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植物硅酸体，简称植硅体，是植物内的含水非晶态二氧化硅(SiO2)颗粒，存在于植物不同部位的细胞内[1-2]。植硅体碳因具有很强的抗腐蚀、抗分解、抗氧化等特性[2-3]，可在土壤中保存数千年乃至万年之久[4]，是陆地生态系统长期固碳的主要机制之一[5-6]，对调节全球碳平衡和应对气候变化意义重大。当前对植硅体的研究主要集中于古环境与古气候重现、农业与环境考古、古生态以及植物分类学等方面，基于宏观估测和默认植硅体恒久稳定的前提进行，因此学界对土壤中植硅体的稳定性存在很大争议。PARR等[7-8]发现：经过2 000 a的分解，土壤中植硅体碳质量分数从仅占表层土壤有机碳不到10%的比例，上升到82%，表明土壤中植硅体碳的封存是一个长期积累的过程[9]。WILDING等[4]发现：植硅体中碳的放射性年龄约为1.33万a。因此，植硅体具有长期稳定性。也有研究认为植硅体是不稳定的。如FRAYSSE等[10]发现竹林土壤中的植硅体的溶解度等同于玻璃质硅石，是石英的17倍；BARTOLI等[11]认为植硅体的溶解速率比硅酸盐矿物高一个数量级[11]；CONLEY等[12]发现：保存死亡植物的地方，水溶性硅的输出明显增加。竹类作为禾本科Poaceae中典型的硅富集植物，植硅体碳含量高，提取、纯化相对方便[13-14]。其次，竹类植物分布广泛，种类丰富[15]，不同生境竹种差异大[16]，为比较不同竹种植硅体碳稳定性差异和微观形态特征提供了理想的材料。选择竹类植物为研究对象，对揭示植硅体碳稳定性机理和准确估测竹类植硅体碳封存潜力具有双重意义。扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)是由电子光学技术、真空技术、精细机械结构以及现代计算机控制技术等共同组成的电子光学仪器[17]，在植物研究工作中主要被应用于植物来源和种类鉴定、植物微形态学研究以及植物生长的优劣与环境污染等质量控制[18-19]。近年来，随着植物和土壤植硅体碳研究的深入，扫描电子显微镜等先进仪器也被应用到植硅体碳测定上[20-21]。本研究以毛竹Phyllostachys edulis叶片为材料，利用扫描电子显微镜的高清成像功能检测植硅体微观形态特征，从微观形态上研究毛竹植硅体的稳定性，建立植硅体稳定性微观表征方法，为深入开展植硅体碳研究提供依据。
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在野外调查基础上，采集杭州市临安区青山镇毛竹叶片约500 g。样品带回实验室，用软毛笔轻扫除去表面灰尘和其他杂物，过程中需注意不损伤毛竹叶片样品。用吹气球吹净后，蒸馏水进行清洗。在105 ℃下杀青20 min，再在75 ℃下烘24 h以上，磨碎备用。
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采用微波消解法、湿灰化法和干灰化法提取毛竹叶片中植硅体。①微波消解法：称取毛竹叶片样品0.300 0 g，加4.5 mL质量分数为65%的硝酸(HNO3)，3.0 mL质量分数为30%的过氧化氢(H2O2)，1.0 mL质量分数为36%的盐酸(HCl)，置于微波消解仪中，消解2 h后取出，离心清洗[7]。提取后的植硅体，采用Walkley-Black法[22]确保除去植硅体外残留的有机碳等物质。65 ℃烘干24 h。②湿灰化法：取0.100 0 g毛竹叶片样品，置于100 mL烧杯，加入约10.0 mL质量分数为65%的硝酸(HNO3)，于电热板上缓慢加热，使样品内有机质逐渐被氧化，直至有机质氧化完全，样品不再呈黏稠，溶液澄清为止。再加入2 mL 100 g·kg-1的稀盐酸清洗，以去除附着的钙离子；去离子水清洗2次，无水乙醇清洗2次，65 ℃烘干24 h。③干灰化法：取0.100 0 g毛竹叶片样品置于500 ℃的马弗炉中灰化6 h，取出，再加100 g·kg-1的稀盐酸清洗，溶解灰分中的钙离子，离心清洗2次，65 ℃烘干24 h。。
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称取微波消解法提取的纯净毛竹叶植硅体50 mg，放入50 mL的塑料离心管中，加入0.4 mol·L-1的硼酸缓冲液45.0 mL(pH 10，浸泡用)。摇匀后放置于恒温振荡机中，设置温度为50 ℃，振动频率为70 r·min-1，振荡15 d。抽取摇匀的悬浊液1 mL置于微量离心管中，10 000 r·min-1离心10 min；在含有植硅体的沉淀中加入超纯水，10 000 r·min-1清洗10 min，直到清洗干净。沉淀烘干后备用。
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称取20 mg已提取的植硅体样品，分散在100 mL质量分数为7 g·kg-1的甘油中；用定量吸管吸取0.01 mL制样，红外线灯烘干。采用离子溅射镀覆法进行植硅体样品镀膜。将上述烘干后的植硅体样品粉末均匀地撒在卡片纸上，用粘有导电胶的扫描电镜样品台沾取样品。样品及样品台置于BC-Ⅱ离子溅射仪中进行真空喷镀, 喷镀时金靶材处于阴极，调整靶材和样品台合适的距离，抽真空后通入微量氮气。两极间加电场后产生辉光放电，并调节电流大小。重复多次至获得最佳的镀膜真空度和电流值。
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前处理完成后，放入场发射扫描电子显微镜中(型号为SU-8000 Hitachi)；调节灯丝饱和点、光阑对中、光阑合轴、消象散调节和聚焦观测等，可获得清晰的表面形貌植硅体微观表面形貌图像。
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由图 1A可见：微波消解法提取的毛竹植硅体长为12~14 μm，宽为7~10 μm；植硅体呈现长鞍形(竹节形)，图像细节清晰，植硅体形态完整，说明微波消解法是一种获得植硅体理想形貌的方法。用干灰化法(图 1B)和湿灰化法(图 1C)提取的毛竹植硅体，除长鞍形外，还观察到哑铃形；植硅体长为12 μm，连接处宽度为4 μm，两端的宽度为8 μm；用湿灰化法提取的毛竹植硅体还可见微小突起(图 1C)。
图 1 单个植硅体扫描电子显微镜图片
Figure 1. SEM graph of phytolith
由图 1可知：3种提取毛竹植硅体的方法均能获得清晰的植硅体微观形态，但相比而言，微波消解法所展现的细节最为丰富、清晰，可以观察到植硅体表面的溶蚀坑、破碎、粗糙度等微形态变化特征，能保留植硅体的细节形貌不被破坏。因此，微波消解法为最佳提取方法，更有利于探究植硅体的微观形貌及其稳定性。
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微波消解法提取的植硅体经pH 10的硼酸缓冲液中浸泡15 d后微观形态发生变化。从图 2A可以看出：未经浸泡的毛竹植硅体呈现棒状，没有弯曲和分叉，表面较为光滑。浸泡15 d后的植硅体(图 2B)样品表面变粗糙，出现溶蚀坑；内部硅质颗粒暴露，清晰可见其呈聚集分布。由此认为植硅体并非惰性，其不稳定性从外表面开始被破坏；扫描电镜图像验证了“植硅体有可能不稳定”的结论。
图 2 微波消解法提取的植硅体浸泡前后的微观形态变化
Figure 2. Micromorphological changes of the phytolith extracted by microwave digestion method before and after soaking
目前对植硅体稳定性的判断还没有统一的评价标准，因此如何寻求有效方式快速了解植硅体的稳定性成为研究者急需解决的问题之一。本研究结果认为：扫描电镜作为一种直观探测方式，可以观测到植硅体表面的微形态变化，可为植硅体稳定性的研究提供依据和辅助判别方法。
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微波消解法是提取毛竹植硅体比较理想的方法，可以观察到植硅体表面的溶蚀坑、破碎、粗糙度等微形态变化特征。对微波消解法提取的毛竹植硅体，经pH 10的硼酸缓冲液中浸泡15 d后进行扫描电镜观测，能观察到毛竹植硅体在浸泡后的不稳定状态，验证了“植硅体不稳定”的说法。
Stability of Phyllostachys edulis phytolith by scanning electron microscopy
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摘要: 为了揭示竹子植硅体表面形态和结构，探究植硅体在缓冲液浸泡后形态是否稳定，以毛竹Phyllostachys edulis叶片为研究材料，采用微波消解法、湿灰化法和干灰化法，提取毛竹叶片中的植硅体。对提取的植硅体经镀金膜处理，用扫描电子显微镜（SU-8000 Hitachi）观测。结果表明：毛竹植硅体具有多种形态。微波消解法提取的毛竹植体长为12~14 μm，宽为7~10 μm，植硅体呈现长鞍形（竹节形），图像细节清晰，植硅体形态完整；湿灰化法和干灰化法提取的毛竹植硅体呈哑铃形，长约为12 μm，连接处宽度约为4 μm，两端的宽度约8 μm，并且用湿灰化法提取的毛竹植硅体还可见微小突起。微波消解法是提取毛竹植硅体比较理想的方法。微波消解法提取的植硅体在pH 10的硼酸缓冲液中浸泡15 d后的微观形态可见：植硅体外表已出现溶蚀坑，表面变粗糙，可见硅质颗粒，呈现为聚集分布。说明植硅体表面已被破坏，呈现不稳定状态。Abstract: In order to reveal the surface morphology and structure of bamboo plant phytolith and explore the stability of phytolith after strong alkali soaking, the leaves of Phyllostachys edulis were used as the research material to extract the phytolith by using microwave digestion method, wet ashing method and dry ashing method. The extracted phytolith was treated with gold plated film and observed by scanning electron microscope (SU-8000 Hitachi). The results showed that the phytoliths of Ph. edulis had various forms. The length of phytolith extracted by the microwave digestion method was 12-14 μm; the width of phytolith was 7-10 μm; the phytolith presented a long saddle shape (slub shaped); the image details were clear and the morphology of the Ph. edulis was complete. The phytolith extracted by wet ashing method and dry ashing method were dumbbell shaped with a length of about 12 μm. The width of the joint was about 4 μm and the width of the ends was about 8 μm. The phytolith extracted by wet ashing could also showed tiny protuberances. Microwave digestion was an ideal method to extract Phytolith from Ph. edulis. The micromorphology of the phytolith extracted by microwave digestion method could be seen after soaking in the boric acid buffer solution with a pH value of 10. The surface of the phytolith appeared corrosion pit and became rough; and the silica particles presented aggregation distribution. It indicated that the surface of the phytolith was damaged and unstable.
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Key words:
- botany /
- Phyllostachys edulis /
- phytolith /
- scanning electron microscope /
- stability /
- micromorphology
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2018.06.023
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