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简单序列重复（SSR）广泛分布于真核生物的核基因组，叶绿体基因组以及线粒体基因组中，常指一类以1~6个核苷酸为重复基元的串联重复DNA序列[1]。因其分布广泛、多态性高且具共显性，SSR标记被广泛开发和应用于种质资源鉴定与遗传多样性分析[2-3]。在植物中，由于叶绿体基因组表现为母系遗传，以半保留方式进行自我复制，几乎不发生重组，保守性远高于核基因组。因此，叶绿体基因组中的SSR标记（chloroplast SSR，cpSSR）可在更高分类水平上进行种间、种内鉴定和遗传进化分析[4]。随着高通量测序技术的发展，大量植物的叶绿体基因组被测序与公布，相应的叶绿体SSR也得到了广泛的开发与应用[5-7]。花椒Zanthoxylum bungeanum是芸香科Rutaceae花椒属Zanthoxylum植物，其果皮晒干后是中国传统的调味料和中草药。在市场上流通的花椒果皮主要来自于花椒Z. bungeanum（又称红花椒或大红袍花椒）和竹叶花椒Z. armatum（又称青花椒），而在日本主要利用日本花椒Z. piperitum（又称胡椒木或朝仓花椒）进行麻味物质和其他药用活性成分的提取分析[8]。在前人的研究中，基于核基因组内部序列差异开发的SCAR（sequence-related amplified polymorphism）标记[9]、ISSR（inter-SSR）标记[10]和EST-SSR（expressed sequence tags-SSR）标记[11]等已利用到花椒属植物的遗传分析中，而cpSSR标记在花椒属植物的开发与应用还未见报道。鉴于此，本研究对花椒cpSSR位点进行筛选，分析其分布特点并利用花椒、竹叶花椒和日本花椒种质资源开发多态性标记，以期为花椒属植物的种质资源鉴定、遗传进化分析等提供可靠的标记资源。
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基于本研究前期获得的花椒叶绿体基因组序列[12]，利用TRF（tandem repeats finder）在线软件（http://tandem.bu.edu/trf/trf.html）搜索单核苷酸重复序列，设置重复数≥10次；利用SSRHunter软件[13]搜索核苷酸重复数位为2，3，4，5的SSR位点，对应重复数设置为5，3，3，3次。合并2种软件的检测结果，统计1~5 bp核苷酸重复所在花椒叶绿体基因组中的位置：长单拷贝序列区（LSC）、短单拷贝序列区（SSC）和2个反向重复序列区（IR）。SSR引物利用Primer3软件（http://primer3.ut.ee）设计。原则为：扩增片段为150~250 bp；引物长度为18~22 bp；退火温度为57~63 ℃；GC质量分数为30%~55%。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
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本研究共选用16份花椒属种质资源进行SSR多态性的筛选，其中包括来自中国四川省和重庆市的5份竹叶花椒种质资源和1份日本花椒种质资源（均采自四川省林业科学研究院生物技术与良种研究所花椒种质圃）以及来自四川、贵州、陕西、山东和山西等5个省的10份花椒种质资源（均采自西北农林科技大学凤县花椒试验示范站）进行多态性的筛选（表 1）。所有种质资源选取3株，取鲜嫩叶片混合，硅胶干燥，常温保存备用。
表 1 供试16份花椒属种质资源来源地
Table 1. Origin of 16 germplasms of Zanthoxylum
种质资源名称 拉丁学名 来源地 ‘重庆九叶青’ Z. armatum
‘Chongqingjiuyeqing’重庆市江津区 ‘重庆荣昌无刺’ Z. armatum
‘Chongqingrongchangwuci’重庆市荣昌区 ‘蓬溪青花椒’ Z. armatum ‘Pengxiqinghuajiao’ 四川省遂宁市 ‘汉源葡萄青椒’ Z. armatum
‘Hanyuanputaoqingjiao’四川省雅安市 ‘狗椒’ Z. armatum ‘Goujiao’ 四川省雅安市 ‘汉源大红袍’ Z. bungeanum
‘Hanyuandahongpao’四川省雅安市 ‘油花椒’ Z. bungeanum ‘Youhuajiao’ 贵州省六盘水市 ‘素花椒’ Z. bungeanum ‘Suhuajiao’ 贵州省六盘水市 ‘凤县大红袍’ Z. bungeanum ‘Fengxiandahongpao’ 陕西省宝鸡市 ‘狮子头’ Z. bungeanum ‘Shizitou’ 陕西省韩城市 ‘韩城大红袍’ Z. bungeanum ‘Hanchengdahongpao’ 陕西省韩城市 ‘党村无刺’ Z. bungeanum ‘Dangcunwuci’ 陕西省韩城市 ‘府谷花椒’ Z. bungeanum ‘Fuguhuajiao’ 陕西省榆林市 ‘山东大红袍’ Z. bungeanum ‘Shandongdahongpao’ 山东省临沂市 ‘山西大红袍’ Z. bungeanum ‘Shanxidahongpao’ 山西省永济市 日本花椒 Z. piperitum 日本兵库县 供试种质资源全基因组DNA利用“植物全基因组DNA提取试剂盒（DP305）”（北京天根生物有限公司）提取，质量分数为1%琼脂糖结合紫外分光光度计检测DNA质量和浓度后稀释至20 mg·L-1，4 ℃保存备用。
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PCR扩增体系为20 μL，包括10 μL 2× Taq Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司），模板DNA（20 mg·L-1）5.0 μL，正、反向引物（2 μmol·L-1）各1.5 μL，双蒸水（ddH2O）2.0 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸8 min后4 ℃保存。取1.5 μL的PCR扩增产物，质量分数为8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（恒定功率100 W，100 min）分离检测，使用pBR322 DNA/MspI Marker作为标准分子量，银染拍照保存。
根据电泳图像，统计扩增条带并构建0~1数据矩阵，即有共迁移条带记为1，无条带则记为0。利用NTSYSpc-2.10软件计算遗传相似系数，采用非加权配对算术平均法（UPGMA）进行遗传相似性聚类。
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花椒叶绿体基因组全长为158 401 bp，共搜索出了144个SSR位点（图 1和表 2），即在花椒叶绿体基因组中平均每隔1 100.00 bp出现1个SSR位点。
图 1 SSR在花椒叶绿体基因组中的分布特点
Figure 1. Distribution of SSRs in the chloroplast genome of Zanthoxylum bungeanum
表 2 花椒cpSSR的重复类型与次数
Table 2. Repeat types and times of cpSSR in Zanthoxylum bungeanum
重复类型 重复单元 重复数/次 总计/次 3 4 5 6 10~15 ＞15 单核苷酸 A/T 52 8 60 C/G 2 0 2 二核苷酸 AT/TA 4 1 5 三核苷酸 AAC/GTT 5 5 AAG/CTT 22 3 25 AAT/ATT 20 4 1 25 ACC/GGT 2 2 ACT/AGT 2 2 AGC/CTG 4 4 AGG/CCT 2 2 ATC/ATG 5 5 四核苷酸 AAAT 2 1 3 其他类型 4 4 根据SSR位点在花椒叶绿体基因组中的位置（图 1）可知：LSC区分布85个SSR位点，占SSR总数的59.03%，平均1 010.56 bp出现1个SSR位点；SSC区分布23个SSR位点，占SSR总数的15.97%，平均765.65 bp分布1个SSR位点；在2个IR区（IRA和IRB），均分布18个反向重复的SSR位点，合计占SSR总数的25.00%，平均1 524.72 bp分布1个SSR位点。
数量上，单核苷酸重复和三核苷酸重复分别有62和70个，两者占SSR总数的91.67%，且在LSC区、SSC区和IR区均有分布。二核苷酸重复和四核苷酸重复分别只有5个（3.47%）和7个（4.86%），但二核苷酸重复仅分布于SSC区，而四核苷酸重复仅分布于LSC区。
重复次数上，单核苷酸重复次数多集中在10~15次，共54个位点，占单核苷酸重复总数的87.10%，而重复数＞15次的共有8个位点；二核苷酸重复数集中在5次，三核苷酸和四核苷酸重复数集中在3次。根据重复基元类型，单核苷酸重复中A/T重复共60个，而C/G重复位点仅有2个；二核苷酸重复基元均为AT/TA；AAG/CTT和AAT/ATT为三核苷酸重复中的优势重复基元，均为25个，其余重复基元总计为20个；此外，AAAT为四核苷酸重复中的优势重复基元（3个），其余重复基元总计为4个（表 2）。
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根据SSR位点两侧序列，由Primer3软件设计了30对引物（命名为YLT-01~YLT-30）并合成。其中，YLT-01~YLT-20扩增片段包含的是2个及2个以上的核苷酸重复位点（YLT-01~YLT-12位于LSC；YLT-14~YLT-18位于SSC区；YLT-13、19、20位于IR区），YLT-21~YLT-30扩增片段包含的是单核苷酸重复位点（YLT-21~YLT-27位于LSC区；YLT-30位于SSC区；YLT-28、29位于IR区）。
经PCR扩增筛选，30对引物均能扩增出稳定的目的片段。其中，10对引物在供试种质中呈现多态性，占筛选引物总数的33.33%。如表 3所示：10对引物共检测到24个等位基因。其中，YLT-26包含4个等位基因，YLT-21和YLT-29包含3个等位基因，其余的7个位点（YLT-01，YLT-17，YLT-22，YLT-23，YLT-24，YLT-25和YLT-27）均检测出2个等位基因。在包含2个等位基因的7个位点中，YLT-01，YLT-17，YLT-24，YLT-25和YLT-27能区分出日本花椒，花椒与竹叶花椒为一类（扩增片段大小一致），而YLT-22和YLT-23的扩增结果为：10份花椒种质同一带型，竹叶花椒与日本花椒为同一带型；YLT-21和YLT-29能将花椒、竹叶花椒和日本花椒区分开；YLT-26不仅能区分出花椒、竹叶花椒和日本花椒3个花椒属的不同种，且能区分出竹叶花椒种质中的狗椒。此外，未检测到有标记在10份花椒种质呈现多态性（图 2）。
表 3 多态性SSR引物的基本信息
Table 3. Characterizations of polymorphic SSR primers pairs
引物名称 正向引物（5′→3′） 反向引物（5′→3′） 重复单元 SSR区间位置/
bp片段长度/
bp等位基因数/个 YLT-01 GAAGGGCGTCCATTGTCTAA GAGGAAGCGGAAGCTCTTTT （ATA）3 10 940~10 948 218 2 YLT-17 TGAGACATTCCCAAATCCAA GACCGAAGCTTTTTCGAACT （TA）5…（TA）6 122 229~122 258 177 2 YLT-21 CCGTGTCAACCAATAATCCA ATCCGACTAGTTCCGGGTTC （T）16 1 931~1 946 198 3 YLT-22 CCACAAATGCATTCAGTTCC CAGGCCCGACAGAATAAAAA （A）13 7 436~7 448 177 2 YLT-23 GATTGGTTCGGTTCCAAGAA GGCAATTTGGCGAATAAAAA （A）18 7 924~7 941 215 2 YLT-24 TCGCATTGTAGCGGGTATAG TTTCGAATTGACCCTTGGAT （A）20 9 976~9 995 219 2 YLT-25 CATAGGTCATCGATTCAGCA AAGTCCAGACAAAGCACGGTA （A）15 13 422~13 436 239 2 YLT-26 AACGGAAACGAAGCGATAAA ACGGGAATCCACCAAAAAGT （A）16 28 499~28 514 248 4 YLT-27 ATCTGGGAACGGGGATTAAC CCATCAGAACGGAACGAAAT （T）17 33 511~33 527 157 2 YLT-29 AGCCACTTGTACTGCGAATTT ACGTGCGATTCGATAAAACC （T）11…（A）16 124 632~124 666 207 3 
图 2 16份花椒属种质的UPGMA聚类分析
Figure 2. Cluster diagram for 16 germplasms of Zanthoxylum by UPGMA method
在设计的20对包含2个及2个以上的核苷酸重复位点的引物中，仅有2对引物表现出多态性；而包含单核苷酸重复位点的10对引物中，有8对引物呈现多态性，多态性比例远高于包含多核苷酸重复的位点。
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基于10个多态性标记的检测结果，利用NTSYSpc-2.10软件对供试的16份花椒属种质进行UPGMA聚类分析。如图 2所示：在遗传相似系数阈值为0.22时，可将16份花椒种质聚为2类，即花椒和竹叶花椒为1类，日本花椒为1类；在遗传相似系数阈值为0.59时，可将花椒和竹叶花椒分为2个小类；而在遗传系数阈值为0.91时，可将竹叶花椒中的狗椒与其他4种竹叶花椒种质区分为2个小类。聚类结果与多态性标记的鉴定结果保持一致。
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本研究在花椒的叶绿体基因组中共筛选到144个SSR位点，其中三核苷酸重复的数量要高于单核苷酸重复以及二核苷酸和四核苷酸重复的数量，与杨丽等[14]在麻竹Dendrocalamus latiflorus和绿竹Bambusa oldhamii叶绿体基因组中获得的SSR位点的规律一致，但与蒺藜苜蓿Medicao truncatula[15]，棉花Gossypium hirsutum[16]和霍山石斛Dendrobium huoshanense[17]等的叶绿体基因组中均以单核苷酸重复为主不同。原则上，碱基重复基元越多，越难形成SSR位点。本研究在三核苷酸重复次数的筛选上，选择重复数大于或等于3次的位点，而大于3次的重复位点仅占三核苷酸重复总数的11.43%（8个）。因此，本研究的三核苷酸重复数量多于单核苷酸重复是由软件参数设置不同引起。此外，花椒cpSSR在LSC和SSC区的分布密度要高于IR区。在花椒叶绿体基因组中，GC质量分数在LSC区，SSC区和IR区中分别为36.87%，33.51%和42.54%[12]。由于GC间有3个氢键相连，打破GC键所需的能量要高于AT间的2个氢键，因此更难造成碱基数量的增加或减少[18]。由此推断，花椒叶绿体基因组中IR区SSR位点相对稀疏的原因与GC质量分数相关。
叶绿体基因组由于保守性高，不涉及基因重组，因此，其中突变位点也更容易保留，基于叶绿体开发的SSR标记除了保留核基因组SSR标记的特点外，其可重复性也更高，在种质资源鉴定中也更具说服力[19]。在本研究获得的10个多态性引物中，有2对引物可以把本研究所选花椒属的3个种区分开，1对引物可以将竹叶花椒种内的‘狗椒’区分出。然而，10对多态性引物均未在10份花椒种质资源中表现出多态性。由此推断，相对于竹叶花椒，花椒种内的种质资源在叶绿体基因组进化上保守性更高。
本研究开发的花椒cpSSR可作为花椒属种间鉴定的有效标记，但要应用于种内鉴定，需进一步筛选种间多态性更高的cpSSR标记或利用EST-SSR、核基因组SSR（Genomic-SSR）等保守性相对较低的标记资源进行区分。
Development of chloroplast SSR markers of Zanthoxylum bungeanum and their generality for interspecies and intraspecies
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摘要: 叶绿体基因组为母系遗传，保守性高，因此叶绿体基因组中的简单序列重复（SSR）标记可在更高分类水平上进行种质资源鉴定和群体遗传结构分析。利用TRF软件和SSR Hunter软件相结合对花椒Zanthoxylum bungeanum叶绿体基因组中的SSR位点进行筛选。结果显示：花椒叶绿体基因组中共有144个SSR位点，位点间的平均分布距离为1 100.00 bp。基于检测软件设置参数，SSR重复类型主要集中在一、三核苷酸重复，二者占SSR位点总数的91.67%。此外，随机设计合成30对SSR引物对10份花椒种质、5份竹叶花椒Zanthoxylum armatum种质和1份日本花椒Zanthoxylum piperitum种质进行PCR扩增检测，共筛选出10对多态性引物，其中单核苷酸重复位点的多态性高于多核苷酸重复位点。本研究开发的叶绿体SSR标记可有效区分花椒、竹叶花椒和日本花椒，但在花椒种内并未检测出多态性。表明花椒叶绿体基因组的SSR标记可用于花椒属Zanthoxylum不同种间的遗传多样性分析。
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关键词:
- 植物学 /
- 花椒 /
- 叶绿体基因组 /
- 简单序列重复（SSR） /
- 多态性分析
Abstract: Simple sequence repeat (SSR) molecular markers in the chloroplast genome can be used for germplasm resource identification and population genetic structural analysis at a higher classification level due to the chloroplast genome being of maternal inheritance and high conservation. To screen and develop SSR markers which will be useful for genetic diversity analysis, fingerprinting and germplasms resource identification in the chloroplast genome of Zanthoxylum bungeanum, a traditional spice plant in China, TRF software and SSR Hunter were used to screen the mono-, di-, tri- and tetra-nucleotide repeat motifs and 16 germplasms of Zanthoxylum including 10 individuals of Z. bungeanum, 5 individuals of Zanthoxylum armatum, and 1 individual of Zanthoxylum piperitum were selected to test polymorphism of these detected loci. As a result, 144 SSR loci were identified with an average distribution distance of 1 100.00 bp in the chloroplast genome of Z. bungeanum. Based on parameters set by the detection software, mono-nucleotide and tri-nucleotide repeat motifs were the main repeat types accounting for 91.67% of the total. In addition, 30 SSR primer pairs were randomly designed and synthesized with 10 of them showing polymorphism. The polymorphic markers of mono-nucleotide repeat motifs were more than that of polynucleotide repeat motifs in this study. Furthermore, these cpSSR markers could effectively divide Z. bungeanum, Z. armatum, and Z. piperitum, but no polymorphic marker was found in the 10 individuals of Z. bungeanum. Thus, cpSSR markers of Z. bungeanum could be used for genetic diversity analysis among different interspecies of Zanthoxylum.-
Key words:
- botany /
- Zanthoxylum bungeanum /
- chloroplast genome /
- SSR /
- polymorphism analysis
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以热塑性树脂，如高密度聚乙烯（high density polyethylene，HDPE），聚丙烯（polypropylene，PP）等作为木材胶黏剂，利用热压-冷压串联的平压工艺制备木质原料/热塑性树脂复合材料，不仅能从根源上解决游离甲醛释放的问题，而且能为热塑性树脂的回收利用提供一条新的路径[1-3]。目前，热塑性树脂已与异氰酸酯基胶黏剂、大豆基胶黏剂等共同成为环保型木材胶黏剂的重要发展方向[4-6]。热塑性树脂在一定温度下熔融后，能与多孔性的木材单板形成胶钉结合，赋予复合材料一定的强度[7]，但表面自由能低、结晶度高、与木质原料相容性差，是HDPE和PP等热塑性树脂作为胶黏剂的最大缺陷，导致复合材料的耐沸水和耐高温破坏能力较弱，应用范围受限[8-9]。通过减少木质原料表面的羟基数量，或促进木质原料与热塑性树脂发生化学交联，是提高界面相容性的根本方法[10-14]。笔者前期研究发现[15]：以乙烯基三甲氧基硅烷（A-171）和引发剂过氧化二异丙苯（DCP）为改性剂制备的硅烷化杨木单板，能够与HDPE薄膜形成优良的胶接，复合材料的胶合强度、耐水性能和耐高温能力显著增强。与传统的脲醛树脂（UF）等热固性胶黏剂不同，热塑性树脂胶黏剂具有受热软化、冷却固化的特性，其对木材的胶合是其在木材表面熔融软化、流展、渗透和冷却固化的过程。因此，对于特定的热塑性树脂胶黏剂，必须确定适当的热压温度，使胶黏剂既能在木材表面充分的流展、渗透，且不会出现因黏度过低而发生过度渗透导致胶层过薄等现象，同时能够促进硅烷化木材单板与HDPE薄膜达到充分胶合状态。本研究分析了不同的热压温度对硅烷化杨木单板/HDPE薄膜复合材料性能的影响。
1. 材料与方法
1.1 材料
单板：107杨Populus× euramericana，幅面为300 mm × 300 mm × 1.60 mm，含水率为6%~8%；高密度聚乙烯（HDPE）薄膜，厚度为0.06 mm，密度为0.92 g·cm-3；硅烷偶联剂，乙烯基三甲氧基硅烷（A-171），购买于广东中杰化工有限公司；过氧化二异丙苯（DCP），纯度99%，百灵威科技。
1.2 硅烷化杨木单板/HDPE薄膜复合材料的制备
配制质量分数为95.0%，pH 3.00~3.50的乙醇溶液，一边搅拌一边加入硅烷A-171（杨木单板质量的2.0%）和引发剂DCP（HDPE薄膜质量的0.1%），使溶液质量分数达到4.0%，水解1 h。用配好的溶液对杨木单板进行喷淋处理，室温晾置24 h后转入烘箱中，在120 ℃的条件下处理2 h。
在不同热压温度（140，150，160，170 ℃）下，将上述硅烷化杨木单板与HDPE薄膜进行复合，制备5层结构复合材料，每2层单板之间使用1层HDPE薄膜。其中：热压时间为1 min·mm-1，热压压力1.00 MPa，冷压压力1.00 MPa，冷压时间5 min。其中，试验条件重复3次·组-1。
1.3 性能测试
1.3.1 物理力学性能
按照GB/T 17657-2013《人造板及饰面人造板理化性能试验方法》测定硅烷化杨木单板/HDPE薄膜复合材料的胶合强度（Ⅰ类），静曲强度（MOR），弹性模量（MOE），吸水率（WA），吸水厚度膨胀率（TS）。
1.3.2 动态热力学性能（DMA）
利用DMA（Q2980，TA）的3点弯曲模式测定硅烷化杨木单板/HDPE薄膜在25~200 ℃范围内的储能模量（E′）和损耗角正切（tanδ）变化。其中，升温速率为3 ℃·min-1，振幅为0.03 mm，频率为1 HZ，试样尺寸为60 mm（长）×12 mm（宽）×3 mm（厚）。
1.3.3 胶合界面分析(SEM)
对硅烷化杨木单板/HDPE薄膜复合材料的胶合端面进行喷金处理，利用扫描电子显微镜SEM（Hitachi S-4800）观察硅烷化杨木单板/HDPE薄膜的胶接界面结构。
2. 结果与讨论
2.1 热压温度对复合材料力学性能的影响
热压温度对硅烷化杨木单板/HDPE薄膜复合材料胶合强度和抗弯性能的影响分别如图 1A 图 1B所示。由图 1A可知：复合材料的胶合强度在一定范围内随着热压温度的升高而增加，当热压温度从140 ℃增加至160 ℃时，胶合强度从1.27 MPa逐渐增加至1.89 MPa。这是由于热压温度直接影响HDPE大分子的黏度变化，140 ℃时HDPE的黏度相对较高，不利于其在硅烷化杨木单板表面充分流展，因此，进入单板多孔性结构中HDPE含量少，形成的胶钉数量减少。同时，较低的温度下HDPE大分子的链段运动受到限制，抑制了引发剂DCP对HDPE的诱导反应，削弱了HDPE薄膜与硅烷化杨木单板的化学反应。当热压温度升高至160 ℃时，HDPE的黏度降低，流动性能改善，一方面使得机械结合作用力增强，另一方面HDPE自由基与硅烷改性单板之间的化学反应得到增强。但如果继续增加热压温度，HDPE的黏度会进一步降低，更多的HDPE大分子进入单板内部，使得保留在胶层上的HDPE大分子及其自由基数量减少，胶合界面处的化学作用力减弱，胶合强度开始降低。
热压温度对抗弯性能的影响与胶合强度类似：当热压温度从140 ℃增加至160 ℃时，MOR和MOE值分别从63.90 MPa和5 970.00 MPa增加到72.20 MPa和6 710.00 MPa。当热压温度增加至170 ℃时，胶合板的MOR和MOE值分别下降至67.40 MPa和6 621.00 MPa（图 1B）。抗弯性能的变化趋势仍然与HDPE大分子在单板中的浸透程度及其与杨木单板之间化学作用力的强弱相关。
2.2 热压温度对复合材料耐水性能的影响
HDPE薄膜是一种憎水性的材料，本身不吸收水分，具有比UF树脂胶黏剂更加优异的耐水性能，但是木材单板/HDPE薄膜的界面相容性差，导致复合材料的整体耐水性能较低[3]。因此，本研究还测定了热压温度对硅烷化杨木单板/HDPE薄膜复合材料吸水率（WA）和吸水厚度膨胀率（TS）的影响（图 2）。
由图 2A和图 2B可知：硅烷化杨木单板/HDPE薄膜复合材料的耐水性能随着热压温度的升高逐渐增强。当热压温度为170 ℃时，复合材料的吸水性最低，浸泡24 h后WA和TS值分别为54.22%和4.09%。这是因为：热压温度越高，一方面HDPE大分子自由基与硅烷化杨木单板在胶合界面处的化学反应活性越强，形成紧密的胶接界面结构，可以有效地阻碍水分的进入；另一方面更多熔融的HDPE大分子进入杨木单板内部，憎水性的HDPE包覆亲水性的木材组分，可以降低水分子进入的速度。同时，较高的热压温度有利于杨木单板表面吸水性较强的羟基数量的进一步减少，类似于一个短时的高温处理过程，同样有助于复合材料耐水性能的改善。
2.3 热压温度对复合材料热稳定性的影响
图 3A和图 3B分别是3点弯曲模式下测定的热压温度对硅烷化杨木单板/HDPE薄膜储能模量（E′）和损耗角正切（tanδ）的影响。随着热压温度的升高，复合材料的耐高温破坏能力增强，即在相同的环境温度下储能模量（E′）保留率增大（图 3A）。当热压温度从140 ℃增加至170 ℃时，复合材料在130 ℃时的E′值由3 524.00 MPa增加到7 240.00 MPa，E′值的保留率由62.31%提高到92.01%。当热压温度为170 ℃时，储能模量在环境温度为200 ℃的条件下保留率仍然有53.87%，约为热压温度为140 ℃时保留率的2倍。
图 3 热压温度对热稳定性的影响Figure 3. Effects of pressing temperatures on dynamic mechanical properties热压温度的提高同样有利于增加复合材料胶接界面层的刚性，主要体现在tanδmax的减小（图 3B）。当热压温度由140 ℃增加到170 ℃时，tanδmax的值由0.22降至0.11，到达tanδmax的温度点从144 ℃延后至200 ℃，此时，对应的储能模量值分别为2 897.00 MPa和4 239.00 MPa。这说明适当的热压温度有助于HDPE大分子活性自由基与硅烷化杨木单板达到充分胶合，显著提高胶接界面层的耐高温破坏能力。
2.4 硅烷化杨木单板/HDPE薄膜的胶合界面形貌
热压温度对硅烷化杨木单板/HDPE薄膜复合材料的胶接界面结构影响较大（图 4和图 5）。在较低的热压温度下（140~150 ℃），HDPE大分子链段运动不活跃，与硅烷化杨木单板间的机械结合力和化学作用力较弱。因此，胶接界面处会存在较大的间隙（图 4B）。胶合界面处存在的间隙直接影响了硅烷化杨木单板/HDPE薄膜复合材料物理力学性能和热稳定性，这与前面的分析是一致的。当热压温度提高到160 ℃时，在硅烷偶联剂A-171和引发剂DCP的共同作用下，硅烷化木材单板与HDPE大分子自由基发生了有效的化学反应，形成了紧密的胶接界面结构，在两相结合处几乎观察不到间隙的存在（图 5B），复合材料的各项性能都显著改善。
图 4 硅烷化杨木单板/HDPE薄膜的胶合界面(热压温度140~150℃) "Figure 4. Bonding interface of silane modified veneer/HDPE film(pressing temperature of 140~150℃)
图 5 硅烷化杨木单板/HDPE薄膜的胶合界面(热压温度 160℃) "Figure 5. Bonding interface of silane modified veneer/HDPE film(pressing temperature of 160℃)3. 结论
适宜的热压温度是硅烷化木材单板与HDPE大分子自由基发生有效化学反应的必要条件，能够促进良好胶接界面结构的形成，进而改善复合材料的各项物理力学性能。热压温度为160 ℃时复合材料的综合性能最佳。
当热压温度从140 ℃增加到160 ℃时，硅烷化杨木单板/HDPE薄膜复合材料的胶合强度、抗弯性能、耐水性能和耐高温破坏能力都显著增强。但继续增加热压温度，会降低胶接界面层上的HDPE大分子及其自由基数量减少，减弱胶合界面处的化学作用力，导致胶合强度和抗弯性能降低。
利用荧光显微镜等手段，进一步分析不同热压温度下HDPE大分子在硅烷化木材单板中的渗透路径和渗透性能，阐明热压温度对复合材料性能的影响机理，将是日后研究的重点。
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图 1 SSR在花椒叶绿体基因组中的分布特点
Figure 1 Distribution of SSRs in the chloroplast genome of Zanthoxylum bungeanum
图 2 16份花椒属种质的UPGMA聚类分析
Figure 2 Cluster diagram for 16 germplasms of Zanthoxylum by UPGMA method
表 1 供试16份花椒属种质资源来源地
Table 1. Origin of 16 germplasms of Zanthoxylum
种质资源名称 拉丁学名 来源地 ‘重庆九叶青’ Z. armatum
‘Chongqingjiuyeqing’重庆市江津区 ‘重庆荣昌无刺’ Z. armatum
‘Chongqingrongchangwuci’重庆市荣昌区 ‘蓬溪青花椒’ Z. armatum ‘Pengxiqinghuajiao’ 四川省遂宁市 ‘汉源葡萄青椒’ Z. armatum
‘Hanyuanputaoqingjiao’四川省雅安市 ‘狗椒’ Z. armatum ‘Goujiao’ 四川省雅安市 ‘汉源大红袍’ Z. bungeanum
‘Hanyuandahongpao’四川省雅安市 ‘油花椒’ Z. bungeanum ‘Youhuajiao’ 贵州省六盘水市 ‘素花椒’ Z. bungeanum ‘Suhuajiao’ 贵州省六盘水市 ‘凤县大红袍’ Z. bungeanum ‘Fengxiandahongpao’ 陕西省宝鸡市 ‘狮子头’ Z. bungeanum ‘Shizitou’ 陕西省韩城市 ‘韩城大红袍’ Z. bungeanum ‘Hanchengdahongpao’ 陕西省韩城市 ‘党村无刺’ Z. bungeanum ‘Dangcunwuci’ 陕西省韩城市 ‘府谷花椒’ Z. bungeanum ‘Fuguhuajiao’ 陕西省榆林市 ‘山东大红袍’ Z. bungeanum ‘Shandongdahongpao’ 山东省临沂市 ‘山西大红袍’ Z. bungeanum ‘Shanxidahongpao’ 山西省永济市 日本花椒 Z. piperitum 日本兵库县 
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表 2 花椒cpSSR的重复类型与次数
Table 2. Repeat types and times of cpSSR in Zanthoxylum bungeanum
重复类型 重复单元 重复数/次 总计/次 3 4 5 6 10~15 ＞15 单核苷酸 A/T 52 8 60 C/G 2 0 2 二核苷酸 AT/TA 4 1 5 三核苷酸 AAC/GTT 5 5 AAG/CTT 22 3 25 AAT/ATT 20 4 1 25 ACC/GGT 2 2 ACT/AGT 2 2 AGC/CTG 4 4 AGG/CCT 2 2 ATC/ATG 5 5 四核苷酸 AAAT 2 1 3 其他类型 4 4
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表 3 多态性SSR引物的基本信息
Table 3. Characterizations of polymorphic SSR primers pairs
引物名称 正向引物（5′→3′） 反向引物（5′→3′） 重复单元 SSR区间位置/
bp片段长度/
bp等位基因数/个 YLT-01 GAAGGGCGTCCATTGTCTAA GAGGAAGCGGAAGCTCTTTT （ATA）3 10 940~10 948 218 2 YLT-17 TGAGACATTCCCAAATCCAA GACCGAAGCTTTTTCGAACT （TA）5…（TA）6 122 229~122 258 177 2 YLT-21 CCGTGTCAACCAATAATCCA ATCCGACTAGTTCCGGGTTC （T）16 1 931~1 946 198 3 YLT-22 CCACAAATGCATTCAGTTCC CAGGCCCGACAGAATAAAAA （A）13 7 436~7 448 177 2 YLT-23 GATTGGTTCGGTTCCAAGAA GGCAATTTGGCGAATAAAAA （A）18 7 924~7 941 215 2 YLT-24 TCGCATTGTAGCGGGTATAG TTTCGAATTGACCCTTGGAT （A）20 9 976~9 995 219 2 YLT-25 CATAGGTCATCGATTCAGCA AAGTCCAGACAAAGCACGGTA （A）15 13 422~13 436 239 2 YLT-26 AACGGAAACGAAGCGATAAA ACGGGAATCCACCAAAAAGT （A）16 28 499~28 514 248 4 YLT-27 ATCTGGGAACGGGGATTAAC CCATCAGAACGGAACGAAAT （T）17 33 511~33 527 157 2 YLT-29 AGCCACTTGTACTGCGAATTT ACGTGCGATTCGATAAAACC （T）11…（A）16 124 632~124 666 207 3
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2019.06.023
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