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FT（Flowering Locus T）基因是模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana的重要开花调控因子之一，其编码蛋白质是可以长距离转运成花激素的主要成分，在花形成过程中起关键作用[1-2]。目前，已经在水稻Oryza sativa[3]，小麦Triticum sestivum[4]，葫芦Cucurbita moschata[5]，番茄Lycopersicon esculentum[6]，柑橘Poncirus trifoliate[7]，苹果Malus × domestica[8]，杨树Populus[1, 9-12]等中克隆出FT的同源基因，并对部分植物进行了遗传转化，转基因植物中FT类基因的过量表达均不同程度地引起了转基因植株的早期开花。水稻FT同源基因Hd3a在水稻中的过量表达，导致转化株具有不依赖于光周期的极早花表型[3]。多年三叶桔Poncirus trifoliata FT同源基因CiFT的组成型表达，促使幼龄期植株提早进入生殖阶段[7]。苹果FT同源基因MdFT1在苹果和杨树中的组成型、或在拟南芥韧皮筛管特异表达启动子SUC2作用下的特异表达，均可有效促进转化株的开花，开花促进作用甚至表现在组织培养阶段[8]。杨树中，Hsu等[9]在美洲黑杨Populus deltoides中克隆到了与其开花诱导或季节性生长等相关的基因 FT2，并将 FT2转入杨树幼树中，使它们 1 a内开花。Böhlenius等[1]将毛果杨P． trichocarpa的FT同源基因 FT1 转入杂种杨中，4周后农杆菌Agrobacterium浸染的茎段即出现花状结构，FT1表达量稍弱的植株6个月可以成花。Shen等[12]克隆了小叶杨Populus simonii的2个FT同源基因PsFT1和PsFT2，转基因杨树在40 d内即可开花。FT基因在木本植物中应用的关键是其诱导的花能够产生有育性的正常配子。上述研究结果均只显示了FT基因能够促进转基因植物提前开花，重点在开花过程中FT基因转录、表达活性及与其他基因的抑制/促进关系研究方面，而对于其诱导的花的发育及花器官的变异却很少涉及。我们曾对热激启动子（HSP）驱动的不同种类 FT 基因诱导的杨树花器官进行较为详细的报道[13]，发现HSP 驱动的FT基因诱导的杨树花器官变异较大，有单性单朵花，两性单朵花，正常的柔荑花序，以及回复营养生长的花序等。那么，作为植物转基因中应用最为普遍的组成型启动子——CaMV35S启动子，其驱动的 FT 基因诱导的杨树花器官变异有多大，同HSP启动子相比较，变异程度如何，都值得进一步研究。
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从拟南芥中聚合酶链式反应（PCR）扩增获得FT基因编码区，利用Gateway技术将扩增片段克隆在双元表达载体pH35GS（Invitrogen）上，代替位于CaMV35S启动子下游的ccdB基因。扩增引物为：5′-GGCATCGTATCAAGCTTACTAGTG-3′，5′-ATCAAGAACGTCTCCAACAACTCTG-3′。
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供试杨树为杂种无性系T89（雄株，P. tremula × P. tremuloides）及无性系717（雌株，P. tremula × P. alba）试管苗。35S::FT 转化农杆菌（LBA4404）参考Holstein等[14]的方法，无性系T89和717再生、转化参照Tuominen等[15]的方法。转基因植株的PCR检测参照Filichkin等[16]的方法，扩增引物为：5′-AGTGAAGGCATCGTATCAAGC-3′，5′-CGCGGGATATCACCACTTTG-3′。
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将PCR检测呈阳性的植株按株系编号，于（25+2） ℃，光照16 h·d-1，光强45 μmol·m-2·s-1的培养室中茎段扩繁培养，待不定芽长至2 cm时生根培养，期间观察记录在试管培养阶段的开花情况。将试管培养阶段形成初始花结构的转基因植株一部分茎段扩繁继代，观察35S::FT在继代过程中的诱导开花情况；同时，将形成初始花结构的转基因植株另一部分移栽至装有灭菌移栽基质的塑料容器中（口径5 cm），浇水后放在装水的密封塑料袋内炼苗3周后移至温室[温度（25±2）℃，光照时间16 h·d-1，光照强度120 μmol·m-2·s-1]培养；待苗高长至15 cm 时移栽至口径20 cm的大塑料容器中，观察记录温室培养阶段的开花情况。浇水1次·d-1，施液体肥料1次·周-1[V（氮）∶V（磷）∶V（钾）＝20∶20∶20]。最后，将温室培养开花的转基因植株转至露天栽培，经过1个冬季休眠后，于生长季观察转基因植株的2次开花能力。
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试验总共获得无性系T89转基因阳性株系15个，其中在6个转基因株系中观察到了早期开花现象，开花株系占阳性株系的40.0%。获得无性系717转基因阳性株系11个，其中在5个转基因株系中观察到了早期开花现象，开花株系占阳性株系的45.5%。同我们之前在HSP::FT中的研究结果类似[11, 13]，2种杨树同一开花转基因株系内，并不是所有单株都能诱导开花，开花率（开花株系内，开花个体占总个体数的百分率）最高的株系约为56.0%，最低的约为12.0%，这种现象在杨树开花基因转化研究中很常见，可能是由于FT基因插入杨树基因组的不同位点影响的结果，例如插入位点位于正向调节元件周围，或位于反向调节元件周围，会导致FT基因不同地表达强度和特异性。或者插入异染色质区，而非常染色质区域时，由于与周边序列碱基组成的差异，都可以引起基因沉默，从而失去表达的能力[17]。
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转基因植株顶端分生组织属性的转变及初始花结构的形成发生于试管培养阶段，试管培养2个月，株高为4～6 cm的植株就可开始初始花结构的发育（图 1a），说明转基因植株顶端分生组织属性的改变最早可发生于外植体与农杆菌Agrobacterium tumefaciens共培养之后至不定芽诱导出的2个月内。
图 1 35S::FT转基因杨树早期花发育及花器官变异
Figure 1. Flower development and variation of 35S::FT transgenic poplars
在该时段内，顶端分生组织由营养型向生殖型转变，变成花序型分生组织[18]，花序型分生组织在发育过程中，一部分在叶腋部位产生花芽，一部分继续生长、伸长，在新的叶腋部位产生更多的花芽。花芽发育时，最开始从叶腋部位长出一细丝状类似于花梗的结构，随着培养时间延长，细丝结构会伸长，约2周后，长至3~5 mm时，其顶端会慢慢膨大，在随后的温室培养中会分化成花器官，形成单朵花（图 1b）。
花是极度压缩的枝条，杨树野生型花是由很多小花紧密着生在花轴上，形成一柔荑花序，各小花之间无节间。而转基因植株产生的这些单朵花更像着生在一花枝上面，每朵花基部有一叶片，2朵花之间的节间较长，约5 mm。这似乎暗示了35S::FT基因可能只决定了开花的时间，不能使顶端分生组织属性由营养型向生殖型彻底转变，一部分营养生长还在继续。当转基因植株产生4~6朵单朵花时，花序型分生组织营养生长才明显受到抑制，产生于顶端的8~10朵花簇生在一起，外观更像一花序，花与花之间的节间极度缩短，基部没有叶片，顶端成花，不再伸长生长（图 1c）。
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试验发现，开花的转基因株系继代后开花率大幅下降（表 1）。T89雄性无性系继代前6个开花株系的平均开花率为37.8%，继代1次后株系平均开花率就下降至16.0%，随着继代次数增加，开花率不断下降，继代5次后未发现开花植株。717雌性无性系继代前5个开花株系的平均开花率为10.3%，继代1次后下降至3.0%，继代2次后未见开花植株。同时，T89雄性转基因植株中会产生少量两性花（图 1e），两性花的比例会随着继代次数的增加而上升。继代前两性花比率为11.8%，继代1次为12.4%，继代4次后升至39.7%。在杨树其他开花基因转化中也曾发现转基因植株出现性别转化现象[19]，目前还不清楚开花基因究竟如何引起两性花的发育，以及为何继代次数会增加两性花比例。
表 1 继代次数对转基因无性系开花率、两性花比率的影响
Table 1. Effects subculture on flowering frequency and bisexual
继代次数 T89(♂)开花率/% 717(♀)开花率/% T89(♂)两性花
比例0 37.8 10.3 11+8 1 16.0 3+0 12+4 2 9+2 0 - 3 3+6 0 - 4 0+8 0 39+7 5 0 0 - 说明:表中数据为11个开花株系的平均值, 每个株系约30~35个个体。"-" 表示未观察。 -
转基因植株在试管培养阶段只能形成初始花结构，不能完成花器官的分化。试管内开花的转基因植株，如不及时继代培养或移栽至温室培养，初级花结构会很快枯萎凋谢，不能继续发育。只有将试管培养完成花芽分化的材料移栽至温室培养，才能完成花器官的分化。我们将部分试管阶段形成初始花结构未凋谢、未继代的转基因植株，直接经炼苗移栽后转入温室培养，发现试管阶段诱导的初始花结构在移栽至温室后会继续发育，形成花器官，但发育不完全，具雌雄蕊、花盘结构，无成熟苞片结构，雄蕊不能成熟发育（图 1g）。雄株T89转基因株系会产生大量的雄花（图 1d）以及少量两性花（10%左右）（图 1e），雌株717转基因株系只产生雌花（图 1f）。不论哪种花，均为单朵花，而非野生型的柔荑花序（图 1j）。从试管培养阶段初始花结构形成至温室培养阶段花器官的分化需要约5周左右的时间。花器官均产生于初始花结构顶端膨大部位。对于雄花，花药从花盘中展露约需1周时间；每个花朵会产生3～5枚散生雄蕊，均由1个花丝连接在花盘上，花丝长约0.5 mm，花药长约0.1～0.3 mm （图 1d）。花药外形跟野生型区别不大，但不能成熟发育，未发现散粉现象。两性花的雄蕊和雄花的大小相当，也未见散粉现象，雌蕊很大，子房可达2 mm，纺锤形，没有明显的花柱（图 1e）。雌花子房比两性花子房大，约3～4 mm（图 1f）。因为一起开放的雄花未能散粉，又未进行人工授粉，所以，两性花及雌花的胚囊育性未知。
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温室培养阶段的开花植株，在随后1 a的继续培养中未能再次开花，即使植株高度达 1 m 以上的植株，也未二次开花。是否因为植株没有经过休眠造成这种现象呢？我们将在温室生长1 a的 35S::FT 转基因植株移栽至露天栽培，发现经过一个冬天的低温休眠处理，第1次开花的转基因植株也未能再次开花。
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试验显示：FT 基因在诱导杨树早期开花方面，确实有明显促进作用。由于 35S启动子的过量表达，促使 FT 基因在 2月龄试管苗中提前表达而诱导其开花，这将杨树大田开花所需的 8～20 a时间缩短到短短的 2个月。然而，35S::FT 转基因植株所开的花全为异常的单朵花，而非野生型的柔荑花序。除了胚囊育性不可知之外，所有雄花均不能完全发育，不能产生花粉。而我们构建的热激启动子（HSP）驱动的FT 转基因杨树，尽管花器官变异依然较大，但产生了较多数量的正常柔荑花序（图 1h和图 1i），且有花粉产生[11, 13]。这说明，在以诱导正常花器为目的转基因研究中，35S 并不是合适的启动子，尽管该启动子驱动的FT转基因植株具有明显的早花性，但因其诱导的花发育不全没有育性而失去应用价值。
35S::FT 转基因植株在成花过程的早期，分生组织并不能完全失去营养生长特性，导致花与花之间有较长节间，且有叶片发育，形成异常的单朵花，单朵花不能成熟发育等。这些都暗示了FT 基因可能只决定了开花的时间，而不能决定花的正常发育。在后期，分生组织基本丧失了营养生长特性，形成外观更像花序的顶端簇生单朵花。这暗示了在后期，可能有别的影响花朵发育的基因发挥了作用，促使花的发育更加趋于正常，而这些开花基因的正常表达，与转基因植株的生长发育状态有关。这也说明了为什么转基因植株在试管培养阶段只能完成分生组织属性的改变，形成初始花结构，不能完成花器官的分化与发育，而在移栽至温室后会完成花器官的分化发育过程的原因。
植物从营养生长向生殖生长的转换是高等植物开花最重要的过程，开花诱导过程是开花基因在时间和空间上顺序表达的结果，机制十分复杂，有光周期、春化、自主促进和赤霉素（GA）等多种开花诱导途径的参与，涉及许多调控基因[18]。自然界中杨树必须经过8～20 a的营养生长阶段之后才能诱导开花，35S::FT 虽然可以瞬时过量表达促进转基因杨树在很早的试管培养阶段形成花结构，但似乎很难改变杨树在长期进化过程中形成的固有开花模式，正常花器的诱导依然离不开植株自身足够的营养生长，以及在特定发育阶段表达的其他开花基因的调控。这一点在我们对 HSP::FT 转基因杨树的研究中也有发现，热激材料的年龄越大，开花率越高，正常花器数目越多[13]。这也暗示了在开花基因转化研究中，特异性启动子较组成型启动子有优势，因为特异性启动子如 HSP 可以在植株经过足够的营养生长时间之后再诱导让其表达，促进开花，而组成型启动子如 35S，这一点似乎很难实现。
以往研究显示，35S启动子驱动的开花基因的表达很不稳定，在离体及温室栽培中促花性能不一，甚至同一开花基因转化不同种植物促花性能也不一样，开花植株重复开花率较低，而且会阻遏植物的正常生长发育等[10, 21]。我们的研究也发现这种不稳定现象，35S::FT转基因杨树开花率随着试管苗继代次数的增加而下降、温室培养及转至大田的开花植株也未能再次开花。甚至同样的实验材料，我们的结果与Hoenicka等[10]的研究结果也不一致，他们在35S::FT转化无性系T89的研究中发现，转基因植株在温室培养阶段不能继续完成花的发育。引起这种不稳定现象的原因需进一步用实验证明，Hoenicka等[10]认为可能是由于基因沉默或其他开花基因扰乱了35S::FT系统的开花诱导所致。也可能与影响35S启动子表达的植株发育阶段、光周期、温度等因素[22]有关。
总之，植物生长发育、开花结实是一个复杂的生化过程。该过程的正常实现，既与各种相互关联的遗传基因、环境因子、遗传与环境因子之间的严密调控有关，也与长期进化中形成的各种平衡关系有关，还与植物的生长发育状态有关[4-6, 9-10, 21-22]。开花基因转化中，转基因植株早期开花中存在的一系列异常现象，可能涉及上述任一因素，要揭示其真正原因，需要从分子手段入手，深入探明开花基因及其调控基因促进开花的机制以及影响花器官正常发育的基因及其调控机制。相信杨树和其他林木以及1年生植物的比较基因组学和基因组功能的基础研究，将会帮助找到解决问题的新途径。或许，其他开花基因（单基因途径）及启动子，以及多种开花基因的联合使用（基因叠加途径），是解决这一问题的有效途径。
FT gene with a CaMV35S promoter to control early flowering of transgenic poplar
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摘要: 为了研究CaMV35S启动子驱动的FT基因对转基因杨树Populus早期开花的影响,利用Gateway技术构建了35S::FT基因表达载体,并对杨树进行了遗传转化,从转基因杨树花的发育、花器官变异等方面初步探讨了35S::FT促进杨树早期开花性能。结果表明:35S::FT转基因杨树分生组织属性的改变及初始花结构的形成发生于试管培养阶段;花开始发育后如不及时把开花植株继代培养或转至土壤温室培养,初始花结构会凋谢枯萎,不能继续发育。转基因植株花器官的分化与发育发生于温室培养阶段的3~5周内,能够分化出典型的花器官,但发育不完全,具雌雄蕊、花盘结构,无成熟苞片结构,雄蕊不能成熟发育。35S::FT诱导的花均为单朵花,而非野生型的柔荑花序;多数花属于单性花,但转基因雄性无性系中会出现两性花。转基因植株的开花率随着试管苗继代次数的增加而急剧下降,但两性花比例会上升。Abstract: To study the effects on the early flowering capacity of the FLOWERING LOCUS T(FT) gene in transgenic poplar driven by a Cauliflower Mosaic Virus 35S (CaMV35S) promoter, provide basic data for effective application of FT gene on forest trees, an FT gene vector driven by a CaMV35S promoter was constructed using Gateway technology, and then genetic transformation of hybrid poplar was performed with this vector. The early flowering capability of transgenic poplar induced by 35S::FT was discussed both from flower development and floral organ variation viewpoints. Results showed that transformation of the meristem attributive and initial floral structure of 35S::FT transgenic poplar happened in the tube culture stage. If the flowering plants were not sub-cultured in vitro or timely transplanted into soil to culture in a greenhouse, the initial floral structure withered or ceased development. Within 3-5 weeks of greenhouse culture the initial floral structure continued to develop and finished floral organ differentiation and development. The floral organ was incomplete typically with pistil/stamen and flower disc structures but no mature bract structures; stamens also failed to mature. Flowers induced by 35S::FT were single flowers rather than catkins as with wild-types. Most flowers were unisexual, but bisexual flowers appeared on male transgenic plants. Flowering frequency of transgenic plants declined sharply with the increase of subculture time, but the proportion of bisexual flowers on male transgenic plants rose. 35S promoter is not suitable in genetic transformation for the purpose of getting normal floral organ.
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Key words:
- forest tree breeding /
- 35S promoter /
- FT gene /
- poplar /
- early flowering
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绿色植物通过光合作用固定二氧化碳(CO2)并转变成有机物质的过程被称为植物碳汇[1−2]，是降低大气中CO2浓度最主要的途径。但受到植物呼吸消耗、微生物分解和环境条件变化的影响，绝大部分被固定的碳都无法长期稳定存在[1]。植硅体(phytolith)是植物在生长过程中，通过根系吸收的无定型硅酸[Si(OH)4]经维管束输送后在植物细胞内腔或细胞间隙中形成的硅包碳化合物，几乎存在于所有植物体中，在竹亚科Bambusoideae植物中植硅体尤其丰富[3−4]。植硅体碳是在植硅体形成过程中被封存于植硅体内的有机碳[5]，随植物体死亡分解进入土壤后，可以稳定存在数千年甚至上万年之久[6−7]，成为陆地土壤长期碳封存的重要机制之一。这种长期的生物地球化学碳封存形式被认为在减少大气CO2，缓解温室效应方面具有很大的潜力[8]。
毛竹Phyllostachys edulis已被证明是一种植硅体碳汇能力很强的植物[6−8]，在中国广泛分布。在毛竹的经营管理过程中一直有施用氮肥的习惯，氮肥的施用直接促进毛竹的光合作用，进而提高单位面积毛竹笋材产量。研究表明：在毛竹的生长过程中除了氮素以外，对硅也有很强的富集能力[9−10]，而毛竹体内硅、植硅体及植硅体碳的质量分数具有极显著的相关关系[11]。氮施用后虽然增强了毛竹光合能力[12]，但对硅的吸收利用以及毛竹植硅体碳汇能力的影响还需进一步探索。
本研究以毛竹为研究对象，开展氮、硅二因素三水平栽培试验，采集毛竹不同器官，并测定不同器官硅、植硅体和植硅体碳质量分数，以明确不同器官对外源氮、硅添加的响应，揭示外源氮、硅添加对毛竹植硅体碳汇的影响机理，为提升中国竹林生态系统植硅体碳汇能力提供参考。
1. 试验设计与方法
1.1 试验设计
本研究设计为氮、硅二因素三水平盆栽试验。具体设计见表1。
表 1 试验设计及氮、硅用量Table 1 Experimental design and N, Si application rate处理 尿素/
(mg·kg−1)硅酸钠/
(mg·kg−1)处理 尿素/
(mg·kg−1)硅酸钠/
(mg·kg−1)处理 尿素/
(mg·kg−1)硅酸钠/
(mg·kg−1)N0Si0 0 0 N1Si0 250 0 N2Si0 500 0 N0Si1 0 75 N1Si1 250 75 N2Si1 500 75 N0Si2 0 150 N1Si2 250 150 N2Si2 500 150 说明：氮和硅用量按照生产上常规施肥量，即尿素750和225 kg·hm−2，有效土层深度30 cm，容重1.01 g·cm−3计算。 试验盆栽栽培于福州市晋安区新店镇福建省林业科学研究院苗圃(26°09′05″N，119°17′03″E，海拔为103.8 m)。试验栽培容器长、宽、高分别为30、20、30 cm，距容器底部2 cm侧面设直径为0.5 cm的小孔，保证排水通气。栽培用土壤来源于福州市闽侯县三叠井森林公园自然分布毛竹林。挖取土壤前清除地表植被和凋落物，挖取0~30 cm土层土壤，挑除石子、动植物残体后于干燥通风处晾干，过2 mm筛后备用。土壤容重为1.01 g·cm−3，土壤有机质为20.3 g·kg−1，土壤pH为5.51，土壤碱解氮、有效磷、速效钾、有效硅质量分数分别为245.00、2.93、116.60、54.10 mg·kg−1。
试验用毛竹苗来源于四川峨眉廷富育苗有限公司培育的毛竹1年生袋装实生幼苗，种源为广西桂林。栽培时竹苗呈丛状分生，4~5株·丛−1，蔸部具完整根鞭，苗高30 cm左右，生长健壮，无病虫害。栽培之前将每片竹叶剪去60%，以降低蒸腾速率，增加成活率。
每盆置风干土10.0 kg，浅栽生长均匀的幼苗4株，浇透水，至容器侧面小孔有水溢出，再取10.0 kg风干土均匀铺盖于湿土之上，保湿保水防结块，置于通风防雨透光玻璃温室中培养。栽培期间17:00浇水1次，浇水量为当地前10 a平均日降雨量。
1.2 样品采集
竹苗生长的过程中定时定量浇水，分别收集不同处理凋落物，及时烘干储存。毛竹苗生长2 a后，采用全株采集法采集每盆毛竹样品，清洗干净后分不同器官烘干储存备用。
1.3 样品分析
不同处理和不同器官毛竹样品在分析测定前进行粉碎(＜0.5 mm)。样品植硅体的提取采用微波消解法，之后用0.800 0 mol · L−1重铬酸钾溶液对植硅体进行检验，确保植硅体表面有机物质完全被去除，提取后的植硅体于65 ℃烘箱中烘干48 h，称量[13]。植硅体碳采用碱溶分光光度法测定[14]，在样品测定的同时加入植物标准样(GBW07602)对测定的准确性进行检验。每个样品重复3次。样品总硅采用偏硼酸锂熔融-比色法测定[15]，样品碳和氮采用碳氮元素分析仪测定。
1.4 数据处理与统计
使用SPSS 18.0进行数据统计分析，Duncan新复极差法测验不同处理的差异显著性，Origin 8.5作图。植硅体质量分数(g·kg−1)=植硅体质量(g)/样品干质量(kg)，植硅体碳质量分数(g·kg−1) =植硅体碳质量(g)/样品干质量(kg)。
2. 结果与分析
2.1 毛竹不同器官硅、植硅体、植硅体碳、碳和氮质量分数
由表2可知：在毛竹不同器官及凋落物中，硅、植硅体和植硅体碳质量分数从高到低依次均为凋落物、叶、枝、篼、秆，变化范围分别为2.2~78.4、1.9~151.9和0.78~3.93 g·kg−1。与硅、植硅体和植硅体碳不同，碳质量分数在毛竹不同器官及凋落物中从高到低依次为秆、叶、篼、枝、凋落物，变化范围为372.0~466.0 g·kg−1。不同器官及凋落物氮质量分数则表现为毛竹叶中最高，为18.8 g·kg−1，凋落物最低，为4.4 g·kg−1。差异显著性分析结果表明：凋落物中硅和植硅体质量分数均显著高于其他器官(P＜0.05)，且植硅体质量分数在枝、秆和篼之间均具有显著差异(P＜0.05)，而硅质量分数在枝、秆和篼之间不具有显著差异。与植硅体相似，植硅体碳在枝、秆和篼之间具有显著差异(P＜0.05)，但植硅体碳质量分数在凋落物和叶之间不具有显著差异。碳质量分数除了在叶和篼之间不具有显著差异外，在其他器官及凋落物之间均具有显著差异(P＜0.05)。氮质量分数在不同器官之间均具有显著差异(P＜0.05)，但在凋落物中没有表现出显著低于枝的现象。
表 2 毛竹不同器官和凋落物硅、植硅体、植硅体碳、碳和氮质量分数Table 2 Content of Si, phytolith, PhytOC, C and N in different organs and litterfall of Ph. edulis样品 硅/(g·kg−1) 植硅体/(g·kg−1) 植硅体碳/(g·kg−1) 碳/(g·kg−1) 氮/(g·kg−1) 叶 26.8±2.8 b 42.3±3.8 b 3.78±0.17 a 452±4 b 18.8±0.9 a 枝 6.7±0.3 c 22.1±1.0 c 2.84±0.19 b 439±1 c 5.8±0.3 d 秆 2.2±0.1 c 1.9±0.1 e 0.78±0.10 d 466±1 a 7.7±0.6 c 篼 5.2±0.4 c 11.7±0.8 d 1.55±0.13 c 448±2 b 11.8±0.3 b 凋落物 78.4±2.8 a 151.9±3.4 a 3.93±0.15 a 372±4 d 4.4±0.2 d 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同器官间差异显著 (P＜0.05)。 2.2 不同处理硅、植硅体、植硅体碳、碳和氮质量分数
由表3可知：毛竹叶、枝、秆、篼硅质量分数均表现为N0Si2处理最高，分别为42.2、8.4、2.9和6.6 g·kg−1，处理N2Si0最低，分别为18.4、5.6、1.8和3.5 g·kg−1。差异显著性分析结果表明： N0Si2和N0Si1处理叶硅质量分数显著高于除N0Si0处理以外的所有处理(P＜0.05)，而枝、秆和篼硅质量分数在不同处理之间均无显著差异。与叶、枝、秆、篼不同，凋落物硅质量分数表现为N2Si2处理最高，为91.8 g·kg−1，在N0Si0处理中最低，仅为60.9 g·kg−1。差异显著性分析结果表明： N2Si2处理中硅质量分数显著高于N0Si1和N0Si0处理(P＜0.05)，凋落物硅质量分数在其他处理间均不具有显著差异。
表 3 各处理毛竹不同器官和凋落物硅质量分数Table 3 Contents of Si in different organs and litterfall of Ph. edulis under different treatments处理 各处理毛竹不同部位硅质量分数/(g·kg−1) 叶 枝 秆 篼 凋落物 N0Si0 33.1±4.7 ab 6.1±3.0 a 2.3±1.0 a 3.7±0.7 a 60.9±5.3 c N0Si1 36.5±2.8 a 6.8±0.4 a 2.3±0.4 a 5.7±1.6 a 74.1±2.2 bc N0Si2 42.2±2.1 a 8.4±0.3 a 2.9±0.2 a 6.6±0.3 a 78.9±7.0 ab N1Si0 20.0±2.5 c 5.9±2.8 a 2.0±0.5 a 3.5±0.8 a 77.0±2.1 ab N1Si1 24.3±2.4 bc 6.2±0.5 a 2.1±0.5 a 5.4±0.2 a 77.2±2.9 ab N1Si2 24.4±1.2 bc 8.0±1.1 a 2.5±0.6 a 6.3±0.1 a 79.2±1.7 ab N2Si0 18.4±3.8 c 5.6±1.5 a 1.8±0.2 a 3.5±0.7 a 80.3±0.3 ab N2Si1 20.3±1.5 c 5.9±0.2 a 1.9±0.4 a 5.6±2.2 a 86.1±1.7 ab N2Si2 21.9±1.9 c 7.5±0.9 a 2.4±0.2 a 6.3±0.8 a 91.8±9.3 a 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 由表4可知：随着硅添加量的增加，大部分处理植硅体质量分数呈增加的趋势。具体来看，不同处理毛竹叶植硅体质量分数为30.3~59.5 g·kg−1，其中N0Si2处理叶植硅体质量分数最高，N2Si0处理最低。N2Si2处理枝植硅体质量分数最高，为26.6 g·kg−1， N1Si0处理最低，仅为18.6 g·kg−1。不同处理秆和篼植硅体质量分数变化规律较为一致，均表现为N2Si2处理最高，分别为2.2和14.9 g·kg−1， N0Si0处理最低，分别为1.6和9.1 g·kg−1。N0Si2处理凋落物植硅体质量分数最高，为169.5 g·kg−1，比N1Si0处理高24.3%。差异显著性分析结果表明：仅叶中植硅体质量分数在N0Si0、N0Si1、N0Si2处理与其他处理间具有显著差异(P＜0.05)。
表 4 各处理毛竹不同器官和凋落物植硅体质量分数Table 4 Contents of phytolith in different organs and litterfall of Ph. edulis under different treatments处理 各处理毛竹不同部位植硅体质量分数/(g·kg−1) 叶 枝 秆 篼 凋落物 N0Si0 51.8±7.8 a 19.8±3.3 a 1.6±0.1 a 9.1±2.8 a 156.6±23.0 a N0Si1 59.2±2.3 a 20.6±4.0 a 1.9±0.4 a 9.5±0.2 a 160.8±10.4 a N0Si2 59.5±2.8 a 24.2±4.3 a 2.0±0.2 a 14.0±4.7 a 169.5±3.8 a N1Si0 35.4±1.2 b 18.6±2.4 a 1.8±0.1 a 10.1±2.8 a 136.4±19.5 a N1Si1 35.7±0.9 b 20.8±2.2 a 1.9±0.5 a 12.3±0.8 a 154.6±9.9 a N1Si2 37.8±0.9 b 26.2±3.3 a 2.1±0.5 a 14.7±0.2 a 155.3±6.4 a N2Si0 30.3±0.2 b 20.7±2.5 a 1.9±0.1 a 10.1±2.2 a 144.3±15.6 a N2Si1 34.4±3.0 b 21.1±1.9 a 2.0±0.3 a 11.0±1.7 a 144.7±0.7 a N2Si2 36.3±1.9 b 26.6±5.1 a 2.2±0.2 a 14.9±1.7 a 144.7±28.7 a 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 由表5可知：毛竹不同器官植硅体碳质量分数在不同处理之间差异较小。总体来看，随着硅添加量的增加，不同器官及凋落物植硅体碳质量分数均具有上升趋势。不同处理叶、枝、秆、篼及凋落物植硅体碳质量分数分别为3.15~4.68、2.10~3.47、0.30~1.18、1.09~2.15和3.21~4.63 g·kg−1，均表现为N2Si2处理最高， N0Si0处理最低，表明氮和硅的添加能够促进植硅体碳质量分数增加。差异显著性分析结果表明：仅秆植硅体碳质量分数在N0Si1和N0Si0与N2Si2处理间具有显著差异(P＜0.05)。
表 5 各处理毛竹不同器官和凋落物植硅体碳质量分数Table 5 Contents of PhytOC in different organs and litterfall of Ph. edulis under different treatments处理 各处理毛竹不同部位植硅体碳质量分数/(g·kg−1) 叶 枝 秆 篼 凋落物 N0Si0 3.15±0.24 a 2.10±0.56 a 0.30±0.04 c 1.09±0.22 a 3.21±0.81 a N0Si1 3.20±1.05 a 2.25±0.66 a 0.39±0.10 bc 1.11±0.07 a 3.83±0.92 a N0Si2 3.82±0.55 a 3.12±0.63 a 0.61±0.40 abc 1.54±0.50 a 4.14±2.25 a N1Si0 3.59±0.67 a 2.28±0.59 a 0.70±0.33 abc 1.13±0.47 a 3.52±0.67 a N1Si1 4.01±0.12 a 3.10±0.54 a 0.91±0.13 abc 1.77±0.51 a 3.73±1.05 a N1Si2 4.31±0.98 a 3.38±0.46 a 1.06±0.14 ab 1.79±0.32 a 4.46±0.20 a N2Si0 3.63±1.17 a 2.45±1.28 a 0.86±0.19 abc 1.58±0.18 a 3.81±0.51 a N2Si1 4.05±0.20 a 3.39±0.28 a 1.00±0.27 abc 1.84±0.62 a 4.01±0.17 a N2Si2 4.68±0.41 a 3.47±0.98 a 1.18±0.05 a 2.15±0.33 a 4.63±1.60 a 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 由表6可知：与植硅体碳质量分数相似，毛竹不同器官碳质量分数在不同处理间差异均较小并具有随着氮添加量增加不断增加，随着硅添加量的增加不断降低的趋势。不同处理叶、枝、秆、篼碳质量分数分别为436~478、436~441、462~471和441~456 g·kg−1，可知叶碳质量分数在不同处理之间差异最大。不同处理凋落物碳质量分数随氮和硅添加量的增加均不断增加，为348~387 g·kg−1。差异显著性分析结果表明： N2Si1处理叶碳质量分数显著高于其他处理，N0Si2处理枝碳质量分数显著低于N1Si0处理， N1Si0处理和N2Si0处理秆碳质量分数显著高于除N2Si1处理以外的其他处理， N2Si2处理凋落物碳质量分数显著高于N0Si0处理(P＜0.05)。
表 6 各处理毛竹不同器官和凋落物碳质量分数Table 6 Contents of C in different organs and litterfall of Ph. edulis under different treatments处理 各处理毛竹不同部位碳质量分数/(g·kg−1) 叶 枝 秆 篼 凋落物 N0Si0 440±2 b 440±3 ab 463±2 b 443±5 b 348±17 b N0Si1 439±2 b 437±3 ab 463±2 b 442±3 b 372±6 ab N0Si2 436±3 b 435±2 b 462±2 b 441±4 b 376±5 ab N1Si0 453±2 b 442±2 a 471±0 a 452±3 ab 365±11 ab N1Si1 453±2 b 439±1 ab 466±2 b 450±5 ab 368±14 ab N1Si2 453±3 b 438±3 ab 465±1 b 449±4 ab 369±3 ab N2Si0 454±4 b 441±1 ab 471±2 a 456±1 a 381±16 ab N2Si1 478±21 a 441±1 ab 467±0 ab 451±4 ab 384±2 ab N2Si2 459±4 ab 439±2 ab 465±1 b 449±2 ab 387±11 a 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 由表7可知：毛竹不同器官氮质量分数在不同处理之间差异均较大，叶、枝、秆、篼和凋落物氮质量分数最低的处理分别为N0Si1、N0Si2、N0Si1、N0Si0和N0Si1处理，其氮质量分数分别为14.5、4.3、5.0、10.0和3.4 g·kg−1；最高的处理分别为N2Si1、N2Si0、N1Si2、N2Si0和N2Si0处理，比最低值分别增加54.5%、79.1%、90.0%、29.0%和50.0%。差异显著性分析结果表明：叶、枝、秆、篼和凋落物氮质量分数在不同处理间变化规律均不明显，氮质量分数在部分处理间存在显著差异(P＜0.05)。
表 7 各处理毛竹不同器官和凋落物氮质量分数Table 7 Contents of N in different organs and litterfall of Ph. edulis under different treatments处理 各处理毛竹不同部位氮质量分数/(g·kg−1) 叶 枝 秆 篼 凋落物 N0Si0 16.9±0.8 cde 5.4±0.9 bcd 6.5±1.0 abc 10.0±0.2 b 3.4±0.1 c N0Si1 14.5±0.9 e 4.6±0.1 cd 5.0±0.3 c 10.7±0.3 b 3.6±0.1 bc N0Si2 15.7±0.9 de 4.3±0.1 d 5.6±0.2 bc 10.8±0.1 b 3.4±0.1 c N1Si0 19.1±1.0 bc 6.3±0.6 abc 8.7±1.6 ab 12.3±0.2 ab 4.4±0.2 ab N1Si1 20.8±0.8 ab 6.1±0.2 abcd 8.6±0.6 abc 12.4±0.8 ab 4.8±0.3 a N1Si2 18.4±1.0 bcd 5.4±0.3 bcd 9.5±0.1 a 12.1±0.3 ab 4.8±0.3 a N2Si0 20.9±1.1 ab 7.7±0.7 a 9.3±2.2 a 12.9±1.1 a 5.1±0.4 a N2Si1 22.4±0.4 a 6.7±1.0 ab 7.7±0.8 abc 12.3±0.4 ab 5.1±0.6 a N2Si2 20.2±0.6 ab 5.8±0.5 abcd 8.4±1.3 abc 12.6±0.2 a 4.7±0.1 a 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 2.3 毛竹硅、植硅体、植硅体碳、碳和氮质量分数之间的相关关系
相关性分析结果(表8)表明：毛竹硅与植硅体、植硅体与植硅体碳以及硅与植硅体碳质量分数之间均存在极显著正相关关系(P＜0.01)，硅与氮质量分数之间存在极显著二次相关关系(P＜0.01)，植硅体碳与碳质量分数之间存在极显著负相关关系(P＜0.01)。
表 8 毛竹硅、植硅体、植硅体碳、碳和氮质量分数之间的相关关系Table 8 Correlation between Si and phytolith, phytolith and PhytOC, Si and PhytOC, Si and N, C and PhytOC contents of Ph. edulisx y 拟合方程 决定系数(R2) 显著性水平 植硅体 硅 y = 0.088 + 0.517x 0.958 4 P＜0.001 植硅体 植硅体碳 y = 1.839 + 0.016x 0.463 2 P＜0.001 硅 植硅体碳 y = 1.837 + 0.031x 0.481 8 P＜0.001 硅 氮 y = 7.004 + 0.507x−0.007x2 0.493 3 P＜0.001 碳 植硅体碳 y = 472.8−14.5x 0.318 3 P＜0.001 2.4 植硅体、植硅体碳与碳质量分数的氮-硅交互作用
交互作用分析结果表明：对于毛竹植硅体、植硅体碳与碳质量分数来说，氮与硅之间均不存在交互作用的显著性(表9)。
表 9 植硅体、植硅体碳与碳质量分数的氮-硅交互作用Table 9 Interaction between N and Si for phytolith, PhytOC, and C contents指标 自由度 均方 F 显著性水平 $ {\eta }_{p}^{2} $ 植硅体 4 15.858 0.005 1.000 0.000 植硅体碳 4 0.069 0.030 0.998 0.001 碳 4 0.555 0.044 0.996 0.001 说明：$ {\eta }_{p}^{2} $表示植硅体和植硅体碳分别对组间变异的贡献率。 2.5 毛竹不同器官植硅体碳占总碳比
由图1可知：毛竹叶、枝、秆、篼和凋落物中植硅体碳占总碳的比例分别为5.7%~8.6%、4.8%~7.9%、0.7%~2.5%、2.5%~4.8%和9.2%~12.1%。与不同器官相比，凋落物中植硅体碳占总碳的比例平均最高，为10.5%。不同处理凋落物之间，N1Si2处理植硅体碳占总碳的比例最高，N0Si0处理最低。不同器官之间，不同处理植硅体碳占总碳的比例从高到低依次为叶、枝、篼、秆，平均分别为6.9%、6.5%、3.5%和1.7%。同一器官不同处理之间，在同一氮添加水平下随着硅添加量的增加，植硅体碳占总碳的比例不断升高。
3. 讨论
3.1 毛竹植硅体、植硅体碳的形成与硅密切相关
硅是地壳中第二大元素，其蕴藏量仅次于氧，在地球化学碳循环中起着重要的作用[16]。研究表明：植物对硅的吸收利用分为对单硅酸的跨膜吸收和沿维管束的运输2个过程，其中植物对硅的吸收能力取决于土壤溶液中单硅酸的浓度和植物根系硅转运蛋白的表达量[17]。动力学研究表明：外部单硅酸浓度的升高能够有效促进其以被动扩散或主动运输的形式被跨膜吸收[18−19]。土壤中的有效硅到达植物根部后才能开始随蒸腾流沿着维管束运输的第2个过程，并且具有边运输边形成聚合硅酸的能力[20]，最终在植物组织的蒸腾末端沉积，形成稳定的无定型二氧化硅颗粒，表明植物对硅的吸收利用最终依赖于特异性硅转运蛋白和蒸腾作用。
植硅体在植物抗寒、抗逆等方面[4, 21]具有重要的作用。硅被植物吸收后主要以植硅体的形式存在于植物体内，因此植物体内植硅体质量分数取决于植物吸收利用硅的能力。本研究中毛竹不同器官之间硅与植硅体质量分数差异较大，但表现出相同的变化规律和极显著相关关系，表明毛竹不同器官对硅利用的能力不同，也表明了硅与植硅体之间存在的密切联系。这与ZUO等[22]对黍Panicum miliaceum、粟Setaria italica的研究，LI等[23]对湿地芦苇Phragmites australis的研究，PARR等[24]对竹林的研究及SONG等[25]对中国草原植被的研究结果相同，证明了植物体中植硅体质量分数明显受植物对硅富集能力的影响。
植硅体碳形成于植硅体积淀的过程中。LI等[26]在对白洋淀芦苇的研究中指出：植硅体碳质量分数与植物吸收利用CO2速率有直接的关系。SONG等[13]在中国不同森林类型植硅体碳封存估测的研究中提出：植硅体碳质量分数与硅质量分数之间存在密切的联系，并且以硅质量分数的3%作为计算植硅体碳的标准。本研究设计硅外源添加以增加毛竹对硅的吸收利用，同时设计氮外源添加提高毛竹光合作用效率及吸收利用CO2的能力，并对不同处理硅、植硅体和植硅体碳质量分数进行分析，发现硅、植硅体和植硅体碳在毛竹不同器官之间的变化规律呈现高度的一致性，并且随着外源氮和硅添加量的变化，毛竹不同器官植硅体与植硅体碳仍然表现出相似的变化规律；除此之外，植硅体与植硅体碳之间及硅与植硅体碳质量分数之间均存在极显著的正相关关系。这一结果与已有竹类植物植硅体碳相关研究结果一致[8, 13, 27]，反映了竹林生态系统中硅与植硅体碳之间的内在联系，表明外源硅的添加是毛竹不同器官植硅体碳质量分数增加的主要原因，证明了硅的添加能够促进毛竹植硅体碳汇能力提升。
3.2 毛竹不同器官对外源氮添加的响应差异明显
氮是植物生长最重要的营养元素之一，对于植物光合效率的提高及养分的吸收、利用、积累具有直接的影响[12]。植物对氮的吸收过程复杂且多样，主要包括主动性和被动性吸收2个途径，与光照、温度、pH等环境因素密切相关，与硅的吸收利用相关性较小。本研究中氮-硅交互作用分析结果表明：氮与硅之间均不存在交互作用的显著性，也进一步说明毛竹对氮和硅的吸收是2个相互独立的过程。毛竹叶中碳、氮和植硅体碳质量分数均随着外源氮添加量的增加不断提高，但硅与植硅体质量分数却不断下降 ，主要是由于外源氮的添加极大地促进了叶的生长，导致净生物量在短期内快速积累，而植物对硅的吸收动力主要来源于蒸腾作用[12]，在短期内并不会出现大幅变化，因此造成了净生物量积累与植硅体积累不协调的现象，也说明了虽然本研究中硅的添加促进了毛竹对硅的吸收，但氮的添加增加了有机物质的积累，对植硅体形成了稀释效应，因此表现为低氮添加处理植硅体质量分数更高的现象。
随着叶片的老化，大部分氮被转移再利用[28]，凋落物氮和碳质量分数均大幅降低，但硅、植硅体和植硅体碳质量分数却并未随之下降，且随着外源氮添加量的增加，凋落物中硅和植硅体碳质量分数有所增加，植硅体质量分数却有所降低，表明尽管外源氮的添加促进了硅的吸收和有机物质的积累，但被吸收的硅并没有形成稳定的植硅体，对植硅体碳的贡献有限，也说明尽管毛竹对氮和硅的吸收利用交互作用不显著，但硅的吸收仍然与氮的添加有关。
进一步对不同处理不同器官及凋落物中植硅体碳占总碳比进行分析，可以更清晰地表明：单纯的氮添加能够促进有机物质的快速积累，但对于提高植硅体碳在总碳中的比例作用有限，而硅的添加对提高植硅体碳在总碳中的比例作用更为明显，这一点也被外源氮添加后碳和植硅体碳呈极显著负相关所证明。
3.3 氮和硅添加对植硅体稳定性的影响
植硅体的稳定性主要决定于其形态、颗粒大小、组分和结构[29−32]。有研究表明：外源硅的添加增加了土壤溶液中单硅酸的浓度，外源氮和硅的添加共同促进了毛竹对硅的吸收，进而增加植硅体在植物体内的积累[33−35]，但是这种靠人为因素增加的植硅体已被证明主要是轻组植硅体[31]，其稳定性、抗腐蚀能力等均远小于重组植硅体[34, 36]，且氮的添加促进了毛竹对氮的吸收利用，改变了植硅体组成成分[31]，因此尽管高氮处理促进了毛竹凋落物硅质量分数的增加，但植硅体质量分数仍较低。表明虽然氮的添加对毛竹吸收硅的影响不显著，但对毛竹吸收硅后形成的植硅体的稳定性有显著影响。
4. 结论
毛竹叶中氮质量分数最高，秆中碳质量分数最高，凋落物中硅、植硅体和植硅体碳质量分数均最高。外源氮添加有助于毛竹对硅的吸收和有机物质的积累，外源硅添加有助于毛竹植硅体和植硅体碳质量分数的增加以及植硅体碳占碳比例的提高。
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图 1 35S::FT转基因杨树早期花发育及花器官变异
Figure 1 Flower development and variation of 35S::FT transgenic poplars
表 1 继代次数对转基因无性系开花率、两性花比率的影响
Table 1. Effects subculture on flowering frequency and bisexual
继代次数 T89(♂)开花率/% 717(♀)开花率/% T89(♂)两性花
比例0 37.8 10.3 11+8 1 16.0 3+0 12+4 2 9+2 0 - 3 3+6 0 - 4 0+8 0 39+7 5 0 0 - 说明:表中数据为11个开花株系的平均值, 每个株系约30~35个个体。"-" 表示未观察。 
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