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中国南方岩溶高原地区由于岩石孔隙裂隙发育，加上土层浅薄且不连续，地表持水能力差，漏失严重，加上降水时空分布不均，使得水分成为喀斯特地区植物生长的主要限制因子。喀斯特生境对植物种类具有较强的选择性，一般是易于生长，根系发达，能在岩溶环境中求得水分和养分的补充的植物，但植物水分具体来源一直是一个困扰的问题。针对植物根系吸收水分过程和水分在植物根部与茎干之间运输时，在水分到达如叶片或幼嫩未栓化的枝条之前不发生同位素分馏[1]，因此，通过植物根系和茎干木质部水的同位素组成可得出植株所利用水的同位素组成状况[2]。对于喀斯特地区植物，传统方法很难确定植物具体吸收哪层土壤水分，并且根系的分布并不意味着水分或养分的吸收。喀斯特地区特殊的生境，植物根系分布与其他常态地貌下的根系模型有很大差异[3]，再加上根系模型建立需耗费巨大人力物力，直接测定地下生态过程也十分困难，使得相关的根系分布数据极少[4]。运用稳定同位素技术，通过对比植物木质部水与各种水源的氘（D）和18O组成，可得出植物利用的水分如降水、土壤水、地下水或表层岩溶带水，并且可以确定植物对不同水源利用的程度[5-6]。在中国，环境同位素技术在喀斯特地貌区得到广泛应用[7-10]，但主要集中在多属于峰丛洼地的广西[11]和贵州[12]，而对以溶丘洼地为主[13]的云南喀斯特高原区研究较为薄弱。研究区属滇中高原岩溶地貌，位于石林地质公园，公园内部经过多年的退耕还林和保护等措施，植被出现了草丛、灌草地、灌丛、人工林、次生林、原生林等不同演替阶段的群落，不同树种、树龄在不同演替阶段水分利用来源存在较大差异[11-12]。其中原生林具备自然演化和自我更新的能力，是对某一地貌和气候的适应，在涵养水源、保持水土、调节气候和维持生态平衡等方面起着重要作用。因此本研究选取了滇中石林国家地质公园中保护较好的滇青冈原生林作为研究对象，通过分析滇青冈原生林中几种典型植被的木质部水及其各种潜在水源中的氧稳定同位素，得出植物水分利用来源季节变化，并结合IsoSource模型[13-14]分析潜在水源利用比例，初步阐明原生林植物水分利用机制及对岩溶干旱生境的适应策略，探讨如何在有限水资源下对喀斯特区植被进行有效恢复，为深入研究岩溶区脆弱生态环境植被保护和植被恢复提供实例，也为该区水源涵养林的选择提供参考。
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研究区滇中石林地质公园位于巴江流域中部，是中国西南岩溶高原区典型的溶丘洼地喀斯特地貌区，是喀斯特岩溶地貌的典型代表，位于云南省昆明市石林彝族自治县境内（24°30′～25°03′ N, 103°10′～104°40′ E）。海拔为1 780～1 950 m，属低纬高原北亚热带季风气候区，多年平均降水量约960 mm，有明显的旱雨季之分（每年5-10月为雨季，降水量约占全年的85.3%，11月至次年4月为旱季），多年平均气温为15.6 ℃。研究区坡向为正东方向，发育地层主要是下二叠统碳酸盐岩，发育土层浅薄且不连续，土体厚度为90～140 cm，岩石出露约30%～40%，其土石比为55%:45%，主要为山原红壤和红色石灰土。植被多生长于石缝、石沟、小土坑、微台地上，森林及灌丛植被多分布于坡面上，坡脚具很多泉点。在喀斯特的岩石层面裂隙发育，形成了与地表关系密切的地表岩溶带。在巴江流域岩溶包气带上部浅表层（＜50 m）发育表层岩溶带，形成了稳定含水层，该层称为喀斯特表层岩溶带水，是石林地区重要的生产和生活水源。
石林地质公园处于中国—日本与中国—喜马拉雅植物区系的过渡带位置，其中研究样地密枝山有原始性强的落叶常阔混交林，主要从原生裸地演替而来，地带性植被以滇青冈林为代表[15]，曾经广泛分布在滇中地区的土山和石灰岩山地[16]，具有较强的适应性，是森林恢复到一定程度才出现的物种。滇青冈原生林中滇青冈Cyclobalanopsis glaucoides约占1/4，样地群落类型为滇青冈林，属滇中石灰岩山地的半湿润常绿阔叶林中偏干的地带性植被，可分为乔木、灌木、草本层，其中乔木层覆盖度约70%，主要以滇青冈，黄毛青冈Cyclobalanopsis delavayi，清香木Pistacia weinmannifolia，云南木樨榄Olea yuennanensis，黄连木Pistacia chinensis等为主，约15～20 m高，灌木层覆盖度约60%，主要以小铁子Myrsine africana，针齿铁子Myrsine semiserrata等为主，郁闭的林冠层，对研究区水源涵养、生态恢复有着重大作用。
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物种采集：在石林公园内的滇青冈原生林样地进行了系统监测，选择具有代表性的无人干扰或干扰较小的样点，选取滇青冈、清香木和云南木樨榄等3种广泛分布的植物。为了便于比较，相同植物均选择胸径差异较大的成熟和幼龄植株各1株。取样时间为旱季（2010年4月13日）和雨季（2010年7月14日），在天气状况比较稳定的上午（7:00-9:00）采集阳面栓化没叶片的小枝，长约10 cm，去除韧皮保留木质部，迅速去皮后装入采样瓶并用parafilm封口膜密封，然后放入随身携带的冰盒（约4 ℃），带回实验室冷冻保存。土样采集：在所选植物冠幅内的树根附近打土钻取样，从地表 0～20 cm（浅层）、20～55 cm（中层）、55～115 cm（深层）分级取土样约30 g，混合完全后立即放入样品袋中密封以防蒸发，样品立即冷冻保存，供土壤水采集。水样采集：在采样点附近设置3个固定点收集大气降水，收集附近喀斯特表层泉以代表层岩溶水及该区浅层地下水，雨水样和泉水样取后立即封装于10 mL干净聚乙烯瓶中，并放入少量矿物油，冷藏（4 ℃）备用。
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植物茎和土壤水的提取用低温真空蒸馏法，抽提出的水分密封于玻璃瓶中低温（2 ℃）保存。水样的D和18O在中国地质科学院桂林岩溶地质研究所岩溶地质与资源环境监督检测中心由Finnigan MAT-253质谱仪测定，实验结果采用标准平均大洋水（SMOW）标准校正，实验误差低于0.5‰。
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将植物木质部水和各潜在水源的同位素值带入IsoSource模型，计算不同潜在水源对植物的贡献比例，计算时来源增量设为1.0%，不确定性水平设为0.1%～0.5%。
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由于采样时段来自孟加拉湾和南海水汽通道的水汽输送明显弱于常年，研究区发生极端气象干旱，降水量较常年偏少53.3%，δD和δ18O值相对较高，当地降水线（LMWL：δD=8.22 δ18O+12.00）的斜率和截距略大于全球大气降水线（GMWL：δD=8δ18O+10.00）的斜率和截距。说明当时巴江流域受极端干旱影响，季风降水不足，地表水蒸发强烈，使得巴江流域局地水汽再循环强烈，重同位素富集。表层岩溶水δ18O旱雨季变化较小，雨季平均值为-6.34‰，旱季为-6.48‰，表明其具有稳定性和可靠性。在图 1中，土壤水δ18O在旱季随土层变浅而偏正，55~115 cm变化幅度较大；雨季，在20~55 cm，土壤水δ18O随土层变浅而偏正，说明55 cm土层以上的浅表层土壤的蒸发作用极为显著，而55 cm以下土壤水δ18O随深度增加而偏正，可能是受到表层岩溶水的影响。此外，土壤剖面水分的显著差异与土壤质地、植物根系在土壤剖面的分布及植物水分利用等有关[2]。
图 1 旱雨季滇青冈原生林植物木质部水与土壤水中的δ18O变化(A.旱季，B.雨季）
Figure 1. Comparison of δ18O of stem water, soil water and groundwater of Cyclobalanopsis glaucoides primeval forest during rainy seasons (A. dry season, B. rainy season)
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滇青冈原生林植物木质部水与不同深度土壤水及表层岩溶带水的δ18O对比表明，植物对土壤水和表层岩溶水均有利用，但植物根系在土壤中的分布范围因树种、树龄的不同而有差异，因而吸收的水源有显著差异。
旱季不同植物水分来源存在较大差异，水分竞争格局明显。清香木（45 cm，该值为胸径）和云南木樨榄（4.3 cm）木质部水的δ18O为-8.33‰和-8.23‰，与中层土壤水的同位素值接近，表明两者水分利用主要来源于中层土壤水。滇青冈（27.5 cm）和滇青冈（7.4 cm）的δ18O偏负，值分别为-9.64‰和-8.85‰，该种植被与深层土壤水δ18O接近，说明主要利用深层土壤水（图 1A）。
旱季不同年龄阶段植物水分来源存在较大差异。幼龄云南木樨榄（4.3 cm）的δ18O与中层土壤水接近，成熟云南木樨榄（44.3 cm）的δ18O与深层深沉土壤水接近；幼龄清香木（5.9 cm）的δ18O与深层土壤水接近，成熟清香木（45.0 cm）与中层土壤水接近；幼龄滇青冈（7.4 cm）与成熟滇青冈（27.5 cm）的δ18O存在较大差异，但所吸收水分主要来源于深层土壤水。
雨季不同植物水分来源存在较大差异（图 1B）。滇青冈（27.5 cm）和清香木（45.0 cm）木质部水的δ18O偏负，同位素值分别为-11.28‰，-9.67‰，与55 cm深度土壤水的δ18O接近。成熟云南木樨榄（44.3 cm）和幼龄云南木樨榄（4.3 cm）的木质部水的δ18O值分别为-8.39‰和-8.03‰，与20～115 cm中深层土壤水接近。雨季不同年龄阶段植物水分来源存在较大差异（图 1B）。幼龄云南木樨榄（4.3 cm）和成熟云南木樨榄（44.3 cm），幼龄清香木（5.9 cm）和成熟清香木（45.0 cm）的δ18O相差都不大，与20～55 cm，55～115 cm土壤水都有接近的点；幼龄滇青冈（7.4 cm）δ18O与中层、深层土壤水都有接近的点，成熟滇青冈（27.5 cm）δ18O与55 cm土壤水接近。
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通过IsoSource模型计算（图 2），得出植物对土壤水利用比例最大，尤其是20～115 cm土壤水对植物贡献比例最大。在降水量较少的旱季，其中滇青冈（27.5 cm），滇青冈（7.4 cm），云南木樨榄（44.3 cm）和清香木（5.9 cm）主要利用深层土壤水，利用比例为66.4%，35.6%，35.4%和37.9%；云南木樨榄（4.3 cm）和清香木（45 cm）在中层土壤水利用比例最高，分别为32.7%和32.8%。在植物生长旺盛的雨季，中层土壤水对植被贡献率最高，其中滇青冈（27.5 cm），云南木樨榄（44.3 cm），清香木（45.0 cm）和清香木（5.9 cm）主要利用中层土壤水，利用比例分别为100%，33.3%，66.0%和37.4%；滇青冈（7.4 cm）和云南木樨榄（4.3 cm）在深层土壤水利用比例最高，分别为32.9%和31.1%。
图 2 旱雨季滇青冈原生林中的代表植物对土壤水及表层岩溶带水提升及利用的比例！A.旱季，B.雨季）
Figure 2. Calculated water uptake from three soil layers and the subcutaneous flow for Cyclobalanopsis glaucoides virgin forest plots (A. dry season, B. rainy season)
表层岩溶水是岩溶区植物水分利用主要水源之一，具有一定的稳定性。雨季，幼龄植株对表层岩溶水的利用比例明显大于成熟植株，如滇青冈（7.4 cm）20.9%与滇青冈（27.5 cm）0%，云南木樨榄（4.3 cm）19.6%和云南木樨榄（44.3 cm）17.2%，清香木（5.9 cm）16.2%和清香木（45.0 cm）8.8%，旱季的滇青冈和云南木樨榄也存在此现象。从雨季过度到旱季，大部分成熟植株对表层岩溶水的利用增加[如滇青冈（27.5 cm，清香木（45.0 cm）]，而幼龄植株却相对减少[滇青冈（7.4 cm），清香木（5.9 cm）]。
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在自然生态系统中，由于植物根系的类型或分布深度的不同，导致不同树种或不同树龄的植物水分来源在季节上存在差异。雨季，土壤水和表层岩溶带水是滇青冈、云南木樨榄和清香木等不同植物的主要水源，但利用比例存在较大差异，主要集中在中层土壤水，对降水补给的浅表层土壤水的利用反而相比旱季减少。可能是因为该区特殊的地表，降落到地表层雨水迅速漏失到中层土壤中，中层土壤持水率较表层高，能大量被植物所吸收。相比贵州的喀斯特专属植物荔波瘤果茶Camelia rubimuricata[17]，因其生长在深厚的土面上，而雨季降水使得浅层土壤水分充足，植株可以吸收到足够的表层土壤水，因此其主要利用浅层土壤水。原因是雨季降水量相对充沛，补给地表以下各含水层，而植物主要利用储存于浅层裂隙中的雨水，主要是植物通过表层根系吸收水分时消耗能量相对较少，因此当表层土壤或浅层裂隙中有水可用时，植物优先利用储存在这里的水分[18]。
为适应环境因子的变化，植物根系及其分布特征会相应地改变，土壤水分决定活性根系的分布[19]。雨季降水相对丰沛，研究区中层土壤水分充足，成熟的滇青冈、云南木樨榄、清香木主要发展侧根来满足对水分的供求。McCole等[7]在美国爱德华兹高原喀斯特地区发现，常绿灌木杉木Juniperus ashei在冷湿冬季主要水分来源以10～30 cm土壤水为主。但在干旱地区，随雨季到来，某些物种从以吸收深层土壤水或地下水为主转变为以吸收降雨补给的浅层土壤水为主[20]。幼龄滇青冈和云南木樨榄吸收深层土壤水和表层带岩溶水明显大于成熟植株。根据水分利用策略，植株在幼龄时期先发展深根系，穿梭于深层土壤和表层岩溶带中，以保障有充足稳定的水分可供吸收。主要是喀斯特区浅层裂隙虽能储存一定量的雨水，但由于储水有限，及不同植物对浅层裂隙水的利用竞争激烈，因此一些植物为获取稳定的水源而用深层水分，土层浅薄的喀斯特地区表现尤为明显。Rose等[21]发现生长在内华达山脉南部浅薄土层（土层下为深厚的花岗岩风化基岩层）上的黑材松Pinus jeffreyi在幼龄时期主要利用土壤水，而在生长季后成熟期主要利用风化基岩层水分。
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根系分布对植物功能的维持起着关键作用，尤其是喀斯特区在没有灌溉的条件下植物仍能支持度过严峻的干旱时期，说明喀斯特植物可能通过根系伸展获取稳定的水分来源。旱季降水偏少，表层土壤蒸发强烈，水分散失，浅中层土壤水分也随之减少，植被为了度过干旱季节，由利用雨季的中层土壤水转而利用深层土壤水。云贵高原向广西丘陵盆地的过渡地带的茂兰喀斯特区，在少雨时期，土壤下层水对原生林的贡献率达1/3[3]。滇青冈（27.5 cm），滇青冈（7.4 cm），云南木樨榄（44.3 cm）和清香木（5.9 cm）所吸收的水分主要来源于深层土壤水，该层次水源受外界干扰小，并有地下水补给，较为稳定，为植物度过干旱时期起着关键作用。无论是幼龄还是成熟的滇青冈，在干旱季节都偏向于对深层土壤水利用，主要是它有强壮的根系，攀附岩石、穿窜裂隙，在裂隙土壤水、岩溶水中求得水分的补充。植物根系这种寻找并扎入裂隙的行为，可被认为是根系的向水性或向地性或两者共同作用的结果[22]。贵州的荔波瘤果茶在旱季利用深层土壤水存在相似特征[17]。幼龄云南木樨榄对浅层、中层土壤水和表层岩溶水都维持着较大的吸收，但仍主要偏向于中层和浅表层土壤水的利用，侧根发达有关。幼龄清香木主要利用深层土壤水，但成熟清香木主要利用中层和表层土壤水。其原因可能是植物的深层根将其所在深层土壤中吸收的水分传输到浅层土壤中，供浅根使用，出现植物水分再分配[23]，可能与植物的双层根系分布有关。
相对于表层岩溶带水，植物水分利用存在较大差异。表层岩溶带水位于渗流带上部，由于降水的补给作用，既有一般地下水的所有性质，又带有雨水的同位素特性，即存在明显的季节差异和雨量效应[12]。成熟植株滇青冈（27.5 cm）和清香木（45.0 cm）在旱季对表层岩溶带水的利用相对雨季有较大的提高，而幼龄植株滇青冈（7.4 cm）和清香木（5.9 cm）利用比例却降低。主要是旱季降水量减少，对土壤水补给减少，成熟植株根系发达，为度过干旱时期增加对表层岩溶带水的吸收，而幼龄植株因表层岩溶带水补给减少而水面降低，所能吸收的表层岩溶带水相对雨季减少。植物利用表层岩溶带水是适应喀斯特干旱环境的重要策略。美国爱德华兹高原喀斯特地区的常绿灌木杉木为度过干热的夏季主要以稳定的表层岩溶带水分为主[7]。
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研究结果表明：①不同植物种或不同年龄植物具有不同的水分利用模式，能够吸收在空间和时间上存在差异的水源，而土壤水和表层岩溶带水是喀斯特区植物主要水分来源。②雨季，植物主要以降水为补给的中层土壤水为主，旱季主要以较为稳定的深层土壤水为主。③成熟滇青冈在雨季所利用水分来自中层土壤水，旱季主要来自深层土壤水和表层岩溶水；幼龄滇青冈无论旱雨季都偏向于对深层土壤水和表层岩溶水的利用；成熟云南木樨榄雨季主要利用中层土壤水，旱季则是深层土壤水，与幼龄云南木樨榄截然相反；成熟清香木无论旱雨季都利用中层土壤水，幼龄清香木则与成熟滇青冈相似。
根系能对环境变化做出反映，在一定程度上根系反应了土壤—植物间物质和能量的交换。滇青冈原生林中不同物种、不同年龄阶段植物水分利用策略，是植被群落对缺乏地表水岩溶区的适应机制，说明植物根系具有向水性和二态分布特点，使植物在不同时期获得充足水分来源。根据几种植物的水分利用策略，可发现深根吸水植物水分利用最为合理，雨季充分利用降水补给，旱季又有稳定水源度过干旱时期。因此，在滇中石林地质公园生态恢复过程中，建议多栽种深根吸水植物以适应地表水的缺乏。
Soil-water utilization levels in a Cyclobalanopsis glaucoides virgin forest on the Central Yunnan Karst Plateau
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摘要: 为阐明滇中岩溶高原滇青冈Cyclobalanopsis glaucoides原生林植物水分利用机理及其对岩溶干旱生境的适应策略, 运用氧稳定同位素技术, 分析了滇青冈, 云南木樨榄Olea yuennanensis, 清香木Pistacia weinmannifolia等3种不同年龄阶段常见优势木本植物小枝木质部水分及土壤水、表层岩溶带水氧同位素值的相关性, 确定植物水分来源, 并通过IsoSource模型计算不同潜在水源对滇青冈原生林的贡献。结果表明:滇青冈及其伴生的乔木水分利用层位及利用比例呈现时空差异, 并形成明显的水分竞争关系。旱季, 滇青冈、成熟云南木樨榄、幼龄清香木主要利用55~115 cm深层土壤水, 成熟的滇青冈和清香木对表层岩溶带水利用比例增加。雨季, 成熟的滇青冈、云南木樨榄、清香木和幼龄清香木因大气降水对浅表层土壤的补给主要利用20~55 cm土壤水, 利用比例分别为100%, 33.3%, 66.0%, 37.4%, 幼龄植株对表层岩溶带水的利用比例大于成熟植株。Abstract: To explain the water utilization mechanism of a Cyclobalanopsis glaucoides virgin forest on the Central Yunnan Karst Plateau in southwest China, and its adaptive strategies in an arid karst habitat, a stable isotope technique was featured to determine soil-water levels utilized by plants. Several dominant plant species (C. glaucoides, Olea yuennanensis, and Pistacia weinmannifolia) were selected and tested with oxygen isotopes of water on stems and soils from the virgin forest. Using IsoSource model calculations the contribution of different water samples was determined. Results revealed that water utilization positions and proportions for C. glaucoides in the primeval forest and its accompanying trees varied in time and space, and were competitors for water. During dry seasons, C. glaucoides, mature O. yuennanensis, and young P. weinmannifolia used soil water from depths of 55-115 cm with more groundwater used for mature C. glaucoides and mature P. weinmannifolia. In rainy seasons, because of the precipitation, 100% of the mature C. glaucoides, 33.3% of the O. yuennanensis, 66.0% of the P. weinmannifolia, and 37.4% of the young P. weinmannifolia used the 20-55 cm soil-water level.
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无论是脊椎动物还是无脊椎动物，先天性免疫都是第一线防御机制，对抗着各类病原体的侵染。吞噬作用作为一种高度保守进程的先天性免疫机制，能够为许多细胞用来消化微生物病原体以及凋亡或坏死的细胞残骸[1-3]。在吞噬作用中，外来物质被细胞识别并结合到细胞表面，被吞噬小体吞入，并在被吞入的物质周围形成细胞器[4]。吞噬小体经过裂变以及与核内体、溶酶体，或是两者共同的限制性融合后形成成熟的吞噬溶酶体。进入吞噬溶酶体内部的病原体则被低pH值、水解作用以及自由基所消灭[5]。黑腹果蝇Drosophila melanogaster是最常见的果蝇，因拥有与哺乳动物相近的先天性免疫系统，而被认为是研究宿主与微生物相互作用的最佳基因模式生物[6-7]。近年来，果蝇Schneider细胞株（S2）细胞已被确认是一种非常适合研究细胞感染的宿主模型，在对抗衣原体Chlamydia，单胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes，查菲埃立克体Ehrlichia chaffeensis，白念珠菌Candida albicans，大肠埃希菌Escherichia coli以及金黄葡萄球菌Staphylococcus aureus等病菌[6, 8-14]的体外感染过程中，S2细胞与哺乳动物巨噬细胞的作用机制非常相近。金黄葡萄球菌是一种主要的人类病原体，致病率显著，研究显示金黄葡萄球菌可能是一种兼性胞内病原体[15]，并认为金黄葡萄球菌可以在巨噬细胞中存活数日而不影响细胞的生存情况[16]。笔者就果蝇S2细胞对热灭活大肠埃希菌（heat inactivated Esherichia coli, HIEC）及热灭活金黄葡萄球菌（heat inactivated Staphylococcus aureus, HISA）的吞噬模式展开研究，揭示了在S2细胞对抗革兰氏阳性菌时，吞噬作用在清除该类病原体时所起到的重要作用以及金黄葡萄球菌抑制消化过程从而抵御细胞吞噬的策略。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
黑腹果蝇S2细胞株从初代培养24 h的胚胎中分离获得，在体积分数为10%的小牛血清的果蝇培养基（Ivitrogen, 美国）中28 ℃培养[17]。为了确认脂多糖（LPS，Sigma，美国）或聚肽糖（PG，Sigma，美国）的活化作用是否会增强吞噬作用，将S2细胞以106个·孔-1铺开在6孔板中并粘附30 min，LPS或PG经超声处理1 h后，按1.0 mg·L-1的剂量加入到每个孔中孵育1 h，备用。
大肠埃希菌ATCC 14948菌株在LURIA-BERTANI培养基（LB）37 ℃培养24 h后，10 000 g离心10 min收集细菌。金黄葡萄球菌ATCC 25923菌株在含20.0 g·L-1氯化钠的哥伦比亚培养基中培养过夜，在盐溶液中重悬。热灭活大肠埃希菌（HIEC）或热灭活金黄葡萄球菌（HISA）以5×109个·L-1的密度接种于S2细胞，28 ℃孵育1 h。不同时间段收集S2细胞分析。
1.2 试验方法
1.2.1 样品制备与透射电子显微镜（TEM）分析
收集感染后的果蝇S2细胞（5.0~10.0 μL），在含体积分数2%多聚甲醛与2%戊二醛的0.1 mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液（pH 7.4）固定剂中浸泡16 h，室温下不断旋转。以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗，3次·样品-1，5 min·次-1，保持室温下旋转。随后加入体积分数2%锇（Osmium），并以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗3次，5 min·次-1，保持室温下旋转。样品固定，20.0 g·L-1醋酸双氧铀缓冲液（pH 5.2）进行染色，室温避光染色1 h，保持旋转，随后以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗3次，5 min·次-1并不断旋转。通过逐级增加的丙酮溶液（体积分数依次为50%，60%，70%，80%，90%，95%，100%）对样品进行脱水，室温下旋转处理，随后在100%环氧丙烯中毒处理10 min。以EMBED 812或502树脂黏结剂进行最终的渗透处理，V（环氧丙烯）:V（黏合剂）=1:1，室温旋转处理10 min；V（环氧丙烯）:V（黏合剂）=1:2，室温旋转处理20 min；100%黏合剂处理10 min。最终，样品中加入新的100%黏合剂，渗透16 h后，在干燥烘箱中以60 ℃聚合24 ~ 48 h。Hitachi 7650透射电镜（Hitachi, 日本）在70 kV下采集图像[10]。
1.2.2 激光共聚焦显微镜分析
果蝇S2细胞用体积分数10%胎牛血清（FBS）的施耐德培养基12孔板中铺板培养，并将密度为5×109个·L-1异硫氰酸荧光素标记（FITC，Invitrogen, 美国）的热灭活大肠埃希菌（HIEC）/热灭活金黄葡萄球菌（HISA），加入到S2细胞中28 ℃共培养1 h。以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，将混合细胞移植到多聚赖氨酸预处理的载玻片（Sigma，美国）上固定。之后，分别使用罗丹明鬼笔环肽（Invitrogen, 美国）和4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma，美国）一同孵育，用以标记肌动蛋白或细胞核DNA[18]。
1.2.3 流式细胞仪检测分析
细胞培养与处理见1.2.2节。果蝇S2细胞接种细菌后，以PBS清洗，将混合细胞收集到流式管中，通过流式细胞仪检测S2细胞内的FITC荧光信号，统计S2细胞对HIEC和HISA的吞噬能力。为了研究细胞的吞噬作用对活细菌和热灭活细菌的敏感度，以胞内有1个以上FITC标记细菌的细胞在所有细胞中所占的百分比为参考值来予以评价。
1.2.4 细胞酸性指示剂（pHrodo）标签检测溶酶体酸化
在果蝇S2细胞（培养方法见1.2.2节）中加入LPS或PG，孵育S2细胞1 h，从而激活S2细胞；激活后的S2细胞以1×109个·L-1在6孔板中铺开，分别接种pHrodo标记的灭活病原菌（5×109个·L-1），28 ℃共孵育1 h。收集混合细胞，立刻在共聚焦显微镜下观察。分别统计不同处理组中，吞入pHrodo标记病原菌的S2细胞在全部细胞中所占百分比[18]。不同处理组间的差异以t检验进行统计学分析，P < 0.05为显著。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测
果蝇S2细胞经过不同实验处理后，以PBS清洗，收集细胞，使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取总RNA，操作步骤依据产品使用说明书[18]。即刻使用5.0 μg总核糖核酸，以M-MLV反转录酶（Takara，日本）合成为20.0 μL cDNA。实时荧光定量的检测采用基因特异引物与TaqMan探针（表 1），反应体系包括10.0 μL Premix Ex Taq（Takara，日本），1.0 μL cDNA样品，7.2 μL无酶水，各基因对应TaqMan探针0.3 μL，以及各特异性引物0.4 μL。聚合酶链式反应（PCR）程序如下：95 ℃，30 s；90 ℃，5 s，60 ℃，30 s，循环50次。数据分析使用iQTM5软件。
表 1 实时荧光定量PCR反应中引物与TaqMan探针序列Table 1 Primers and TaqMan probe sequences in qRT-PCR寡核苷酸探针 引物与探针序列 RP49-F 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATCTG-3' RP49-R 5'-CACGTTGTGCACCAGGAACTT-3' Rp49-探针 FAM-GGCAGCATGTGGCGGGTGCGCTT-Edipse Rel-F 5'-GCCAGAAAAACCCGTGAGTC-3' Rel-R 5'-AGGTACTTCCCCGATGTTCG-3' Rel-探针 FAM-CGACGTGGCCGCCGCAGA-Edipse Def-F 5'-CCACATGCGACCTACTCTCCA-3' Def-R 5'-AGCCGCCTTTGAACCCCT-3' Def-探针 FAM-ACCACACCGCCTGCGCCG-Eclipse Drs-F 5'-CTGGTGGTCCTGGGAGCC-3' Drs-R 5, -AGCGTCCCTCCTCCTTGC-3' Drs-探针 FAM-CCGATGCCGACTGCCTGTCC-Eclipse 1.2.6 统计学分析
本研究中每组试验均使用3个生物学重复。统计学显著性分析使用t检验，判断对照组与实验组的差异性，P < 0.05为显著，P < 0.01为极显著。
2. 结果与分析
2.1 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
透射电镜下观察黑腹果蝇S2细胞对灭活大肠杆菌（HIEC）或灭活金黄葡萄球菌（HISA）的吞噬过程，发现孵育1 h后S2细胞即可顺利吞噬HIEC（图 1A），孵育后第1天S2细胞内HIEC已消失（图 1B）；但共孵育1 h后S2细胞未能吞噬HISA（图 1C），HISA（图 2A）与S2细胞共孵育4 d，仍保持形态完整（图 1D，图 2B，图 2C，图 2D，图 2E）。在PG或LPS激活后，S2细胞也不能有效地吞噬HISA（图 2F，图 2G，图 2H）。与健康的S2细胞相比，在接种后第4天，S2细胞吞入的HISA依然形态完整（图 2E，图 2F，图 2G，图 2H）；吞入HISA的S2细胞没有出现凋亡或破裂，表明细胞内的HISA并没有对S2细胞造成明显的损伤。
图 1 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用Figure 1 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HIEC or HISA by S2 cells
图 2 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HISA的吞噬作用Figure 2 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HISA by S2 cells2.2 激光共聚焦显微观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
激光共聚焦显微观察发现，在S2细胞吞噬热灭活大肠杆菌HIEC 1 h后，胞内可观察到HIEC发出的绿色荧光（图 3A）；吞噬发生1 d后，S2细胞内观察不到绿色荧光粒子（图 3B）；表明HIEC已经被S2细胞清除。同样处理下，热灭活金黄葡萄球菌HISA没有被S2细胞清除。由图 3C和图 3D可知，HISA被吞噬后，被S2细胞内化到细胞内继续存在。由此可知，在S2细胞接种灭活菌后，HIEC与HISA均被S2细胞吞入，但HIEC被S2细胞清除，而HISA则没有被清除。
图 3 激光共聚焦显微镜观察黑腹果蝇S2细胞对FITC标记的HIEC或HISA的吞噬作用Figure 3 Confocal microscopy of phagocytosis of FITC-labeled HIEC or HISA by S2 cells2.3 流式细胞仪检测S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
流式细胞仪的检测结果由图 4可知：接种1 h后，吞入了至少1个HIEC粒子的S2细胞在所有S2细胞中所占的比例接近40%，与S2细胞吞噬大肠埃希菌的结果相近；吞入至少1个HISA粒子的S2细胞在所有S2细胞中所占的比例接近25%，与S2细胞吞噬金黄葡萄球菌的结果相近。说明S2细胞吞入活细菌和热灭活细菌的敏感度并没有显著差异。
图 4 孵育1 h后黑腹果蝇S2细胞对FITC标记的病原菌的吞噬率Figure 4 Quantification of phagocytosis of FITC-labeled microbes by S2 cells at 1 h post-inoculation2.4 吞噬溶酶体酸化观察和吞噬率检测结果
细胞内的酸性环境可诱导pHrodo标记的病原菌激发出红色荧光，从而指示吞噬溶酶体的形成。激光共聚焦显微镜观察发现，接种HIEC 1 h后，S2细胞内可观察到红色荧光，表明S2细胞对HIEC的消化程序被激活，细胞内形成了酸性环境（图 5A）；图 5B中未能观察到红色荧光，表明HISA未能激活S2细胞的酸化过程。使用LPS或PG激活S2细胞，再进行接种观察，可发现在接种HISA 1 h后，未能观察到红色荧光，说明S2细胞的酸化过程仍未被激活。
图 5 激光共聚焦显微观察孵育1 h后黑腹果蝇S2细胞对pHrodo标记的HIEC及HISA的呑噬作用Figure 5 Confocal microscopy of phagocytosis of pHrodo-labeled HIEC or HISA by S2 cells at 1 h post-inoculation为揭示LPS或PG的刺激对S2细胞吞噬活性的影响，用共聚焦显微镜观察S2细胞吞噬pHrodo标记菌并统计吞噬率。结果表明：共孵育1 h后，只有接种HIEC的S2细胞内呈现酸性环境，其他的处理均不能诱导S2细胞酸化（图 6）。检测吞噬百分比发现，只有HIEC处理组的吞噬率显著高于对照组（P < 0.01）。使用LPS或PG激活S2细胞后再接种，S2细胞对HISA的吞噬率仍没有显著增加。这表明溶酶体酸化过程只发生在S2细胞吞噬HIEC的过程中，而LPS或PG刺激并不能诱导S2细胞吞噬HISA后的酸化过程（图 6）。
图 6 共孵育1 h后S2细胞对pHrodo标记的HIEC及HISA的吞噬率Figure 6 Phagocytic percentages of the pHrodo-labeled HIEC or HISA2.5 实时荧光定量PCR检测基因表达
实时荧光定量PCR反应中引物与TaqMan探针序列如表 1所示。通过实时荧光定量PCR检测不同处理条件下S2细胞内的防御素（defensin），抗真菌肽（drosomycin）和Relish的表达量变化。结果发现：防御素的表达量在HISA，HISA+LPS和HISA+PG等3个处理组中，均发生显著上调（P < 0.01）；抗真菌肽的表达量仅在HISA+PG处理组中发生显著上调（P < 0.01）（图 7）；Relish的表达量在HIEC处理组中发生显著上调（P < 0.01），但在HISA处理组中无显著变化。
图 7 黑腹果蝇S2细胞呑噬HISA作用中防御素，抗真菌肽及Relish的表达谱Figure 7 Expression profiles of drosomycin, defensin and relish in phagocytosis of HISA3. 讨论与结论
吞噬作用是动物对抗微生物病原体的一种重要免疫防御机制，由吞噬细胞来执行具体的功能[19-20]。本研究对黑腹果蝇S2细胞吞噬热灭活大肠埃希菌（HIEC）和金黄葡萄球菌（HISA）的异同进行了研究。结果表明：S2细胞能够在接种后1 d有效吞噬并清除HIEC，但却无法清除HISA；即使到了接种后4 d，S2细胞仍不能有效地清除HISA，而是任由它存在于细胞内。经PG或LPS诱导激活的S2细胞同样不能有效地清除HISA。与健康的S2细胞相比，存在于细胞内的HISA在接种4 d后并没有明显破坏S2细胞。许多研究证明在细胞培养模式下，金黄葡萄球菌能够逃逸宿主细胞的免疫系统，具有隐藏的潜能[21]，可在胞内坚持存活一段时间[22-23]。在本研究中，热灭活金黄葡萄球菌存在于S2细胞中达4 d以上，说明灭活后的金黄葡萄球菌仍存在抗吞噬的成分，这与金黄葡萄球菌存在多个抗吞噬因子有关[24-26]。统计细胞吞噬率发现，热灭活并不会影响吞噬作用对灭活细菌的敏感性，这一点已被另一项研究所证实[11]。
在消化进程中，吞噬溶酶体的pH值降低，细胞内环境酸化，可帮助吞噬作用的进行，并能够通过pHrodo染料的使用进行检测[27]。LPS是革兰氏阴性菌的主要的细胞膜成分，可以通过Imd（immune deficiency）免疫信号通路激活巨噬细胞；PG是革兰氏阳性菌细胞壁上的主要成分，可以通过Toll信号通路激活巨噬细胞。使用LPS或PG刺激接种HISA的S2细胞，细胞并未形成酸化环境。通过透射电镜与激光共聚焦显微镜的观察，明确了即使S2细胞经过LPS或PG的激活也不能有效地吞噬HISA的结果；检测S2细胞对pHrodo标记的病原菌的吞噬百分比也表明，吞噬溶酶体的酸化只发生在S2细胞对HIEC的吞噬过程中，其他处理并不能引起S2细胞的酸化。
黑腹果蝇S2细胞的吞噬作用中包括了Toll与Imd等2条信号通路，其中Toll通路参与到抗革兰氏阳性菌的免疫作用中，该免疫应答机制中包含Defensin基因[28-29]的表达，而已知的防御素（defensin）是一类由小胱甘酸富集而成，可被诱导的抗微生物肽，有利于宿主对真菌的防御应答[30]；Drosomycin基因表达的Drosomycin是一类可诱导的抗真菌肽，同样由Toll通路调节，并在全身脂肪体中均有表达[31-32]。观察发现防御素的表达量在HISA，HISA+LPS以及HISA+PG处理中，均发生显著上调；抗真菌肽的表达量在HISA+PG处理中显著上调；由此可以推断，Toll通路在HISA+PG的刺激下被激活。但是也看到PG虽然能激活S2细胞的Toll通路，但却无法有效清除HISA，同样，胞内的HISA也不会诱导S2细胞凋亡。由此可知，金黄葡萄球菌作为一种人类病原体，对黑腹果蝇来说也是高致病的病原，与其他革兰氏阳性菌相比，它表现出了更强的对防御素的抵御能力[36]。在黑腹果蝇中，Imd通路调节着对革兰氏阴性菌的免疫应答，Relish作为NF-κB通路的转录因子，是Imd通路的终极目标[28]。本研究结果发现：Relish在HIEC处理中显著上调（P < 0.01），说明Imd通路在HIEC处理中被激活，而激活的Imd通路最终诱导S2细胞吞噬HIEC，说明Relish的表达量与S2细胞吞噬HIEC的百分率呈正相关。
有研究表明：金黄葡萄球菌能够迅速地逃避溶酶体/吞噬体的捕获，在细胞液泡内存活可长达4 d，之后逃入细胞质中[16, 37-38]。有趣的是，我们发现灭活金黄葡萄球菌同样能够在S2细胞内存活4 d，其细胞表面物质具有抗吞噬消化的活性。该结果同时暗示着无脊椎动物吞噬细胞对清除部分革兰氏阴性及革兰氏阳性菌均有所帮助，但细胞免疫对这些胞内细菌的清除效力胜于体液免疫。
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图 1 旱雨季滇青冈原生林植物木质部水与土壤水中的δ18O变化(A.旱季，B.雨季）
Figure 1 Comparison of δ18O of stem water, soil water and groundwater of Cyclobalanopsis glaucoides primeval forest during rainy seasons (A. dry season, B. rainy season)
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2014.05.005
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