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麸皮是小麦Triticum aestivum加工工业的副产物，约占小麦籽粒质量的26%。小麦麸皮中含有丰富的阿拉伯木聚糖，占小麦麸皮干质量的18.8%~21.4%[1]。虽然小麦麸皮在食品工业中有应用，但是大部分小麦麸皮被用作动物饲料或酿造原料。此外，小麦麸皮未被充分利用及产生的废物也会造成环境问题。
全球范围内，中国的核桃Juglans regia种植量稳居首位。随着核桃产业的迅猛发展，核桃榨油副产物——核桃饼粕数量急剧增加。这些副产品不仅对环境造成了负担，而且在一定程度上阻碍了核桃类产品的进一步开发和利用[2]。为了突破这一瓶颈，利用核桃饼粕生产核桃肽(WP)，是对核桃饼粕的综合利用、实现核桃饼粕的价值增值、开辟核桃饼粕的应用途径，成为核桃加工新的利润增长点，但是制备核桃活性多肽在提高核桃粕工业价值的同时，也会使生产成本大幅提升[3]。
美拉德反应是还原糖的羰基与氨基酸、肽或蛋白质的氨基之间复杂的非酶褐变反应[4−5]，具有绿色、高效、温和等优点，被认为是修饰天然蛋白质结构和功能特性的最有前途的方法之一[6]，可以改善蛋白或肽的乳化性、发泡性；增加溶解度、抗菌活性、抗氧化性、热稳定性；改善食物质地、风味等[7]。目前大多研究集中在大豆肽、鱼肽等肽类与碳水化合物的美拉德反应方面，但有关核桃肽的研究较少。因此，本研究以核桃肽、阿拉伯木聚糖(AX)和低聚木糖(XOS)为原料，研究阿拉伯木聚糖、核桃肽及其美拉德反应产物理化性质的变化以及糖基化对核桃肽功能特性的影响，为核桃肽功能性食品的开发提供参考。
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材料主要包括麸皮(徐州宏昌)、核桃粕(长春)、低聚木糖(上海源叶)。
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基于前期研究结果[8]，核桃肽通过酶促水解制备。按质量体积比为9∶100的料液比在核桃粉中加入去离子水，进行15 min超声后，在90 ℃条件下处理15 min，冷却至50 ℃，用1 mol·L−1的氢氧化钠调至pH 9.0，加入7 000 ×16.67 nkat·g−1的碱性蛋白酶，在50 ℃下搅拌2 h，沸水浴15 min以灭活酶，通过4 500 r·min−1离心15 min分离水解物的可溶性和不溶性部分，将核桃肽的可溶性部分冷冻干燥备用。
基于前期研究结果[9]，阿拉伯木聚糖通过碱提醇沉法制备。按质量体积比为1∶20的料液比在麸皮中加入去离子水，加入耐高温的α-淀粉酶，在95 ℃、pH 6.0条件下持续搅拌3 h。冷却至室温后加入糖化酶，然后在37 ℃、pH 4.5条件下搅拌过夜，离心得到沉淀，烘干。沉淀按质量体积比为1∶20的料液比加入0.2 mol·L−1 的氢氧化钠溶液，常温搅拌提取12 h。离心并收集上清液，上清液pH调至4.0。上清液中加入无水乙醇，离心得到粗多糖沉淀，加入适量去离子水复溶沉淀，加入蛋白酶持续搅拌4 h，然后灭活10 min并再次离心去除蛋白。取上清液进行透析后，经离心除去不溶性多糖，收集上清液进行旋蒸浓缩后冻干，得到阿拉伯木聚糖样品，保存备用。
将1 g核桃肽、2 g阿拉伯木聚糖或低聚木糖溶于100 mL去离子水中，之后将样品进行冻干，收集冻干粉末，放置于预热到80 ℃的干燥器中，利用饱和溴化钾溶液控制体系内相对湿度为79%，反应5 h得到核桃肽的糖基化产物。将产物加蒸馏水溶解，进行透析和离心，以去除游离氨基酸和不溶性成分。
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(1)蛋白质量分数测定参考GB
5009.5 —2016凯氏定氮法[10]，根据标准曲线，采用BCA试剂盒法进行测定。(2)总糖质量分数测定使用苯酚-硫酸法[11]，根据标准曲线，测定波长490 nm处的吸光度。
(3)溶解度测定：称取10 mg的阿拉伯木聚糖、核桃肽或糖基化产物于2 mL离心管中，加入1 mL去离子水，在室温下混合90 min(每30 min摇匀5 s)，9 000 r·min−1离心10 min，去除上清液，将离心管及内部沉淀真空冷冻干燥后称量[12]。每份样品平行测定3次。
(4)根据标准曲线，相对分子量测定采用高效液相色谱仪(HPLC)。①多糖分子量测定[13]：以不同分子量的葡聚糖(分子量分别为10、40、70、500、2 000 kDa)作为标准品。色谱条件如下：Ultrahydrogel Column Linear凝胶色谱柱(10 μm，7.8 mm×300.0 mm)，柱温为40 ℃，流速为0.6 mL·min−1，流动相为0.1 mol·L−1的硝酸钠溶液，进样量为20 μL，运行时间为25 min。②肽分子量测定[14]：以不同分子量的物质作为标准品。色谱条件如下：TSKgel 2000 SWXL色谱柱(5 μm，7.8 mm×300.0 mm)，柱温为30 ℃，流速为0.5 mL·min−1，流动相为V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=450∶550∶1，进样量为20 μL，运行时间为40 min。
(5)单糖组成成分的测定采用气相色谱法测定阿拉伯木聚糖的单糖组成，参考WANG等[15]的方法，并稍作修改。以标准单糖(鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖)做混合标准单糖简称混标。称取5 mg阿拉伯木聚糖或标准品于三氟乙酸中，120 ℃水解4 h后用硼氢化钠还原，再经V(乙酸酐) ∶V(吡啶)=1∶1进行乙酰化，过0.22 μm有机滤膜待测。测定参数如下：HP-5MS色谱柱，进样口温度为250 ℃，进样量为2 μL，流速为1.0 mL·min−1，氮气载气分流体积比为1∶20。
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参考文献[16]的方法测定接枝度。精准称取40 mg的邻苯二甲醛(OPA)溶于1 mL的甲醇中，与质量浓度为20%的十二烷基硫酸钠(SDS) 2.5 mL、0.1 mol·L−1的四硼酸钠25.0 mL以及100.0 μL的β-巯基乙醇混合，然后用蒸馏水定容至50.0 mL，得到OPA试剂，现配现用。测定时，在200 μL样品溶液加入4 mL的OPA试剂，室温避光保存5 min。然后测定波长340 nm处的吸光度。以OPA试剂中加入200 μL蒸馏水的混合物作为空白。同时，用L-亮氨酸标准溶液(0~0.5 g·L−1)校准曲线计算游离氨基质量浓度。
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糖基化产物用蒸馏水分别稀释至0.05和0.50 g·L−1，以蒸馏水作为空白对照，分别在波长294和420 nm处测定吸光度，重复3次取平均值。波长294 nm处的吸光度表示美拉德反应的中间产物含量；波长420 nm处的吸光度表示反应过程中最终产物含量，例如类黑素[17]。
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粒径是影响肽功能特性的重要因素之一，因此分析糖基化改性前后核桃肽的平均粒径。使用Malvern Mastersizer 2000型激光粒度仪和Hydro 2000S取样装置测定样品的平均粒径。使用乙醇作为分散剂材料来读取样品，每个样品平行测量3次，最后取平均值。Zeta电位是表征分散系稳定性的重要指标之一。使用Malvern Zetasizer Nano-Z设备测量样品的Zeta电位，以2 g·L−1的质量浓度制备样品溶液，在室温下测定溶液的Zeta电位，每个样品平行测量3次，最后取平均值[18]。
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将待测样品涂抹于导电胶的表面，喷涂约10 nm的电镀层，在15 kV加速电压下进行电镜扫描，放大500倍[19]，观察阿拉伯木聚糖、低聚木糖、核桃肽以及其糖基化产物的微观形态。
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差示扫描量热法是评估蛋白质、肽等物质热稳定性的常用技术手段，可通过变性温度(Td)和焓值变化(ΔH)来表示稳定性的大小。Td用于描述蛋白的热稳定性，而ΔH则表示克服变性过程中非共价所需的能量。在通氮气条件下，利用差示扫描量热仪对样品的热稳定性进行测定。将5~10 mg样品装入DSC坩埚中，采用铝片进行密封处理。仪器参数设定如下[20]：升温速率为10 ℃·min−1，温度为25~110 ℃，气体流速为50 mL·min−1。以空铝坩埚作为空白对照。
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在糖基化反应中，游离巯基和二硫键交换在蛋白质交联和聚集中起着重要作用。参考文献[21]，准确称取40 mg 5,5-硫硝基苯甲酸溶于10 mL的Tris-甘氨酸缓冲液(0.086 mol·L−1 Tris，0.090 mol·L−1甘氨酸，4.000 mmol·L−1乙二胺四乙酸，pH 8.0)中，配制成Ellman试剂。用Tris-HCl缓冲液将样品配制成质量浓度为6 g·L−1的溶液，在10 000 r·min−1条件下离心10 min。吸取2 mL离心后的样品，加入 80 μL Ellman试剂混均，反应5 min，测定波长412 nm处的吸光度，即为游离巯基质量摩尔浓度。吸取2 mL样品上清液，加入β-巯基乙醇溶液(体积分数为0.2%)混匀，反应2 h后加入4 mL三氯乙酸溶液(质量浓度为12%)，反应1 h，10 000 r·min−1条件下离心10 min，再用三氯乙酸溶液重复洗涤沉淀，将沉淀用3 mL Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)溶解，测定波长412 nm处的吸光度，即为总巯基质量摩尔浓度。
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2, 2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力测定参考LIU等[22]的方法，2, 2-二苯基-1-苦味肼(DPPH)自由基清除能力测定参考SUN等[23]的方法，羟自由基清除能力测定参考ZHANG等[24]的方法，氧自由基吸收能力(ORAC)测定参考ZHANG等[25]的方法。
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采用SPSS 26.0进行t检验和方差分析，结果以平均值±标准差表示，显著水平为0.05。利用Origin 2022作图。
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通过高效液相色谱图(图1A)可知：信号峰出现在13.56 min时，主要为高相对分子量组分。通过气相色谱图(图1B)可知：混标从左至右出峰顺序为阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)，发现阿拉伯木聚糖主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖组成。从表1可见：阿拉伯木聚糖的蛋白和总糖质量分数分别为0.73%和81.39%，相对分子量为413.45 kDa，阿拉伯糖和木糖的质量分数之和约占整体的90%。
图 1 阿拉伯木聚糖的高效液相色谱图(A)和气相色谱图(B)
Figure 1. High performance liquid chromatogram (A) and gas chromatogram (B) of arabinoxylan
表 1 阿拉伯木聚糖的理化性质
Table 1. Physical and chemical properties of arabinoxylan
样品 相对分子量/kDa 总糖质量分数/% 蛋白质量分数/% 溶解度/% 各单糖质量分数/% 阿拉伯糖 木糖 葡萄糖 半乳糖 阿拉伯木聚糖 413.45±1.98 81.39±2.05 0.73±0.11 72.00±2.65 61.52±2.10 27.27±2.48 8.48±0.45 2.73±0.07 -
为确定核桃肽-阿拉伯木聚糖的反应产物(WP-AX)和核桃肽-低聚木糖的反应产物(WP-XOS)的美拉德反应程度，对接枝度和褐变程度进行了分析。如图2A所示：WP-AX在美拉德反应前后的游离氨基质量浓度分别为0.10和0.09 g·L−1，WP-XOS在美拉德反应前后的游离氨基质量浓度分别为0.09和0.04 g·L−1，表明游离氨基质量浓度在美拉德反应后有所降低。经计算，WP-AX、WP-XOS的接枝度分别为12.31%±3.52%和54.46%±3.26%，表明核桃肽中分别有12.31%和54.46%的游离氨基在美拉德反应后分别与阿拉伯木聚糖和低聚木糖结合。
图 2 美拉德反应前后对游离氨基(A)、中间产物生成量(B)和褐变程度(C)的影响
Figure 2. Effect of Maillard reaction on free amino groups (A), intermediate product formation (B) and browning degree (C)
D(294)和D(420)能够分别反映美拉德反应中无色中间体化合物生成量和糖基化产物褐变程度[26]。吸光度越低，褐变程度越小，说明糖基化反应程度越小，反之越大。如图2B所示：WP-AX和WP-XOS的中间产物显著上升(P＜0.05)，而且WP-XOS比WP-AX产生了更多的中间产物——还原酮和高级产物类黑素。如图2C示：WP-XOS的褐变程度具有显著差异(P＜0.05)，且WP-XOS的褐变程度明显高于WP-AX。
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核桃肽在美拉德反应后的分子量分布如图3所示。图3A为核桃肽分子量的HPLC洗脱，核桃肽中存在多种大小不一的多肽片段，其分子量主要分布在3 000 Da以下，其中小于2 000 Da的占64.35%，小于1 000 Da的占37.28%，表明核桃肽富含由2~10个氨基酸残基组成的寡肽。图3B为WP-AX分子量的HPLC洗脱，WP-AX小于1 000 Da的占43.59%，相比于核桃肽，WP-AX寡肽部分的含量有一定程度的提高。图3C为WP-XOS分子量的HPLC洗脱，而WP-XOS小于1 000 Da的只占26.30%，但分子量大于3 000 Da部分占40.20%，相对于核桃肽有明显的提高。这2种不同的情况可能是因为肽在美拉德反应过程中存在2种转化方式：①肽直接参与美拉德反应生成产物；②通过热降解形成小分子肽，这些小分子肽再参与美拉德反应生成产物，说明美拉德反应的最佳肽段可能存在原料差异性。
图 3 WP(A)、WP-AX(B)、WP-XOS(C)的高效液相色谱图(HPLC)
Figure 3. High performance liquid chromatograms (HPLC) of WP (A), WP-AX (B), and WP-XOS (C)
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如表2所示：与核桃肽相比，引入碳水化合物进行糖基化后，WP-AX和WP-XOS的游离巯基和总巯基显著增加(P＜0.05)。与WP-AX相比，WP-XOS的二硫键质量摩尔浓度更高(P＜0.05)。因此，可推断出WP-XOS的结构更稳定。
表 2 WP、WP-AX和WP-XOS的巯基及二硫键质量摩尔浓度分析
Table 2. Analysis of thiol and disulfide bond content in WP, WP-AX, and WP-XOS
样品 总糖质量分数/% 蛋白质量分数/% 溶解度/% 总巯基/(μmol·g−1) 游离巯基/(μmol·g−1) 二硫键/(μmol·g−1) WP 9.96±0.24 c 77.28±0.10 a 99.68±0.55 a 7.49±0.01 c 5.66±0.25 c 0.91±0.12 b WP-AX 36.27±0.77 a 23.82±0.30 c 94.75±1.19 b 24.79±0.02 a 23.01±0.28 a 0.89±0.13 b WP-XOS 19.18±0.75 b 50.15±1.11 b 96.35±1.56 b 10.97±0.03 b 7.18±0.23 b 1.90±0.10 a 说明：WP为核桃肽；WP-AX为核桃肽和阿拉伯木聚糖的美拉德反应产物；WP-XOS为核桃肽和低聚木糖的美拉德反应产物。同列不同小写字母表示不同样品间差异显著(P＜0.05)。 -
由图4A可知：未处理的核桃肽颗粒相对较大，经过糖基化反应后，WP-AX和WP-XOS的粒径显著降低(P＜0.05)，分别为66.45和10.93 μm，这可能是核桃肽与碳水化合物共价结合后，其结构发生了变化，从而使原有的片状结构被破坏，形成粒径更小的体系。
图 4 不同样品美拉德反应前后的粒径图(A)和Zeta电位图(B)
Figure 4. Particle size plots (A) and Zeta potential plots (B) before and after the Maillard reaction of different samples
由图4B可知：WP-AX的Zeta电位绝对值显著低于WP-XOS (P＜0.05)，这可能是引入的阿拉伯木聚糖的Zeta电位绝对值显著低于低聚木糖(P＜0.05)，说明WP-XOS溶液的稳定性比WP-AX好。
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由图5所示：阿拉伯木聚糖呈现丝状的纤维结构，没有规律性；低聚木糖表面光滑，呈相互连接的状态；核桃肽呈现不同大小的片状结构。经过糖基化反应后，WP-AX和WP-XOS呈丝状分支结构，这可能是因为核桃肽分别与阿拉伯木聚糖和低聚木糖发生了共价结合，导致核桃肽的结构遭到破坏，分子充分展开，从而使核桃肽从片状结构变为片状带有丝状分支的结构。因为WP-XOS的接枝程度比WP-AX高，所以表现出更多的丝状无序结构。
图 5 不同样品美拉德反应前后的扫描电镜图
Figure 5. Scanning electron microscopy images of different samples before and after Maillard reaction
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如图6所示：WP、AX和XOS的变性温度(Td)分别为82.18、53.23、48.52 ℃，焓值变化(ΔH)分别为3.11、0.60、9.66 J·g−1，WP-AX和WP-XOS的玻璃化转变温度(Tg)为95.78、83.53 ℃。WP经过糖基化改性后，WP-AX和WP-XOS并未出现热变形峰，而是出现了玻璃化转变峰，热变形峰可能是样品不稳定或者样品结构破坏所导致的，这是不可逆的，但是玻璃化转变是可逆的，说明经糖基化改性后热稳定性增加。
图 6 不同样品美拉德反应前后的热分析图谱
Figure 6. Thermal analysis profiles of different samples before and after the Maillard reaction
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如图7A所示：与核桃肽相比，当阿拉伯木聚糖和低聚木糖分别与核桃肽共价结合时，产物的清除能力显著提升(P＜0.05)。与WP-AX相比，WP-XOS表现出了更强的自由基清除能力(P＜0.05)。
图 7 不同样品美拉德反应前后的抗氧化活性比较
Figure 7. Comparison of antioxidant activity before and after Maillard reaction of different samples
如图7B所示：当阿拉伯木聚糖和低聚木糖分别与核桃肽进行糖基化反应后，其羟自由基清除能力得到了显著提高(P＜0.05)，同时，WP-XOS表现出了更强的自由基清除能力(P＜0.05)。
如图7C所示：由于核桃肽本身的ABTS自由基清除能力已经很高，当阿拉伯木聚糖和低聚木糖分别与核桃肽进行糖基化反应后，WP-AX和WP-XOS并未表现出更强的自由基清除能力。这是因为WP-AX的接枝度较低，引入了清除能力较低的阿拉伯木聚糖，从而导致了WP-AX比核桃肽表现出了更弱的自由基清除能力(P＜0.05)。
如图7D所示：与核桃肽相比，经过糖基化后，WP-AX和WP-XOS的氧自由基吸收能力(ORAC)显著提升(P＜0.05)，其中WP-AX表现出了更强的氧自由基吸收能力(P＜0.05)。
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现阶段大量研究发现：阿拉伯木聚糖具有抗氧化、抗炎和改善记忆等多种生物活性，是蛋白质和多肽等生物活性物质的理想载体[27−29]。低聚木糖生物活性范围较宽，具有抗氧化活性、抗菌、抗感染、抗过敏以及抗炎等特性，能选择性增加细胞活性，进行免疫调节等[30]，是一种理想安全的食品原料[31]。此外核桃肽的生物活性潜力巨大，具有抗氧化、降血压、提高免疫活性、抗疲劳和改善记忆等功效[32]。美拉德反应可以提高蛋白质和肽的抗氧化、乳化等性能[33]。
本研究表明：核桃肽2种不同底物的美拉德反应导致了终产物中肽分子量分布的不同变化，说明小分子肽和碳水化合物的交联作用跟大分子肽的热降解作用有关[34]。核桃肽糖基化后，游离巯基和总巯基质量摩尔浓度都显著增加，一方面，可能是由于核桃肽在糖基化反应过程中，空间结构改变，使得嵌入内部的游离巯基暴露，从而质量摩尔浓度增加[35]；另一方面，可能是糖基化反应导致二硫键断裂，使二硫键转化成新的巯基[36]，游离巯基质量摩尔浓度随着反应的加深而增加，这与现有的研究结果一致[37]。美拉德反应后样品粒径均减小，这是由于核桃肽与碳水化合物的结合改善了肽的热变性，破坏了表面水合层，从而使得粒径下降[38]；也有可能在糖基化反应过程中，肽的表面电荷减少，肽和碳水化合物之间的静电相互作用减少，导致粒径减小[39]。有研究表明：糖基化显著降低了肌源性纤维连接蛋白的粒径，表明共价接枝可以有效抑制加热过程中的蛋白质聚集[40]。通过扫描电镜发现糖基化反应后，出现了纤维结构，缀合物的结构变得更加无序，这与已有的研究结果一致[41]。通过差示扫描热分析发现：美拉德反应能提高肽的热稳定性，缀合物在110 ℃内未出现热变形，这可能得益于疏水的相互作用和氢键的增加[42]。有研究表明：蛋白质与碳水化合物经过糖基化后，变性温度都有不同程度的提高，可见，可通过提供碳水化合物来增加蛋白质的热稳定性或三级构象的稳定性[43]。将核桃肽分别与阿拉伯木聚糖和低聚木糖进行美拉德反应，成功提高了核桃肽的抗氧化活性，这可能与非挥发性美拉德中间产物还原酮和高级阶段产物蛋白黑素具有较强的抗氧化活性有关，同时，也与挥发性含氮、硫的杂环化合物等低分子量物质较强的抗氧化性能有关[44−45]。本研究通过美拉德反应制备的糖肽，在降低肽成本的同时，可提高肽的功能特性，可为以糖肽为原料的保健品或功能食品的应用提供数据支持。
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本研究表明：WP-XOS的接枝度和褐变程度都比WP-AX高。核桃肽美拉德产物的平均粒径降低，负电荷降低，活性巯基质量摩尔浓度增大。扫描电镜结果表明：碳水化合物的加入使肽的片状结构更加松散，呈现丝状分支结构。热分析图谱显示：核桃肽的变性温度为82.18 ℃，其美拉德反应产物并未出现热变形的现象。此外，WP-AX、WP-XOS的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和ORAC都比核桃肽显著提高了；而ABTS自由基清除率由于核桃肽本身就拥有较高的清除能力，所以并未得到提高，反而引入了阿拉伯木聚糖且接枝度低，导致WP-AX的ABTS自由基清除率比核桃肽低。综上所述，糖基化改性是提升核桃肽热稳定性和抗氧化活性的有效途径，可为核桃肽在食品工业生产中的应用提供参考依据。
Effect of glycosylation modification on structure and functional properties of walnut peptides
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摘要:
目的 探究干热条件下核桃肽(walnut peptides, WP)与碳水化合物的美拉德反应对改性前后其结构的影响，分析了核桃肽美拉德反应前后的抗氧化活性、热稳定性等功能特性，为核桃肽在食品工业中的应用提供理论依据。 方法 采用干热法将核桃肽分别与阿拉伯木聚糖(arabinoxylan, AX)和低聚木糖(xylo-oligosaccharides, XOS)进行美拉德反应，以接枝度、褐变指数反映糖基化程度，测定不同碳水化合物对核桃肽的分子量、微观结构、粒径、热稳定性、抗氧化活性等指标的影响。 结果 提取的阿拉伯木聚糖是以阿拉伯糖和木糖为主要成分的高分子量多糖，核桃肽主要由小于2 000 Da的肽段组成。与阿拉伯木聚糖进行糖基化反应后，核桃肽寡肽含量得到了提高，反之，与低聚木糖进行糖基化反应后，寡肽含量却降低了。核桃肽美拉德产物的平均粒径减小，总巯基和游离巯基质量摩尔浓度增加，结构更加无序松散，热稳定性以及抗氧化活性都得到了提高。 结论 糖基化有利于改善核桃肽的结构和功能性质，可提升核桃肽在食品工业中应用的可行性。图7表2参45 Abstract:Objective This study aimed to explore the effects of the Maillard reaction between walnut peptides (WP) and carbohydrates under dry heat conditions on the structural modifications before and after the reaction. It also analyzed the functional characteristics such as antioxidant activity and thermal stability before and after the Maillard reaction, providing a theoretical basis for walnut peptides application in the food industry. Method The Maillard reaction between walnut peptides and arabinoxylan (AX) or xylo-oligosaccharides (XOS) was conducted using dry heat. The degree of grafting and the browning index were used to reflect the extent of glycosylation. The impacts of different carbohydrates on the molecular weight, microstructure, particle size, thermal stability, and antioxidant activity of walnut peptides were measured. Result Arabinoxylan was a high-molecular-weight polysaccharide mainly composed of arabinose and xylulose, while walnut peptides were primarily composed of peptide fragments less than 2 000 Da. After glycosylation with arabinoxylan, the content of oligopeptides increased, whereas it decreased when reacting with xylo-oligosaccharides. The average particle size of the Maillard products of walnut peptides decreased, while the total and free thiol contents increased, leading to a more disordered and loose structure. Furthermore, both thermal stability and antioxidant activity improved. Conclusion Glycosylation is beneficial for improving the structure and functional properties of walnut peptides, and can enhance the feasibility of their application in the food industry. [Ch, 7 fig. 2 tab. 45 ref.] -
Key words:
- Maillard /
- glycosylation /
- walnut peptides /
- functional properties
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土壤养分异质性在自然界中普遍存在，主要表现在土壤中包含许多大小不同、形状各异的养分富集区域，且养分含量各不相同[1]。引起养分异质性分布的因素很多，除了土壤自身的异质理化性质外，还包括动物的排泄物、植物凋落物理化性质的差异以及微生物活动等[2]。由于不同植物对养分异质性的响应不同，土壤养分异质性可能会对植物间的竞争关系造成一定的影响[3−5]。研究表明：与本地植物间的竞争关系是决定外来植物能否成功入侵的关键因素之一[6]。与本地植物相比，入侵植物更能从环境异质性中获益[7−8]，因此，土壤养分异质性可能会促进外来植物的入侵[9−10]。
节节麦Aegilops tauschii属于禾本科Poaceae山羊草属Aegilops植物，为世界十大恶性杂草之一。野生节节麦种群广泛分布于欧亚大陆中部的干旱及半干旱地区[11]，在长期的传播及适应过程中，该物种已经扩散至从叙利亚、土耳其北部到中国西部等欧亚大陆中部广泛的地理区域[12]。节节麦作为小麦Triticum aestivum的野生近缘种之一，在出苗时间、苗期特征及生长习性等方面均与小麦接近，不仅会竞争光照、水及肥等资源，还是小麦条锈病的替代宿主，因此极易造成小麦的减产甚至绝收。自1955年在河南省新乡地区首次采集到其标本至今，节节麦已入侵扩散至中国的陕西、河南及山东等小麦主产省[13]，并已严重威胁到小麦的生产安全[13−14]。节节麦具有较强的生存能力，且对土壤养分条件的适应性强[15−16]。目前，有关养分异质性对节节麦和小麦生长及竞争影响的研究尚未见有报道。为此，本研究探讨土壤养分异质性对节节麦与小麦竞争关系的影响，以期为节节麦入侵危害机制研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
2021年6月，供试节节麦及小麦种子来源于河南省新乡农业科学院试验田(35°18′N，113°52′E)，种子晒干后室内保存。试验在河南科技大学科教试验园内进行，该试验园位于河南省洛阳市洛龙区(34°59′N，112°16′E)。该地区属温带季风气候，海拔高度为209 m。年均气温为14.86 ℃，年均降水量为578.2 mm。
1.2 试验设计
2021年9月，将经过筛选的节节麦及小麦种子播种至营养钵内进行育苗，基质为V(珍珠岩)∶V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1∶1。待幼苗生长至“两叶一心”时，选取高度及长势基本一致的节节麦和小麦幼苗移栽至种植箱(60 cm×40 cm×20 cm)内。
在种植箱内填入人工制备的均质或异质土壤，为了便于排水，容器底部均铺设约2 cm的略大颗粒砂土。基质填充前，利用聚氯乙烯(PVC)板在种植箱内隔离出所需空间，填充基质后移除PVC板。参照文献[17−18]的处理方式对土壤养分进行定性控制。设置包括高养分[V(草炭土)∶V(砂土)=3∶1]、低养分[V(草炭土)∶V(砂土)=1∶3]及异质性土壤(将种植容器均匀分隔为若干部分，交叉应用等量的高、低养分土壤)3种养分条件。异质养分处理设置20个营养斑块，其中高、低养分斑块各10个(图1)。同质养分处理则是用与异质养分处理中相同数量的高、低养分土壤混合而成。各个处理是由富含营养的草炭土和砂土的不同混合物代表的。因此，同质与异质养分处理中总体营养供应是相同的。此外，结合种植箱面积及大田小麦的种植密度，设计3种种植模式：①12株节节麦均匀种植；②12株小麦均匀种植；③6株节节麦和6株小麦交替均匀种植。异质养分模式中，植株均定植在异质性斑块的交叉点，与同质养分模式中植株定植的位置完全相同，如图1所示。共6个处理，每处理设置4个重复，所有种植箱均随机排列。养护期间维持土壤水分以保证植物正常生长。
试验于2021年10月开始，持续120 d。试验结束时，在单种及混种条件下，从每个处理中随机抽取10株植株。先测量每株植株高度，随后用水冲刷的方法将植株根部从土壤中小心分离出来，并尽量减少细根的损失。使用扫描仪和Photoshop软件来确定叶面积[19]。最后，将植物的叶、茎和根分开，保存在纸袋中。然后将样品在80 ℃的烘箱中烘干至恒量，并测定生物量(精确至0.000 1 g)。
1.3 数据处理
采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析土壤养分异质性对节节麦和小麦单株指标的影响。利用SPSS 19.0进行数据统计分析，Excel软件作图。
根冠比=根生物量/地上部分生物量[20]。
采用相对产量(R)、相对产量总和(T)及竞争平衡指数(Ca)测度节节麦与小麦间的竞争能力强弱[21−23]。公式为：Ra=Yab/Ya；T=(Ra+Rb)/2；Ca=ln(Ra/Rb)。其中，a、b分别表示2个供试物种；Ya表示单种时物种a的单株产量；Ra、Rb分别表示混种时物种a、b的相对产量；Yab表示混种时物种a的单种产量。计算时单株产量为单个植株的干物质量。Ra=1.0，表明物种a与b的种内及种间竞争强度相同，即2个物种的竞争力相同；Ra＞1.0，表明种内竞争力大于种间，即物种a对物种b的竞争力大于其对自身的竞争强度；Ra＜1.0，表明种内竞争力小于种间，即物种a对物种b的竞争力小于其对自身的竞争强度。T=1.0，表明物种a与b需要相同的营养资源，且一种物种可以通过竞争作用将另一物种排除出去；T＞1.0，表明a与b不存在竞争作用；T＜1.0，表明a与b存在竞争作用。Ca=0，表明物种a和b的竞争力相等；Ca＜0，表明物种a的竞争力小于物种b；Ca＞0，表明物种a的竞争力大于物种b，Ca越大，表明物种a的竞争力越强。
2. 结果与分析
2.1 土壤养分异质性下小麦和节节麦的生长发育
与同质性土壤相比，无论种内还是种间竞争，土壤养分异质性均明显促进了小麦和节节麦株高及叶面积的增加(图2)。其中，种内竞争条件下，异质性土壤中小麦的株高和叶面积分别较同质性土壤中增加了29.80%、20.09%，明显小于节节麦的39.29%、39.37%；而种间竞争条件下，异质性土壤中小麦的株高及叶面积分别较同质性土壤中增加了23.88%、21.63%，同样明显小于节节麦的26.58%、25.35%。此外，仅有在种内竞争条件下，异质性土壤中节节麦株高的增加与同质性土壤差异显著(P＜0.05)。
图 2 土壤养分异质性与种间竞争对小麦和节节麦株高及叶面积的影响Figure 2 Effect of soil nutrient heterogeneous and interspecific competition on the plant height and leaf area of T. aestivum and A. tauschii无论是种内竞争还是种间竞争，土壤养分异质性均促进了小麦和节节麦单株分蘖数的增加，但均未达到显著水平(图3)。其中，在种内和种间竞争条件下，异质性土壤中小麦的单株分蘖数分别较同质性土壤中增加了27.78%、24.39%，小于节节麦的41.43%、30.00%。
图 3 土壤养分异质性与种间竞争对小麦和节节麦单株分蘖数的影响Figure 3 Effect of soil nutrient heterogeneous and interspecific competition on the tillers per plant of T. aestivum and A. tauschii如图4所示：无论是种内竞争还是种间竞争，土壤养分异质性促进了小麦和节节麦总生物量的增加，且与同质性土壤相比，均达到了显著水平(P＜0.05)。其中，在种内和种间竞争条件下，土壤养分异质性促使小麦的总生物量分别增加了132.51%、123.81%，小于节节麦的133.06%、131.42%。
图 4 土壤养分异质性与种间竞争对小麦和节节麦总生物量的影响Figure 4 Effect of soil nutrient heterogeneous and interspecific competition on total biomass of T. aestivum and A. tauschii无论是种内还是种间竞争，与同质性土壤相比，异质性土壤中小麦和节节麦的根冠比均略有下降，但均未达到显著水平(图5)。其中，在种内和种间竞争下，土壤养分异质性促使小麦的根冠比分别下降了21.17%、17.74%，大于节节麦的20.53%、25.11%。
图 5 土壤养分异质性与种间竞争对小麦和节节麦根冠比的影响Figure 5 Effect of soil nutrient heterogeneous and interspecific competition on root-shoot ratio of T. aestivum and A. tauschii2.2 土壤养分异质性下节节麦和小麦的竞争关系
从表1可知：无论是在同质性土壤还是异质性土壤中，节节麦和小麦的相对产量及节节麦的相对产量总和均小于1。节节麦的竞争平衡指数值均大于0，且异质性土壤中的竞争平衡指数较同质性土壤中有所增加，但未达到显著水平。
表 1 不同土壤类型下节节麦与小麦的竞争关系Table 1 Competitive relationship between A. tauschii and T. aestivum under soil nutrient heterogeneity土壤类型 Ra Rb 相对产量总和 竞争平衡指数 同质性 0.921±0.022 a 0.901±0.016 a 0.911±0.011 a 0.022±0.001 a 异质性 0.914±0.041 a 0.867±0.014 a 0.891±0.022 a 0.053±0.015 a 说明：数值为平均值±标准误，同列不同小写字母表示不同土壤养分间差异显著(P＜0.05) 3. 结论与讨论
为了最大限度地获取土壤养分资源，植物会通过形态或生理上的调节来适应异质性的土壤斑块环境[24]。也有研究显示：土壤养分异质性对植物生长的影响是由植物自身属性及土壤养分异质性斑块的属性共同决定的[25]。当异质性土壤斑块间差异不明显或斑块较小时，土壤养分异质性并不会对植物生长造成显著影响[26]，这可能是由于养分的空间异质性分布对植物的影响不足以抵消光照、空间或竞争等因素对生长特征的影响[24]。本研究中，土壤养分异质性一定程度促进了节节麦和小麦幼苗的生长发育，并提高了节节麦对小麦的竞争抑制作用。
3.1 土壤养分异质性对节节麦生长发育的影响
株高和叶面积是植物获取光合作用空间及更多光照条件的重要保障，也是决定植物个体间光照资源竞争成功的关键因素之一[27]，对环境变化敏感且可塑性强，并与植物生长发育紧密相关，因此，常被用于植物响应环境变化研究的评价指标[28]。本研究中，无论是种内还是种间竞争，异质性土壤中小麦和节节麦幼苗株高及叶面积均有所增加，表明土壤养分异质性促进了小麦和节节麦地上部分的生长发育。而此结果也证实之前的研究结论，即植物在异质性土壤养分供应的环境中经常表现出较同质土壤养分供应的环境更好，即使2种环境中的养分总量相同[29]，而这可能与其在异质环境中能从资源丰富的斑块中获取更多养分有关[30]。从株高及叶面积的增幅可以看出，土壤养分异质性对节节麦的促进作用较为明显。
外界环境因素通常不会影响植物分蘖芽的分化，但分蘖芽是否会发育成为分蘖则与环境因素密切相关[31]。本研究发现：土壤养分异质性促进了小麦和节节麦单株分蘖数的增加，其中种内竞争条件下节节麦的增幅最大。相同条件下(即竞争模式及土壤状态)，节节麦的单株分蘖数明显高于小麦。而这也证实了房锋[32]的研究结论，即节节麦的分蘖能力与土壤条件等因素有关，且通常情况下多于小麦。此结果再次证实了节节麦具有分蘖能力强、繁殖系数高的特征，而这也可能是节节麦得以大面积入侵扩散并对小麦造成危害的重要原因之一。
生物量是反映植物相对竞争能力的重要性状[33]。研究表明：在可用养分总含量相当的情况，一些植物在异质条件下比在均质条件下积累的生物量更大[34]。无论是否与本土植物莲子草Alternanthera sessilis共生，入侵植物空心莲子草A. philoxeroides的生物量在异质养分处理中明显高于同质养分处理[35]。袁伟影等[36]研究表明：土壤养分异质性增加了南美蟛蜞菊Sphagneticola trilobata和蟛蜞菊S. calendulacea的总生物量。与土壤均匀性相比，土壤异质性明显增加了入侵物种鬼针草Bidens pilosa和薇甘菊Mikania micrantha在竞争条件下的生物量[37]。本研究中，与同质性土壤相比，小麦和节节麦的总生物量均显著提高，其中又以节节麦的增幅最大，表明土壤养分异质性对节节麦幼苗生长的促进作用相对较大。
生物量分配格局的改变被认为是植物应对可变生境的重要策略[38]。植物会通过调节分配地上及地下器官的生物量对资源做出竞争反应，从而保证自身能够最大化的吸收受限资源[39]。在土壤养分充足条件下，植物会通过增加叶面积等形式将更多的生物量分配至碳同化器官[40]；而当养分有限时，植物则会通过增加根冠比的形式加大对根部的投入，从而能更有效地捕获限制性的土壤养分[41]。本研究中，土壤养分异质性造成了小麦和节节麦根冠比的下降，这表明土壤养分并不是两者生长的限制因素，因此，两者均通过增加地上部分的投入以占领资源丰富斑块获得更多资源。其中，种间竞争条件下，节节麦根冠比的降幅较大，表明节节麦将更多的生物量投入至地上部分以加大对小麦的竞争抑制作用。
3.2 土壤养分异质性对节节麦与小麦竞争关系的影响
竞争能力会影响到群落的组成及结构，同时也是决定外来植物入侵的重要因素之一[42]，正确选择判定指标对解释植物间的竞争结果至关重要[43]。生物量是种间竞争的重要衡量指标之一，因此，多数竞争指标均依据混种条件下的生物量变化来反映入侵植物的竞争能力[44]。有研究认为：相邻植物的根系会在营养丰富的区域增殖，因此，土壤养分异质性会增加入侵植物的竞争强度[45]。但也有不同的研究结果，如官玉婷等[1]研究发现：土壤养分异质性削弱了互花米草Spartina alterniflora对芦苇Phragmites australis的竞争优势。本研究中，无论是同质性还是异质性土壤，节节麦的相对产量总和均小于1，表明节节麦和小麦之间存在竞争关系，而节节麦与小麦的相对产量均小于1，表明两者的种内竞争小于其种间竞争。与同质性土壤相比，异质性土壤中节节麦的竞争平衡指数值同样大于0，并呈增加态势，表明土壤养分异质性增强了节节麦对小麦的竞争能力。
土壤养分异质性在较小尺度下可能会通过改变本地植物与入侵植物间的竞争平衡，从而有利外来植物的成功入侵[36]。但GAO等[46]研究认为：土壤养分异质性对入侵植物的生长一般具有积极影响，但不支持土壤养分异质性有利于外来植物在本地植物群落中成功入侵的观点。而本研究结果表明：土壤养分异质性一定程度上促进了节节麦的生长发育，并提高其对小麦的竞争作用，因此认为土壤养分异质性会进一步加剧节节麦对小麦的危害程度。
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图 1 阿拉伯木聚糖的高效液相色谱图(A)和气相色谱图(B)
Figure 1 High performance liquid chromatogram (A) and gas chromatogram (B) of arabinoxylan
图 2 美拉德反应前后对游离氨基(A)、中间产物生成量(B)和褐变程度(C)的影响
Figure 2 Effect of Maillard reaction on free amino groups (A), intermediate product formation (B) and browning degree (C)
图 3 WP(A)、WP-AX(B)、WP-XOS(C)的高效液相色谱图(HPLC)
Figure 3 High performance liquid chromatograms (HPLC) of WP (A), WP-AX (B), and WP-XOS (C)
图 4 不同样品美拉德反应前后的粒径图(A)和Zeta电位图(B)
Figure 4 Particle size plots (A) and Zeta potential plots (B) before and after the Maillard reaction of different samples
图 5 不同样品美拉德反应前后的扫描电镜图
Figure 5 Scanning electron microscopy images of different samples before and after Maillard reaction
图 6 不同样品美拉德反应前后的热分析图谱
Figure 6 Thermal analysis profiles of different samples before and after the Maillard reaction
图 7 不同样品美拉德反应前后的抗氧化活性比较
Figure 7 Comparison of antioxidant activity before and after Maillard reaction of different samples
表 1 阿拉伯木聚糖的理化性质
Table 1. Physical and chemical properties of arabinoxylan
样品 相对分子量/kDa 总糖质量分数/% 蛋白质量分数/% 溶解度/% 各单糖质量分数/% 阿拉伯糖 木糖 葡萄糖 半乳糖 阿拉伯木聚糖 413.45±1.98 81.39±2.05 0.73±0.11 72.00±2.65 61.52±2.10 27.27±2.48 8.48±0.45 2.73±0.07 
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表 2 WP、WP-AX和WP-XOS的巯基及二硫键质量摩尔浓度分析
Table 2. Analysis of thiol and disulfide bond content in WP, WP-AX, and WP-XOS
样品 总糖质量分数/% 蛋白质量分数/% 溶解度/% 总巯基/(μmol·g−1) 游离巯基/(μmol·g−1) 二硫键/(μmol·g−1) WP 9.96±0.24 c 77.28±0.10 a 99.68±0.55 a 7.49±0.01 c 5.66±0.25 c 0.91±0.12 b WP-AX 36.27±0.77 a 23.82±0.30 c 94.75±1.19 b 24.79±0.02 a 23.01±0.28 a 0.89±0.13 b WP-XOS 19.18±0.75 b 50.15±1.11 b 96.35±1.56 b 10.97±0.03 b 7.18±0.23 b 1.90±0.10 a 说明：WP为核桃肽；WP-AX为核桃肽和阿拉伯木聚糖的美拉德反应产物；WP-XOS为核桃肽和低聚木糖的美拉德反应产物。同列不同小写字母表示不同样品间差异显著(P＜0.05)。
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