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树冠外轮廓模型是指以树木树冠任意位置处半径为因变量，以冠幅、冠长、树高或胸径等因子为自变量的函数，用来模拟树冠形状变化规律的数学表达式[1]。树冠外轮廓模型不仅能够估计树冠任意位置处的树冠半径和推导计算整个树冠体积，而且可以驱动林分树木树冠三维可视化模拟。此外，树冠形态与树冠体积对于间接估算树木树冠部分生物量具有重要意义[2]。为了描述树冠外轮廓形态变化规律和推导计算树冠体积，国内外学者常利用以下方法预测树冠相关变量，包括简单几何形状模拟、经验模型方法、树冠轮廓模型积分法、激光扫描方法等。早期学者们利用规则几何体描述树冠外轮廓二维形状，常采用如下公式定义树冠形状：RCR=（1-RDH）k，其中：RCR表示相对树冠半径，RCH为从树冠基部到任意位置处树冠长度与最大树冠长度的比，k的取值决定了其几何形状，当k为0、0.5、1.0、1.5时分别表示圆柱形、抛物线形、圆锥形或凹面形等，该模型被广泛应用于道格拉斯杉Pseudotsuga douglasii[3]、西部铁杉Tsuga heterophylla[4]、火炬松Pinus taeda[5]、华北落叶松Larix principis-rupprechtii[6]等树冠形状模拟和体积计算研究中。PRETZSCH等[7]、SADONO[8]将树冠分为“阳冠”“阴冠”两部分，分别采用抛物线体和圆锥体表示。由于树冠形状并不是简单规则形式，不同树种树冠形状并不相同，树冠体积大小与冠幅、冠长、胸径、树高等林木因子之间存在相关关系，研究者针对不同树种利用经验模型方法构建幂函数、指数函数等多种形式树冠体积模型，如楠木Phoebe zhennan[9]、樟子松Pinus sylvestris var. mongolica[10]、杉木Cunninghamia lanceolata[11]、长白落叶松Larix olgensis[12]、欧洲赤松Pinus sylvestris和云杉Picea asperata[13]、黑荆树Acacia mearnsii[14]，也有研究者通过构建枝条长度、角度、半径等枝条属性经验方程间接预测树冠半径和模拟树冠形态变化规律，如李凤日[15]、LI等[16]、GILMORE等[17]、姜立春等[18]，但是存在树冠枝条测量困难且误差较大问题。三维激光扫描等技术的发展，不仅提供了快速数据获取方式，而且能够更加准确获取树冠数据[19-21]，但由于数据获取成本高、处理困难、数据量大等限制了它的使用。除了以上方法，为了更加准确预测树冠体积，一些学者利用多项式[22]、幂函数[23]、修正Beta曲线[24]、连续分段函数[25]等曲线形式描述树冠外轮廓形态，并将树冠曲线围绕树干轴旋转得到的旋转体，通过对旋转体积分推导计算树冠体积[26-28]。该方法只需要简单林木因子就能够准确模拟树冠形态与树冠体积。目前，树冠外轮廓模型积分法计算体积研究，一般将树冠外轮廓与树冠体积模型单独进行研究，分别拟合不同模型方程得到2套模型参数；由于外轮廓与体积方程之间存在内在相关性，采用传统最小二乘方法分别求解模型参数，不能保证2个模型误差同时最小，无法满足模型参数估计的渐进无偏性、有效性和一致性。通过对树冠轮廓模型积分推导得到树冠体积方程，将2个方程联立构建一致性方程组，能够有效解决以上模型参数估计存在的问题。目前一致性方程组的研究主要集中在树干削度与材积一致性方程组研究方面[29-30]，关于利用树冠外轮廓与树冠体积一致性模型方面研究还未见报道。本研究以福建地区杉木人工林为研究对象，采用似乎不相关回归方法，构建以最大树冠半径与相对冠长为自变量的树冠外轮廓和树冠体积一致性方程组模型，研究构建的模型能够用于驱动树木树冠三维可视化模拟，直观地反映不同生长条件下树冠生长活力及林木个体间树冠重叠程度，指导林分抚育间伐活动，同时为通过树冠体积间接推算树冠生物量提供新思路。
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福建省位于中国东南沿海地区（23°33′~28°20′N，115°50′~120°40′E），地势东南低西北高，地形多丘陵少平原，不同区域气候相差较大，其中东南沿海属南亚热带气候，东北与西北区域属中亚热带气候，年平均气温为15.0~22.0 ℃，年平均降水量为1 400~2 000 mm，土壤类型主要包括红土壤、黄土壤、山地草甸土壤，主要用材树种有杉木、马尾松Pinus massoniana、巨尾桉Eucalyptus grandis × E. urophylla等。杉木为杉科Taxodiaceae乔木，幼树树冠尖塔形，大树树冠圆锥形，为中国长江流域、秦岭以南地区栽培最广、生长快、经济价值高的用材树种。
研究数据来自于福建省顺昌县大历和岚下林场布设的杉木人工纯林临时样地，选择不同龄组、林分密度和立地条件类型设置标准样地，共设置98块30 m × 20 m的样地，每个标准地内选择3~5株树木，共413株杉木。测量每株树木胸径（D）、树高（H）、冠幅（CW）、最大冠长（LCL）、枝下高（HCB），树冠长度（CHi）以及相应树冠半径（CRi），其中：i（i=0.10、0.25、0.50、0.75、0.90）表示从树冠基部到树梢顶端的相对位置。树冠因子测量如图 1所示，该装置由透明绘图板、三脚架以及照准装置组成，具体使用方法如下：①根据相似三角形原理，在距离所测树冠一定距离位置处（通常距离1倍树高），将该绘图板固定在三脚架之上保持板面垂直于地面，然后通过透明板观察树冠，往后移动三脚架，保持透明板与地面垂直，直到通过透明板能够观察到整个树冠。②用笔将树冠外轮廓绘制在透明板之上，首先绘制树冠枝下高位置处的点A、树冠顶端的点B以及最大树冠位置处的点C与点D，然后从A点开始到B、C点，将树冠轮廓绘制出来。并将透明板上的树冠轮廓草图复制到有计算网格方格的透明硫酸纸上。③利用测高仪器和皮尺分别测量该树冠的冠长L（LCL=A′B′）和冠幅（CW=E′F′），计算树冠冠长测量值A′B′与绘图纸上AB之间比值以及树冠冠幅测量值E′F′与CD之间比值，根据这2个比值在绘图纸上分别计算树冠冠长0.10、0.25、0.50、0.75、0.90位置处对应的树冠长度和半径值。为了尽可能减少树冠测量误差，应从多个方向观察树冠，取测量均值。通过以上调查方法收集到杉木树冠调查数据情况如表 1所示。
图 1 杉木树冠测量因子示意图
Figure 1. Schematic diagram of crown measurement factors of C. lanceolata
表 1 树冠调查数据的基本概况
Table 1. Summary statistics of measurements of tree variables
项目 t/a N/（株·hm-2） D/cm H/cm CW/m LCR/m LCL/m HCB/m CR/m 平均值 16.00 1 850.00 16.36 12.60 3.50 1.75 6.00 6.40 1.10 最小值 5.00 900.00 5.90 3.00 1.60 0.80 1.10 0.30 0.10 最大值 29.00 4 000.00 33.20 25.50 7.60 3.80 10.30 16.30 3.80 标准差 7.25 60.39 5.52 3.91 1.05 0.53 2.65 3.17 0.56 说明：t为年龄；N为株数密度 -
本研究收集整理了国内外文献研究中常用于描述树冠外轮廓形状的模型方程，具体形式如模型1、模型2、模型3以及模型4所示。其中：模型1被广泛用于模拟多个树种树冠形态[3]，该模型是否可用于杉木树冠模拟需要进一步验证，其他3个模型常用于模拟杉木树冠[23]。本研究将这4个可积分模型方程作为联立方程组中树冠外轮廓模型的备选模型。模型因变量为任意位置处树冠半径（CR），模型自变量为相对树冠冠长（RCH）、最大树冠半径（LCR）。
$$ C_{\mathrm{R}}=L_{\mathrm{CR}}\left(1-R_{\mathrm{CH}}\right)^{a_{0}}； $$ (1) $$ C_{\mathrm{R}}=L_{\mathrm{CR}}\left[a_{0}\left(\frac{R_{\mathrm{CH}}-1}{R_{\mathrm{CH}}+1}\right)+a_{1}\left(R_{\mathrm{CH}}-1\right)\right]； $$ (2) $$ C_{\mathrm{R}}=L_{\mathrm{CR}}\left(a_{0}+a_{1} R_{\mathrm{CH}}+a_{2} R_{\mathrm{CH}}^{2}\right)； $$ (3) $$ C_{\mathrm{R}}=L_{\mathrm{CR}}\left(a_{0}+a_{1} R_{\mathrm{CH}}^{a_{2}}\right)。 $$ (4) 采用积分法计算树冠体积，从树冠基部到树木顶端积分树冠外轮廓模型，得到$V_{\mathrm{c}}=\int_{0}^{L_{a}} {\rm{ \mathsf{ π} }} C_{\mathrm{R}}^{2} \mathrm{d} C_{\mathrm{H}}$体积方程，其中：VC为树冠体积，LCL最大树冠长度，CH为从树冠基部到树冠任意位置处树冠长度，推导得出树冠体积模型方程。
$$ V_{\mathrm{C}}=\frac{{\rm{ \mathsf{ π} }}}{2 a_{0}+1} L_{\mathrm{CR}}^{2} L_{\mathrm{CL}}； $$ (5) $$ V_{\mathrm{C}}={\rm{ \mathsf{ π} }} L_{\mathrm{CR}}^{2} L_{\mathrm{CL}}\left[\left(8 a_{0} a_{1}-4 a_{0}^{2}\right) \ln (2)+3 a_{0}^{2}-5 a_{0} a_{1}+\frac{1}{3} a_{1}^{2}\right]； $$ (6) $$ V_{\mathrm{C}}={\rm{ \mathsf{ π} }} L_{\mathrm{CR}}^{2} L_{\mathrm{CL}}\left(a_{0}^{2}+a_{0} a_{1}+\frac{1}{3} a_{1}^{2}+\frac{2}{3} a_{0} a_{2}+\frac{1}{2} a_{1} a_{2}+\frac{1}{5} a_{2}^{2}\right)； $$ (7) $$ V_{\mathrm{C}}={\rm{ \mathsf{ π} }} L_{\mathrm{CR}}^{2} L_{\mathrm{CL}}\left(a_{0}^{2}+\frac{2 a_{0} a_{1}}{a_{2}+1}+\frac{a_{1}^{2}}{2 a_{2}+1}\right)。 $$ (8) 式（5）~（8）中：RCH为相对冠长（RCH=CH/LCL，树冠基部为0，树冠顶部为1）；a0、a1、a2为模型系数。
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假设定义如下非线性模型联立方程组，存在一组随机变量Y1，…，Yn与自变量x1，…，xn之间满足非线性关系，如下：
$$ \begin{array} [c]{c} Y_{1}=f_{1}\left(x_{1}, \beta_{1}\right)+\varepsilon_{1}；\\ Y_{2}=f_{2}\left(x_{2}, \beta_{2}\right)+\varepsilon_{2};\\ … \;…\\ Y_{n}=f_{n}\left(x_{n}, \beta_{n}\right)+\varepsilon_n 。 \end{array} $$ 其中：n个模型的同一次观测模型误差εi的各分量间是相关的，即cov（εi）是非对角矩阵[17]。这里多个方程之间存在联系，各方程的扰动项之间存在相关性，同时估计多个方程能够提高模型估计效率。
将树冠外轮廓模型和树冠体积模型两两联立为方程组，即2.1中式（1）与式（5）、式（2）与式（6）、式（3）与式（7）、式（4）与式（8）共4个方程组。每组的2个方程拥有同一套参数，对2个模型共同进行拟合，即解决非线性联立方程组模型的参数估计问题。
为了保证参数估计的一致性和渐进无偏性，利用SAS统计软件proc model程序提供的似乎不相关回归法（SUR），选择SUR法同时拟合树冠外轮廓与体积相容性模型。此外，在林业模型拟合过程中，模型误差项之间可能存在异方差的问题，本研究采用模型回归函数自身作为权函数消除异方差[13]。
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模型拟合和检验结果通过以下指标评价：决定系数（R2）、均方根误差（RMSE）和平均绝对误差（MAE）、平均偏差（MD）。最优模型选择根据R2最大，RMSE、MAE、MD绝对值最小的原则进行。具体公式如下：
$$ R^{2}=1-\frac{\sum\limits_{i=1}^{m}\left(y_{i}-\hat{y}_{i}\right)^{2}}{\sum\limits_{i=1}^{m}\left(y_{i}-\bar{y}_{i}\right)^{2}}；\\ R_{\mathrm{MSE}}=\sqrt{\frac{\sum\limits_{i=1}^{n}\left(y_{i}-\hat{y}_{i}\right)^{2}}{n-1}}；\\ M_{\mathrm{AE}}=\frac{1}{n} \sum\limits_{i=1}^{n}\left|y_{i}-\hat{y}_{i}\right|；\\ M_{\mathrm{D}}=\frac{\sum\limits_{i=1}^{n}\left(y_{i}-\hat{y}_{i}\right)}{n}。 $$ 其中：yi为第i因变量实际值，$\hat y_i$为第i因变量预测值，yi为因变量实际值平均，n为样本数。
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树冠体积数据可采用分层切割法处理得到。本研究在对杉木树冠进行调查时，采用平均断面积求积法，将树冠从树梢到树冠基部按照相对冠长分6部分（0~0.10，0.10~0.25，0.25~0.50，0.50~0.75，0.75~0.90，0.90~1.00）。将树冠最上部分看作圆锥体近似计算体积，其他各部分采用平均断面积法。计算公式如下：
$$ V_{\mathrm{e}}=V_{1}+V_{2}+\cdots+V_{n}=g_{1} l_{1}+g_{2} l_{2}+\cdots+g_{n} l_{n}+\frac{1}{3} g^{\prime} l^{\prime}=\sum\limits_{i=1}^{n} g_{i} l_{i}+\frac{1}{3} g^{\prime} l^{\prime}。 $$ 其中：Vc表示整个树冠体积（m3）；Vi为第i部分树冠体积（m3）；gi为第i区分段中央断面积（m2）；li为第i分段长度（m）；g′为梢头底端断面积（m2）；l′为梢头树冠长度（m）；n为分段个数。
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利用SAS软件的proc model模块中似乎不相关回归过程SUR方法对树冠外轮廓模型和树冠体积预测模型的一致性方程组同时进行拟合，表 2给出了不同模型拟合的统计量，即决定系数（R2）、均方根误差（RMSE）。
表 2 树冠外轮廓-体积模型拟合结果
Table 2. Fitting results of crown profile and crown volume models
模型 参数 R2 RMSE a0 a1 a2 CR VC CR VC 模型1 0.661 4（0.006 8）* 0.802 5 0.858 1 0.260 3 8.605 4 模型2 1.975 3（0.054 7）* －2.703 0（0.044 4）* 0.808 2 0.860 9 0.256 6 8.518 9 模型3 0.827 9（0.009 1）* 0.138 1（0.138 1）* －0.870 5（0.043 5）* 0.829 2 0.861 0 0.242 1 8.517 6 模型4 0.835 5（0.005 5）* －0.748 7（0.010 0）* 2.277 1（0.078 1）* 0.829 5 0.861 0 0.241 9 8.517 4 说明：a0、a1、a2为模型系数，参数拟合结果数值表示估计值（标准差）；*表示P＜0.000 1 由表 2拟合结果可知：树冠外轮廓模型拟合指标R2的对比结果为模型4＞模型3＞模型2＞模型1，轮廓模型拟合指标RMSE的对比结果为模型4＜模型3＜模型2＜模型1，树冠体积模型拟合指标R2的对比结果为模型4=模型3＞模型2＞模型1，体积模型拟合指标RMSE结果为模型4＜模型3＜模型2＜模型1。根据R2最大且RMSE相对较小的最优模型选择标准，不管从树冠外轮廓还是体积模型结果来看，模型4显示了较好的拟合结果，最终利用模型4来描述福建地区杉木树冠外轮廓和树冠体积。
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建模数据只能反映模型拟合的好坏，不能反映模型的预测性能。模型系统的独立性检验是采用建模时未使用的独立样本数据，对各模型系统的预测性能进行综合评价。基于表 3的参数估计值和检验数据，利用SAS软件计算各模型系统树冠外轮廓和体积的绝对误差、均方根误差。从表 3可以看出：各树冠外轮廓模型的检验指标R2对比结果为模型4＞模型3＞模型2＞模型1，外轮廓模型RMSE对比结果为模型4＜模型3＜模型2＜模型1，各树冠体积模型检验指标R2对比结果为模型3=模型4＞模型2＞模型1，体积模型RMSE对比结果为模型4＜模型3＜模型2＜模型1，不管是从R2还是RMSE来看，模型4均优于其他模型。此外，模型4的检验指标MAE和MD绝对值最小，真实值与预测值之间误差最小，进一步验证了模型4作为杉木树冠外轮廓-体积模型的合理性。
表 3 不同模型独立性检验
Table 3. Validation results of different crown models
模型 树冠外轮廓模型 体积模型 MAE MD R2 RMSE MAE MD R2 RMSE 模型1 0.170 9 -0.027 3 0.760 1 0.277 6 5.258 3 -0.842 7 0.853 1 8.306 9 模型2 0.197 0 0.026 3 0.781 5 0.264 9 5.156 0 0.337 4 0.855 8 8.232 2 模型3 0.177 8 -0.011 3 0.803 3 0.251 3 5.161 4 0.007 4 0.856 0 8.226 2 模型4 0.177 4 -0.010 2 0.803 9 0.250 9 5.161 2 -0.000 4 0.856 0 8.226 1 -
模型拟合的总体评价反映了总体树冠外轮廓和体积的变化，不能反映各模型是否存在异方差性和无偏性，评价这2个指标最直观的方法就是利用残差分布图。为全面评价模型4效果，分别绘制模型4加权前后的残差分布图。图 2为未增加权函数时相容模型的残差图，左侧为树冠外轮廓模型残差分布，右侧为树冠体积模型残差分布，从图 2可以看出：残差均存在明显喇叭口形状，说明异方差问题显著。图 3为增加权函数后相容模型残差分布图，从图 3可以看出：加权后模型的残差散点图分布变得均匀，说明权函数明显消除了异方差。进一步说明加权后模型4显示了较高的等方差性和无偏性，效果较好。
图 2 未加权的SUR方法拟合的相容模型残差分布图
Figure 2. Residual distribution of models fitted by unweighted SUR method
图 3 加权的SUR方法拟合的相容模型残差分布图
Figure 3. Residual distribution of models fitted by weighted SUR method
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在树冠模型研究方面，许多学者利用规则几何体模拟树冠形状并计算树冠体积，这类方法具有简单方便特点，但是不灵活且预测精度相对较低。本研究以福建杉木为研究对象，选择4种常用的树冠外轮廓经验模型模拟树冠形状曲线，与简单几何体模拟方法相比，能够更加准确合理地描述树冠形状的变化，而且方程形式更加灵活。
本研究通过树冠外轮廓模型方程推导树冠体积方程，构建一致性的相容的非线性树冠外轮廓-体积联立方程组模型，利用SAS软件模块中的似乎不相关回归过程（SUR）解决复杂分段联立方程组模型系统的参数同时估计，确保了2个方程参数估计的一致性，模型预测效果较好。本研究构建的树冠外轮廓-体积一致性模型方程，可以预测树冠外轮廓形态，驱动林分树木三维可视化并预估树冠体积，实现了树冠外轮廓与体积模型之间互相推导，同时也为进一步估测树木地上部分生物量提供了理论依据。
Crown profile and volume compatibility model of Cunninghamia lanceolata in Fujian Province
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摘要:
目的 树冠外轮廓模型不仅能够描述任意位置处树冠半径，而且能够推导预测树冠体积与树木地上部分生物量。根据福建地区98块杉木Cunninghamia lanceolata人工林样地的413株杉木调查数据，构建了具有同一套模型参数的树冠外轮廓模型和树冠体积预测联立方程组系统。 方法 选取4种常用的可积分树冠外轮廓备选模型，利用积分法对备选模型进行推导，得到树冠体积预测模型；将模型方程分别两两联立建立树冠外轮廓与体积相容性联立方程组，并利用SAS软件模块中的似乎不相关回归过程估计联立方程组模型系统的参数。为了消除模型异方差，采用加权回归方法拟合模型，并对不同模型系统的拟合精度、预测精度进行对比分析。 结果 基于模型4的联立方程组拟合精度高、预测性能好，其树冠外轮廓和体积拟合精度分别达到0.829 5和0.861 0，预测结果精度分别为0.803 9和0.856 0；通过似乎不相关回归法解决了联立方程组共线性问题，加权回归方法一定程度上消除了模型中存在的异方差性。 结论 所构建的树冠外轮廓-体积一致性模型方程实现了树冠外轮廓与体积模型之间互相推导，为进一步估测树木地上部分生物量提供了理论依据。 Abstract:Objective Crown profile models can not only describe the radius at any position of the crown, but also predict the crown volume and the aboveground biomass. This paper developed a simultaneous equation system of crown profile model and crown volume prediction with the same set of model parameters using the data of 413 trees in 98 sample plots of Cunninghamia lanceolata plantation in Fujian Province. Method Four commonly used and integral crown profile models were selected, and the crown volume prediction models were derived by using integral method. The model equations were set up in pairs to establish the simultaneous equations of tree crown profile and volume compatibility, and the seemingly unrelated regression (SUR) process in SAS software module was used to estimate the parameters of the simultaneous equations model system. In order to eliminate the heteroscedasticity of the model, the weighted regression method was used to fit the model. The fitting accuracy and prediction accuracy of different model systems were compared and analyzed. Result The simultaneous equations based on model 4 had high fitting accuracy and good prediction performance. The fitting accuracy of the crown profile model and crown volume model reached 0.829 5 and 0.861 0 respectively, and the accuracy of prediction was 0.803 9 and 0.856 0 respectively. The collinearity problem of simultaneous equations was solved by the SUR method, and the heteroscedasticity in the model was eliminated to some extent by the weighted regression method. Conclusion The consistency model equation of crown profile-volume constructed in this paper can be used to derive the crown profile and volume model, which provides a theoretical basis for estimating the biomass of the aboveground part of trees. -
桑Morus是一种重要的木本植物，具有28条染色体[1]，不仅可以作为家蚕的重要食物，还具有一定的经济、药用及生态价值。但是桑葚在成熟的过程中易脱落，使得桑葚变软变黑，影响其产业价值，因此，如何采用有效的手段对桑葚脱落进行调控十分重要。
果实脱落是植物正常发育过程中的一种常见现象，但是，在一定程度上会限制果树的产量。果实脱落主要受环境因素、酶、生理代谢共同调控[2]，其中，环境因素主要包括生物胁迫(如病虫害[3])和非生物胁迫(温度胁迫[4]、水分胁迫[5]、光胁迫[6]等)；生理代谢则包括一些激素代谢(如脱落酸[7]、乙烯[8]等植物激素)和糖代谢[9]；由于纤维素和果胶是植物细胞壁的主要组成成分，因此纤维素酶、果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶[10]等与果实脱落相关[11]。
目前，桑葚脱落的分子机制还未见报道。本研究以白桑Morus alba为供试材料，对其进行转录组测序分析，探究桑葚在脱落过程中的生化成分代谢的分子机制，旨在为进一步了解桑葚果实脱落的分子机制提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
2021年4月在西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室桑树资源种质基地，选取无病害、健康状况较好的白桑幼果果柄。以落果果柄 (YD) 为实验组，取6个果柄为1份，设3个生物学重复，标记为YD1、YD2、YD3。正常果果柄 (YN) 为对照组，同样取6个果柄为1份，设3个生物学重复，标记为YN1、YN2、YN3。取材后立即在液氮中速冻并储存于−80 ℃冰箱保存。
1.2 冷冻切片的制作
将正常果和脱落果果柄组织清洗后用质量分数为4%的多聚甲醛过夜固定，用包埋剂包埋材料。待包埋剂彻底凝固后进行冷冻切片。切片厚度为5 μm，将切片后的材料吸附于阳离子载玻片上，室温干燥30 min后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤样品，去除包埋剂后置于显微镜下观察。
1.3 RNA提取
采用TRIzol法提取落果果柄和正常果果柄的总RNA，用分光光度计检测RNA样品的浓度和纯度，以保证是否可以进行下一步测序分析。
1.4 转录组测序与分析
样品由华大基因进行测序及分析，利用华大智造测序平台BGISEQ测序，所得的原始数据为raw reads。过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，过滤后的数据称为clean reads。将clean reads比对到参考基因组上，再进行后续分析。
1.5 测序原始数据的公开
将测序所得原始数据提交到美国国家生物技术信息中心(NCBI)的SRA数据库中，检索号为: PRJNA811258。
1.6 差异表达基因的筛选和富集分析
使用DEseq2方法检测样品之间的差异表达基因(DEG)[12]。根据基因本体论数据库(GO)和京都基因与基金组百科全书(KEGG)注释结果以及官方分类，将差异基因进行功能分类，同时使用R软件中的phyper函数进行富集分析。详细说明见Wiki网站
https://en.wikipedia.org/wiki/Hypergeometric_distribution 。校正后的P≤0.05为显著富集。1.7 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)验证
将桑葚幼果的落果果柄与正常果果柄RNA用PrimesciptTM RT reagent kit with gDNA Eraser (Takara)反转录，在primer premier 5.0软件设计定量引物(表1)，内参基因为 Actin，利用NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus(novoprotein) 试剂盒进行荧光定量PCR。反应程序为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。用2−ΔΔCt算法处理数据，利用GraphPad Prism 8.0.2软件作图。
表 1 转录组数据RT-qPCR验证引物序列Table 1 Primer sequences used in RT-qPCR validation of transcriptome data基因ID 基因名 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) XM_010096892.1 GH3.6 ACACTAACTACACCAGCCCAAA ACTTAATAGCACGAATGAACCC XM_010102492.2 bHLH78 TATTACCTTCGTCGTCCCCTCCTA ACCACTCTTTTCGTTTCCTTCACC XM_010113436.1 SAUR15 TGAAGAAGCCGAGAAGGAGTA GGTGGTAGGAGAAGGGATAAC XM_024169608.1 PHO1 GCCAATAACGACAGGAAA AACAACCCGTGAACAAAC 2. 结果与分析
2.1 果柄离区切片观察
桑果是带果柄脱落，为了研究桑树正常果柄和脱落果柄的差异，对其进行冷冻切片并观察显微结构。从图1可知：正常幼果果柄与枝干相连的区域内细胞规则，形态一致，而脱落幼果果柄与枝干相连处细胞小且致密。
图 1 落果与正常果果柄纵切面显微结构图Figure 1 Longitudinal section microscopic structures of abscised and normal surviving young fruit peduncles2.2 转录组测序结果质量分析
基于BGISEQ对桑葚幼果的落果与正常果果柄离区进行转录组测序，6个样品获得262.92 Mb的原始序列。原始测序数据经一系列质量控制后，每个样本获得超过6.3 Gb的高质量纯净测序数据量，每项碱基质量大于20的碱基数量占总碱基数量的比例 (Q20) 均大于96%，每项碱基质量大于30 的碱基数量占总碱基数量的比例 (Q30) 均大于91%。将每个样本的高质量纯净序列与测序并组装的桑树基因组序列进行比对，比对率均高于59%(表2)，表明本研究转录组测序数据质量较高，可用于后续的分析。
表 2 测序数据统计Table 2 Statistics of sequencing data样本
名称原始序列
数/Mb纯净序列
数/Mb纯净碱基
数/GbQ20/% Q30/% YD1 43.82 42.48 6.37 96.50 91.31 YD2 43.82 42.74 6.41 96.53 91.34 YD3 43.82 42.58 6.39 96.53 91.39 YN1 43.82 42.61 6.39 96.46 91.19 YN2 43.82 42.58 6.39 96.55 91.38 YN3 43.82 42.65 6.40 96.55 91.39 2.3 落果与正常果果柄的差异表达基因
用每2个样品之间的Pearson相关系数以反映样本间基因表达的相关性(图2)。结果发现：Pearson相关系数为0.69~1.00，说明各样本间重复性和相关性较好。
图 2 落果与正常果果柄的相关性热图Figure 2 Correlation heatmap of abscised and normal surviving young fruit peduncles在桑葚幼果果柄组织中，共鉴定到25 293个基因(图3A)。其中，共表达的基因有23 203个，占91.7%。正常果果柄特有基因为1 164个，占4.6%，落果果柄组特有基因为926个，占3.7%。由此可见，落果果柄基因较正常果果柄基因少。根据差异筛选标准，在2组中共筛选到10 481个差异表达基因(图3B)，其中，5 239个差异表达基因上调表达，5 242个差异表达基因下调表达。
图 3 落果与正常果果柄的表达基因和差异表达基因Figure 3 Expressed genes and differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles2.4 差异表达基因的GO富集分析
本研究对差异表达基因进行GO功能富集分析，共发现37个显著性GO条目。生物过程共富集到7 064个基因，显著富集到19个条目，涉及生物调节、细胞过程、代谢过程、对刺激的反应等，其中富集到生物过程中最多的差异表达基因为细胞过程和代谢过程基因；细胞组分共富集到6 857个基因，显著富集到6个条目，涉及细胞解剖实体、细胞内、其他有机部分、含蛋白质复合物、病毒粒子等，富集到细胞组分最多的差异表达基因为细胞解剖实体和细胞内基因；分子功能共富集到9 842个基因，显著富集到12个条目，涉及催化活性、转运蛋白活性、转录调节活性、分子功能调节剂等，富集到分子功能最多的差异表达基因为催化活性和结合基因(图4)。
图 4 落果与正常果果柄的差异表达基因GO分类柱状图Figure 4 Histogram of GO classification of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit pedunclesGO富集分析结果显示：大多数差异基因集中在催化活性、膜的组成成分、氧化还原酶活性、膜的内在成分，分别为4 623、2 774、777、1 781个基因(图5)。其中，具催化活性的基因最多，说明在桑葚的落果过程中可能有很多重要的酶参与，从而发生一系列的催化反应。
图 5 落果与正常果果柄的差异表达基因GO富集气泡图Figure 5 GO enrichment bubble chart of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles2.5 差异表达基因的KEGG代谢通路富集分析
在本研究中，细胞过程富集的基因为380个，富集到1个条目，为运输和分解代谢；环境信息处理共富集到653个基因，富集到2个条目，为膜运输和信号转导；遗传信息处理共富集到1 558个基因，包含4个条目，为折叠分类和降解、复制和修复、转录、翻译；代谢通路富集到5 315个基因，包含11个条目，为氨基酸代谢、其他次生代谢物的生物合成、碳水化合物代谢、能量代谢等；有机系统共富集到427个基因，含1个条目(图6)。分析发现：代谢通路富集的基因最多，说明桑葚在脱落过程中代谢反应尤为明显。
图 6 落果与正常果果柄的差异表达基因KEGG分类柱状图Figure 6 Histogram of KEGG classification of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit pedunclesKEGG通路富集分析结果显示：大多数差异表达基因集中在MAPK信号通路、黄酮类生物合成、柠檬酸循环、植物激素信号转导、氨基酸的生物合成通路，分别含293、102、55、318、251个基因(图7)。其中，植物激素信号转导途径的差异表达基因数量最多，说明在桑葚果实脱落过程中植物激素起到了十分重要的作用。
图 7 落果与正常果果柄的差异表达基因的KEGG富集气泡图Figure 7 KEGG enrichment bubble diagram of differentially expressed genes of abscised and normal surviving young fruit peduncles在桑树的代谢通路中，植物激素信号转导途径的差异表达基因数量最多，为318个基因，其中，落果果柄中有51.9% (156个)的差异表达基因的表达量高于正常果果柄(图8A)；在黄酮类生物合成途径中，有102个差异基因富集，其中有73.5% (75个)的差异基因在落果果柄中表达量高(图8B)；在氨基酸生物合成通路中，共有251个差异表达基因富集，其中有59.8% (150个)的差异表达基因在落果果柄中表达量更高(图8C)；在柠檬酸循环中，有55个差异表达基因富集，其中有74.5% (41个)的差异表达基因在落果果柄中表达量更高(图8D)。不难发现，落果果柄有超过一半的差异表达基因表达量高于正常果果柄。说明植物激素、黄酮类等次生代谢物以及柠檬酸等物质在桑葚脱落过程中发挥了重要的作用。
图 8 落果与正常果果柄的代谢途径的差异表达基因热图Figure 8 Heat map of differentially expressed genes in metabolic pathways of abscised and normal surviving carpopodium2.6 转录组测序数据的RT-qPCR验证
由于植物激素对于落花落果以及保花保果都具有十分重要的作用，于是在植物激素信号转导途径中筛选4个差异十分显著的基因，分别为GH3.6 (XM_010096892.1)、bHLH78 (XM_010102492.2)、SAUR15 (XM_010113436.1)、PHO1 (XM_024169608.1)。将这4个基因的每千个碱基转录每百万映射读取的碎片值(FPKM)绘制直方图，GH3.6在落果组中的表达水平是正常果组的20多倍，bHLH78在落果组中的表达水平约为正常果组20倍，PHO1(磷转运蛋白)在落果组中的表达水平是正常果组的30多倍，SAUR15在落果组中的表达水平是正常果组的100多倍(图9A)。由此推测，这4个基因均参与了桑葚的果实脱落。为了验证转录组数据的准确性，对这4个基因进行RT-qPCR验证，结果发现：4个差异表达基因的荧光定量相对表达量的变化趋势与转录组表达趋势一致，说明该转录组数据可靠(图9B)。
图 9 4个差异表达基因的RT-qPCR验证Figure 9 RT-qPCR validation of four differentially expressed genes3. 讨论
近年来，为了提高果树产量，越来越多果实脱落的相关研究被报道，如番茄Lycopersicon esculentum[13]、荔枝Litchi chinensis[14]、扁桃Amygdalus communis[15]等。桑树作为一种具有重要经济价值的植物，其生理落果引起学者们的关注。2021年，有研究者对不同种类的长果桑Morus macroura的生理落果进行研究，发现高浓度的脱落酸(ABA)和乙烯(ETH)能够促进落果，而高浓度的赤霉素(GA3)和生长素(IAA)抑制落果[16]。但是，关于桑树果实脱落的分子机制还尚不清楚。
植物激素是植物生长发育过程中十分重要的物质，参与植物的落花落果，与落花落果常见的相关植物激素有IAA、GA3、细胞分裂素、ETH、ABA[17]。
IAA主要是促进植物的生长发育，抑制果实的脱落，如果生长素在运输途径中受到阻碍则会导致植物果实的脱落[18−19]。GH3.6是吲哚乙酸酰胺合成酶的基因，能够催化IAA氨基化，使生长素失活[20]，这与本研究的结论一致。Small auxin-up RNA (SAUR) 基因是一类生长素早期响应基因，SAUR15能够调控植物的生长发育并参与环境胁迫响应[21]。在本研究中，SAUR15的表达水平在落果组高于正常果组100多倍，说明SAUR15基因可能参与桑葚果实脱落；ABA主要是促进果实脱落[7]，这是由于ABA能够增加纤维素酶的活性进而促进果实脱落[22]。有学者通过研究无核荔枝ABA合成关键酶LcNCED与生理落果的关系，验证了ABA对于落果的作用[14]；GA主要是通过作用于IAA影响果实脱落[23]；ETH主要促进果实的成熟、衰老、脱落，这在多种植物中被报道，如番茄[13]等；细胞分裂素能够促进坐果，延迟果实的脱落[24]。
此外，在对落果的研究中还发现了大量的基因和转录因子的调控，如JOINTLESS[25]、LATERAL SUPPRESSOR(LS)[26]、MACROCALYX[27]主要调控离区的形成，MYB[28]、WRKY[29]、bHLH[30]、bZIP[31]等转录因子能参与植物的器官脱落。bHLH78属于bHLH转录因子，参与植物生长和代谢[32]，调节花青素的生物合成[33]。本研究中，bHLH78的表达水平在落果组较高，说明其可能参与桑葚的脱落。此外，还有一些重要的酶及蛋白调控植物的器官脱落，如纤维素酶、果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、扩展蛋白等[34]。在本研究中，磷转运蛋白(PHO1)在落果果柄组的表达水平是正常果柄组的30多倍。此前研究表明：ABA调控依赖于PHO1的表达[35]，说明PHO1基因可能参与桑葚的脱落。
4. 结论
本研究GO富集分析结果显示：有4 623个基因具有催化活性，说明在果实脱落过程中，有多种重要的酶发挥催化效应；KEGG通路富集分析结果显示：大多数差异表达基因集中在黄酮类生物合成、柠檬酸循环、植物激素信号转导、氨基酸的生物合成等通路中，说明在果实脱落过程中，植物激素、糖类、次生代谢物质等发挥了重要的作用，从而调控果实的脱落。本研究筛选了4个显著的差异表达基因，均在桑葚脱落过程中参与反应，可为今后进一步研究桑树的果实脱落提供参考。
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图 1 杉木树冠测量因子示意图
Figure 1 Schematic diagram of crown measurement factors of C. lanceolata
图 2 未加权的SUR方法拟合的相容模型残差分布图
Figure 2 Residual distribution of models fitted by unweighted SUR method
图 3 加权的SUR方法拟合的相容模型残差分布图
Figure 3 Residual distribution of models fitted by weighted SUR method
表 1 树冠调查数据的基本概况
Table 1. Summary statistics of measurements of tree variables
项目 t/a N/（株·hm-2） D/cm H/cm CW/m LCR/m LCL/m HCB/m CR/m 平均值 16.00 1 850.00 16.36 12.60 3.50 1.75 6.00 6.40 1.10 最小值 5.00 900.00 5.90 3.00 1.60 0.80 1.10 0.30 0.10 最大值 29.00 4 000.00 33.20 25.50 7.60 3.80 10.30 16.30 3.80 标准差 7.25 60.39 5.52 3.91 1.05 0.53 2.65 3.17 0.56 说明：t为年龄；N为株数密度 
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表 2 树冠外轮廓-体积模型拟合结果
Table 2. Fitting results of crown profile and crown volume models
模型 参数 R2 RMSE a0 a1 a2 CR VC CR VC 模型1 0.661 4（0.006 8）* 0.802 5 0.858 1 0.260 3 8.605 4 模型2 1.975 3（0.054 7）* －2.703 0（0.044 4）* 0.808 2 0.860 9 0.256 6 8.518 9 模型3 0.827 9（0.009 1）* 0.138 1（0.138 1）* －0.870 5（0.043 5）* 0.829 2 0.861 0 0.242 1 8.517 6 模型4 0.835 5（0.005 5）* －0.748 7（0.010 0）* 2.277 1（0.078 1）* 0.829 5 0.861 0 0.241 9 8.517 4 说明：a0、a1、a2为模型系数，参数拟合结果数值表示估计值（标准差）；*表示P＜0.000 1
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表 3 不同模型独立性检验
Table 3. Validation results of different crown models
模型 树冠外轮廓模型 体积模型 MAE MD R2 RMSE MAE MD R2 RMSE 模型1 0.170 9 -0.027 3 0.760 1 0.277 6 5.258 3 -0.842 7 0.853 1 8.306 9 模型2 0.197 0 0.026 3 0.781 5 0.264 9 5.156 0 0.337 4 0.855 8 8.232 2 模型3 0.177 8 -0.011 3 0.803 3 0.251 3 5.161 4 0.007 4 0.856 0 8.226 2 模型4 0.177 4 -0.010 2 0.803 9 0.250 9 5.161 2 -0.000 4 0.856 0 8.226 1
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