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FT（Flowering Locus T）基因是模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana的重要开花调控因子之一，其编码蛋白质是可以长距离转运成花激素的主要成分，在花形成过程中起关键作用[1-2]。目前，已经在水稻Oryza sativa[3]，小麦Triticum sestivum[4]，葫芦Cucurbita moschata[5]，番茄Lycopersicon esculentum[6]，柑橘Poncirus trifoliate[7]，苹果Malus × domestica[8]，杨树Populus[1, 9-12]等中克隆出FT的同源基因，并对部分植物进行了遗传转化，转基因植物中FT类基因的过量表达均不同程度地引起了转基因植株的早期开花。水稻FT同源基因Hd3a在水稻中的过量表达，导致转化株具有不依赖于光周期的极早花表型[3]。多年三叶桔Poncirus trifoliata FT同源基因CiFT的组成型表达，促使幼龄期植株提早进入生殖阶段[7]。苹果FT同源基因MdFT1在苹果和杨树中的组成型、或在拟南芥韧皮筛管特异表达启动子SUC2作用下的特异表达，均可有效促进转化株的开花，开花促进作用甚至表现在组织培养阶段[8]。杨树中，Hsu等[9]在美洲黑杨Populus deltoides中克隆到了与其开花诱导或季节性生长等相关的基因 FT2，并将 FT2转入杨树幼树中，使它们 1 a内开花。Böhlenius等[1]将毛果杨P． trichocarpa的FT同源基因 FT1 转入杂种杨中，4周后农杆菌Agrobacterium浸染的茎段即出现花状结构，FT1表达量稍弱的植株6个月可以成花。Shen等[12]克隆了小叶杨Populus simonii的2个FT同源基因PsFT1和PsFT2，转基因杨树在40 d内即可开花。FT基因在木本植物中应用的关键是其诱导的花能够产生有育性的正常配子。上述研究结果均只显示了FT基因能够促进转基因植物提前开花，重点在开花过程中FT基因转录、表达活性及与其他基因的抑制/促进关系研究方面，而对于其诱导的花的发育及花器官的变异却很少涉及。我们曾对热激启动子（HSP）驱动的不同种类 FT 基因诱导的杨树花器官进行较为详细的报道[13]，发现HSP 驱动的FT基因诱导的杨树花器官变异较大，有单性单朵花，两性单朵花，正常的柔荑花序，以及回复营养生长的花序等。那么，作为植物转基因中应用最为普遍的组成型启动子——CaMV35S启动子，其驱动的 FT 基因诱导的杨树花器官变异有多大，同HSP启动子相比较，变异程度如何，都值得进一步研究。
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从拟南芥中聚合酶链式反应（PCR）扩增获得FT基因编码区，利用Gateway技术将扩增片段克隆在双元表达载体pH35GS（Invitrogen）上，代替位于CaMV35S启动子下游的ccdB基因。扩增引物为：5′-GGCATCGTATCAAGCTTACTAGTG-3′，5′-ATCAAGAACGTCTCCAACAACTCTG-3′。
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供试杨树为杂种无性系T89（雄株，P. tremula × P. tremuloides）及无性系717（雌株，P. tremula × P. alba）试管苗。35S::FT 转化农杆菌（LBA4404）参考Holstein等[14]的方法，无性系T89和717再生、转化参照Tuominen等[15]的方法。转基因植株的PCR检测参照Filichkin等[16]的方法，扩增引物为：5′-AGTGAAGGCATCGTATCAAGC-3′，5′-CGCGGGATATCACCACTTTG-3′。
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将PCR检测呈阳性的植株按株系编号，于（25+2） ℃，光照16 h·d-1，光强45 μmol·m-2·s-1的培养室中茎段扩繁培养，待不定芽长至2 cm时生根培养，期间观察记录在试管培养阶段的开花情况。将试管培养阶段形成初始花结构的转基因植株一部分茎段扩繁继代，观察35S::FT在继代过程中的诱导开花情况；同时，将形成初始花结构的转基因植株另一部分移栽至装有灭菌移栽基质的塑料容器中（口径5 cm），浇水后放在装水的密封塑料袋内炼苗3周后移至温室[温度（25±2）℃，光照时间16 h·d-1，光照强度120 μmol·m-2·s-1]培养；待苗高长至15 cm 时移栽至口径20 cm的大塑料容器中，观察记录温室培养阶段的开花情况。浇水1次·d-1，施液体肥料1次·周-1[V（氮）∶V（磷）∶V（钾）＝20∶20∶20]。最后，将温室培养开花的转基因植株转至露天栽培，经过1个冬季休眠后，于生长季观察转基因植株的2次开花能力。
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试验总共获得无性系T89转基因阳性株系15个，其中在6个转基因株系中观察到了早期开花现象，开花株系占阳性株系的40.0%。获得无性系717转基因阳性株系11个，其中在5个转基因株系中观察到了早期开花现象，开花株系占阳性株系的45.5%。同我们之前在HSP::FT中的研究结果类似[11, 13]，2种杨树同一开花转基因株系内，并不是所有单株都能诱导开花，开花率（开花株系内，开花个体占总个体数的百分率）最高的株系约为56.0%，最低的约为12.0%，这种现象在杨树开花基因转化研究中很常见，可能是由于FT基因插入杨树基因组的不同位点影响的结果，例如插入位点位于正向调节元件周围，或位于反向调节元件周围，会导致FT基因不同地表达强度和特异性。或者插入异染色质区，而非常染色质区域时，由于与周边序列碱基组成的差异，都可以引起基因沉默，从而失去表达的能力[17]。
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转基因植株顶端分生组织属性的转变及初始花结构的形成发生于试管培养阶段，试管培养2个月，株高为4～6 cm的植株就可开始初始花结构的发育（图 1a），说明转基因植株顶端分生组织属性的改变最早可发生于外植体与农杆菌Agrobacterium tumefaciens共培养之后至不定芽诱导出的2个月内。
图 1 35S::FT转基因杨树早期花发育及花器官变异
Figure 1. Flower development and variation of 35S::FT transgenic poplars
在该时段内，顶端分生组织由营养型向生殖型转变，变成花序型分生组织[18]，花序型分生组织在发育过程中，一部分在叶腋部位产生花芽，一部分继续生长、伸长，在新的叶腋部位产生更多的花芽。花芽发育时，最开始从叶腋部位长出一细丝状类似于花梗的结构，随着培养时间延长，细丝结构会伸长，约2周后，长至3~5 mm时，其顶端会慢慢膨大，在随后的温室培养中会分化成花器官，形成单朵花（图 1b）。
花是极度压缩的枝条，杨树野生型花是由很多小花紧密着生在花轴上，形成一柔荑花序，各小花之间无节间。而转基因植株产生的这些单朵花更像着生在一花枝上面，每朵花基部有一叶片，2朵花之间的节间较长，约5 mm。这似乎暗示了35S::FT基因可能只决定了开花的时间，不能使顶端分生组织属性由营养型向生殖型彻底转变，一部分营养生长还在继续。当转基因植株产生4~6朵单朵花时，花序型分生组织营养生长才明显受到抑制，产生于顶端的8~10朵花簇生在一起，外观更像一花序，花与花之间的节间极度缩短，基部没有叶片，顶端成花，不再伸长生长（图 1c）。
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试验发现，开花的转基因株系继代后开花率大幅下降（表 1）。T89雄性无性系继代前6个开花株系的平均开花率为37.8%，继代1次后株系平均开花率就下降至16.0%，随着继代次数增加，开花率不断下降，继代5次后未发现开花植株。717雌性无性系继代前5个开花株系的平均开花率为10.3%，继代1次后下降至3.0%，继代2次后未见开花植株。同时，T89雄性转基因植株中会产生少量两性花（图 1e），两性花的比例会随着继代次数的增加而上升。继代前两性花比率为11.8%，继代1次为12.4%，继代4次后升至39.7%。在杨树其他开花基因转化中也曾发现转基因植株出现性别转化现象[19]，目前还不清楚开花基因究竟如何引起两性花的发育，以及为何继代次数会增加两性花比例。
表 1 继代次数对转基因无性系开花率、两性花比率的影响
Table 1. Effects subculture on flowering frequency and bisexual
继代次数 T89(♂)开花率/% 717(♀)开花率/% T89(♂)两性花
比例0 37.8 10.3 11+8 1 16.0 3+0 12+4 2 9+2 0 - 3 3+6 0 - 4 0+8 0 39+7 5 0 0 - 说明:表中数据为11个开花株系的平均值, 每个株系约30~35个个体。"-" 表示未观察。 -
转基因植株在试管培养阶段只能形成初始花结构，不能完成花器官的分化。试管内开花的转基因植株，如不及时继代培养或移栽至温室培养，初级花结构会很快枯萎凋谢，不能继续发育。只有将试管培养完成花芽分化的材料移栽至温室培养，才能完成花器官的分化。我们将部分试管阶段形成初始花结构未凋谢、未继代的转基因植株，直接经炼苗移栽后转入温室培养，发现试管阶段诱导的初始花结构在移栽至温室后会继续发育，形成花器官，但发育不完全，具雌雄蕊、花盘结构，无成熟苞片结构，雄蕊不能成熟发育（图 1g）。雄株T89转基因株系会产生大量的雄花（图 1d）以及少量两性花（10%左右）（图 1e），雌株717转基因株系只产生雌花（图 1f）。不论哪种花，均为单朵花，而非野生型的柔荑花序（图 1j）。从试管培养阶段初始花结构形成至温室培养阶段花器官的分化需要约5周左右的时间。花器官均产生于初始花结构顶端膨大部位。对于雄花，花药从花盘中展露约需1周时间；每个花朵会产生3～5枚散生雄蕊，均由1个花丝连接在花盘上，花丝长约0.5 mm，花药长约0.1～0.3 mm （图 1d）。花药外形跟野生型区别不大，但不能成熟发育，未发现散粉现象。两性花的雄蕊和雄花的大小相当，也未见散粉现象，雌蕊很大，子房可达2 mm，纺锤形，没有明显的花柱（图 1e）。雌花子房比两性花子房大，约3～4 mm（图 1f）。因为一起开放的雄花未能散粉，又未进行人工授粉，所以，两性花及雌花的胚囊育性未知。
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温室培养阶段的开花植株，在随后1 a的继续培养中未能再次开花，即使植株高度达 1 m 以上的植株，也未二次开花。是否因为植株没有经过休眠造成这种现象呢？我们将在温室生长1 a的 35S::FT 转基因植株移栽至露天栽培，发现经过一个冬天的低温休眠处理，第1次开花的转基因植株也未能再次开花。
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试验显示：FT 基因在诱导杨树早期开花方面，确实有明显促进作用。由于 35S启动子的过量表达，促使 FT 基因在 2月龄试管苗中提前表达而诱导其开花，这将杨树大田开花所需的 8～20 a时间缩短到短短的 2个月。然而，35S::FT 转基因植株所开的花全为异常的单朵花，而非野生型的柔荑花序。除了胚囊育性不可知之外，所有雄花均不能完全发育，不能产生花粉。而我们构建的热激启动子（HSP）驱动的FT 转基因杨树，尽管花器官变异依然较大，但产生了较多数量的正常柔荑花序（图 1h和图 1i），且有花粉产生[11, 13]。这说明，在以诱导正常花器为目的转基因研究中，35S 并不是合适的启动子，尽管该启动子驱动的FT转基因植株具有明显的早花性，但因其诱导的花发育不全没有育性而失去应用价值。
35S::FT 转基因植株在成花过程的早期，分生组织并不能完全失去营养生长特性，导致花与花之间有较长节间，且有叶片发育，形成异常的单朵花，单朵花不能成熟发育等。这些都暗示了FT 基因可能只决定了开花的时间，而不能决定花的正常发育。在后期，分生组织基本丧失了营养生长特性，形成外观更像花序的顶端簇生单朵花。这暗示了在后期，可能有别的影响花朵发育的基因发挥了作用，促使花的发育更加趋于正常，而这些开花基因的正常表达，与转基因植株的生长发育状态有关。这也说明了为什么转基因植株在试管培养阶段只能完成分生组织属性的改变，形成初始花结构，不能完成花器官的分化与发育，而在移栽至温室后会完成花器官的分化发育过程的原因。
植物从营养生长向生殖生长的转换是高等植物开花最重要的过程，开花诱导过程是开花基因在时间和空间上顺序表达的结果，机制十分复杂，有光周期、春化、自主促进和赤霉素（GA）等多种开花诱导途径的参与，涉及许多调控基因[18]。自然界中杨树必须经过8～20 a的营养生长阶段之后才能诱导开花，35S::FT 虽然可以瞬时过量表达促进转基因杨树在很早的试管培养阶段形成花结构，但似乎很难改变杨树在长期进化过程中形成的固有开花模式，正常花器的诱导依然离不开植株自身足够的营养生长，以及在特定发育阶段表达的其他开花基因的调控。这一点在我们对 HSP::FT 转基因杨树的研究中也有发现，热激材料的年龄越大，开花率越高，正常花器数目越多[13]。这也暗示了在开花基因转化研究中，特异性启动子较组成型启动子有优势，因为特异性启动子如 HSP 可以在植株经过足够的营养生长时间之后再诱导让其表达，促进开花，而组成型启动子如 35S，这一点似乎很难实现。
以往研究显示，35S启动子驱动的开花基因的表达很不稳定，在离体及温室栽培中促花性能不一，甚至同一开花基因转化不同种植物促花性能也不一样，开花植株重复开花率较低，而且会阻遏植物的正常生长发育等[10, 21]。我们的研究也发现这种不稳定现象，35S::FT转基因杨树开花率随着试管苗继代次数的增加而下降、温室培养及转至大田的开花植株也未能再次开花。甚至同样的实验材料，我们的结果与Hoenicka等[10]的研究结果也不一致，他们在35S::FT转化无性系T89的研究中发现，转基因植株在温室培养阶段不能继续完成花的发育。引起这种不稳定现象的原因需进一步用实验证明，Hoenicka等[10]认为可能是由于基因沉默或其他开花基因扰乱了35S::FT系统的开花诱导所致。也可能与影响35S启动子表达的植株发育阶段、光周期、温度等因素[22]有关。
总之，植物生长发育、开花结实是一个复杂的生化过程。该过程的正常实现，既与各种相互关联的遗传基因、环境因子、遗传与环境因子之间的严密调控有关，也与长期进化中形成的各种平衡关系有关，还与植物的生长发育状态有关[4-6, 9-10, 21-22]。开花基因转化中，转基因植株早期开花中存在的一系列异常现象，可能涉及上述任一因素，要揭示其真正原因，需要从分子手段入手，深入探明开花基因及其调控基因促进开花的机制以及影响花器官正常发育的基因及其调控机制。相信杨树和其他林木以及1年生植物的比较基因组学和基因组功能的基础研究，将会帮助找到解决问题的新途径。或许，其他开花基因（单基因途径）及启动子，以及多种开花基因的联合使用（基因叠加途径），是解决这一问题的有效途径。
FT gene with a CaMV35S promoter to control early flowering of transgenic poplar
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摘要: 为了研究CaMV35S启动子驱动的FT基因对转基因杨树Populus早期开花的影响,利用Gateway技术构建了35S::FT基因表达载体,并对杨树进行了遗传转化,从转基因杨树花的发育、花器官变异等方面初步探讨了35S::FT促进杨树早期开花性能。结果表明:35S::FT转基因杨树分生组织属性的改变及初始花结构的形成发生于试管培养阶段;花开始发育后如不及时把开花植株继代培养或转至土壤温室培养,初始花结构会凋谢枯萎,不能继续发育。转基因植株花器官的分化与发育发生于温室培养阶段的3~5周内,能够分化出典型的花器官,但发育不完全,具雌雄蕊、花盘结构,无成熟苞片结构,雄蕊不能成熟发育。35S::FT诱导的花均为单朵花,而非野生型的柔荑花序;多数花属于单性花,但转基因雄性无性系中会出现两性花。转基因植株的开花率随着试管苗继代次数的增加而急剧下降,但两性花比例会上升。Abstract: To study the effects on the early flowering capacity of the FLOWERING LOCUS T(FT) gene in transgenic poplar driven by a Cauliflower Mosaic Virus 35S (CaMV35S) promoter, provide basic data for effective application of FT gene on forest trees, an FT gene vector driven by a CaMV35S promoter was constructed using Gateway technology, and then genetic transformation of hybrid poplar was performed with this vector. The early flowering capability of transgenic poplar induced by 35S::FT was discussed both from flower development and floral organ variation viewpoints. Results showed that transformation of the meristem attributive and initial floral structure of 35S::FT transgenic poplar happened in the tube culture stage. If the flowering plants were not sub-cultured in vitro or timely transplanted into soil to culture in a greenhouse, the initial floral structure withered or ceased development. Within 3-5 weeks of greenhouse culture the initial floral structure continued to develop and finished floral organ differentiation and development. The floral organ was incomplete typically with pistil/stamen and flower disc structures but no mature bract structures; stamens also failed to mature. Flowers induced by 35S::FT were single flowers rather than catkins as with wild-types. Most flowers were unisexual, but bisexual flowers appeared on male transgenic plants. Flowering frequency of transgenic plants declined sharply with the increase of subculture time, but the proportion of bisexual flowers on male transgenic plants rose. 35S promoter is not suitable in genetic transformation for the purpose of getting normal floral organ.
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Key words:
- forest tree breeding /
- 35S promoter /
- FT gene /
- poplar /
- early flowering
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种子活力是指种子具有的发芽潜力、生长潜力和生产潜力，是检验种子质量优劣的最可靠指标[1-2]。高活力的种子抗逆性强，具有实现高产量和优品质的潜在能力[3]。测定种子活力是农林业生产中不可缺少的步骤。目前，种子活力的测定方法主要有直接法和间接法2类。直接法指在实验室模拟一定条件直接测定萌发率，如低温发芽测定[4]和冷冻测定[5]；间接法通过测定某些与种子活力相关的生理生化指标间接评价种子活力的方法，比较常用的方法如四氮唑法(TTC)测定、电导率测定[6]、加速老化测定[7]等。不同物种的最适种子活力测定方法也不相同。POONGUZHALI等[8]发现最能正确反映黑吉豆Vigna mungo种子活力的方法是加速老化法；电导率法评价紫花苜蓿Medicago sativa种子活力最为敏感[9]；而通过记录平均胚根突出时间是测定燕麦Avena sativa种子活力高低的重要指标[10]。一般来讲，直接法测定种子活力最准确，但较为耗费时间，难以大规模进行。因此多采用电导率法和TTC法等间接法测定种子活力。TTC法测定种子活力具有方便快速、结果重复性好等优点，主要用于农作物种子活力的测定[11]。电导率法根据细胞膜的完整性来评价种子活力大小，但精度受到标准参考物、温度、水质等因素的影响较大[12]。紫外分光光度计法(UVS)由电导率法改进而来，通过测定种子浸出液的紫外吸光值，来判定浸出液中氨基酸等有机物的相对含量间接推断种子活力。鲁黎明等[13]利用UVS法测定烟草Nicotiana tabacum种子活力时发现：UVS法测定种子活力简便快捷，准确度较高。杉木Cunninghamia lanceolata是中国南方地区的优良速生用材树种，生长快、材质较好，在中国商品材生产中占有重要地位。杉木种子活力的测定与评价是杉木良种培育、种苗生产和人工林营建的重要环节，但由于杉木种子细小、种皮坚硬，胚小易碎等，一般的种子测量方法并不能快速有效检测。本研究以标准发芽试验为参照，比较了TTC法和UVS法测定杉木种子活力的准确性和便捷性，旨在建立一种快速方便且较为准确的种子活力检测方法。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
2017年10月底至11月初，分别收集普通杉木(普杉)ZLP-1、速生型杉木(速杉)ZLS-9、龙15×闽33双系杂交(杂杉)种子，其中普杉种子和速杉种子采自浙江农林大学林木种质资源圃，杂杉种子由浙江省开化县林场提供。另于2018年11月初在浙江农林大学林木种质资源圃中采集优良无性系速1、新6和红47的半同胞种子用于测定方法验证。
1.2 方法
1.2.1 种子处理
采集健康成熟球果，于阴凉通风处晾干；将种子从球果抖出，挑选健康饱满种子装入玻璃广口瓶，密封后置于4 ℃冰箱保存，约6个月后用于种子活力测定。
1.2.2 标准发芽法
取3个品种杉木种子各150粒，体积分数为10%的安替福明灭菌15 min，无菌水清洗3次，无菌水中25 ℃浸泡24 h。取无菌培养皿，铺上无菌滤纸，并用无菌水湿润；将浸泡后的种子铺于滤纸上，置于25 ℃光照培养箱中萌发。各样品重复3次，每5 d 观察统计发芽情况，15 d后统计萌发种子数，计算平均萌发率(%)。
1.2.3 TTC法
取3个品种杉木种子各150粒，按1.2.2灭菌浸泡后剥去种皮，切下种胚，加质量分数为0.1%的TTC溶液10 mL，置于35 ℃恒温箱中染色120 min。吸去多余TTC液，清水冲洗1~2次，观察并记录被染色的种胚数。胚染成红色的为具有活力的种子，计算染色百分率(%)。重复3次。
1.2.4 UVS
取3个品种杉木种子各150粒，蒸馏水清洗2次，超纯水清洗1次，滤纸吸干后放入50 mL离心管中，用20 mL超纯水在25 ℃下浸泡，于4、8、12、24 h后测定种子浸出液吸光度D(260)。重复3次。以D(260)为x，种子真实萌发率为y，利用Excel软件进行线性回归分析，建立不同时间浸出液与萌发率间的回归方程，通过拟合系数(R2)选定用于种子活力预测的回归方程。
1.2.5 数据处理
采用Excel及SPSS进行统计分析。
2. 结果与分析
2.1 真实萌发率
由表1发现：相同萌发环境下，3个品种杉木种子萌发率差异显著(P＜0.05)。杂杉种子萌发初期萌发率较小，普杉和速杉种子在萌发初期(5 d)就表现出很高的发芽势，均在萌发15 d时趋于稳定。统计萌发15 d 时的萌发率发现：速杉种子萌发率最高(44.88%)，普杉较低(41.11%)，杂杉最低，仅为37.33%；总体上萌发率变异系数较小，均略大于5%。
表 1 不同杉木种子真实萌发率Table 1 Real germination rate of different C. lanceolata seeds种子类型 萌发率/% 变异系数/% 普杉 41.11±2.34 b 5.69 速杉 44.88±2.25 a 5.01 杂杉 37.33±2.33 c 6.24 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) 2.2 TTC染色法
如表2可知：不同杉木种子的胚染色率存在差异，其中速杉最高(49.78%)，杂杉略低(42.22%)，普杉最低(38.89%)；变异系数波动较大。
表 2 不同杉木种子胚TTC染色率Table 2 TTC staining rate of different C. lanceolata seed embryos种子类型 染色率/% 变异系数/% 普杉 38.89±8.88 c 22.83 速杉 49.78±3.04 a 6.10 杂杉 42.22±3.35 b 7.93 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) 2.3 UVS法
由图1可知：随着浸泡时间延长，同一种子浸出液吸光度[D(260)]呈现逐渐增大的趋势；相同浸泡时长下，不同种子浸出液吸光度[D(260)]不同，3种种子间存在显著差异。速杉种子浸出液紫外吸光值最小，说明萌发率最高，杂杉紫外吸光值最大，说明种子萌发率最低，与实际萌发率一致。对不同浸泡时间下吸光度[D(260)]与真实萌发率做线性回归分析，得到回归方程如下：① 4 h浸泡，y=−0.566 6x+0.449 3 (R2=0.953)；② 8 h浸泡，y=−0.309 7x+0.440 2 (R2=0.899)；③ 12 h浸泡，y=−0.506 7x+0.458 8 (R2=0.902)；④ 24 h浸泡，y=−0.145 7x+0.444 6 (R2=0.689)。由回归方程可看出4 h种子浸出液的紫外吸光度与萌发率之间拟合系数最高(0.953)，说明在本研究条件下，杉木种子浸泡4 h后的浸出液紫外吸光值能够较好地反映杉木种子的活力。利用该回归方程计算3个品种种子的萌发率(表3)，发现速杉种子萌发率为44.94%，普杉为41.00%，杂杉为37.39%；且其变异系数均约为5%。
图 1 不同浸泡时间下杉木种子浸出液吸光度Figure 1 Absorbance of leaching solution of different C. lanceolata seeds at different soaking times表 3 浸泡4 h后杉木种子吸光度[D(260)]所对应的萌发率波动Table 3 Fluctuation range of germination rate corresponding to obsorbance [D(260)] of different C. lanceolata seeds soaked for 4 h种子类型 萌发率/% 变异系数/% 普杉 41.00±1.96 b 4.78 速杉 44.94±1.95 a 4.33 杂杉 37.39±2.10 c 5.61 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) 2.4 标准发芽法、TTC法和UVS法的比较
由表4可知：标准发芽法步骤简单，但耗时最长；TTC染色法需将种胚剥出染色，操作最为繁琐，且较为耗时；UVS法操作简单，耗时也最短。比较3种方法测定的萌发率(图2)，TTC法测得的种子萌发率与实际萌发率间存在显著差异(P＜0.05)，UVS法测定的种子活力与实际萌发率没有显著差异(P＞0.05)。
表 4 3种方法测定种子活力步骤与耗时比较Table 4 Comparison of three methods for determining seed vigor and time-consuming方法 步骤(耗时) 总耗时/h 标准发芽法 安替福明灭菌(15 min) 无菌水浸泡(24 h) 测定自然萌发率(15 d) 约384 TTC法 安替福明灭菌(15 min) 蒸馏水浸泡(24 h) 剥种胚恒温染色(1~3 h) 结果统计(1 h) 26~28 UVS法 种子清洗(1 h) 去离子水浸泡(4 h) OD值测定(0.5 h) 5.5 2.5 UVS法验证
为了进一步验证UVS法的稳定性，随机选取速1、新6和红47共3个杉木无性系，于2018年11月采集其半同胞种子进行UVS法种子活力测定，同时也采用标准发芽法和TTC法测定进行比较。活力测定方法按方法1.2.2，1.2.3和1.2.4进行。结果如表5所示：UVS法测定的结果与标准发芽法较为一致，没有显著差异，而TTC法测得的萌发率与其他2种方法差异显著，说明UVS法所测得的萌发率可靠程度较高，也比较稳定，是杉木种子活力测定的较好方法。
表 5 3种测定方法的稳定性比较Table 5 Comparison of the stability of the three methods方法 萌发率/% 速1 新6 红47 TTC法 57.33±10.28 a 55.33±7.83 a 56.67±9.55 a 标准发芽法 49.33±3.47 b 46.67±3.67 b 50.00±3.26 b UVS法 44.81±5.71 b 45.16±3.06 b 45.27±5.51 b 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) 3. 讨论
种子活力可以通过标准发芽法、加速老化法、TTC染色法和电导率法等多种方法进行评价，但由于受到物种、基因型和环境等因素的影响，目前并没有通用的种子活力测定方法[14-15]。因此，针对特定植物进行种子活力测定方法的比较，对于建立适用于特定植物种子活力测定具有重要意义。
作为一种公认的种子活力测定标准方法[16]，TTC法可以根据种子的种属、状态等调整染色时间以达到最佳活力检测效果[17-19]。本研究发现：由于杉木种子种皮较厚，用TTC法测定活力时需从种子中将胚剥离后再进行染色；此过程不仅费时费力，剥胚时还会造成损伤。同时由于不同种子胚的染色效果存在差异，易造成假阳性，导致活力测定结果与实际萌发率偏差较大。UVS法测定时间短、通量高、所需样本量少，可以有效提高检测效率，是近年来使用较多的测定种子活力的方法。边子星等[20]在利用该方法测定濒危华石斛 Dendrobium sinense种子活力时发现：浸泡4 h的种子浸出液吸光值与发芽率相关性较高，通过拟合回归方程可快速预测华石斛的种子活力。岳媛[21]比较了5种杜鹃Rhododendron种子活力测定方法发现，UVS法(种子浸泡8 h)能较准确地反映出田间出苗的情况，变异系数相对较小，试验结果较稳定，可以作为杜鹃花属植物种子活力测定的方法。本研究首次采用UVS法对杉木种子活力进行了测定，结果发现种子浸泡4 h后，种子浸出液吸光度[D(260)]与种子活力间有较高相关性(R2=0.953)，通过预测回归方程可以较好地拟合杉木种子活力。在实际操作中，受试种子往往不同批次、不同年份，因而萌发率会有较大波动，因此应分别计算不同批次种子浸出液吸光值与真实萌发率的相关性，从而避免较大的误差。总体上来讲，这种方法简便快速，准确性高，有利于提高测定效率。
综合上述实验结果，本研究认为TTC法在测定杉木种子活力时，检测准确率与速度上均较差；UVS法可快速检测杉木种子活力，且操作简便，尤其对于检测大量不同杉木种子的活力具有更高效率。
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图 1 35S::FT转基因杨树早期花发育及花器官变异
Figure 1 Flower development and variation of 35S::FT transgenic poplars
表 1 继代次数对转基因无性系开花率、两性花比率的影响
Table 1. Effects subculture on flowering frequency and bisexual
继代次数 T89(♂)开花率/% 717(♀)开花率/% T89(♂)两性花
比例0 37.8 10.3 11+8 1 16.0 3+0 12+4 2 9+2 0 - 3 3+6 0 - 4 0+8 0 39+7 5 0 0 - 说明:表中数据为11个开花株系的平均值, 每个株系约30~35个个体。"-" 表示未观察。 
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