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黄秋葵Abelmoschus esculentus，别名咖啡黄葵、秋葵、羊角豆、补肾菜等，为锦葵科Malvaceae秋葵属Abelmoschus 1年生药食两用草本植物。目前，全世界均有黄秋葵种植[1-3]。作为一种新型的保健蔬菜，黄秋葵中富含多糖、黄酮、蛋白质、维生素、矿物质以及脂肪等多种生物活性成分，具有较高的食用及药用价值[4-5]。黄秋葵多糖具有抗疲劳[6]，抗氧化[7]，抗菌，抗癌[8]，降血糖血脂，提高机体免疫力及具有体外结合胆酸的能力等药理作用[9]。同时，由于具有良好的增稠、乳化等性能，黄秋葵多糖已广泛用于面制品、肉制品、饮料、冰淇淋等食品的生产中[10-12]。王炜强等[13]研究表明：黄秋葵多糖是一种天然高分子絮凝剂，安全无毒，生物降解性好，在环保领域应用前景广阔。因此，黄秋葵多糖的开发已成为研究的热点。超声辅助提取可加快可溶性黄秋葵多糖的溶出，能避免高温高压破坏黄秋葵多糖的成分，且条件温和、提取时间短、提取效率高[14]。离子液体通常由无机阴离子和有机阳离子组成，室温时呈液态，离子液体不易挥发、稳定温度范围宽、化学稳定性较高、物质溶解性良好、酸性可调[15-17]。离子液体-无机盐双水相萃取技术同时结合了离子液体和双水相的优点，具有分相时间短、无乳化现象、能保持生物分子活性、回收率高等优点，是一种绿色环保的分离方法，已用于生物大分子和天然产物的萃取分离[18-20]。本研究首先采用浊点法分别绘制离子液体[Bmim]Cl与K2HPO4、Na2HPO4、Na2CO3、(NH4)2SO4等4种无机盐组成的双水相体系相图，筛选出[Bmim]Cl-K2HPO4为最佳体系；再利用[Bmim]Cl-K2HPO4双水相耦合超声波提取黄秋葵多糖，通过五因素三水平响应面Box-Behnken设计优化单因素试验，确定黄秋葵多糖的最佳提取工艺条件，以期提高黄秋葵多糖的提取率，为黄秋葵多糖的进一步开发提供试验依据。
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黄秋葵果：产自山东微山；葡萄糖标准品：质量分数(HPLC)≥98%，上海金穗生物科技有限公司批号20170829；1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([Bmim]Cl)：林州市科能材料科技有限公司，分析纯；三水合磷酸氢二钾：西陇科学股份有限公司，分析纯；十二水合磷酸氢二钠：西陇科学股份有限公司，分析纯；无水碳酸钠：天津博迪化工股份有限公司，分析纯；硫酸铵：国药集团化学试剂有限公司，分析纯；苯酚、浓硫酸均为分析纯。
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AUY120型电子天平：日本岛津公司；SK3310HP超声波清洗器(53 kHz，180 W)：上海科导超声仪器有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；SHZ-DⅢ循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器厂；RE-52AAA型旋转蒸发器：上海嘉鹏科技有限公司；TG16-WS型台式高速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司。
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精确称取葡萄糖标准品0.020 2 g，蒸馏水溶解后于50 mL容量瓶定容、摇匀，即得质量浓度为0.404 g·L−1的葡萄糖标准溶液。精确移取0.0、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL葡萄糖标准溶液至6支10 mL容量瓶中，依次加入蒸馏水1.0 mL和质量分数为5%苯酚(蒸馏，收集182 ℃馏分)1.0 mL，振荡摇匀后加5 mL浓硫酸，蒸馏水定容后，于92 ℃水浴中加热30 min，流水冷却，于487 nm波长处测其吸光度。用最小二乘法进行回归分析，得到一元线性回归方程：y=15.316x−0.001 9，R2=0.999 0。其中：y为吸光度，x为黄秋葵多糖质量浓度。
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采用苯酚-硫酸法测定黄秋葵多糖质量。该法是先以葡萄糖作标准品做出标准曲线，再通过多糖的显色反应(浓硫酸可使多糖降解为葡萄糖，苯酚再与葡萄糖作用而显色)测定吸光度，然后根据一元线性回归方程和稀释倍数先计算出上相液黄秋葵多糖质量，再计算黄秋葵多糖提取率。
精确移取适量黄秋葵提取上相液于10 mL容量瓶中，其他同1.3.1，测其吸光度。黄秋葵多糖提取率=黄秋葵多糖质量/黄秋葵粉质量×100%
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将黄秋葵果于60 ℃下干燥4 h后，粉碎机中粉碎，过80目筛，保存备用。准确称取0.5 g黄秋葵粉，置于50 mL碘量瓶中，加入5 mL不同质量分数的[Bmim]Cl溶液和5 mL不同质量分数的K2HPO4溶液形成的双水相体系中，将5个试验因素K2HPO4质量分数、提取时间、提取温度、液固比、[Bmim]Cl质量分数中的4个固定不变，1个作为变量，超声提取后抽滤，滤液以7 500 r·min−1转速离心10 min，于分液漏斗中分相，上相液待用。
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在5个单因素试验得出的最佳条件基础上，以单因素为自变量，黄秋葵多糖提取率为响应值，设计五因素三水平响应面中心组合试验。结果见表1。
表 1 Box-Behnken试验因素与水平
Table 1. Factors and levels of Box-Behnken design
因素 水平 −1 0 1 A. K2HPO4质量分数/% 20 23 26 B. 提取时间/min 25 30 35 C. 提取温度/℃ 55 60 65 D. 液固比/(mL·g−1) 15 20 25 E. [Bmim]Cl质量分数/% 70.0 72.5 75.0 -
单因素试验数据采用2010软件处理；响应面试验数据采用Design-Expert 8.0.6.1软件处理，并对数据的显著性差异进行分析。
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分别精确移取葡萄糖标准溶液0.4 mL、黄秋葵提取上相液1.0 mL于10 mL容量瓶，其他操作同1.3.1，可见光区400~800 nm光谱扫描。图1表明：葡萄糖标准溶液和黄秋葵提取上相液在487 nm处均有最大吸收，故选择检测波长为487 nm。
图 1 最大波长的确定
Figure 1. Determination of maximum wavelength
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采用浊点滴定法绘制各双水相体系相图，考察离子液体[Bmim]Cl与K2HPO4、Na2HPO4、Na2CO3、(NH4)2SO4等4种无机盐形成双水相体系的分相能力[21-23]。室温20 ℃下，分别准确称取一定质量的无机盐于4支试管中，加蒸馏水溶解，再加入一定质量的[Bmim]Cl，直至溶液浑浊，胶头滴管逐滴滴加蒸馏水至澄清，称其质量，反复以上操作。计算每次出现浑浊时，无机盐和[Bmim]Cl的质量分数。分别以无机盐的质量分数为横坐标，[Bmim]Cl的质量分数为纵坐标，绘制相图。
图2的4条曲线均为双节线，曲线上的点为临界点，曲线下方为单相区，不分层，曲线上方为两相区。由图2可知，(NH4)2SO4和Na2HPO4的分相能力较差，仅有3个浊点，继续滴加(NH4)2SO4和Na2HPO4不再出现浑浊，不能与[Bmim]Cl形成稳定的双水相体系；Na2CO3和K2HPO4与[Bmim]Cl能形成稳定的双水相体系，但Na2CO3的溶解度受温度变化影响较大，分相范围较窄，持续时间较短，而K2HPO4分相范围广且持续时间较长。
图 2 双水相体系相图
Figure 2. Phase diagram of two-phase aqueous system
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通过相比、分配系数及提取率等物理量，考察[Bmim]Cl-无机盐双水相体系对黄秋葵提取液的萃取能力。准确称取一定质量的黄秋葵粉，分别加入到5 mL一定质量分数的4种无机盐(Na2CO3、NaHPO4、(NH4)2SO4、K2HPO4)溶液和5 mL一定质量分数的[Bmim]Cl形成的双水相体系中，60 ℃水浴中超声提取(超声功率180 W)30 min，抽滤，滤液离心后，在分液漏斗中分相。测定上相和下相中黄秋葵多糖的吸光度，计算4种双水相体系的相比(R)、分配系数(K)及提取率。
$$ R = \frac{{{V_t}}}{{{V_b}}}\text{；} $$ (1) $$ K = \frac{{{C_t}}}{{{C_b}}}\text{。} $$ (2) 式(1)～(2)中：Vt、Vb分别为上相、下相溶液体积(mL)；Ct、Cb分别为上相、下相中黄秋葵多糖质量浓度(g·L−1)。
由表2可知：在[Bmim]Cl-(NH4)2SO4和[Bmim]Cl-Na2HPO4双水相中，提取液不分相；[Bmim]Cl-Na2CO3和[Bmim]Cl-K2HPO4中，提取液分相，但相较而言，[Bmim]Cl-K2HPO4双水相提取率较大，且黄秋葵多糖主要分布在上相。
表 2 不同[Bmim]Cl-无机盐双水相体系萃取能力的比较
Table 2. Comparison of extraction ability of different [Bmim]-Cl-inorgnic salts in aqueous two-phase system
双水相体系 [Bmim]Cl质量分数
(%)/盐质量分数(%)R K 上相提
取率/%[Bmim]Cl-(NH4)2SO4 55/40 − − − [Bmim]Cl- Na2CO3 70/20 0.21 1.72 4.80 [Bmim]Cl-Na2HPO4 60/7 − − − [Bmim]Cl-K2HPO4 50/75 0.45 1.54 19.40 说明：“−”表示不分相 综合以上分析，[Bmim]Cl-K2HPO4双水相有较强的分相能力与萃取能力，因此，选择[Bmim]Cl-K2HPO4为本试验的双水相体系。
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称取0.5 g黄秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL质量分数为70%的[Bmim]Cl溶液、液固比20 mL·g−1、提取温度60 ℃、提取时间30 min，5 mL K2HPO4质量分数分别为20%、21%、23%、25%、27%的条件下进行超声提取(超声功率180 W)。由图3可知：随着K2HPO4质量分数的增大，黄秋葵多糖提取率先增大后减小，质量分数23%时最大。随着盐量的增加，富集盐的下相结构性逐渐增强，容纳黄秋葵多糖的空腔形成越困难，而富集离子液体的上相结构性逐渐减弱，容纳黄秋葵多糖的空腔越易形成，黄秋葵多糖提取率不断增大；但质量分数超过23%时，产生盐效应，黄秋葵多糖提取率逐渐降低。因此，选取23%为K2HPO4适宜的质量分数。
图 3 K2HPO4质量分数对黄秋葵多糖提取率的影响
Figure 3. Effect of K2HPO4 mass fraction on the extraction rate of okra polysaccharide
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称取0.5 g黄秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL质量分数为70%的[Bmim]Cl溶液，5 mL质量分数为23%的K2HPO4溶液，液固比20 mL·g−1，提取温度60 ℃，分别在20、30、40、50、60 min的条件下进行超声提取(超声功率180 W)。由图4可知：随提取时间增长，黄秋葵多糖提取率增大，30 min时达到最大，但30 min后提取率下降，并趋于平缓。提取时间增长，上相液黏度增大，导致黄秋葵多糖的提取越困难。因此，选取30 min为适宜的提取时间。
图 4 提取时间对黄秋葵多糖提取率的影响
Figure 4. Effect of extraction time on the extraction rate of okra polysaccharide
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称取0.5 g黄秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL质量分数为70%的[Bmim]Cl溶液，5 mL质量分数为23%的K2HPO4溶液，液固比20 mL·g−1，提取时间30 min，提取温度分别为30、40、50、60、70 ℃的条件下进行超声提取(超声功率180 W)。由图5可知：温度升高，促进了黄秋葵多糖的溶出，提取率增大；但温度过高，杂质溶出相应增多，提取率反而下降。因此，选取60 ℃为适宜的提取温度。
图 5 提取温度对黄秋葵多糖提取率的影响
Figure 5. Effect of extraction temperature on the extraction rate of okra polysaccharide
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称取0.5 g黄秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL质量分数为70%的[Bmim]Cl溶液，5 mL质量分数为23%的K2HPO4溶液，提取时间30 min，提取温度60 ℃，液固比分别为17、20、25、30、34、50 mL·g−1的条件下进行超声提取(超声功率180 W)。由图6可知：随着液固比的增大，黄秋葵粉与[Bmim]Cl-K2HPO4双水相接触面积增加，黄秋葵多糖不断溶出。液固比超过20 mL·g−1，黄秋葵多糖提取率下降，可能液固比过大，浓缩等操作时间延长，导致黄秋葵多糖损失较多，提取率下降[24]。因此，选取20 mL·g−1为适宜的液固比。
图 6 液固比对黄秋葵多糖提取率的影响
Figure 6. Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of okra polysaccharide
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称取0.5 g黄秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL质量分数为23%的K2HPO4溶液，提取时间30 min，提取温度60 ℃，液固比20 mL·g−1，[Bmim]Cl质量分数分别为65.0%、67.5%、70.0%、72.5%、75.0%的条件下进行超声提取(超声功率180 W)。由图7可知：随着[Bmim]Cl量的增大，黄秋葵多糖在上相的富集增多，[Bmim]Cl质量分数72.5%时最大，之后提取率下降，黄秋葵多糖在上相的富集达到饱和。因此，选取72.5%为[Bmim]Cl适宜的质量分数。
图 7 [Bmim]Cl质量分数对黄秋葵多糖提取率的影响
Figure 7. Effect of [Bmim]Cl mass fraction on the extraction rate of okra polysaccharide
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五因素三水平响应面试验共46组，包括析因试验(40组)和中心试验(6组)。析因试验各不相同，6组因素水平均相同的中心试验，是重复6次以估算试验误差。
对试验数据进行回归拟合，得到各单因素与黄秋葵多糖间的二次多元方程：y=27.27−0.13A+0.17B−0.35C+2.99D−1.26E+2.62AB−0.063AC−1.14AD+0.64AE+3.29BC+2.06BD+0.95BE−3.77CD+0.98CE+0.21DE−3.68A2−5.53B2−2.75C2−3.04D2−4.85E2。
分析表3数据可知：模型P＜0.000 1(差异极显著)，模型对黄秋葵多糖的提取有显著影响，失拟项P=0.909 7＞0.050 0(差异不显著)，说明模型拟合程度较好；各单因素与黄秋葵多糖提取率之间呈良好线性关系(R2=0.974 2)，模型能解释95.35%的黄秋葵多糖提取率的变化(
$R_{{\rm{Adj}}}^2 $ =0.953 5)；变异系数为4.31%，数据分散程度较小，试验结果可信，因此该模型可分析和预测黄秋葵多糖的提取结果。由F值大小可推断5个单因素对黄秋葵多糖提取率显著性影响的顺序：D(液固比)＞E([Bmim]Cl 质量分数)＞C(提取温度)＞B(提取时间)＞A(K2HPO4质量分数)；由P值大小可推断：一次项中，D、E对提取率影响极显著；二次项中，A、B、C、D、E对提取率影响均极显著；交互项中，AB、BC、BD、CD之间作用对提取率的影响极显著，AD、BE、CE之间作用对提取率的影响显著。图8为各因素交互作用对黄秋葵多糖提取率显著影响的响应面图。表 3 方差分析表
Table 3. Variance analysis table
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性 模型 726.72 20 36.34 47.14 ＜0.000 1 ** A 0.26 1 0.26 0.33 0.568 4 B 0.46 1 0.46 0.59 0.449 2 C 1.93 1 1.93 2.50 0.126 6 D 143.28 1 143.28 185.88 ＜0.000 1 ** E 25.40 1 25.40 32.95 ＜0.000 1 ** AB 27.46 1 27.46 35.52 ＜0.000 1 ** AC 0.016 1 0.016 0.020 0.887 9 AD 5.20 1 5.20 6.74 0.015 5 * AE 1.64 1 1.64 2.13 0.157 3 BC 43.30 1 43.30 56.17 ＜0.000 1 ** BD 17.06 1 17.06 22.13 ＜0.000 1 ** BE 3.65 1 3.65 4.73 0.039 3 * CD 56.70 1 56.70 73.56 ＜0.000 1 ** CE 3.88 1 3.88 5.03 0.033 9 * DE 0.17 1 0.17 0.22 0.644 6 A2 118.50 1 118.50 153.73 ＜0.0001 ** B2 266.53 1 266.53 345.90 ＜0.000 1 ** C2 65.99 1 65.99 85.61 ＜0.000 1 ** D2 80.51 1 80.51 104.45 ＜0.000 1 ** E2 204.92 1 204.92 265.84 ＜0.000 1 ** 残差 19.27 25 0.77 失拟项 12.36 20 0.62 0.45 0.909 7 误差项 6.91 5 1.38 总和 745.99 45 R2=0.974 2，${R_{{\rm{Adj}}}^2} $=0.953 5 说明：**表示差异极显著(P＜0.01)；*表示差异显著(P＜ 0.05) 
图 8 各因素交互作用对黄秋葵多糖提取率交互影响的响应面图
Figure 8. Response surface of the interaction of various factors on the extraction rate of polysaccharides from okra
通过回归模型可预测黄秋葵多糖提取的最佳工艺条件为：K2HPO4质量分数22.31%，提取时间29.36 min，提取温度55.69 ℃，液固比25.00 mL·g−1，离子液体[Bmim]Cl质量分数71.94%。在此条件下，黄秋葵多糖提取率可达29.12%。
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为实际操作方便，在K2HPO4质量分数22%，提取时间29 min，提取温度56 ℃，液固比25.00 mL·g−1，离子液体[Bmim]Cl质量分数72%的条件下进行验证试验。5次平行试验的黄秋葵多糖提取率为：30.28%、32.48%、30.24%、32.47%、30.64%，平均值为31.22%，相对标准偏差为3.70%。
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室温下分别绘制离子液体[Bmim]Cl与4种无机盐[(NH4)2SO4、Na2HPO4、Na2CO3和K2HPO4]形成的双水相体系相图，通过比较提取后黄秋葵多糖在各体系中的相比、分配系数和提取率，确定[Bmim]Cl-K2HPO4为本实验的双水相体系。离子液体-无机盐双水相体系对环境无污染，是一种新型绿色的分析方法。
选取5个因素：K2HPO4质量分数、提取时间、提取温度、液固比和离子液体[Bmim]Cl质量分数进行单因素试验，以单因素最佳提取条件为基础进行响应面试验，超声波辅助[Bmim]Cl-K2HPO4双水相提取黄秋葵多糖的最佳工艺可由回归模型预测。在5 mL离子液体[Bmim]Cl质量分数为71.94%，5 mL K2HPO4质量分数为22.31%的双水相体系中，提取时间为29.36 min，提取温度为55.69 ℃，液固比为25.00 mL·g−1的最佳提取条件下，黄秋葵多糖的提取率为29.12%。在该预测最佳工艺基础上进行5次验证试验，黄秋葵多糖提取率平均值为31.22%，相对标准偏差为3.70%。
Extraction of polysaccharides of Abelmoschus esculentus using ultrasonic-assisted [Bmim] Cl-K2HPO4 aqueous two phases optimized by response surface method
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摘要:
目的 探讨超声波辅助[Bmim]Cl-K2HPO4提取黄秋葵多糖的最佳工艺。 方法 采用浊点滴定法，比较[Bmim]Cl-(NH4)2SO4、[Bmim]Cl-Na2HPO4、[Bmim]Cl-Na2CO3和[Bmim]Cl-K2HPO4等4种双水相体系的分相能力与萃取能力，确定[Bmim]Cl-K2HPO4为最佳双水相体系。以黄秋葵Abelmoschus esculentus为原料，采用超声波辅助[Bmim]Cl- K2HPO4提取黄秋葵多糖，探讨K2HPO4质量分数、提取时间、提取温度、液固比、[Bmim]Cl质量分数等5个单因素对提取率的影响。在各单因素试验最佳条件的基础上，进行响应面Box-Behnken设计，优化黄秋葵多糖提取工艺。 结果 各因素对提取率影响大小依次为液固比、[Bmim]Cl质量分数、提取温度、提取时间、K2HPO4质量分数；最佳工艺条件为5 mL质量分数71.94%的离子液体[Bmim]Cl，5 mL质量分数22.31%的K2HPO4双水相体系中，提取时间29.36 min，提取温度55.69 ℃，液固比25.00 mL·g−1，黄秋葵多糖提取率为29.12%。验证平均值为31.22%，相对标准偏差为3.70%。 结论 超声波辅助[Bmim]Cl-K2HPO4提取工艺具有提取率高、时间短、离子液体可回收等优点，可用于工业化生产。图8表3参24 -
关键词:
- 植物学 /
- 黄秋葵多糖 /
- 超声波辅助 /
- [Bmim]Cl-K2HPO4双水相 /
- 提取 /
- 响应面Box-Behnken法 /
- 优化
Abstract:Objective This study attempts to explore the optimum technology of ultrasonic-assisted [Bmim]Cl-K2HPO4 extraction of okra polysaccharides. Method Cloud point titration was used to compare the phase separation ability and extraction ability of four aqueous two-phase systems, [Bmim]Cl-(NH4)2SO4, [Bmim]Cl-Na2HPO4, [Bmim]Cl-Na2CO3 and [Bmim]Cl-K2HPO4. [Bmim]Cl-K2HPO4 was determined to be the best aqueous two-phase system. The polysaccharides were extracted from okra (Abelmoschus esculentus) by ultrasonic-assisted [Bmim]Cl-K2HPO4. The effects of five single factors on the extraction rate were discussed: mass fraction of K2HPO4, extraction time, extraction temperature, liquid-solid ratio and mass fraction of [Bmim]Cl. On the basis of the optimum conditions of each single factor experiment, the Box-Behnken design of response surface was applied to optimize the extraction process of okra polysaccharides. Result The results showed that the effects of various factors on the extraction rate ranging from large to small included liquid-solid ratio, mass fraction of [Bmim]Cl, extraction temperature, extraction time, and mass fraction of K2HPO4. The optimum extraction conditions were aqueous two-phase system consisting of 5 mL ionic liquid [Bmim]Cl with mass fraction of 71.94%, and 5 mL K2HPO4 with mass fraction of 22.31%, extraction time of 29.36 min, extraction temperature of 55.69 ℃, and liquid-solid ratio of 25.00 mL·g−1. Under the above optimized extraction conditions, the predicted value of extraction rate was 29.12%. The validation average was 31.22%, and RSD was 3.70%. Conclusion Ultrasonic-assisted extraction of [Bmim] Cl-K2HPO4 has such advantages as high extraction rate, short time and recyclable ionic liquids, and can be used in industrial production. [Ch, 8 fig. 3 tab. 24 ref.] -
农田杂草与作物竞争，影响作物生长发育，导致作物产量下降，是农业生产面临的主要危害之一[1]。中国每年的杂草发生面积超过
9000 万hm2，造成的主粮作物损失超过300万t[2]。传统的杂草管理方式，如物理拔除和化学除草剂等，并不能彻底解决农田中的杂草问题，且存在诸多弊端[3]。因此，农作物栽培等领域可以结合生态学理论(如作物-杂草竞争、物种共存等方向)进行学科交叉研究，寻找可持续的综合性杂草管理策略。例如，通过施肥[4]、调控种植密度[5]和杂草种类[6]来调控作物-杂草群落的结构和群落内植物的功能性状，进而影响杂草与作物的资源竞争，从而达到提升作物产量的目的[7−8]。小麦 Triticum aestivum是支撑全球粮食产量的主要作物之一，中国小麦种植面积约2 400万 hm2，占全球总产量的17%[9]，麦田杂草主要以禾本科Poaceae植物为主，造成的小麦产量损失每年超过15%，高达150万 t[10]。麦田杂草约200多种，以安徽巢湖农业示范基地小麦田为例，其优势杂草主要为野燕麦Avena fatua和稗草Echinochloa crus-galli，共占杂草总丰度的86%[11]。野燕麦是常见的恶性杂草。稗草原本是水稻Oryza sativa田中的典型杂草[12]，偏好温暖阴湿的生长环境，但随着多地区推广稻麦轮作耕作制度，稗草也开始在水分充足的稻茬麦田中出现[11]。
合理的种植密度和施肥是调节作物生长发育的重要栽培措施之一，直接关系到作物的表型和产量[13−14]。适宜的种植密度和施肥可以提高资源利用率，形成优良的农田群落结构[14]。此外，杂草密度和类型也是影响作物产量的主要因素之一[15]。通过改变作物和杂草密度、比例和类型，使群落内出现多种低竞争能力的杂草，进而提升作物产量[7−8]。
植物的功能性状决定了植物对资源的竞争能力[16]，是植物适应环境变化的关键生态策略，反映了植物在特定环境中生存和繁衍的能力[17]。其中，株高和叶片性状是光合活动的重要指标[18−19]，这些性状不仅与植物的生物量积累和光资源的吸收利用有关，还能够揭示植物的养分供应状态和生存策略[20]。而根系作为植物吸收水分和矿质元素的主要器官，其形态特征与植物吸收利用、生长发育和籽粒产量密切相关。如更高的株高、更大的叶、根面积和体积等，均有助于作物获取光、水、氮等资源并提高利用效率，进而促进生物量的积累[21]。但目前针对小麦-杂草体系中种植密度、比例和施肥对小麦功能性状影响的研究相对较少。因此，本研究以冬小麦为目标作物，研究优势杂草野燕麦和稗草在不同密度和施肥条件下对小麦的生物量和功能性状的影响，旨在为小麦杂草管理和生产提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料选取与培养
本研究选择在安徽省合肥市庐阳区大杨镇的合肥高新技术农业园内(31°55′28.17″N，117°12′12.85″E)的温室大棚中进行。研究区属于亚热带湿润季风气候，年平均气温为14~22 ℃，全年降水充沛且多集中在夏季，光照充足。供试小麦品种为‘烟农19’‘Yannong 19’，野燕麦和稗草种子采集于合肥高新技术农业园内。挑选均匀饱满、无虫眼和霉坏的小麦、野燕麦和稗草种子，清洗消毒后置于培养皿中，在25 ℃光照培养箱内育苗，待幼苗长至2~4 cm，选取长势基本一致的幼苗移栽进行盆栽试验。
1.2 试验设置
冬小麦于2021年11月13日播种，2022年5月开始收割。所用花盆上口直径为24.5 cm，下口直径为18.5 cm，高为25.0 cm。设置3种种植方式(表1)：小麦单播(W)、小麦与野燕麦混播(W-O)、小麦与稗草混播(W-B)。氮肥施用量为小麦田常规施肥量(210.000 kg·hm−2)，对应每盆施加2.182 g尿素，在移栽前作为基肥溶于水后一次性施入盆栽土壤中[11]。植物栽种参考响应曲面法，在设置密度梯度的同时，嵌套小麦和杂草的种植比例详见表1。盆栽总计128盆，采取随机区组设计摆放，降低光照和温度等环境差异对植株生长的影响。在移栽后的2周内对盆栽中死亡的幼苗进行替补移栽，并去除来自于土壤库中的植株幼苗。
表 1 小麦和杂草的种植方式Table 1 Planting pattern for wheat and weeds种植方式 种植密度
(株·盆−1)种植比例(小麦∶杂草) 施肥处理 盆数 小麦单播(W) 4、8、12、16 100%∶0 未施肥 16盆(4种种植密度各4盆) 施肥 16盆(4种种植密度各4盆) 小麦-稗草混播(W-B) 4、8、12、16 25%∶75%、50%∶50%、75%∶25% 未施肥 24盆(4种种植密度各6盆，内含3种种植比例各2盆) 施肥 24盆(4种种植密度各6盆，内含3种种植比例各2盆) 小麦-野燕麦混播(W-O) 4、8、12、16 25%∶75%、50%∶50%、75%∶25% 未施肥 24盆(4种种植密度各6盆，内含3种种植比例各2盆) 施肥 24盆(4种种植密度各6盆，内含3种种植比例各2盆) 1.3 指标测定
将植株从土壤中完整采集，分为地上和地下部分，用蒸馏水冲洗干净后置于65 ℃烘箱内48 h至恒量，利用天平(精度
0.0001 g)称取植株生物量。对于地上性状，收样前使用直尺测量植物地上部分的最大拉伸高度，记为最大株高；从每株植物中随机选择不少于总数四分之一的健康完整叶片测量叶片性状，包括叶片鲜质量、叶面积和叶片干质量。叶面积使用Digimizer统计软件测量，叶片质量由天平称量。利用叶面积/叶片干质量计算比叶面积，叶片干质量/叶片鲜质量计算叶片干物质相对含量。对于地下性状，利用根系扫描仪(Expression 12000XL, EPSON) 和WinRHIZO根系分析软件测量植株根长、根表面积和根体积。利用根表面积/根干质量计算比根面积，根长/根干质量计算比根长，根体积/根干质量计算比根体积，根干质量/根体积计算根组织密度。1.4 数据分析
所有数据采用R 4.2.3软件进行分析和绘图。利用ggplot2包绘图[22]；将原始数据进行以10为底的对数转化以使数据总体符合正态分布，进而利用stats包对取对数后的数据进行线性回归、方差分析及多重比较，分析种植密度、种植比例、施肥对小麦生物量和功能性状的影响；利用vegan包对原始数据进行冗余分析[23]。
2. 结果与分析
2.1 种植密度和施肥对单播小麦生长特征的影响
在单播小麦条件下，无论是否施肥，随着种植密度增大，小麦生物量显著降低(P＜0.05)；施肥显著增加了生物量，种植密度为8株·盆−1时增幅最大，达58.8% (图1A，P＜0.05)。在功能性状方面，对于地上性状，小麦的最大株高在种植密度为4株·盆−1时最大，施肥对最大株高无显著影响(图1B)。小麦叶面积在未施肥时随着种植密度增大逐渐降低，而施肥显著增加叶面积，且在种植密度为8株·盆−1时增幅最大，达143.4% (图1C，P＜0.05)。小麦的比叶面积在种植密度改变时并未发生显著变化，与未施肥相比，种植密度为8株·盆−1时，施肥仅显著增加了比叶面积，从111.90 cm2·g−1增大至168.60 cm2·g−1 (图1D，P＜0.05)。小麦叶片干物质相对含量在未施肥时随着种植密度增大呈驼峰形变化趋势，而在施肥情况下随着种植密度增大呈U形的变化趋势(图1E)。对于根性状，施肥和种植密度均未改变根长、根表面积、比根体积和根组织密度(图1F~K)。整体而言，种植密度和施肥会影响单播小麦的生物量和地上性状，而对根性状作用不明显。
图 1 种植密度和施肥对单播小麦生长特征的影响Figure 1 Changes of wheat biomass and functional traits with N addition and planting density treatments in monoculture单株小麦的生物量、最大株高和叶面积之间呈正相关，它们与叶片干物质相对含量呈负相关(图2A)；单株小麦的根长与根表面积呈正相关，比根面积和比根长呈正相关，两类根性状呈负相关，比根体积与其余4个性状相关性较小(图2B)。
图 2 种植密度和施肥与小麦生长特征之间的相关性分析Figure 2 Redundancy analysis between wheat biomass and functional traits with N addition and planting density treatments in monoculture2.2 与野燕麦混播时不同处理对小麦生长特征的影响
当小麦与野燕麦混播时，无论小麦种植比例如何，随着种植密度增大，小麦生物量显著降低(P＜0.05)；当种植密度相同时，随着小麦种植比例增大，生物量整体呈下降趋势；当种植密度为8株·盆−1，且小麦与野燕麦种植比例为25%∶75%时，施肥仅显著增加了生物量，未施肥时为4.23 g，施肥时为15.65 g，增加了270.3% (图3A，P＜0.05)。在功能性状方面，当小麦与野燕麦种植比例为25%∶75%和50%∶50%时，施肥、种植密度和小麦种植比例均未改变最大株高；当小麦与野燕麦种植比例为75%∶25%时，未施肥时最大株高随种植密度增大显著降低(P＜0.05)，从密度为4株·盆−1时的最大值(59.41 cm)降低至密度为16株·盆−1时的最小值(39.56 cm)；施肥时株高的密度依赖性消失(图3B)。对于叶片性状，施肥、种植密度和小麦种植比例均未改变小麦平均叶面积、比叶面积和叶片干物质相对含量(图3C~E，P＞0.05)。对于根性状，施肥、种植密度和种植比例均未改变根长、根表面积、比根长、比根体积和根组织密度(图3F~K，P＞0.05)。
图 3 与野燕麦混播时不同处理下小麦生长特征的变化Figure 3 Changes of wheat biomass and functional traits of wheat in W-O mixture with N addition, planting density and proportion2.3 与稗草混播时不同处理对小麦生长特征的影响
从图4可见：当小麦与稗草混播时，无论小麦种植比例如何，随着种植密度增大，小麦生物量显著降低(P＜0.05)；当种植密度相同时，随着小麦种植比例增大，生物量整体呈下降趋势；施肥并未改变小麦生物量。在功能性状方面，施肥、种植密度和种植比例均未改变小麦地上性状和根性状。施肥、种植密度和种植比例的交互作用会改变根长和根表面积。在未施肥时，当种植密度为4株·盆−1，且小麦与稗草种植比例为25%∶75%时，小麦根长和根表面积最大，而当种植密度为16株·盆−1，且小麦与杂草种植比例为75%∶25%时，小麦根长和根表面积最小。
图 4 与稗草混播时不同处理下小麦生长特征的影响Figure 4 Changes of biomass and functional traits of wheat in W-B mixture with N addition, planting density and proportion3. 讨论
3.1 种植密度对小麦生长的影响
本研究中，无论是单播还是混播，小麦的单株生物量随着种植密度的增大而显著下降，不依赖于小麦邻体杂草的物种类型。这与以往的研究结果一致，这是因为在高种植密度下，个体可用资源减少[24]。当小麦与野燕麦混播种植比例为75%∶25%，且未施肥时，小麦的最大株高随种植密度增大而显著降低，而此时小麦与稗草混播中的小麦最大株高无明显变化。这表明在相同种植密度和种植比例下，小麦与野燕麦共存时承受着更为激烈的光竞争压力。这可能是因为冬季和早春气温较低，导致原本在温暖潮湿地区常见的稗草发芽和生长较慢[25−26]。相比之下，野燕麦耐旱耐冷、适应性强，拔节后生长迅速，能对小麦构成更大的竞争。此外，野燕麦种子成熟时间较早，这也增大了其对土壤资源的占据[27]，体现了杂草生长过程中的权衡策略[28]，即通过缩短生育期来获取在资源竞争中的优势[29]。
3.2 施肥对小麦生长的影响
施肥是提高土壤肥力的常用手段[30−31]。本研究发现：在小麦单播时，施肥可以增大单株小麦的生物量和叶面积，表明施肥能通过缓解氮受限来增强光合作用和呼吸作用，从而促进生物量的积累[32]。然而，在混播系统中，施肥与否对小麦的生长并无显著改变，这可能是因为当前施肥量对小麦生长的增益不足以弥补种植密度对小麦生长的制约[32]，也可能是因为邻体杂草的竞争作用抵消了施肥对小麦生长的促进[33]。
3.3 种植密度、种植比例和施肥的交互作用对混播小麦生长的影响
当小麦与野燕麦混播时，施肥显著增加了种植密度为8株·盆−1，种植比例为25%∶75%时的单株小麦生物量。这可能是因为施肥后土壤中的可利用氮素增加，在一定程度上缓解了对小麦株高和根系生长的密度制约效应，从而有利于小麦生物量的积累。同时，土壤中可利用氮素的增加也会促进杂草的生长[34]，而野燕麦的生长能力和养分吸收能力优于小麦[35]，因此施肥处理可能会加剧野燕麦对小麦产量的密度制约效应。而当小麦与稗草混播时，施肥对其影响相对较小。这表明种植密度、种植比例和施肥的交互作用对小麦与杂草混播时单株小麦生长的影响可能具有杂草依赖性。种植密度和施肥的交互作用对根长和根表面积的影响较大，即在低密度施肥时最高而高密度未施肥时最低，而对株高和叶片性状的影响较小。这可能是因为与大田环境相比，盆栽不同植株获得光资源的差异较小，而土壤资源和空间受限，使得小麦根系需要发生比地上性状更大的表型可塑性以获取养分和生长。
本研究采用容易获得的形态性状进行分析，并未对叶片光合作用、根呼吸和根系分泌物特征等生理性状进行研究，这些性状能更准确地反映植物对不同环境因子的响应[36]，但难以快速大量测量[37−38]，所以相关研究仍然较少。为了能进一步揭示植物地上、地下性状的权衡机制并将其运用到农业生产和杂草管理之中，应在不同作物、不同耕作方式和不同的田间配置条件下进行有关植物生理属性的研究，并平衡多个功能性状间的权衡关系提高作物适合度。
4. 结论
种植密度、种植比例和施肥的交互作用对小麦与杂草混播系统中小麦的生物量、根长和根表面积产生较大影响，而对株高和叶片性状的影响相对较小。在相同的种植条件下，野燕麦对小麦生长的不利影响超过稗草。施肥则根据混播的杂草种类而表现出不同的效果。因此，在农业生产实践中，应合理调控种植密度、杂草比例和施肥量。同时，在进行杂草管理时应选择合适的杂草种类，以发挥作物和杂草多样性在调控产量中的潜在价值。
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图 3 K2HPO4质量分数对黄秋葵多糖提取率的影响
Figure 3 Effect of K2HPO4 mass fraction on the extraction rate of okra polysaccharide
图 4 提取时间对黄秋葵多糖提取率的影响
Figure 4 Effect of extraction time on the extraction rate of okra polysaccharide
图 5 提取温度对黄秋葵多糖提取率的影响
Figure 5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of okra polysaccharide
图 6 液固比对黄秋葵多糖提取率的影响
Figure 6 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of okra polysaccharide
图 7 [Bmim]Cl质量分数对黄秋葵多糖提取率的影响
Figure 7 Effect of [Bmim]Cl mass fraction on the extraction rate of okra polysaccharide
图 8 各因素交互作用对黄秋葵多糖提取率交互影响的响应面图
Figure 8 Response surface of the interaction of various factors on the extraction rate of polysaccharides from okra
表 1 Box-Behnken试验因素与水平
Table 1. Factors and levels of Box-Behnken design
因素 水平 −1 0 1 A. K2HPO4质量分数/% 20 23 26 B. 提取时间/min 25 30 35 C. 提取温度/℃ 55 60 65 D. 液固比/(mL·g−1) 15 20 25 E. [Bmim]Cl质量分数/% 70.0 72.5 75.0 
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表 2 不同[Bmim]Cl-无机盐双水相体系萃取能力的比较
Table 2. Comparison of extraction ability of different [Bmim]-Cl-inorgnic salts in aqueous two-phase system
双水相体系 [Bmim]Cl质量分数
(%)/盐质量分数(%)R K 上相提
取率/%[Bmim]Cl-(NH4)2SO4 55/40 − − − [Bmim]Cl- Na2CO3 70/20 0.21 1.72 4.80 [Bmim]Cl-Na2HPO4 60/7 − − − [Bmim]Cl-K2HPO4 50/75 0.45 1.54 19.40 说明：“−”表示不分相
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表 3 方差分析表
Table 3. Variance analysis table
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性 模型 726.72 20 36.34 47.14 ＜0.000 1 ** A 0.26 1 0.26 0.33 0.568 4 B 0.46 1 0.46 0.59 0.449 2 C 1.93 1 1.93 2.50 0.126 6 D 143.28 1 143.28 185.88 ＜0.000 1 ** E 25.40 1 25.40 32.95 ＜0.000 1 ** AB 27.46 1 27.46 35.52 ＜0.000 1 ** AC 0.016 1 0.016 0.020 0.887 9 AD 5.20 1 5.20 6.74 0.015 5 * AE 1.64 1 1.64 2.13 0.157 3 BC 43.30 1 43.30 56.17 ＜0.000 1 ** BD 17.06 1 17.06 22.13 ＜0.000 1 ** BE 3.65 1 3.65 4.73 0.039 3 * CD 56.70 1 56.70 73.56 ＜0.000 1 ** CE 3.88 1 3.88 5.03 0.033 9 * DE 0.17 1 0.17 0.22 0.644 6 A2 118.50 1 118.50 153.73 ＜0.0001 ** B2 266.53 1 266.53 345.90 ＜0.000 1 ** C2 65.99 1 65.99 85.61 ＜0.000 1 ** D2 80.51 1 80.51 104.45 ＜0.000 1 ** E2 204.92 1 204.92 265.84 ＜0.000 1 ** 残差 19.27 25 0.77 失拟项 12.36 20 0.62 0.45 0.909 7 误差项 6.91 5 1.38 总和 745.99 45 R2=0.974 2， ${R_{{\rm{Adj}}}^2} $ =0.953 5说明：**表示差异极显著(P＜0.01)；*表示差异显著(P＜ 0.05)
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20190339
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