性的主要因素；若回归系数接近0，则代表自然选择是主要因素。
1.5 ENC-plot绘图分析
ENC-plot绘图分析表现密码子的使用偏好性受到突变和自然选择的影响程度。使用Python 3.7进行ENC-plot绘图分析，构建散点图，横纵坐标分别为GC3、ENC，并绘制ENC的标准曲线。基因位点靠近或在标准曲线上，表明突变是决定密码子偏好性的主要因素，若基因位点和标准曲线距离很大，则说明偏好性主要由自然选择决定。
1.6 PR2-plot偏倚分析
PR2-plot分析表明基因中密码子的第3位碱基的构成情况。计算密码子碱基中第3位上4种碱基A、T、C、G比例，G3/(G3+C3)为X轴，A3/(A3+T3)为Y轴，绘制PR2-plot散点图，中心点为碱基比例A=T、C=G时的值，代表处于此区域的密码子并无使用偏好性[16]。
1.7 最优密码子分析
将51条基因升序排列后的ENC前后两端10％的基因建立高、低表达基因库。通过CodonW软件计算2个表达库中密码子的RSCU和ΔRSCU，同时满足高频密码子(RSCU＞1)和高表达密码子(ΔRSCU≥0.08)的为最优密码子[17]。
1.8 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析
在Codon Usage Database (
http://www.kazusa.or.jp/codon/ )下载异源表达宿主和植物代表类群，包括巨龙竹D. farinosus、粉麻竹D. sinicus、小叶龙竹D. pulverulentus、硬头黄竹、大肠埃希菌Escherichia coli、烟草Nicotiana tabacum、拟南芥Arabidopsis thaliana和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae等物种基因组密码子的使用频率，与梁山慈竹基因组密码子使用频率比值进行比较分析，当梁山慈竹密码子使用频率比其他生物的比值≥2.0或≤0.5时，说明该物种与梁山慈竹的同义密码子的使用偏好性差异较大，当比值不在上述范围内时，表明这2个物种对该密码子的偏好性较接近。1.9 对应分析
将叶绿体基因如表1所示进行功能分类，使用CodinW软件，选择对应分析计算样本中各个基因的RSCU，将分析结果分布在59维向量空间中，分析指标间的对应性。
表 1 梁山慈竹叶绿体基因结构分析Table 1 Structural analysis of the choroplast genome of D. farinosus基因分类 基因分组 基因名称 光合系统基因 光系统Ⅰ基因 psaA、psaB、psbA、psbC、psbD、psbB 光系统Ⅱ基因 petA、petB、petD 细胞色素b/f复合体基因 atpA、atpB、atpE、atpF、atpI 三磷酸腺苷合成酶基因 ndhA、ndhB、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、ndhH、ndhI、ndhJ、ndhK 遗传系统基因 烟酰胺腺票吟二核甘酸氧化还原酶基因 rbcL 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因 rpoA、rpoB、rpoC1、rpoC2 RNA聚合酶亚基基因 rps2、rps3、rps4、rps7、rps8、rps11、rps12、rps14、rps18 核糖体蛋白小亚基基因 rpl2、rpl14、rpl16、rpl20、rpl22 其他基因 成熟酶K基因 matK 膜蛋白基因 cemA 细胞色素合成基因 ccsA 酪蛋白分解蛋白酶基因 clpP 未知功能基因 假定叶绿体阅读框 ycf2、ycf3、infA 2. 结果与分析
2.1 密码子的碱基组成分析
分析梁山慈竹叶绿体基因组CDS序列的碱基组成：梁山慈竹的4种碱基所对应的同义密码子的第3位碱基比例 (T3s、A3s、C3s、G3s)分别为45.28%、42.07%、18.13%、17.96%，T3s和A3s远高于G3s和C3s，表明梁山慈竹叶绿体基因组密码子的第3位碱基以A/U结尾为主。梁山慈竹的ENC为50.40，CAI为16.6%，第3位同义密码子的GC比率 (GC3S)为28.1%，表明其叶绿体基因组密码子偏好性较弱。
梁山慈竹叶绿体基因组密码子的GC平均比率为39.48%，且GC1 (47.69%)＞GC2 (39.70%)＞GC3 (31.05%)。ENC为 39.04~61.00，均值为49.51，GC比率在基因密码子上并没有均匀分布(表2)。ENC和密码子3个位置GC比率的相关分析(表3)结果发现：ENC与GC3比率显著相关，与GC1、GC2不显著相关，说明密码子使用偏好性形成过程中GC3的影响作用大于GC1、GC2。
表 2 梁山慈竹叶绿体基因组各基因密码子相关参数统计Table 2 Statistics of codon related parameters of various genes in the chloroplast genome of D. farinosus基因 GC比率/% ENC CAI FOP 基因 GC比率/% ENC CAI FOP GC GC1 GC2 GC3 GC GC1 GC2 GC3 rps12 41.87 52.00 47.20 26.40 44.85 0.140 0.341 rps18 33.53 34.50 39.77 26.32 39.04 0.147 0.333 psbA 42.56 49.72 42.94 35.03 41.33 0.313 0.532 rpl20 36.11 38.33 40.83 29.17 50.97 0.112 0.298 matK 34.44 40.82 32.42 30.08 49.49 0.166 0.329 clpP 43.01 52.53 38.25 38.25 52.37 0.175 0.337 psbD 44.44 53.39 43.50 36.44 48.99 0.242 0.456 psbB 44.01 54.42 45.97 31.63 50.73 0.190 0.380 psbC 44.66 53.59 44.73 35.63 48.91 0.183 0.386 petB 41.06 48.93 41.20 33.05 47.31 0.191 0.333 rpoB 39.19 49.81 38.01 29.74 49.69 0.153 0.353 petD 40.37 50.93 39.13 31.06 49.46 0.161 0.305 rpoC1 39.87 49.93 38.07 31.63 52.77 0.156 0.347 rpoA 37.06 46.18 35.59 29.41 49.94 0.151 0.311 rpoC2 38.95 49.01 36.64 31.18 52.29 0.154 0.333 rps11 43.52 50.69 56.25 23.61 44.33 0.174 0.396 rps2 38.40 40.51 40.93 33.76 52.55 0.168 0.338 infA 40.35 43.86 35.96 41.23 61.00 0.181 0.409 atpI 38.84 47.58 36.29 32.66 50.55 0.163 0.353 rps8 36.50 41.61 41.61 26.28 46.62 0.122 0.374 atpF 38.27 47.62 35.45 31.75 53.17 0.147 0.353 rpl14 38.71 54.84 37.10 24.19 51.90 0.181 0.392 atpA 42.06 56.01 39.96 30.12 49.96 0.182 0.385 rpl16 44.76 52.14 53.57 28.57 39.41 0.115 0.354 rps14 39.42 39.42 46.15 32.69 41.73 0.135 0.384 rps3 33.47 43.75 31.67 25.00 48.03 0.193 0.402 psaB 41.81 48.71 43.13 33.61 49.34 0.172 0.350 rpl22 37.56 41.33 36.67 34.67 47.48 0.188 0.415 psaA 43.68 51.80 43.28 35.95 52.07 0.198 0.373 rpl2 44.56 51.77 48.58 33.33 53.33 0.143 0.361 ycf3 39.69 47.40 38.15 33.53 55.45 0.156 0.343 ndhB 38.16 42.07 39.33 33.07 46.71 0.156 0.348 rps4 37.13 47.52 37.13 26.73 49.59 0.169 0.386 rps7 39.49 49.68 45.22 23.57 48.31 0.164 0.373 ndhJ 39.38 49.38 36.88 31.88 51.48 0.176 0.356 ndhF 34.19 37.84 38.92 25.81 46.19 0.144 0.321 ndhK 38.60 41.70 43.72 30.36 51.91 0.159 0.329 ccsA 33.64 33.74 41.10 26.07 45.60 0.152 0.307 ndhC 39.67 50.41 36.36 32.33 48.75 0.177 0.345 ndhD 36.19 40.72 36.93 30.94 48.98 0.133 0.314 atpE 42.51 52.17 39.13 36.23 59.51 0.167 0.405 ndhE 33.33 41.18 32.35 26.47 59.06 0.144 0.316 atpB 42.62 53.91 41.68 32.26 47.43 0.192 0.381 ndhG 34.46 44.07 32.77 26.55 45.77 0.125 0.250 rbcL 44.14 57.11 43.93 31.38 50.19 0.271 0.454 ndhI 34.99 37.57 38.67 28.73 52.09 0.171 0.345 ycf4 41.22 48.39 39.78 35.48 47.14 0.162 0.385 ndhA 33.98 42.42 36.36 23.14 44.35 0.140 0.321 cemA 33.62 41.99 27.71 31.17 55.91 0.176 0.342 ndhH 37.82 50.76 34.77 27.92 49.95 0.155 0.322 petA 40.29 53.58 35.2 32.09 51.12 0.155 0.331 表 3 梁山慈竹叶绿体基因组中各基因参数的相关性分析Table 3 Correlation analysis of various gene parameters in the chloroplast genome of D. farinosus参数 GC1 GC2 GC3 ENC CAI CBI FOP GC3s GC GC1 1 GC2 0.300* 1 GC3 0.265 −0.009 1 ENC 0.142 −0.425** 0.389** 1 CAI 0.409** 0.076 0.370** 0.012 1 CBI 0.438** 0.272 0.322* −0.092 0.774** 1 FOP 0.402** 0.312* 0.341* −0.064 0.797** 0.965** 1 GC3s 0.271 −0.029 0.946** 0.445** 0.330* 0.330* 0.370** 1 GC 0.814** 0.673** 0.525** 0.010 0.407** 0.512** 0.518** 0.499** 1 说明： *表示显著相关 (P＜0.05)；**表示极显著相关 (P＜0.01)。 2.2 相对同义密码子使用度分析
梁山慈竹叶绿体基因组中共包含18110个密码子(表4)，总计编码20个氨基酸，密码子数为12~705个，其中密码子UGA共有12个，密码子含量最多的是编码谷氨酸的GAA，共有705个。梁山慈竹叶绿体基因组蛋白编码序列RSCU分析表明：氨基酸含量较高的有亮氨酸(Leu)和精氨酸(Arg)，均为6个密码子编码，编码精氨酸的是UUA、UUG、CUU、CUC、CUA和CUG；编码亮氨酸的有AGA、AGG、CGU、CGC、CGA和CGG；除此之外，蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)均只有1个密码子编码，分别是AUG和UGG，其余氨基酸密码子编码个数分别为2~4个。
表 4 梁山慈竹叶绿体基因组蛋白编码序列RSCU分析Table 4 RSCU of protein coding region in the chloroplast of D. farinosus氨基酸 密码子 数量 RSCU 氨基酸 密码子 数量 RSCU 氨基酸 密码子 数量 RSCU 氨基酸 密码子 数量 RSCU Phe UUU* 644 1.29 Tyr UAU* 532 1.59 Ser UCU* 343 1.58 Cys UGU* 151 1.53 Phe UUC 351 0.71 Tyr UAC 137 0.41 Ser UCC* 260 1.19 Cys UGC 47 0.47 Leu UUA* 634 1.94 TER UAA* 28 1.56 Ser UCA* 222 1.02 Arg AGA* 322 1.75 Leu UUG* 362 1.11 TER UAG 14 0.78 Ser UCG 119 0.55 Arg AGG 119 0.64 Leu CUU* 420 1.29 TER UGA 12 0.67 Ser AGU* 273 1.25 Arg CGU* 261 1.41 Leu CUC 138 0.42 Trp UGG* 328 1.00 Ser AGC 89 0.41 Arg CGC 95 0.51 Leu CUA 295 0.90 Gln CAA* 477 1.53 Thr ACU* 403 1.68 Arg CGA* 234 1.27 Leu CUG 107 0.33 Gln CAG 148 0.47 Thr ACC 181 0.75 Arg CGG 76 0.41 Ile AUU* 740 1.48 Glu GAA* 705 1.46 Thr ACA* 259 1.08 Gly GGU* 421 1.24 Ile AUC 295 0.59 Glu GAG 263 0.54 Thr ACG 116 0.48 Gly GGC 145 0.43 Ile AUA 461 0.92 Lys AAA* 647 1.44 Ala GCU* 493 1.73 Gly GGA* 538 1.58 Met AUG* 416 1.00 Lys AAG 253 0.56 Ala GCC 172 0.60 Gly GGG 259 0.76 Val GUU* 382 1.47 Asp GAU* 522 1.54 Ala GCA* 343 1.20 Pro CCU* 286 1.48 Val GUC 126 0.49 Asp GAC 155 0.46 Ala GCG 135 0.47 Pro CCC* 196 1.01 Val GUA* 390 1.50 His CAU* 311 1.47 Asn AAU* 528 1.48 Pro CCA* 209 1.08 Val GUG 139 0.54 His CAC 112 0.53 Asn AAC 187 0.52 Pro CCG 84 0.43 说明：*表示RSCU大于1的高频密码子。 梁山慈竹叶绿体基因组RSCU大于1的密码子数目为34个(分别为UUU、UUA、UUG、CUU、AUU、AUG、GUU、GUA、UCU、UCC、UCA、AGU、ACU、ACA、GCU、GCA、AAU、UAU、UAA、UGG、CAA、GAA、AAA、GAU、CAU、UGU、AGA、CGU、CGA、GGU、GGA、CCU、CCC和CCA)，即筛选出了34个高频密码子，其中以A、U、C、G结尾的密码子分别有13、16、2和1个，这说明密码子偏好以A和U结尾，RSCU较高的3个密码子分别为UUU (1.94)、CUA (1.73)和UCU (1.75)。
2.3 中性绘图分析
中性绘图分析量化自然选择和突变压力之间的关系，阐明3个密码子位置之间的联系。结果表明：横坐标GC3的数值为23.14%~41.23%，纵坐标GC12的数值为39.04%~61.00% (图1)。梁山慈竹的Pearson相关系数为0.17，呈正相关关系，数据拟合后的回归系数为0.1868，决定系数(R2)较小，为0.0282，GC12和GC3的相关性不显著，说明其叶绿体基因组密码子偏好性受自然选择影响较大。
2.4 ENC-plot绘图分析
图2显示：ENC分布并不紧密，少量分布在标准曲线附近，还有个别分布在标准曲线上侧，位点的ENC均大于35，与预期ENC值有差距。说明梁山慈竹密码子偏好性较弱且自然选择和突变都对其偏好性有影响。由于落在标准曲线下方的基因点数量比较多，所以梁山慈竹基因组密码子使用偏好性主要受自然选择的影响。
2.5 PR2-plot绘图分析
图3显示：基因位点在平面图4个区域内分布并不均匀，在A3/(A3+T3)＜0.5和G3/(G3+C3)＞0.5区域范围内分布最多。表明第3位碱基使用频率为：T＞A、G＞C，梁山慈竹叶绿体基因组密码子的第3位碱基在选择上具有偏好性，同时说明其密码子使用偏好性主要受自然选择的影响。
2.6 最优密码子的确定
对梁山慈竹的ENC进行升序排列，前10%为高表达基因，即rps18、rpl16、psbA、rps14、rps11，后10%为低表达基因，即 ycf3、cemA、ndhE、atpE、infA。梁山慈竹的RSCU和ΔRSCU表明(表5)：梁山慈竹叶绿体基因组有32个高频密码子，筛选出GCA、GCU等25个高表达密码子，最终确定18个密码子作为梁山慈竹叶绿体基因组的最优密码子，分别为UAA、GCA、GCU、UUC、GGU、AAA、CUU、UUA、CCA、CCU、CAA、AGA、CGU、AGU、UCC、ACU、GUA、GUU。其中16个以A/U结尾，2个以C结尾。
表 5 梁山慈竹叶绿体基因组各氨基酸的RSCU分析及最优密码子分析Table 5 RSCU analysis and optimal codon analysis of amino acids in chloroplast genome of D. farinosus氨基酸 密码子 基因组
RSCU高表达
RSCU低表达
RSCUΔRSCU 氨基酸 密码子 基因组
RSCU高表达
RSCU低表达
RSCUΔRSCU Ter UAA*** 1.560 0 1.800 0 1.200 0 0.600 0 Met AUG 1.000 0 1.000 0 1.000 0 0 UAG 0.780 0 0.600 0 1.200 0 −0.600 0 Asn AAC* 0.520 0 0.893 6 0.625 0 0.268 6 UGA 0.670 0 0.600 0 0.600 0 0 AAU 1.480 0 1.106 4 1.375 0 −0.268 6 Ala GCA** 1.200 0 1.200 0 0.734 7 0.465 3 Pro CCA** 1.080 0 0.800 0 0.500 0 0.300 0 GCC 0.600 0 0.457 1 0.653 1 −0.196 0 CCC 1.010 0 0.800 0 1.166 7 −0.366 7 GCG 0.470 0 0.228 6 0.734 7 −0.506 1 CCG 0.430 0 0.444 4 1.000 0 −0.555 6 GCU* 1.730 0 2.114 3 1.877 6 0.236 7 CCU*** 1.480 0 1.955 6 1.333 3 0.622 3 Cys UGC** 0.470 0 0.400 0 0 0.400 0 Gln CAA* 1.530 0 1.500 0 1.368 4 0.131 6 UGU 1.530 0 1.600 0 2.000 0 −0.400 0 CAG 0.470 0 0.500 0 0.631 6 −0.131 6 Asp GAC* 0.460 0 0.500 0 0.411 8 0.088 2 Arg AGA* 1.750 0 1.723 4 1.534 9 0.188 5 GAU 1.540 0 1.500 0 1.588 2 -0.088 2 AGG 0.640 0 0.319 1 0.837 2 −0.518 1 Glu GAA 1.460 0 1.189 2 1.578 9 −0.389 7 CGA 1.270 0 1.276 6 1.395 3 −0.118 7 GAG** 0.540 0 0.810 8 0.421 1 0.389 7 CGC 0.510 0 0.319 1 0.837 2 −0.518 1 Phe UUC** 1.290 0 1.041 7 0.650 0 0.391 7 CGG 0.410 0 0.319 1 0.279 1 0.040 0 UUU 0.710 0 0.958 3 1.350 0 −0.391 7 CGU*** 1.410 0 2.042 6 1.116 3 0.926 3 Gly GGA 1.580 0 1.253 7 1.818 2 −0.564 5 Ser AGC 0.410 0 0.384 6 0.470 6 −0.086 0 GGC 0.430 0 0.417 9 0.484 8 −0.066 9 AGU** 1.250 0 1.846 2 1.411 8 0.434 4 GGG 0.760 0 0.119 4 0.363 6 −0.244 2 UCA 1.020 0 0.615 4 1.058 8 −0.443 4 GGU*** 1.240 0 2.209 0 1.333 3 0.875 7 UCC*** 1.190 0 1.769 2 0.941 2 0.828 0 His CAC** 0.530 0 0.941 2 0.571 4 0.369 8 UCG 0.550 0 0.153 8 0.705 9 −0.552 1 CAU 1.470 0 1.058 8 1.428 6 −0.369 8 UCU 1.580 0 1.230 8 1.411 8 −0.181 0 Ile AUA 0.920 0 0.850 7 0.949 4 −0.098 7 Thr ACA 1.080 0 1.181 8 1.176 5 0.005 3 AUC* 0.590 0 0.626 9 0.531 6 0.095 3 ACC 0.500 0 0.818 2 1.058 8 −0.240 6 AUU 1.480 0 1.522 4 1.519 0 0.003 4 ACG 0.480 0 0.363 6 0.588 2 −0.224 6 Lys AAA** 1.440 0 1.471 7 1.155 6 0.316 1 ACU** 1.680 0 1.636 4 1.176 5 0.459 9 AAG 0.560 0 0.528 3 0.844 4 −0.316 1 Val GUA*** 1.500 0 1.767 4 1.257 1 0.510 3 Leu CUA 0.900 0 0.833 3 1.295 5 −0.462 2 GUC 0.490 0 0 1.028 6 −1.028 6 CUC 0.420 0 0 0.545 5 −0.545 5 GUG 0.540 0 0.372 1 0.342 9 0.029 2 CUG 0.330 0 0.250 0 0.477 3 −0.227 3 GUU** 1.470 0 1.860 5 1.371 4 0.489 1 CUU* 1.290 0 1.333 3 1.227 3 0.106 0 Trp UGG 1.000 0 1.000 0 1.000 0 0 UUA*** 1.940 0 2.166 7 1.022 7 1.144 0 Tyr UAC** 0.410 0 0.521 7 0.166 7 0.355 0 UUG 1.110 0 1.416 7 1.431 8 −0.015 1 UAU 1.590 0 1.478 3 1.833 3 −0.355 0 说明: 高频密码子(RSCU＞1.00)带下划线；*. ΔRSCU≥0.08；**. ΔRSCU≥0.3；***. ΔRSCU≥0.5; 加粗的密码子表示最优密码子。 2.7 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析
将梁山慈竹基因组密码子使用频率与巨龙竹、粉麻竹、小叶龙竹、硬头黄竹、大肠埃希菌、烟草、拟南芥和酿酒酵母等物种的基因组密码子使用频率进行比较(图4)。结果显示：梁山慈竹与巨龙竹、粉麻竹、小叶龙竹和硬头黄竹的密码子使用频率为0.5~2.0，说明它们的密码子使用偏好性相似，推测具有亲缘关系的禾本科Gramineae牡竹属植物叶绿体基因组密码子偏好性相似；在大肠埃希菌、烟草、拟南芥和酿酒酵母的密码子使用比值中筛选≥2.0或≤0.5的密码子，分别有28和15、15、14个，表明梁山慈竹与这些物种在同义密码子的偏好性上有一定差异。
图 4 梁山慈竹与其他物种密码子偏好性比较Figure 4 Comparison of codon preference between D. farinosus and other species2.8 对应分析
将梁山慈竹的51个叶绿体基因的基因功能分为光合系统基因、遗传系统基因、其他基因和未知功能基因四大类，在计算RSCU的基础上将各个基因分布到59维的向量空间。对应分析结果(图5)显示：前4个向量轴分别存在18.3%、16.8%、15.6%和15.4%的差异，前4向量轴累计差异为66.1%，4个轴对密码子均有不同程度的影响；第1轴的值大于其他轴，说明第1轴对梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的影响较大。对第1轴与CAI、CBI、FOP、ENC和GC3s等指数进行进一步的相关分析发现：梁山慈竹基因在第1轴上的坐标值与CAI (r=−0.001 7，P＜0.01)、CBI (r=0.099 0，P＜0.01)、FOP (r=0.083 0，P＜0.01)、ENC (r=0.112 0，P＜0.01)、GC3s (r=−0.145 0，P＜0.01)间具有极显著的相关关系，其中CAI和GC3s第1轴具有负相关关系，表明基因组密码子的偏好性不止受单一因素的影响，自然选择、基因突变均有可能影响梁山慈竹基因组密码子使用偏好性[18]。
3. 讨论
本研究对梁山慈竹叶绿体基因组密码子进行使用偏好性分析，筛选出51条CDS序列，分析表明：GC1＞GC2＞GC3，密码子在3个位置上的分布并不均匀，密码子偏好使用以A或U结尾的碱基，且梁山慈竹叶绿体基因组的ENC均值为49.51，表明其叶绿体基因组密码子使用偏好性较弱。这与乳油木Vitellaria paradoxa[19]和二乔玉兰Magnolia soulangeana[20]等植物叶绿体基因组密码子偏好性相似。
对梁山慈竹叶绿体基因组密码子进行中性绘图、ENC-plot分析、PR2-plot分析和对应分析。在中性绘图分析中，回归系数为0.412 8，说明密码子偏好性更多受到自然选择的影响；在ENC-plot分析中，多数基因离标准曲线距离较远，实际ENC和预期ENC有差距，表明该部分基因的密码子偏好性主要受自然选择的影响；在PR2-plot绘图分析中，大部分基因位于平面图的右下方，即T＞A、G＞C，表明其密码子的使用更多受自然选择的影响。综上所述，影响梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的主要原因是自然选择。该研究结果与巨桉Eucalyptus grandi[21]、灰毛浆果楝Cipadessa cinerascens、酸枣Ziziphus jujuba var. spinosa[22]和云南油杉Keteleeria evelyniana[23]等叶绿体基因组密码子偏好性研究结果基本一致；但在对4种蔷薇科 Rosaceae果树[24]和银白杨Populus alba[25]的研究中发现：突变是影响密码子偏好性的主要因素。这说明密码子的使用偏好性受自然选择或基因突变因素影响。基于RSCU的对应分析表明：梁山慈竹的密码子使用变异原因除了突变和自然选择之外，还有其他的因素，这其中光合系统基因和遗传系统基因分布相对集中，各类基因密码子使用偏好性较为接近。该结论与木薯Manihot esculenta[26]和高山松Pinus densata[27]的研究结果一致。密码子使用频率比较结果显示：梁山慈竹与禾本科牡竹属的植物密码子偏好性相似，在基因选择外源系统表达时，可以选择密码子偏好性差异相对较小的酿酒酵母，在选择大肠埃希菌、烟草和拟南芥作为外源表达宿主时，需要根据密码子使用偏好性进行碱基优化，从而使基因在宿主体内更好地表达。
最优密码子分析表明：梁山慈竹叶绿体基因组有GCU、GAU以及GGU等18个最优密码子，最优密码子大部分以A或U结尾。该结果与抽筒竹Gelidocalamus tessellatus[28]和毛竹Phyllostachys edulis[29]叶绿体基因组最优密码子分析结果一致，这可能与亲缘关系相近，但不同物种之间叶绿体基因组进化过程中的相对保守性有关系[21]。通过筛选获取梁山慈竹偏好使用密码子，可进一步对目标基因进行密码子优化，提高梁山慈竹的竹笋产量和造纸纤维含量，以及利用新一代精准基因编辑工具CRISPR/Cas9优化梁山慈竹密码子，从而改造梁山慈竹基因组编辑的Cas9基因，提高该基因在梁山慈竹中的表达水平[30]。
4. 结论
本研究通过分析梁山慈竹叶绿体基因组的CDS序列，对梁山慈竹的叶绿体基因组进行生物信息学分析，筛选出梁山慈竹叶绿体基因组有GCU、GAU以及GGU等18个最优密码子。研究结果表明：影响梁山慈竹密码子偏好性的主要因素是自然选择。研究结果为后续在分子层面上利用基因工程开发梁山慈竹优良资源提供参考。
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图 3 主要优势树种Pearson与生态位重叠值的回归分析
Figure 3 Regression analysis of Pearson rank correlation with niche overlap of dominant tree species
表 1 研究区常绿阔叶林群落样地基本情况
Table 1. Basic situation of survey sites for broadleaf evergreen forest community survey in the study area
样地号 类型 海拔/m 群落类型 样地面积/m2 坡位 密度/(株·hm−2) 平均胸径/cm 郁闭度 1 天然林 1 163 常绿阔叶林 14 000 上 3 698 7.20 75.8 2 天然林 1 163 常绿阔叶林 400 上 2 750 9.87 93.9 3 天然林 1 146 常绿阔叶林 400 中 4 775 8.39 94.5 4 天然林 1 136 常绿阔叶林 400 中 2 100 12.15 90.7 5 天然林 1 151 常绿阔叶林 400 中 4 150 6.25 88.2 6 天然林 1 121 常绿阔叶林 400 中 1 525 16.86 93.4 7 天然林 1 176 常绿阔叶林 400 上 2 300 11.82 94.0 
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表 2 优势植物重要值与生态位宽度
Table 2. Important value and niche breadth of dominant plant species
编号 种名 个体数 分布频度 重要值/% Levins生态位宽度(BL) Shannon生态位宽度(BS) sp1 木荷 Schima superba 984 41 14.30 25.91 3.42 sp2 甜槠 Castanopsis eyrei 682 41 12.85 28.20 3.49 sp3 黄山松 Pinus taiwanensis 245 40 12.23 29.67 3.52 sp4 锥栗 Castanea henryi 261 38 6.02 21.39 3.30 sp5 马银花 Rhododendron ovatum 665 38 5.47 19.43 3.23 sp6 麂角杜鹃 Rhododendron latoucheae 500 35 4.30 18.47 3.19 sp7 大萼黄瑞木Adinandra glischroloma var. macrosepala 284 33 2.83 4.85 2.44 sp8 江南山柳 Clethra delavayi 189 35 2.45 17.07 3.17 sp9 野漆树 Toxicodendron succedaneum 112 33 2.21 24.31 3.32 sp10 浙江新木姜子 Neolitsea chekiangensis 157 28 1.91 11.83 2.79 sp11 微毛柃 Eurya hebeclados 152 27 1.87 12.21 2.89 sp12 短柄枹栎 Quercus glandulifera 115 27 1.86 19.59 3.11 sp13 江南越橘 Vaccinium mandarinorum 135 29 1.75 16.06 3.04 sp14 小叶青冈 Cyclobalanopsis gracilis 90 23 1.62 10.83 2.69 sp15 黄背越橘 Vaccinium iteophyllum 100 27 1.53 19.38 3.11 sp16 树参 Dendropanax dentiger 97 23 1.48 10.04 2.64 sp17 云山青冈 Cyclobalanopsis sessilifolia 72 22 1.37 14.64 2.84 sp18 红楠 Machilus thunbergii 50 22 1.15 13.30 2.82 sp19 吴茱萸五加 Gamblea ciliata var. evodiifolia 47 22 1.09 17.96 2.98 sp20 薄叶山矾 Symplocos anomala 43 20 1.02 14.11 2.81 sp21 华中樱 Cerasus conradinae 38 21 1.02 15.70 2.89
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表 3 优势植物总体关联性
Table 3. Overall associations of dominant plant species
方差比率(VR) 检验统计量(W) 卡方临界值(0.95, 41) 卡方临界值(0.05, 41) 检验结果 2.84 116.73 27.33 56.94 显著正联结
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表 4 主要优势树种χ2统计量检验
Table 4. χ2 correlation test of dominant population of dominant tree species
编号 sp1 sp2 sp3 sp4 sp5 sp6 sp7 sp8 sp9 sp10 sp11 sp12 sp13 sp14 sp15 sp16 sp17 sp18 sp19 sp20 sp2 0.00 sp3 0.00 0.00 sp4 0.00 0.00 2.75 sp5 0.00 0.00 2.75 0.42 sp6 0.00 0.00 1.03 3.24 3.24 sp7 0.00 0.00 0.61 0.02 1.92 2.20 sp8 0.00 0.00 1.03 0.01 0.01 4.11 0.13 sp9 0.00 0.00 0.61 0.02 0.02 6.75 0.87 2.20 sp10 0.00 0.00 0.16 0.34 0.34 0.15 0.00 2.30 0.67 sp11 0.00 0.00 0.11 0.36 0.36 1.83 2.16 1.83 0.04 0.00 sp12 0.00 0.00 0.11 3.48 0.36 10.34 5.29 1.83 5.29 0.00 1.43 sp13 0.00 0.00 0.21 0.67 4.57 0.52 3.50 0.06 0.02 0.26 0.19 3.02 sp14 0.00 0.00 0.02 0.05 0.05 0.59 0.00 0.59 0.00 0.02 0.81 0.06 1.50 sp15 0.00 0.00 0.11 0.36 3.48 1.83 2.16 1.83 0.41 2.13 1.43 3.57 6.07 0.06 sp16 0.00 0.00 0.02 0.97 0.05 0.01 0.00 0.01 0.62 0.02 0.06 0.81 0.73 0.79 0.06 sp17 0.00 0.00 0.01 0.02 1.15 1.29 0.03 0.06 0.03 0.10 0.00 0.43 1.78 1.35 0.00 0.53 sp18 0.00 0.00 0.01 0.02 0.02 0.41 0.39 0.06 0.39 0.10 0.00 3.96 1.78 0.28 1.77 0.53 0.04 sp19 0.00 0.00 0.01 0.02 0.02 0.41 2.01 0.06 2.01 0.10 1.77 3.96 0.42 0.01 3.96 1.86 2.10 0.19 sp20 0.00 0.00 0.00 0.00 1.34 1.59 0.10 0.14 0.22 0.01 0.77 0.05 0.86 0.03 0.05 1.17 0.02 0.02 0.02 sp21 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.26 0.22 0.26 0.22 0.61 0.20 0.05 1.28 0.21 0.05 0.21 0.60 0.02 0.02 0.03 说明：sp1. 木荷；sp2. 甜槠；sp3. 黄山松；sp4. 锥栗；sp5. 马银花；sp6. 麂角杜鹃；sp7. 大萼黄瑞木；sp8. 江南山柳；sp9. 野漆树；sp10. 浙江新木姜子；sp11. 微毛柃；sp12. 短柄枹栎；sp13. 江南越橘；sp14. 小叶青冈；sp15. 黄背越橘；sp16. 树参；sp17. 云山青冈；sp18. 红楠；sp19. 吴茱萸五加；sp20. 薄叶山矾；sp21. 华中樱。
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表 5 主要优势树种的Spearman秩相关系数、Pearson相关系数检验结果比较
Table 5. Comparison of the results of Spearman rank correlation and Pearson rank correlation test of dominant tree species
检验方法 正联结(相关)/对 负联结(相关)/对 无联结/对 极显著 显著 不显著 总数 极显著 显著 不显著 总数 总数 χ2检验 2 8 112 122 0 0 49 49 39 Spearman秩相关系数 21 14 108 142 1 4 63 68 0 Pearson相关系数 25 14 89 128 1 2 79 82 0 说明：极显著P＜0.01；显著P＜0.05；不显著P＞0.05。
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