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森林乡村指的是乡村自然生态风貌保存完好，乡土田园特色突出，森林氛围浓郁，森林功能效益显著，涉林产业发展良好，人居环境整洁，保护管理有效的生态宜居乡村。为贯彻乡村振兴战略，建设生态宜居的人居环境，有效保护森林乡村，2019年12月，国家林业和草原局先后公布了2批国家森林乡村名录，自此，森林乡村的保护上升到国家层面。森林乡村的空间分布会对区域空间整体效应的发挥产生直接影响[1]，因此，探索森林乡村的空间分布特征及其影响因素，便于全方位地识别区域内森林乡村的空间关系及布局特征。优化森林乡村的空间布局，正确认识森林乡村的形成因素，对于推进生态文明建设及乡村振兴实践具有重要意义[2]。
目前，关于森林乡村的研究处于初步探索阶段，尚未形成系统的理论体系。从研究主题上看，较多关注与森林乡村相关的乡村绿化[3-5]、森林资源开发[6] 、森林旅游[7]、森林法制建设[8-9]、生态景观价值[10]、土地利用[11]、森林环境收入[12-13]、健康教育[14]等方面；从研究方法上看，多聚焦于定性分析及实证研究；从研究尺度上看，多聚焦于国家级层面宏观尺度上大样本数据的定量分析[15]和村级层面微观尺度上小样本数据的实证分析[16]，为后续研究的开展奠定了理论基础。但仍然存在不足，从研究主题上看，以森林乡村空间分布为主题的研究并不多，而探讨森林乡村的空间分布特征及影响因素有助于优化森林乡村的空间布局，对于提高区域辐射效应，分区分类推进乡村振兴战略具有重要意义。从研究方法上看，利用大数据及地理信息系统(GIS)空间分析法定量研究森林乡村的空间格局可以为区域内森林乡村的发展提供科学依据。从研究尺度上看，对省市内部森林乡村的空间分布差异缺乏关注，这在一定程度上限制了对森林乡村分布特征的认识。因此，亟需拓展中微观尺度上森林乡村的空间异质性研究。浙江省作为“绿水青山就是金山银山”理念的发源地及率先实践地，生态文明建设成效显著，示范效应强，是生态文明建设及乡村振兴的典范。本研究从省级尺度分析浙江省森林乡村的空间分布特征及其影响因素，不仅能丰富乡村地理学的研究内容，为森林乡村的全域发展提供空间统计上的依据，而且能为后续森林乡村的深入研究提供方法借鉴，从而为区域内森林乡村的保护及可持续发展提供科学依据。
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浙江省具有独特的地理环境，森林面积为660.23万 hm2，森林覆盖率为61.15%，森林资源丰富，森林乡村数量众多。自2019年开展森林乡村的评选以来，浙江省共有447个乡村入选森林乡村名录。
选取浙江省447个森林乡村为对象，通过百度应用程序编接口(API)坐标拾取器拾取各个森林乡村的经纬度，用ArcGIS 10.5软件构建浙江省森林乡村的矢量点位。森林乡村的社会经济数据来源于浙江省统计局(
http://tjj.zj.gov.cn/ )、浙江政务网(http://hz.zjzwfw.gov.cn/ )、浙江文物网(http://wwj.zj.gov.cn/ )、浙江省生态环境厅(http://zj.gov.cn/ )。浙江省的数字高程模型(DEM)、气温等数据来源于中国科学院地理空间云数据中心(http://www.gscloud.cn/ )。将百度API坐标拾取器拾取到的447个森林乡村的经纬度坐标保存到Excel中，用ArcGIS 10.5软件导入Excel中的坐标点，配置在浙江省域底图上，对气温、降水、DEM等矢量图进行边界裁剪处理。 -
地理学中用基尼系数来分析区域空间的离散分布情况[17]。通过空间基尼系数研究浙江省森林乡村在省域尺度上的空间分布情况，公式为：
$$ G_{\rm{{i n i}}}=\frac{-\displaystyle \sum\limits_{i=1}^{N} p_{i} \ln p_{i}}{\ln N} 。 $$ (1) 式(1)中：Gini为基尼系数，pi为第i个区域中森林乡村占总数的比例，N为浙江省下辖地级行政区的数量。Gini取值为0~1，Gini越接近1，集中程度越高。Gini＜0.2代表绝对平均，0.2≤Gini＜0.3代表比较平均，0.3≤Gini＜0.4代表相对合理，0.4≤Gini＜0.5代表差距较大， Gini≥0.5代表差距悬殊。
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采用ArcGIS中的衡量核密度分析点要素的集群分布状态，即研究浙江省森林乡村的空间分布形态，公式为：
$$ D\left(X_{i}\right)=\frac{1}{u r} \sum\limits_{i=1}^{u} k\left(\frac{A_{i}}{r}\right)。 $$ (2) 式(2)中： Ai为估值点Xo到事件Xoi的距离，r＞0为搜索半径，u为搜索半径范围内的点数量，k为空间权重函数。D(Xi)越大，表明森林乡村空间分布的密度越高。
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通过ArcGIS中全局自相关判断森林乡村在省域层面空间分布上的自相关性(I)，公式为：
$$ I=\frac{n}{S} \times \frac{\displaystyle \sum\limits_{i=1}^{n} \displaystyle \sum\limits_{j=1}^{n} \mathrm{W}_{i j}\left(X_{i}-\overline{X}\right)\left(X_{j}-\overline{X}\right)}{\displaystyle \sum\limits_{i=1}^{n}\left(X_{i}-\overline{X}\right)^{2}}。 $$ (3) 式(3)中：Xi和Xj表示在第i、j县域单元上森林乡村的数量，
$\overline X$ 为森林乡村数量的均值，Wij为i、j县域单元(90个县城行政区)之间的距离权重，S为距离权重之和，n为浙江省内森林乡村数量的总和。I的取值为[−1, 1]。若I∈[−1，0]，表明具有空间负相关性；若I∈[0, 1]，则表明具有空间正相关性，0表示不存在空间相关，即空间随机分布。此外，由式(3)可得出Z值，用Z值检验空间自相关的统计显著性，Z为正代表存在空间正相关，Z为负代表空间是分散的。森林乡村在县域上的局域关联指数(Gi)：
$$ G_{i}=\frac{\displaystyle \sum\limits_{j=1}^{n} W_{i j} X_{j}-\overline{X} \displaystyle \sum\limits_{j=1}^{n} W_{i j}}{\sqrt[\leftroot{-1}\uproot{-8}{{H}}] {\dfrac{{n\displaystyle\sum\limits_{j = 1}^n {W_{ij}^2} - {{\left( {\displaystyle\sum\limits_{j = 1}^n {{W_{ij}}} } \right)}^2}}}{{n - 1}}} }。 $$ (4) 式(4)中：n为浙江省内森林乡村数量的总和，Wij为i、j县域单元之间的距离权重，H为森林乡村数量的标准差，
$\overline X $ 为森林乡村数量的均值，Xj表示在第j县域单元上森林乡村的数量。若Gi＞0，表示森林乡村集聚程度与邻近地区相似，处于高—高集聚或者低—低集聚状态；若Gi＜0，则表示该区域森林乡村集聚程度与邻近地区相异，处于低—高集聚或者高—低集聚状态。并用Jenks 自然断裂法将空间分布划分为冷点、次冷点、次热点、热点共4种类型，获得浙江省森林乡村冷热点空间分布图。 -
村庄是特定地区人地关系地域系统中“人”和“地”这2个子系统相互影响、相互作用演化形成的产物，其形成和分布受地理环境及人文社会因素共同影响[18]。与传统乡村相比，森林乡村具有较高的生态价值。自然禀赋是森林乡村形成与分布的基础，影响森林乡村的整体分布，人文底蕴使得区域内森林乡村的分布存在差异[19]。因此，本研究从自然及人文2个方面展开对森林乡村空间分布影响因素的分析[20-24]，并选取地形地貌、气候条件、河流水系、森林资源作为自然因素下的二级因素，文化资源、社会经济基础及交通通达性为人文因素下的二级因素展开分析。
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首先通过SPSS 26.0 的Pearson相关性检验功能，探究相关因素对浙江省森林乡村空间分布的影响程度。公式如下：
$$ R=\frac{\displaystyle \sum\limits_{i=1}^{m}\left(X_{i}-\overline{X}\right)\left(Y_{j}-\overline{Y}\right)}{\sqrt{\displaystyle \sum\limits_{{i}=1}^{{m}}\left(X_{i}-\overline{X}\right)^{2}} \sqrt{\displaystyle \sum\limits_{{i}=1}^{{m}}\left(Y_{i}-\overline{Y}\right)^{2}}} 。 $$ (5) 式(7)中：Xi 表示第i个县域单元上森林乡村的数量，Yi为在i县域单元上所选取影响因素的变量，m为选取变量的数量，
$\overline X_i $ 与$\overline Y_i $ 为2个变量的平均值。当R＞0时，代表Xi与Yi正相关；R＜0 时负相关性。其绝对值越接近1，则代表Xi与Yi的相关性越强，反之越弱[24]。 -
由于Pearson相关系数忽略了空间分层的异质性问题，不能准确反映数据的空间差异特征，因此，本研究从空间分异性视角，运用地理探测器的统计方法，进一步分析空间分布差异的影响因素。地理探测器的核心是通过空间分异性揭示因变量与自变量空间分布的相似性[25]，以此度量影响因子的解释度(q)[26]。
$$ q=\frac{\displaystyle \sum\limits_{h=1}^{L} N_{h} \sigma_{h}^{2}}{N {\rm{\sigma}}^{2}} 。 $$ (6) 式(6)中：h=1
$,\cdots, $ L为因变量或自变量的分区，N和σ2分别为研究区域内观测点的数量(浙江省内森林乡村数量的总和)与总体方差，Nh和σh2即为第h个子区域内森林乡村的数量与总体方差。q的取值为[0，1]，q值越大代表自变量对因变量的解释力越强，即某因素对森林乡村的数量影响越强，反之则越弱。 -
根据式(1)计算得到空间基尼系数(Gini)为0.969，代表森林乡村在浙江省市级行政区域的空间分布差异显著，并呈现明显的集中性。将浙江省划分为5个地区，即浙北(杭州、嘉兴、湖州)，浙东(宁波、舟山)，浙南(温州、台州)，浙中(金华、绍兴)，浙西(衢州、丽水)。由图1可知：森林乡村数量最多的是浙西地区，共有108个，占24.16%，其次是浙中、浙南地区，浙东地区数量最少，仅55个，占12.30%。此外，从绘制洛伦兹曲线(图2)可直观地看到弯曲程度较大，进一步验证了浙江省市域层面森林乡村空间分布的不均衡性。浙江省森林乡村的空间分布整体形成了以丽水(柯城)、绍兴(柯桥)、温州(乐清)为中心的多中心分布格局，在空间集聚上呈现团状集聚分布的特征。森林乡村数量分布大致呈现“西多东少”的格局，呈西南—东北向的分布态势，与浙江省自西南向东北呈阶梯状倾斜的基础地理格局十分契合。这代表森林乡村的发展与地形的联系紧密，西部地区以山地为主，森林覆盖率高，为森林乡村的形成及发展提供了丰富的资源。
图 1 浙江省5个地区森林乡村数量统计
Figure 1. Number statistics of the forest villages in the five major divisionsin in Zhejiang Province
图 2 浙江省市域尺度森林乡村分布洛仑兹曲线
Figure 2. Lorenz curve of distribution of forest villages on the city scale in Zhejiang Province
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图3显示：①第1批森林乡村呈现5个核心集聚区、4个核心连绵区的空间分布特征。5个集聚中心分别是衢州市中部(柯城区与常山县交界区域)、绍兴市东南部(柯桥、上虞、嵊州及新昌交界区)、宁波市东南部(余姚及海曙区、鄞州及奉化区交界区域)、温州市西部(瑞安、平阳、文成县交界区域)、温州市北部(乐清县)，而核心连绵区则围绕核心集聚区成包围状分布。②第2批森林乡村形成2个核心集聚区。2个核心集聚区为金华市南部(金东、武义及永康县交界区域)、温州市北部(乐清、永嘉县)与台州市南部(黄岩、路桥、温岭县的交界区域)。③从2批森林乡村的核密度分布来看，形成了双核心集聚区、双核心连绵区。2个集聚中心分别为绍兴南部(柯桥、嵊州、新昌县交界区域)、温州北部(永嘉、乐清县)与台州市南部(黄岩、路桥、温岭县的交界处区域)。2个核心连绵区分别是以绍兴为中心的东西向带状连绵区，以温州与台州交界区域为核心的团状连绵区。具体而言，森林乡村空间分布地域差异显著，呈现出多个层级明显的高密度区，且多分布在东部，具有“小范围聚集、大范围分散”的多中心组团分布特点。
图 3 浙江省森林乡村核密度分布示意图
Figure 3. Kernel density estimation of forest villages in Zhejiang Province
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由表1可见：第1批、第2批森林乡村空间自相关指数I估计值分别是0.398、0.710，正态统计值Z分别为5.447、9.608，均为正，说明2批森林乡村空间分布呈现显著的空间正相关性，不同区域森林乡村在空间上的集聚特征显著。
表 1 浙江森林乡村的全局空间自相关指数
Table 1. Global I index of forest villages in Zhejiang Province
森林乡村批次 I Z P 第2批森林乡村 0.398 3 5.447 0 0.000 0 第1批森林乡村 0.710 3 9.608 2 0.000 0 2批森林乡村 0.786 2 10.617 0 0.000 0 图4显示：①从空间分布形态来看，第1批森林乡村热点区呈现条带状分布特征，热点集聚区呈现“L”形分布形态，位于杭州西南部、衢州西南部及其与丽水北部的交界区域，丽水南部及会稽山脉东南部。第2批森林乡村热点区分布相对分散，呈半环状集聚特征，西部热点区呈现“C”形分布形态，集中分布于杭州西南方、衢州西南方及其与丽水北部的交界区域，东南部则呈现零星分布形态。②从冷热点数量来看，第2批森林乡村热点区有11个县级市，比第1批森林乡村多2个县级市。第2批的森林乡村次冷点区有11个县级市，比第1批森林乡村多6个县级市。热点区和次冷点区增加，说明森林乡村分布的高值、低值集聚性在加强。整体而言，浙江省森林乡村呈现西南部热，东北部冷的空间分布格局。热点区域多分布在历史文化底蕴较为丰富的浙西地区，并呈现条带状分布向条状及零星分布状转变的特征。此外，森林乡村分布高值集聚与低值集聚趋势逐渐明显，空间冷热格局渐进稳定。
图 4 浙江省森林乡村冷热点空间分析示意图
Figure 4. Cold and hot spot analysis of forest villages in Zhejiang Province
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地形地貌中海拔因素影响最明显。运用ArcGIS软件将森林乡村分布点与海拔高程地图进行缓冲区分析，结果显示：森林乡村的平均海拔为217 m，低于全省平均海拔307 m。86.35%的森林乡村分布在海拔500 m以下的山间盆地及丘陵地带，主要包括丽水境内的松古盆地，金华、衢州境内的金衢盆地以及这些盆地周边的丘陵地带。12.76%的森林乡村位于海拔500~1 000 m的低山区，主要包括丽水境内的仙霞岭、温州境内的洞宫山、金衢盆地周边的千里岗岭，仅0.89%的森林乡村分布在海拔高于1 000 m的山地。可见，森林乡村倾向于分布在地形起伏度较小的区域，空间分布上具有明显的“盆地丘陵”指向性特点。这与森林乡村的发展定位密不可分，一方面地形起伏度小的乡村便于科学规划，整合周边的森林公园等资源，打造休闲游憩的场所和乡村森林旅游的平台；另一方面，特殊的地形地貌有利于文化的形成[27]。浙西、浙中丘陵及浙南的山间盆地形成了相对封闭的地理环境，为森林乡村的历史文化遗存提供了有利条件，因此，地形地貌对森林乡村的空间分布具有显著影响。
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将森林乡村分布点与年平均气温及年平均降雨量的地图进行叠加分析，结果显示：浙江省域范围内，森林乡村在年平均气温高且年平均降水量多的浙西地区分布较为密集，如衢州、丽水等地年平均气温较高，年降水量也较丰富，聚集了更多的森林乡村。浙江省年平均气温及年平均降水量的Pearson相关系数依次为0.209、0.134，影响力(q)依次为0.139、0.236，表明气候条件对森林乡村空间分布格局的影响有限，两者弱相关。
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河流水系具有不同的形态及水体特性，对于增添森林乡村的旅游文化气息，营造舒适的观赏环境具有重要作用。将森林乡村分布点与河流水系地图进行缓冲区分析可知：森林乡村主要沿富春江、瓯江、衢江干支流分布，顺沿河道两侧成散点状分布。2.5 km缓冲区内的森林乡村达112个(25.06%)，2.5~10.0 km缓冲区内森林乡村数量呈现减少趋势。浙江省各地水资源总量与森林乡村分布数量的Pearson相关系数为0.486，q为0.306，表明河流水系对森林乡村的空间分布格局具有一定影响。值得注意的是，尽管杭嘉湖平原河网密布，但平原地区多以耕地为主，所以森林资源低于同等水文状况的山地丘陵区。
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丰富的森林资源能为以森林为题材的休闲、运动、康养等旅游项目提供场地与资源条件，推动森林产业发展，带动当地村民就业，实现脱贫致富。浙江省各县域森林覆盖率与森林乡村分布数量Pearson相关系数为0.732，q为0.555，表明森林覆盖率与森林乡村数量间具有较强的正相关。因此，对于依赖森林资源发展森林产业的森林乡村来说，森林覆盖率具有显著影响。
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古村落聚集了历史文物、历史建筑等有形文化遗产[28]，区域内非物质文化遗产及古村落数量越多，代表区域内文化资源越丰富[29]。对于以发展森林旅游及传播生态文化为目的的森林乡村来说，非物质文化遗产及古村落具有重要价值。本研究将浙江省内1092个古村落及2006—2021年入选的5批国家级非物质文化遗产 (226个)来衡量文化资源与森林乡村分布的关系。浙江省各县域古村落数量与森林乡村数量的Pearson 相关系数为0.764，q为0.770；国家级非物质文化遗产数量与森林乡村数量的Pearson 相关系数为0.529，q为0.413，表明古村落、国家级非物质文化遗产与森林乡村分布的相关性强。由此可见，森林乡村将文化资源赋存作为森林产业发展的重要参考因素，并试图与文化底蕴丰富的古村落建立关联。一方面，统筹推进森林乡村与周边古村落的关系，依托区域内古村落的基底，通过科学规划建设，整合周边资源，挖掘休闲、游览及体验价值，打造乡村森林旅游业新亮点；另一方面，合理利用非物质文化遗产资源举办森林文化活动，设计文创产品，对于传播生态文化知识具有重要意义。
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人口密度、人均国内生产总值(GDP)、森林康养基地数量和第三产业增加值等4个经济社会指标对森林乡村空间分布的影响见表2。首先从呈正向相关的指标来看，各地的第三产业增加值与森林乡村的分布具有一定相关性，反映了森林乡村产业趋向于具有高附加值的森林康养、森林旅游等第三产业，旨在通过森林旅游带动当地经济的增长，取得经济效益与生态效益的双赢。各地的森林康养基地数量与森林乡村的分布相关性不显著，可见，目前的森林乡村周围没有形成一定规模的森林康养产业，森林康养产业发展建设尚处于发展阶段。其次，从异向相关的指标来看，各地的人口密度与森林乡村的分布具有较高的异向相关，表明在人口密度相对较小的地区森林乡村趋于集聚。这是由于人口密度大的地区，对农产品的消费需求也增大，从而驱使林地经营者转变土地利用方式，变林地为耕地，直接导致森林面积的减少[23]，进而影响森林乡村的形成。此外，人均GDP与森林乡村具有较低的异向相关，反映了区域经济发展水平较高或较低的地区，森林乡村更为集聚。由于森林乡村在发展过程中，为了促进经济增长，容易过度依赖森林等自然资源，进而加速森林资源的消耗，反之当经济发展水平达到一定程度时，当地居民的环境保护意识及生态服务需求会提高，开始通过整合森林资源，发展高附加值的第三产业而拉动当地经济的增长，从而有利于森林乡村的保存与延续[23]。
表 2 森林乡村与社会经济指标的Pearson相关系数
Table 2. Pearson correlation coefficients between forest villages and socio-economic indicators
指标 Pearson相关系数 q 第三产业增加值 0.356** 0.151 森林康养基地数量 0.237 0.069 人口密度 −0.664 0.485 人均GDP −0.239* 0.143 说明：*P＜0.05，**P＜0.01 -
交通是人类活动突破地域空间限制的最佳途径[30]。交通可达性好能有效地促进城乡发展要素的流通，为森林乡村产业的发展提供极大便利[31]。由于区位布局的特殊性，公路是连接乡村聚落之间及聚落与外部联系的主要途径[32]，因此，选取公路网密度来研究交通条件与森林乡村分布之间的关系。浙江省各县域公路网密度与森林乡村分布数量的Pearson相关系数为0.419，q为0.211，表明交通条件与森林乡村分布的具有一定的正相关性。交通条件一定程度上影响了森林乡村的布局。一方面，交通条件的改善促进了当地居民的对外交往与沟通，公路建设有利于提高农产品的生产效率，赋能当地的农业生产活动；另一方面，交通是森林乡村发展旅游业的先决条件，交通可达性直接影响森林旅游地对游客的吸引力。
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空间分布特征上，浙江省森林乡村在空间上呈现集聚型分布状态，具有“小范围聚集，大范围分散”的多中心组团分布特点。区域空间分布上，在浙江省5个地区及市域层面上分布不均衡，整体呈现“西多东少”的分布格局。空间分布密度上，地域差异显著，形成了双核心集聚区、双核心连绵区。集聚中心为绍兴南部、温州北部与台州南部的交界处区域；核心连绵区包括以绍兴为中心的东西向带状连绵区、以温州台州交界区域为核心的团状连绵区。空间分布关联上，浙江省森林乡村空间分布呈现显著的空间正相关性，不同区域的森林乡村在空间上集聚特征显著。总体呈现中西南部热，东北部冷的空间分布格局，热点区呈现条带状分布向条状及零星状转变的特征，分布高值集聚与低值集聚趋势逐渐明显，空间冷热格局渐进稳定。
浙江省森林乡村的空间分布格局受自然和人文两大因素的综合影响。地形地貌、气候条件、河流水系、森林覆盖率是影响浙江省森林乡村空间分布的自然因素。地形地貌直接影响河流水系、道路交通、森林资源的布局及文化遗存，进而影响森林乡村的形成；气候并非森林乡村形成的必要条件，但其对森林植被生长的影响会间接影响森林乡村的布局；河流水系是森林乡村形成的重要条件，丰富的水资源是乡村居民生产生活的必要条件，同时为森林旅游产业的发展提供了丰富的景观资源；森林覆盖率是森林乡村评选的基础条件，丰富的森林资源能够为以森林为题材的休闲、运动、康养等产业的开展提供重要条件。文化资源、社会经济基础及交通通达性是影响森林乡村空间分布的人文因素。依托区域内的古村落及非物质文化遗产资源，森林乡村将文化资源赋存作为产业转型升级的关键因素；从社会经济因素来看，森林乡村多分布在人口密度较小、经济水平相对较低的地区，通过发展高附加值的第三产业实现经济效益与生态效益的双赢；交通可达性是森林乡村发展的先决条件，不仅赋予农业生产活动，而且有助于森林乡村聚点成线、整合资源、增强联系，促进全域发展。
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浙江省开展森林乡村建设起到以点带面的效应，为生态文明建设提供了高质量的浙江样本。为促进森林乡村的发展，基于本研究结论，提出以下建议：①因地制宜，差异发展。森林乡村拥有丰富的森林资源及文化资源，一方面要充分利用森林资源，发展森林康养、森林旅游、林下经济等特色产业，另一方面要充分发挥不同村庄的文化特色，打造生态、文化、产业、经济、景观多功能融合的特色村庄，从而打通“绿水青山”向“金山银山”双向转换的通道，让村民享受到生态文明建设带来的绿色福利和生态红利，实现经济效益与生态效益的双提升。②协同布局，全域发展。目前浙江省森林乡村分布差异显著，因此，要加强不同区域之间的乡村规划引导，着眼于当下森林乡村的空间格局，结合村庄优势，合理调控资源。通过道路交通，增强村与村、县与县、市与市之间的联系，集中连片打造，以此构建全域共建、全域共融、全域共享的森林乡村发展新模式。
限于数据的可获取性，本研究未涉及政策制度等因素的定量化研究，因此，随着未来信息技术的发展及数据可获取性的增强，政策制度、森林生态效益等因素可以作为未来森林乡村空间分布影响因素分析的重点方向，进而完善森林乡村空间格局形成机制的研究，为森林乡村的保护及发展提供更为科学的理论指导与实践引导。
Spatial distribution characteristics and influencing factors of forest villages in Zhejiang Province
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摘要:
目的 探讨森林乡村的空间分布特征及其影响因素，便于优化森林乡村的空间布局。正确认识森林乡村的形成因素，助推生态文明建设及乡村振兴。 方法 以浙江省447个森林乡村为研究对象，综合运用空间基尼系数、核密度分析、空间自相关等方法分析森林乡村的空间分布特征，并采用皮尔逊(Pearson)相关性分析、地理探测器等方法探究影响其空间分布的自然及人文因素。 结果 ① 从整体空间上看，浙江省森林乡村呈现集聚型的分布状态，具有“小范围聚集，大范围分散”的多中心组团分布特点。②从区域空间上看，在五大分区及市域层面上分布不均衡，整体呈现“西多东少”的分布格局。③从整体空间密度上看，形成了双核心集聚区和双核心连绵区。④从空间分布关联上看，呈现西南部热，东北部冷的空间关联特征，次冷点区域变化较小，热点区域呈现条带状分布向条状及零星分布状转变。⑤浙江省森林乡村的空间分布受地形地貌、气候条件、河流水系、森林资源、文化资源、社会经济基础、交通通达性的综合影响。 结论 由于自然及人文的综合影响，浙江省森林乡村的空间分布差异显著。森林乡村的建设与发展中，地形、气候及河流孕育其生态环境，而交通、文化资源及社会经济基础关乎其发展的基础条件、资源优势及经济支撑。今后浙江省在森林乡村建设中，要基于资源优势、基础条件及本地发展政策，坚持科学规划、因地制宜、协同布局等举措以实现全域发展，为生态文明建设提供高质量的浙江样板。图4表2参32 Abstract:Objective This study is to explore the spatial distribution characteristics and influencing factors of forest villages, so as to optimize the spatial layout and understand the forming factors, so as to comprehensively promote the construction of ecological civilization and rural revitalization. Method The spatial distribution characteristics of 447 forest villages in Zhejiang Province were analyzed using spatial Gini coefficient, nuclear density analysis and spatial autocorrelation, and the natural and human factors affecting their spatial distribution were explored by Pearson correlation analysis and geographic detectors. Result (1) The overall spatial distribution of forest villages was in an agglomerated distribution state, with the characteristics of multi-center clusters of “small-scale aggregation and large-scale dispersion”. (2) The regional spatial distribution was uneven at the level of five major districts and cities, displaying a distribution pattern of “more in the west and less in the east”. (3) In terms of overall spatial density, a dual-core agglomeration area and a dual-core continuous area were formed. (4) In terms of spatial distribution correlation, it showed the spatial correlation characteristics of hot in the southwest and cold in the northeast. The change of sub-cold spot area was small, and the hot spot area changed from strip distribution to strip and sporadic distribution. (5) The spatial distribution of forest villages in Zhejiang Province was affected by topography, climate conditions, river systems, forest resources, cultural resources, socio-economic foundation and traffic accessibility. Conclusion Due to the comprehensive influence of nature and humanity, the spatial distribution of forest villages in Zhejiang Province is significantly different. Topography, climate and rivers nurture their ecological environment, while transportation, cultural resources and socio-economic foundations are related to basic conditions, resource advantages and economic support of their development. We should, according to resource advantages, basic conditions and local development policies, adhere to scientific planning, local conditions, coordinated layout and other measures so as to achieve global development, providing high-quality Zhejiang models for the construction of ecological civilization. [Ch, 4 fig. 2 tab. 32 ref.] -
Key words:
- forest village /
- geographic detector /
- spatial distribution /
- influencing factors /
- Zhejiang Province
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核桃Juglans regia 为胡桃科Juglandaceae胡桃属Juglans植物[1]，其种仁含油量高，有“木本油料之王”的称号[2]。同时，核桃木材坚实，是良好的硬木材料。作为重要的经济林树种，核桃大多种植于土壤贫瘠的山坡沟坎，不与粮争地[3]。然而，核桃树体高大，与其他果树相比对矿质营养元素需求量较高，大量元素与核桃产量和品质形成紧密相关[4]，因此，提高核桃树体对矿质元素的吸收能力对于提高核桃产量和品质至关重要[5]。研究表明：在核桃树各器官中种仁的氮素质量分数最高，核桃树吸收累积的矿质营养元素中氮素被商品核桃(种仁、硬壳)携走的比例也最高，叶片次之[6]。可见，氮素可能是提高核桃产量和品质的关键营养元素。然而，过量施用氮肥会导致严重的环境问题，因此，提高氮素利用效率是提高核桃产量与品质的重中之重[7]。
土壤中氮素主要分为无机氮和有机氮两大类，植物根系能够吸收利用的主要是无机氮，主要以硝态氮和铵态氮形式存在[8−9]。植物根系对无机氮转运调节途径可分为2种，即高亲和力(HATs)和低亲和力(LATs)的氮转运系统[10]，HATs 在外部铵态氮( ${\rm{NH}}_4^ +$)、硝态氮(${\rm{NO}}^ -_3 $)浓度低于 0.5 mmol·L−1时介导吸收大部分的无机氮，而 LATs 则是在 ${\rm{NH}}_4^ + $、${\rm{NO}}_3^ - $浓度高于 0.5或 1.0 mmol·L−1时介导吸收无机氮[10]。植物对铵态氮和硝态氮的吸收主要由铵转运蛋白和硝酸转运蛋白介导。土壤中同时含有植物可吸收利用的硝态氮和铵态氮时，由于植物吸收硝态氮需要先将其还原成铵态氮后才能进行同化利用，消耗的能量更多，所以植物对铵态氮表现出明显的偏好性，而且当植物受盐胁迫及活性氧的伤害时，铵态氮具有缓解作用，因此，介导植物对铵态氮吸收的铵转运蛋白在植物氮同化中起着重要作用[11]。铵转运蛋白基因主要有两大类族，分为AMT1和AMT2。在已知的铵转运蛋白中大部分 AMT1 家族的转运蛋白属于高亲和转运体[12]，如拟南芥Arabidopsis thaliana中有6个编码铵转运蛋白被鉴定，包括5个AMT1家族基因，1个AMT2家族基因。AMT1家族基因中，AtAMT1.1和AtAMT1.3对拟南芥根系铵态氮吸收的贡献率最高，为30%，AtAMT1.2、AtAMT1.5对拟南芥根系高亲和铵态氮吸收的贡献率略低于AtAMT1.1和AtAMT1.3[13]，AtAMT1.4在花粉中特异性表达[14]，在水稻Oryza sativa铵转运蛋白基因家族中AMT1家族有基因3个，其中OsAMT1.1和OsAMT1.2为高亲和力转运体[15]；而 AMT2 家族以低亲和为主，在拟南芥AMT2家族基因中AtAMT2.1 在低亲和范围内适度促进拟南芥根系对铵态氮吸收，主要在铵从根部到地上部运输中发挥作用[16]。AMT2 型蛋白通常在植物的不同组织中包括根、芽和叶中都有表达，如AtAMT2.1基因在拟南芥各器官中均有表达，主要表达在拟南芥的维管束及上皮层[17]，在拟南芥中AtAMT2.1与AtAMT1s之间还存在协同作用。此外，毛果杨Populus trichocarpa PtAMT2.1主要在叶片中，PtAMT2.2在叶柄中高表达。除此之外，玉米Zea mays[18]、番茄Lycopersicon esculentum [19]、欧洲油菜Brassica napus [20]等高等作物均鉴别出了AMT基因，但到目前为止，研究大多集中于高亲和的铵转运蛋白AMT1基因家族，对低亲和的铵转运蛋白AMT2基因家族的研究较少。因此，阐明AMT2的生物学功能和调控机制，对于提高核桃自身的氮效率和提高肥料利用效率都具有重要意义。
本研究以核桃JrAMT2过表达株系为供试材料，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及生理检测的方法鉴定JrAMT2基因在核桃植株体内的表达模式，进一步对核桃JrAMT2基因进行生物学功能分析，为核桃优良品种选育提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 植物材料
实验材料来自浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室保存的核桃野生型(WT)以及课题组2019年获得的核桃JrAMT2过表达阳性植株 [21]，其中JrAMT2基因构建于PCMBIA1300植物表达载体，载体抗性为卡那霉素(kanmycin，Kan)，利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3103菌株介导将构建好的35S::JrAMT2::GFP过表达载体转化到核桃野生型体细胞胚中，植物筛选标记为潮霉素(hygromycin，Hyg)。本研究所用核桃组培苗为野生型体胚和JrAMT2过表达阳性体胚经脱水萌发获得，温室苗则由上述组培苗经生根、炼苗、驯化获得。
1.2 实验方法
1.2.1 生物信息分析运用
SOPMA(
https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html )网站在线分析JrAMT2蛋白质二级结构，运用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )在线软件对JrAMT2 蛋白进行跨膜结构域的预测，通过 GSDS(http://gsds.gao-lab.org/ )软件在线分析JrAMT2基因结构。1.2.2 植株的培养
同一JrAMT2过表达阳性体胚萌出的植株为1个株系，选取3个核桃JrAMT2阳性株系，命名为JrAMT2-1、JrAMT2-2、JrAMT2-3，每个株系继代培养至50株以上，培养条件：温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养基为Driver&Kunivuki&McGranahan (DKW)培养基。
采用2步生根法获得核桃驯化植株，选取阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗作为实验材料。第1步进行根诱导，5~8 cm长的光生芽，转移到补充有10 mg·L−1吲哚丁酸钾(K-IBA)的DKW固体培养基，在黑暗中培养7 d，诱导根原基的发生；第2步，不定根诱导结束后将其转移到粗蛭石∶DKW培养基比例(体积比)为3∶2的固体培养基中，温度为25 ℃，湿度为75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养时间为21~28 d，形成不定根，获得核桃不同株系生根植株[22]。
核桃苗不定根形成后取出用清水冲洗，多菌灵浸泡，移栽到泥炭∶蛭石∶珍珠岩比例(体积比)为2∶1∶1的混合土中，将移栽驯化成活后获得的核桃再生植株在温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗的条件下培养[23]，获得核桃不同株系温室植株。
1.2.3 核桃JrAMT2基因阳性鉴定
选用阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗进行绿色荧光蛋白(GFP) 检测、PCR及RT-qPCR验证，引物见表1。从再生植株顶芽开始向下截取 1.5 cm，培养14 d 后观察植株表型，每个株系均5个生物学重复。选取植株顶芽、叶片、茎段混样提取DNA及RNA。 PCR 反应程序为：94 ℃预变性 2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火温度 30 s，68 ℃延伸 2 min，共 32 个循环；68 ℃延伸 7 min，PCR 反应产物进行质量分数为1.2%琼脂糖凝胶电泳。使用 The iQ5 Real-Time PCR Detection System 仪器进行RT-qPCR，测定转基因植株中JrAMT2的相对表达量。反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40 个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 15 s。通过 2−ΔΔCt方法计算定量结果[24]。
表 1 引物Table 1 Primers引物 序列(5′→3′) 用途 Actin-F GCCGAACGGGAAATTGTC 内参 Actin-R AGAGATGGCTGGAAGAGG 内参 QJrAMT2-F AGCAAATGGGGTTCCAGGTT 定量 QJrAMT2-R TGTCTCCCGCAGATAGAAGGTA 定量 GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 鉴定 GFP-R TTACTTGTACAGCTCGTCCA 鉴定 JrAMT2-F CATGAATACCACACCGGCCTA 鉴定 取核桃野生型及核桃JrAMT2过表达株系组培苗的根、茎、小叶，根纵切、茎横切临时切片分别放置于体视荧光显微镜(Carl Zeiss Stereo D13covery V12，Axio Cam MRc system)在明场和蓝光(488 nm)激发条件下利用 ZEN lite 成像软件连续拍照[25-26]。
1.2.4 生长参数、铵态氮和硝态氮测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，从顶尖向下剪取1.5 cm茎段，含2~4片复叶，培养14 d，每个株系均5个生物学重复，测量株高及节间数。选取长势相同的核桃野生型及JrAMT2过表达植株采用2步生根法驯化，移栽后用直尺测量统计不同株系生长0、20、40 d的株高、节间长、叶片长度及叶片宽度。
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，培养14 d，采用2步生根法获得核桃生根植株，植株分为地上部分及地下部分2个部分，清洗植株，分别测定地上部分及地下部分鲜质量，于105 ℃下杀青，80 ℃烘干至恒量，称取干质量。使用苏州科铭生物技术有限公司的植物铵态氮(ZATD-1-G)和植物硝态氮(ZXTD-1-G)试剂盒测定地上部分及地下部分铵态氮和硝态氮质量分数，每个株系均5个生物学重复。
1.2.5 植株叶绿体观察、叶绿素质量分数及叶绿素荧光测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，取顶尖向下第2节间处复叶。将该叶片置于0.35 mol·L−1氯化钠中研磨破碎至絮状，取悬液于高倍光学显微镜下观察，找到视野中单个完整的叶肉细胞，观察细胞中的叶绿体, 使用image J软件计算叶绿体表面积与单层细胞表面积比率。每个株系均5个生物学重复。
采用丙酮浸取法测定叶绿素质量分数。分别取0.1 g核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗长势一致的叶片，剪碎，置于15 mL离心管中，加入10 mL体积分数 80%丙酮溶液，于室温黑暗处浸提，直至管内材料褪色变白，以80%丙酮溶液为对照，测定663和646 nm处吸光值，每个株系均5个生物学重复。wt=[(wa+8wb)×Vt×(mFW×1 000)−1]，叶绿素 a 质量分数(wa) =20.3×D(646)，叶绿素 b 质量分数(Cb)=8.04×D(663)。其中：wt为叶绿素质量分数(mg·g−1)，Vt为提取液总体积(mL)，mFW为叶片鲜质量(g)，D(646)和D(663)分别为646和663 nm处的吸光度。
叶绿素荧光测定使用M-PEA(multi-function plant efficiency analyser)多功能植物效率分析仪(英国Hansatech公司)测定。选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系温室苗由上向下第3片叶片暗处理30 min，在饱和脉冲光(5 000 μmol·m−2·s−1) 下进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线) 的测定和绘制。参照SCHANSKE等[27]的方法分析叶绿素荧光诱导动力学参数(JIP-test)。
1.2.6 数据分析
利用SPSS 26软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(邓肯法)，显著性水平为0.05。使用GraphPad Prism 7.0软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 核桃JrAMT2基因生物信息学分析
核桃 JrAMT2基因的全长为 1 464 bp，起始密码子为 ATG，终止密码子为 TGA。经过美国国家生物技术信息中心(NCBI)在线序列比对显示：该基因的序列编码的氨基酸序列属于 Ammonium Transporter Family，编码487个氨基酸(图1)，蛋白分子量为52.458 kD，预测分子式为C2433H3715N601O646S23，含有7 418个原子，理论等电点为7.11，不稳定指数为35.61，脂溶指数为101.56，亲水性平均值为0.472。该段蛋白质中包含20种常见氨基酸：亮氨酸质量分数最高，达到11.7%，其次分别为甘氨酸11.1%，丙氨酸10.9%，缬氨酸8.6%，半胱氨酸质量分数最低，仅为1.0%。JrAMT2蛋白中分别含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys) (表2)。
表 2 JrAMT2基因氨基酸组成Table 2 Composition of JrAMT2 amino acids氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 丙氨酸 53 10.90 组氨酸 9 1.80 苏氨酸 27 5.50 精氨酸 11 2.30 异亮氨酸 25 5.10 色氨酸 18 3.70 天冬酰胺 16 3.30 亮氨酸 57 11.70 酪氨酸 17 3.50 天冬氨酸 15 3.10 赖氨酸 18 3.70 缬氨酸 42 8.60 半胱氨酸 5 1.00 甲硫氨酸 18 3.70 吡咯赖氨酸 0 0.00 谷氨酰胺 11 2.30 苯丙氨酸 24 4.90 晒半胱氨酸 0 0.00 谷氨酸 14 2.90 脯氨酸 24 4.90 甘氨酸 54 11.10 丝氨酸 29 6.00 对核桃JrAMT2蛋白跨膜区的预测结果表明：该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋，跨膜螺旋区段分别位于24~46、59~81、129~151、158~180、195~214、227~244、254~276、288~310、314~333、346~368和398~420，推测JrAMT2属于跨膜蛋白，并在N端存在信号肽(图2A)。
对JrAMT2 蛋白二级结构的预测结果显示：JrAMT2的氨基酸组成中有4种构象，其中 α- 螺旋有 201 个氨基酸，占比 43.12%；延伸链有 93个氨基酸，占比19.10%；β- 转角有 30个氨基酸，占比 6.16%；无规则卷曲有154个氨基酸，占比 31.62%。JrAMT2 铵转运蛋白主要由 α- 螺旋和无规则卷曲组成(图2B)。
对JrAMT2基因结构的分析显示：JrAMT2基因由4个外显子，3个内含子组成。与拟南芥AtAMT2基因相比，拟南芥基因结构多了1个外显子和1个内含子，与山核桃Carya cathayensis CcAMT2基因[28]、栓皮栎Quercus suber QsAMT2基因[29]相比，外显子和内含子数量相同，同源性较高(图2C)。
2.2 核桃JrAMT2过表达植株阳性验证
在成功构建35S::JrAMT2::GFP的过表达载体并通过农杆菌介导转化核桃体胚后，对同一无性系JrAMT2体胚经脱水萌发获得的再生植株进行阳性鉴定。利用PCR技术，以核桃JrAMT2过表达植株3个株系(JrAMT2-1、JrAMT2-2和JrAMT2-3) DNA为模板，进行外源GFP基因(729 bp)的PCR验证，检测到大小约为 750 bp的电泳条带，与GFP基因大小符合(图3A)；进行目的基因JrAMT2加外源GFP基因全长(2193 bp)的PCR验证，检测到大小为2000 bp的电泳条带，与目的基因大小符合(图3B)；以核桃JrAMT2过表达植株3个株系的cDNA为模板，利用实时定量PCR技术对JrAMT2基因表达量进行检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株3个株系JrAMT2基因相对表达量分别为野生型的10.58、12.80和14.94倍，显著上调(图3C)，表明核桃JrAMT2过表达植株中JrAMT2基因稳定表达。
图 3 PCR 和RT-qPCR 对核桃组培苗的JrAMT2基因的检测Figure 3 Detection of JrAMT2 gene in J. regia tissue culture seedlings by PCR and qRT-PCR对获得的过表达株系进行GFP荧光阳性鉴定，分别将核桃过表达及野生型幼苗(图4A)的小叶、茎、根置于荧光体视显微镜下在波长为488 nm蓝光激发下拍摄。结果显示：过表达植株的小叶、茎、根表面呈现均匀的绿色荧光，其中腋芽处荧光更明亮(图4B1~6)，野生型核桃幼苗的小叶、茎、根在荧光下拍摄无绿色荧光激发(图4B7~12)，说明JrAMT2蛋白在腋芽处积累。为进一步研究JrAMT2基因在核桃幼苗中的表达，对过表达株系及野生型组培苗的茎段进行横切，根进行纵切后，进行GFP荧光检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株茎段横切中呈现均匀的绿色荧光，其中在维管组织中荧光更明亮，野生型植株茎段横切面无绿色荧面光(图4B1~12)；核桃JrAMT2过表达植株根段纵切面中呈现均匀的绿色荧光，且在维管组织中荧光更明亮，野生型植株根段纵切面无绿色荧光(图4C1~8)。表明JrAMT2基因在核桃幼苗的根和茎中均可稳定表达，其中JrAMT2蛋白在根和茎的维管束组织中积累。
图 4 铵态氮转蛋白基因JrAMT2在核桃苗中稳定表达Figure 4 Stable expression of ammonium nitrogen transfer protein gene JrAMT2 in J. regia2.3 核桃JrAMT2基因的生物学功能分析
2.3.1 核桃JrAMT2过表达植株生长表型分析
为了进一步研究核桃JrAMT2基因的生物学功能，将3个JrAMT2过表达植株与野生型核桃植株培养14 d。结果表明：与野生型相比，核桃JrAMT2过表达植株均生长旺盛，株高显著增加，节间显著增长(P＜0.05，图5A)。3个JrAMT2过表达株系株高分别为3.87、4.23和4.12 cm，节间长分别为0.33、0.35和0.34 cm，野生型植株株高为3.30 cm，节间长为0.28 cm，与野生型相比，3个JrAMT2过表达株系株高分别增加了17.0%、28.0%和29.0% (图5B)，节间长分别增加了19.0%、25.0%和24.0% (图5C)。综上所述，JrAMT2过表达对核桃幼苗的生长有显著提高作用。
图 5 核桃JrAMT2过表达离体培养植株表型分析Figure 5 Phenotypic analysis of J. regia JrAMT2 overexpression plant in vitro culture对核桃JrAMT2过表达植株进一步驯化培养，成功获得核桃JrAMT2过表达温室苗。对其生长表型进行分析(图6A)，定植后培养40 d，核桃JrAMT2过表达温室苗的株高、节间长、叶片长度、叶片宽度增加显著高于野生型(P＜0.05)。培养至第20天时，与野生型相比，核桃JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加21.9%、26.0%和24.6% (图6B)，节间长分别增加41.2%、27.7%和26.3% (图6C)，叶片长度分别增加18.7%、16%和30.7% (图6D)，叶片宽度分别增加41.3%、48.2%和55.1% (图6E)；培养至第40天时，与野生型相比，JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加53.6%、68.2%和62.1%，节间长分别增加37.2%、50.3%和44.8%，叶片长度分别增加了27.8%、34.1%和49.3%，叶片宽度分别增加24.3%、19.5%和29.2%。综上所述，核桃JrAMT2过表达温室苗与野生型相比，株高、节间长、叶片大小均显著增加，进一步证明JrAMT2基因过表达加快了核桃的生长速度。
图 6 核桃JrAMT2过表达阳性温室苗性状分析Figure 6 Character analysis of J. regia JrAMT2 overexpression positive greenhouse seedlings2.3.2 核桃JrAMT2过表达植株对氮素吸收分析
为探究JrAMT2基因在核桃中是否存在差异表达，将核桃野生型及核桃JrAMT2过表达植株进行2步生根，获得核桃JrAMT2过表达生根植株，将其分为地上部分与地下部分。与野生型相比，核桃JrAMT2过表达生根植株地下部分不定根生长旺盛(图7A)。对核桃JrAMT2过表达植株地上部分及地下部分差异分析，分别提取3个核桃JrAMT2过表达株系生根植株地上部分及地下部分RNA，利用实时定量PCR技术，分析地上部分及地下部分JrAMT2基因表达的差异。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的11.94、12.70和15.06倍，地下部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的19.07、23.34和24.00倍(图7B)。对核桃野生型及3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分进行干质量和鲜质量测定。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分鲜质量和干质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加23.45%、33.67%和56.26%，干质量分别增加23.45%、43.89%和56.26%；3个JrAMT2过表达株系地下部分干质量和鲜质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加222.65%、199.24%和344.38%，干质量分别增加222.65%、199.24%和354.33%(图7C)。
图 7 核桃JrAMT2过表达植株氮素吸收分析Figure 7 Character analysis of the regenerated plants with expression of JrAMT2 in J. regia基于核桃JrAMT2过表达植株表型变化，本研究进一步测定核桃JrAMT2过表达植株对硝态氮及铵态氮吸收。结果表明：与野生型相比，核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分铵态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别增加59.1%、32.3%和55.1%，地下部分别增加68.1%、61.9%和114.1% (图7D)；核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分硝态氮质量分数显著降低(P＜0.05)，地下部分硝态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别降低10.1%、7.1%和13.6%，地下部分别增加63.5%、75.7%和70.3% (图7E)。综上所述，JrAMT2基因主要作用于核桃地下部分，且JrAMT2基因过表达促进植株地下部分对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部到地上部的运输。
2.3.3 核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光特性分析
对核桃JrAMT2过表达植株叶色与叶片细胞叶绿体进行观察。核桃JrAMT2过表达植株叶色与野生型相比颜色较深(图8A)，在显微镜下观察3个核桃JrAMT2过表达植株株系及野生型叶绿体特征发现，3个核桃JrAMT2过表达株系扩张的栅栏叶肉细胞中的叶绿体更致密(图8B)。进一步分析发现：对3个阳性株系进行总叶绿素质量分数测定，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿素质量分数显著高于野生型(P＜0.05)，野生型总叶绿素质量分数为3.53 mg·g−1，核桃JrAMT2过表达阳性植株3个株系总叶绿素质量分数分别为4.64、4.69和6.10 mg·g−1，与野生型相比分别增加了32.6%、34.0%和74.3% (图8C)；JrAMT2过表达株系叶绿体表面积在单层细胞表面积的占比显著高于野生型(P＜0.05)，野生型叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率为0.56，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿体表面积与单层细胞表面积的比值分别为0.67、0.68和0.69，与野生型相比分别增加了19.41%、21.18%和22.94% (图8D)。综上所述，JrAMT2基因过表达提高了叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率及核桃叶肉细胞内叶绿素的积累。
图 8 核桃JrAMT2过表达植株叶绿体及叶绿素质量分数分析Figure 8 Analysis of chloroplast and chlorophyll content in J. regia with JrAMT2 overexpression对3个核桃JrAMT2过表达株系进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线测定。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系的O (Fo点)相、K相降低，J点、I点、P (Fm)及J~P点振幅均提高，OJIP曲线较陡，表明JrAMT2基因一定程度上提高了叶片的活性(图9A)。与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系暗适应后的最大荧光强度(Fm)、最大量子产额(Fv/Fm)均提高，Fm分别提高了47.1%、45.9%、50.2%，Fv/Fm分别提高了15.6%、13.4%、14.7%，表明JrAMT2基因一定程度上提高了光系统Ⅱ(PSⅡ)的光化学效率(图9B)。计算归一化处理的OJIP曲线(Vt)[Vt =(Ft−Fo /(Fm−Fo)，Ft为任意时刻t的荧光值]，并计算相对荧光差异ΔVt[ΔVt = Vt处理−Vt对照，用ΔK、ΔJ值分别显示在300 μs和20 ms处的ΔVt值，表示放氧复活体的活性(OEC)]。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系ΔK、ΔJ值下降且＜0 (图9C)，表明JrAMT2基因一定程度上提升了核桃叶片PSⅡ供体侧及受体侧电子传递效率及放氧复活体的活性。
图 9 铵态氮转运蛋白JrAMT2基因表达对核桃叶绿素荧光的影响Figure 9 Effect of ammonium nitrogen transporter JrAMT2 gene on chlorophyll fluorescence of J. regia用JIP-test参数对OJIP曲线进行定量分析，结果显示：核桃3个JrAMT2过表达株系在t=0时的最大光化学效率(φPo)、反应中心捕获的光能用于${\rm{Q}}_{\rm{A}}^- $下游电子传递的量子产量(ΨEo)、吸收的能量用于电子传递的量子产量(φEo)上升，分别上升了14.62%、44.59%、65.80%；在J点的相对可变荧光强度(VJ)、最小荧光强度与最大荧光强度比值(Fo/Fm)、反应中心关闭净速率(dV/dto)下降，分别下降了31.03%、35.29%、49.34% (图9D)，表明JrAMT2基因一定程度上提高了PS反应中心的量子比率及产额；对单位PS反应中心比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在t=0 时的单位反应中心捕获的用于电子传递的能量(ETo/RC)、在t=0 时的单位反应中心传递到电子链末端的能量(REo/RC)无明显变化，在t=0 时单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、在t=0 时单位反应中心耗散的能量(DIo/RC)、在 t=0 时单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)显著下降，分别为36.43%、58.67%、27.22%，表明JrAMT2基因一定程度提高了核桃叶片反应中心活性和用于电子传递的能量份额，增强了电子传递能力(图9E)；对单位受光截面比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在 t=tFM(暗适应后达到最大荧光强度时间点)时的单位受光截面耗散的能量(DIo/CSm)无明显变化，在 t=tFM时单位受光截面吸收的能量(ABS/CSm)、在t=tFM时单位受光截面捕获的用于还原QA的能量(TRo/CSm)、在 t=tFM时单位受光截面捕获的用于电子传递的能量(ETo/CSm)、在t=tFM时单位受光截面传递到电子链末端的能量(REo/CSm)上升，分别上升了 47.79%、69.39%、145.10%、303.62%(图9F)，表明JrAMT2基因一定程度提高核桃叶片单位受光截面的电子传递的份额及电子传递效率。综上所述，JrAMT2基因过表达促进核桃的光合作用。
3. 讨论
氮素作为植物生长发育必不可少的营养元素，是核酸、蛋白质、酶、叶绿素、植物激素等的重要组成部分[30]。自然界中可供利用的氮素资源有限，作物高产就需要化肥的投入。中国的化肥投入总量逐渐升高，但化肥利用率很低，给自然环境带来极大的负担 [31−32]，因此合理使用化肥，提高作物对氮素的吸收效率是促进农业生态化发展的重要途径。铵转运蛋白基因AMTs是广泛存在于动物、植物、微生物中用于运输${\rm{NH}}_4^+ $的载体蛋白，从分子层面提高植物对氮素的利用具有重要意义。前人研究发现：在拟南芥中，氮饥饿能诱导AtAMT1.1、AtAMT2.1基因上调表达，并且AtAMT2基因的表达水平随着氮饥饿时间的延长而增加[33-34]。在充足或高氮条件下，观察到拟南芥中AtAMT2.1及水稻根中OsAMT1.2基因表达水平仍上调 [35-36]，其中氮素形态对AMT基因转录水平的调控也取决于AMT基因个体和植物物种。
本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行初步的功能验证，对JrAMT2基因进行生物信息学分析表明：JrAMT2蛋白中含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys)。该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋结构域，与李畅[36]预测的OsAMT2.1蛋白结构域特点相同，且与夏金泽等[37]研究的木薯Manihot esculenta MeAMT2.6基因的蛋白结构相似。AMT2 型蛋白通常在植物的各种组织中表达，包括根、芽和叶。前人研究发现：杜梨 Pyrus betulifolia PbAMT2基因在所有器官中均有表达，但在根部表达最高[38]。在拟南芥中发现：AtAMT2.1基因主要在维管组织中表达，在芽中的表达高于根[15]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行绿色荧光观察发现：JrAMT2蛋白在核桃苗整株均有表达，且在芽及根茎的维管束中荧光更明亮，说明与拟南芥相同，核桃JrAMT2蛋白在所有器官中表达，且主要在维管组织中表达。
在植物生长发育重要阶段充足的氮素营养供给可以促进其生长发育，增加产量，对植物外施氮素能增加植株株高及叶面积[39]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株生长性状分析发现：JrAMT2基因在核桃中过表达对植株生长发育有调控作用，主要表现在过表达植株株高、节间长显著增加。对过表达植株生根驯化结果显示：过表达植株生物量显著增加，根系发达。对核桃JrAMT2过表达植株移栽驯化，定植后植株生长速率显著高于野生型，主要表现在节间伸长快，叶面积增加。AMT2是具有铵吸收功能的铵转运蛋白，且在维管组织表达，暗示着该基因可能参与铵向木质部的装载，介导铵在植物中的长距离运输。研究发现：拟南芥AtAMT2.1除了对根吸收氮素有一定贡献外，主要作用于${\rm{NH}}_4^+ $从根部到茎部的运输[40]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株地上部分和地下部分基因表达测定发现：植株地下部分JrAMT2基因表达量显著高于地上部分，且植株地下部分生物量的增加显著高于地下部分，说明核桃JrAMT2基因主要在地下部分表达。对核桃JrAMT2过表达植株对铵态氮和硝态氮吸收测定结果表明：核桃JrAMT2过表达植株地上部分仅对铵态氮的吸收显著上调，地下部分对铵态氮与硝态氮的吸收均显著上调，说明JrAMT2基因促进植株对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部分到地上部分的运输。氮素营养还会通过影响叶绿素合成和叶绿素荧光参数的变化来参与光能的利用和调控[41]。有研究表明：水稻OsAMT2.1基因敲除株系的光合特性与野生型相比出现下降趋势，同样说明了AMT2基因对植物光合作用有调控作用[36]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数变化的测定结果显示：JrAMT2基因显著提高了核桃的叶绿体表面积与单层细胞表面积比率、叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数中叶片放氧复活体活性、量子产额、电子传递效率。
4. 结论
JrAMT2作为铵态氮转运基因，促进核桃对铵态氮和硝态氮的吸收，且介导铵态氮从根部到茎部的运输，对核桃生长发育、光合作用等有积极作用，对研究核桃高效利用氮素及良种的筛选有重要意义。
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图 1 浙江省5个地区森林乡村数量统计
Figure 1 Number statistics of the forest villages in the five major divisionsin in Zhejiang Province
图 2 浙江省市域尺度森林乡村分布洛仑兹曲线
Figure 2 Lorenz curve of distribution of forest villages on the city scale in Zhejiang Province
图 3 浙江省森林乡村核密度分布示意图
Figure 3 Kernel density estimation of forest villages in Zhejiang Province
图 4 浙江省森林乡村冷热点空间分析示意图
Figure 4 Cold and hot spot analysis of forest villages in Zhejiang Province
表 1 浙江森林乡村的全局空间自相关指数
Table 1. Global I index of forest villages in Zhejiang Province
森林乡村批次 I Z P 第2批森林乡村 0.398 3 5.447 0 0.000 0 第1批森林乡村 0.710 3 9.608 2 0.000 0 2批森林乡村 0.786 2 10.617 0 0.000 0 
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表 2 森林乡村与社会经济指标的Pearson相关系数
Table 2. Pearson correlation coefficients between forest villages and socio-economic indicators
指标 Pearson相关系数 q 第三产业增加值 0.356** 0.151 森林康养基地数量 0.237 0.069 人口密度 −0.664 0.485 人均GDP −0.239* 0.143 说明：*P＜0.05，**P＜0.01
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