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毛竹Phyllostachys edulis为禾本科Gramineae竹亚科Bambusoideae刚竹属Phyllostachys竹种,用途广泛,是一种可持续发展的重要资源。培育毛竹壮苗是提高实际造林成活率的重要前提[1]。目前,毛竹实生苗因成本低、便于引种等优势,已在生产上广泛利用。油菜素内酯(brassinosteroid,BR)是一种类似于动物甾醇类激素的天然产物,在极低浓度下就可以对植物的生长及发育起到显著的调节改善作用,被认为是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯之后的第六大植物生长调节剂。MITCHELL等[2]首次从油菜Brassica napus花粉中提取油菜素内酯, 发现其极高的生物活性, 能引起菜豆Phaseolus vulgaris节间伸长、弯曲、裂开等生长反应。进一步的研究发现:油菜素内酯参与多种植物生理生长的过程,对植物的生长发育、光合特性、抗逆性、细胞发育和果实品质及产量等方面有重要的调节功能[3-5]。目前,关于外源油菜素内酯对毛竹生理特性影响鲜有报道。本研究以毛竹实生苗为材料,喷施不同质量浓度的油菜素内酯溶液,研究外源油菜素内酯对毛竹实生苗生理特性的影响,以期为培育毛竹壮苗提供理论依据。
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选取广西壮族自治区桂林市灵川县境内开花后的毛竹种子。试验地位于浙江省杭州市临安区浙江农林大学智能实验楼温室大棚(30°23′N,119°72′E),年均白昼气温/夜间气温为(23.0±2.0) ℃/(17.0±2.0) ℃,相对湿度为45%~70%。浸种24 h后置于恒温培养箱中的塑料培养盒内等其露白发芽至芽长度超过种子长度后,选取长势一致的种子移至加有1/2强度的Yoshida营养液中培养[6]。待苗长至三叶期后开始叶面喷施0、0.050 0、0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5 mg·L−1的油菜素内酯溶液,代号为ck、E1、E2、E3、E4、E5。每处理重复30株,隔15 d处理1次。喷施均以植株叶片上下表面滴水为标准。于2018年3月初开始处理持续至8月底,于9月初采样测定各处理下毛竹实生苗各项生理生化指标。
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在上午8:30−11:30进行测定,每个处理选取长势一致的毛竹实生苗,测定植株上部第3片的光合指标,单片叶子重复6次取平均值。仪器采用LI-COR 6800光合仪,测定时仪器的相对湿度为60%,二氧化碳摩尔分数为400 µmol·mol−1,光强设定为800 µmol·m−2·s−1。测定指标包括净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳摩尔分数和蒸腾速率。
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于9月10日测定光合参数后,选取各处理长势一致的毛竹实生苗各8株,将苗拉直后量取顶部至基部的长度,即为株高;用吸水纸擦干根部营养液,拉直后量取整株实生苗根系长度,即为根长;将测完株高和根长的毛竹实生苗快速洗净擦干后,沿基部把毛竹实生苗地上与地下部分切开,放入105 ℃烘箱中杀青30 min,后将烘箱温度调整至70 ℃,将样品烘干至恒量,测定其地上与地下部分干质量。同期选取各处理长势一致的毛竹实生苗叶片各3片,取植株上部第3片叶,参考叶形纸称重法测定叶面积。
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于9月10日选取各处理长势一致的毛竹实生苗各8株,摘取植株上部第3片叶,采用乙醇提取法测定叶绿素质量分数[7]。同时各处理选取长势一致的毛竹实生苗各8株,摘取植株上部第3片叶,洗净并去除叶脉剪碎后,倒入液氮快速研磨成粉末状,放入50 mL离心管于−80 ℃环境下保存待测:毛竹实生苗叶片过氧化氢酶(CAT)采用紫外分光光度法进行测定[8];过氧化物酶(POD)采用愈创木酚法进行测定[9];超氧化物岐化酶(SOD)采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定,可溶性蛋白质质量分数参考考马斯亮蓝法测定,可溶性糖和淀粉质量分数参考蒽酮比色法[10-11]。上述测定指标均重复3次以上。
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采用Excel进行数据处理及图表绘制。运用SPSS软件中单因素方差分析法对处理间的数据做单因素方差分析、多重比较及差异显著性分析。
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由表1可知:随油菜素内酯质量浓度降低,毛竹实生苗株高、根长和叶面积均呈现先上升后下降的趋势。当油菜素内酯质量浓度在0.001 0 mg·L−1时毛竹实生苗株高达最高(P<0.05),较ck提高了11.0%,0.005 0 mg·L−1处理较ck提高了9.2%。0.001 0 mg·L−1处理较ck,其根长增加了13.4%,0.005 0和0.000 5 mg·L−1处理根长也均高于ck,但低于0.001 0 mg·L−1处理。除0.050 0 mg·L−1处理外,其余4组处理较ck均能显著增加毛竹实生苗叶面积(P<0.05),其中0.005 0 mg·L−1处理较ck效果最为显著;通过叶面喷施油菜素内酯,各处理与ck相比,0.010 0、0.005 0和0.001 0 mg·L−13种处理能显著增加毛竹实生苗全株总干质量(P<0.05),其中以0.005 0和0.001 0 mg·L−1处理为最佳,分别比 ck 增加了25.3%和26.8%。植株地上与地下部分干质量均随油菜素内酯质量浓度降低呈先上升后下降的趋势,且相较ck均有不同程度提升,其中0.005 0 mg·L−1较ck对植株地上部分干质量增加尤为显著(P<0.05),0.001 0 mg·L−1处理较ck对植株地下部分干质量提升尤为显著(P<0.05)。外源油菜素内酯处理各组与ck相比,均能在不同程度上降低毛竹实生苗的根冠比,说明毛竹实生苗地上部分营养生长较旺盛,生物量大。
表 1 不同质量浓度油菜素内酯处理毛竹实生苗生长指标
Table 1. Effect of different concentration BR on growth index of Ph. edulis seedlings
处理 株高/cm 根长/cm 叶面积/cm2 总干质量/g 地上部分干质量/g 地下部分干质量/g 根冠比 ck 27.69±1.39 c 29.83±0.85 c 11.58±0.22 c 1.38±0.09 c 0.91±0.09 c 0.47±0.03 b 0.52±0.07 a E1 29.93±1.78 ab 29.07±1.22 c 11.98±0.30 bc 1.50±0.12 bc 1.03±0.11 bc 0.48±0.04 b 0.47±0.06 ab E2 30.19±1.48 ab 29.81±0.74 c 13.39±0.57 a 1.71±0.21 a 1.20±0.19 ab 0.51±0.03 ab 0.43±0.05 b E3 30.24±1.95 ab 30.21±1.13 bc 13.68±0.27 a 1.73±0.15 a 1.22±0.15 a 0.50±0.05 ab 0.42±0.08 b E4 30.60±1.88 a 33.84±1.20 a 13.32±0.71 a 1.74±0.20 a 1.21±0.18 ab 0.54±0.04 a 0.45±0.07 ab E5 28.51±1.45 bc 31.10±1.24 b 12.88±0.42 ab 1.64±0.18 ab 1.11±0.19 ab 0.52±0.03 a 0.49±0.11 ab 说明:同列比较,不同字母表示处理间差异显著(P<0.05), 相同字母表示处理间差异不显著(P>0.05) -
由表2可知:各处理与ck相比均能显著增加毛竹实生苗叶绿素a的质量分数,但以0.005 0 mg·L−1处理叶绿素a质量分数增幅最大,比ck高11.6%。除0.010 0 mg·L−1处理叶绿素b质量分数差异不显著外,其余处理较ck均差异显著(P<0.05),但0.005 0和0.001 0 mg·L−1处理质量分数高于其他处理。5种质量浓度油菜素内酯处理间总叶绿素和类胡萝卜素质量分数差异均不显著,但相较于ck,差异均达到显著水平(P<0.05)。当质量浓度为0.005 0 mg·L−1时,总叶绿素质量分数高于其他处理,其次是0.001 0 mg·L−1;而0.001 0 mg·L−1处理下类胡萝卜素质量分数高于其他处理。由此表明:外源油菜素内酯处理可以提高毛竹实生苗光合色素水平,增强植株的光能利用率,从而提高植株光合能力。
表 2 不同质量浓度油菜素内酯处理毛竹实生苗光合色素质量分数
Table 2. Effect of different concentration BR on photosynthetic pigment content of Ph. edulis seedlings
处理 叶绿素a/(mg·g−1) 叶绿素b/(mg·g−1) 总叶绿素/(mg·g−1) 类胡萝卜素/(mg·g−1) ck 2.28±0.08 c 0.88±0.04 b 3.17±0.12 b 0.92±0.04 b E1 2.50±0.08 ab 1.01±0.06 a 3.51±0.14 a 1.06±0.04 a E2 2.41±0.11 b 0.96±0.08 ab 3.37±0.19 a 1.01±0.06 a E3 2.55±0.08 a 1.03±0.06 a 3.58±0.14 a 1.05±0.07 a E4 2.50±0.10 ab 1.03±0.07 a 3.53±0.17 a 1.07±0.05 a E5 2.50±0.08 ab 1.00±0.06 a 3.51±0.14 a 1.06±0.04 a 说明:同列比较,不同字母表示处理间差异显著(P<0.05),相同字母表示处理间差异不显著(P>0.05) 由表3可知:随着油菜素内酯质量浓度的降低,净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳摩尔分数和蒸腾速率均呈现先升高后降低的趋势。相较于其他处理,0.005 0和0.001 0 mg·L−1处理对净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳摩尔分数和蒸腾速率的影响较ck差异最为显著(P<0.05):0.005 0 mg·L−1处理分别提升26.7%、59.9%、14.1%和28.9%;0.001 0 mg·L−1处理分别提升22.7%、50.8%、16.1%和21.9%。说明外源油菜素内酯对毛竹实生苗光合能力具有促进作用,且随着油菜素内酯质量浓度的改变促进的效果发生变化。
表 3 不同质量浓度油菜素内酯处理毛竹实生苗光合参数
Table 3. Effect of different concentration BR on photosynthetic parameters of Ph. edulis seedlings
处理 净光合速率/(µmol·m−2·s−1) 气孔导度/(mol·m−2·s−1) 胞间二氧化碳摩尔分数/(µmol·mol−1) 蒸腾速率/(mmol·m−2·s−1) ck 6.87±0.21 c 0.051±0.005 d 211.47±15.86 c 1.36±0.08 c E1 7.07±0.21 c 0.069±0.005 c 231.57±13.77 ab 1.48±0.13 bc E2 7.53±0.32 b 0.074±0.005 bc 223.91±17.69 bc 1.56±0.16 b E3 8.70±0.33 a 0.082±0.004 a 241.37±10.34 ab 1.75±0.08 a E4 8.42±0.33 a 0.077±0.003 ab 245.53±9.62 a 1.66±0.13 ab E5 7.49±0.41 b 0.074±0.006 bc 234.66±11.15 ab 1.59±0.15 ab 说明:同列比较,不同字母表示处理间差异显著(P<0.05),相同字母表示处理间差异不显著(P>0.05) -
由表4可知:相较于ck,其他4种质量浓度处理的毛竹实生苗叶片的可溶性蛋白质质量分数均达到差异显著水平(P<0.05),随着喷施质量浓度的降低,可溶性蛋白质呈现先上升后下降的趋势,且在0.005 0和0.001 0 mg·L−1处理下达到最大值。叶面喷施条件下,除0.010 0和0.001 0 mg·L−1差异不显著外,其他处理与ck相比可溶性糖质量分数均达到显著水平(P<0.05),其中0.050 0与0.000 5 mg·L−1处理之间差异不显著,而0.005 0 mg·L−1处理后较ck增幅最大(P<0.05),增加了10.9%。随着油菜素内酯质量浓度的降低,毛竹实生苗淀粉质量分数也呈先上升后下降的趋势,0.005 0和0.001 0 mg·L−1处理较ck差异达显著水平(P<0.05),分别增加17.3%和16.9%。说明外源油菜素内酯溶液可以调节毛竹实生苗体内渗透调节物质的质量分数,有利于植株正常生长发育。
表 4 不同质量浓度油菜素内酯处理毛竹实生苗可溶性蛋白质、可溶性糖和淀粉质量分数
Table 4. Effect of different concentration BR on soluble protein,soluble sugar and amylum content of Ph. edulis seedlings
处理 可溶性蛋白质/(mg·g−1) 可溶性糖/(mg·g−1) 淀粉/(mg·g−1) 处理 可溶性蛋白质/(mg·g−1) 可溶性糖/(mg·g−1) 淀粉/(mg·g−1) ck 4.02±0.20 d 5.08±0.11 c 1.37±0.03 c E3 5.29±0.14 a 5.64±0.15 a 1.61±0.06 a E1 4.21±0.06 c 5.32±0.13 b 1.52±0.08 a E4 5.28±0.13 ab 5.17±0.20 bc 1.60±0.07 a E2 4.26±0.06 c 5.04±0.20 c 1.51±0.02 ab E5 5.10±0.08 ab 5.35±0.20 b 1.42±0.02 b 说明:同列比较,不同字母表示处理间差异显著(P<0.05),相同字母表示处理间差异不显著(P>0.05) -
由表5可知:超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性随油菜素内酯质量浓度降低呈现先上升后下降的趋势。当质量浓度在0.001 0~0.005 0 mg·L−1时,植株超氧化物歧化酶活性达到最大值,其中0.005 0 mg·L−1处理相较于ck增幅最大,提高了6.7%;过氧化氢酶活性则在0.005 0和0.001 0 mg·L−1处理下达到最大值。毛竹实生苗叶片的过氧化物酶活性,随油菜素内酯质量浓度的降低呈升高趋势,当质量浓度在0.000 5 mg·L−1时,植株过氧化物酶活性相较ck差异达显著水平(P<0.05),依次是0.005 0和0.001 0 mg·L−1。这些结果表明:毛竹实生苗叶片的抗氧化酶活性受外源油菜素内酯质量浓度影响,适宜质量浓度油菜素内酯可以提高抗氧化酶活性,增强植株抗逆性。
表 5 不同质量浓度油菜素内酯处理毛竹实生苗抗氧化酶活性
Table 5. Effect of different concentration BR on antioxidant enzyme activities of bamboo seedlings
组别 超氧化物歧化酶/
(×16.67 nkat·g−1)过氧化物酶/
(×16.67 nkat·g−1)过氧化氢酶/
(×16.67 nkat·g−1)组别 超氧化物歧化酶/
(×16.67 nkat·g−1)过氧化物酶/
(×16.67 nkat·g−1)过氧化氢酶/
(×16.67 nkat·g−1)ck 3 018.58±80.60 bc 43 031.11±2 231.96 c 46.81±1.47 c E3 3 219.58±106.30 a 49 306.67±1 573.26 ab 50.67±0.73 ab E1 2 978.00±102.19 c 46 871.11±1 625.14 b 46.96±2.57 c E4 3 202.99±99.55 a 48 937.78±2 994.76 ab 53.63±2.00 a E2 3 159.32±111.30 ab 46 404.44±1 779.30 b 48.44±0.73 bc E5 3 187.05±118.30 a 51 733.33±2 538.05 a 46.37±0.91 c 说明:同列比较,不同字母表示处理间差异显著(P<0.05),相同字母表示处理间差异不显著(P>0.05) -
植物营养生长是指根、茎、叶等营养器官的生长,通过分析植物器官表型可以判断植物的生长情况。油菜素内酯能在植物各个生长发育阶段起到促进生长的作用,能有效提升植物株高、根长及干物质的积累[12]。有研究表明:油菜素内酯对小米Setaria italica[13]、玉米Zea mays[14]、黄瓜Cucumis sativus[15]和甘草Glycyrrhiza uralensis[16]等植物均有促进生长的作用。本研究中,叶面喷施不同质量浓度的油菜素内酯,能不同程度地影响毛竹实生苗的生长发育,其中以0.001 0~0.005 0 mg·L−1质量浓度为最佳。当油菜素内酯质量浓度为0.05 0 0~0.010 0 mg·L−1时,毛竹实生苗地上部分生长虽然没有出现生长抑制的现象,但该质量浓度处理后根系长度有小于对照的趋势,可能的原因是持续高质量浓度的油菜素内酯处理能够调控根系内部乙烯合成,造成根尖顶端优势丧失,进而抑制根系伸长[17]。0.001 0 mg·L−1油菜素内酯对毛竹实生苗根系生长具有促进效果,即较低质量浓度处理能促进毛竹实生苗根系生长,这与邓茜等[18]在小麦Triticum aestivum中的研究结果相似,推测油菜素内酯对根系细胞的伸长或许与生长素类似具有双重效应。生长素浓度高低会分别启动不同的信号传输途径来调节植物生长,即低浓度促进生长,高浓度抑制生长[19-20]。在本研究条件下,适宜质量浓度油菜素内酯处理有效增加了毛竹实生苗的株高,促进了叶片生长。这与前人在烟草Nicotiana tabacum[21]和狐米草Spartina patens[22]上得到的研究结果相类似,说明植物生长可能与油菜素内酯直接促进细胞生长和分裂的效应有关[23-24]。
植物利用光合作用将光能转化为自身生命活动所需的有机化合物,因此,光合作用的强度能反应植物的生活力[25]。随着油菜素内酯质量浓度降低,毛竹实生苗净光合速率、气孔导度及胞间二氧化碳摩尔分数均呈现先升后降的趋势,且在0.001 0~0.005 0 mg·L−1达到最大值,推断适宜质量浓度油菜素内酯可以通过调节气孔,吸收外界二氧化碳向羧化部位扩散,从而增强毛竹实生苗光合能力。这与油菜素内酯在高粱Sorghum bicolor[26]和甘蓝型油菜[27]上的研究结果相似。而YU等[28]发现:油菜素内酯处理后黄瓜幼苗气孔导度和蒸腾速率提高,但胞间二氧化碳摩尔分数却无显著变化,认为气孔因素和非气孔因素有可能都是提升黄瓜幼苗光合能力的原因,这与本研究的结果有所不同。王金平等[29]研究发现:油菜素内酯对樟树Cinnamomum camphora叶绿素含量积累和光合能力均有促进作用。郝建军等[30]认为:油菜素内酯处理能提高玉米叶绿素含量,提升光合速率,但油菜素内酯对光合能力的提升并不是直接活化光合系统,可能是通过某种较长时间的生化反应过程来实现的。BRAUN等[31]研究表明:油菜素内酯可以通过提高植物体内叶绿素含量,促进植物进行光合作用。在本研究中,毛竹实生苗叶片的总叶绿素质量分数与净光合速率均在0.001 0~0.005 0 mg·L−1达到最大值,这可能是外源油菜素内酯能影响聚光色素复合体上的蛋白表达或者调节叶绿素合成降解的关键酶来促进光合色素合成[32],提高植物光合固碳效率,促进植物光合作用[33]。该结果与油菜素内酯在樱桃番茄Lycopersicum esculentum var. cerasiforme[34]和油用牡丹‘凤丹’Paeonia ostii ‘Fengdan’[35]上的结果相似,但不同物种之间生物学特性存在一定差异,这使得其对不同质量浓度油菜素内酯的敏感程度不同。除对照组外,各组毛竹实生苗之间地上与地下部分干质量差异并不大,但当油菜素内酯质量浓度在0.001 0~0.005 0 mg·L−1时,毛竹实生苗全株干质量较其他处理组有明显的提升。说明随着光合能力的增强,油菜素内酯能促进植株干物质的积累[36],从而促进毛竹实生苗生长发育。
有研究认为:外源油菜素内酯处理可诱导合成可溶性蛋白质、可溶性糖等渗透调节物质,提高超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等3种抗氧化酶的活性,从而减轻膜脂过氧化对细胞膜系统的损伤,增强植物的抗逆性[37]。总体而言,在0.001 0~0.005 0 mg·L−1的油菜素内酯处理下,抗氧化酶活性和渗透调节物质质量分数均保持在较高水平,说明喷施适宜质量浓度的油菜素内酯,可能促进植物体内抗氧化酶的合成或调解相关基因的转录与翻译,进而激活抗氧化系统[38],调节相关代谢酶水平,维持植物体正常生理代谢,抑制膜脂过氧化,保持植株细胞膜正常结构,同时维持细胞渗透平衡,增强细胞的保水功能[39]。这一结果与前人在水稻Oryza sativa[40]、番茄Solanum lycopersicum[41]、裸燕麦Avena nuda[42]上的研究结果相似。植株抗氧化水平的提高,可为生长提供有利条件,利于毛竹实生苗营养生长。本研究结果表明:当质量浓度为0.001 0~0.005 0 mg·L−1时, 油菜素内酯持续处理能够促进毛竹实生苗体内渗透调节物质合成,提高抗氧化酶活性,增强实生苗抗逆境能力;还能显著提升植株光合色素质量分数,提高其光合能力,促进干物质的积累,增加生物量,达到促进毛竹实生苗营养生长的效果。
Effects of exogenous BR on physiological characteristics of Phyllostachys edulis seedlings
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摘要:
目的 研究外源喷施油菜素内酯对毛竹Phyllostachys edulis生理特性的影响,为未来毛竹种植栽培及管理提供理论依据和技术参考。 方法 以毛竹实生苗为试材,通过水培试验,设置6种不同质量浓度油菜素内酯溶液处理[0(对照)、0.050 0、0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5 mg·L−1],比较处理间毛竹实生苗生长性状、光合色素、光合特性以及抗氧化系统等的差异。 结果 从整体上看,与对照相比,不同质量浓度的油菜素内酯在不同程度上对毛竹实生苗生长发育,对光合色素质量分数及光合能力起到提升作用。相较于对照,当油菜素内酯质量浓度为0.005 0 和0.001 0 mg·L−1时,毛竹实生苗超氧化物歧化酶活性分别提高6.7%和6.1%,过氧化物酶活性分别提高14.6%和13.7%,过氧化氢酶活性分别提高8.2%和14.6%,可溶性蛋白质质量分数分别增加31.5%和31.2%,淀粉质量分数分别增加17.3%和16.9%;而质量浓度为0.050 0、0.010 0及0.000 5 mg·L−1的油菜素内酯处理与0.005 0和0.001 0 mg·L−1质量浓度处理相比,对毛竹实生苗抗氧化性能与渗透调节能力的提升效果并不明显。 结论 油菜素内酯能提高毛竹实生苗光合能力,增强抗逆境能力,从而促进其营养生长,且当质量浓度在0.005 0~0.001 0 mg·L−1时效果最好。表5参42 Abstract:Objective This research aims to study the effects of exogenous brassinolide (BR) on physiological characteristics of Phyllostachys edulis, and to provide theoretical basis and technical reference for future cultivation and management of Ph. edulis. Method The seedlings of Ph. edulis were used as test materials, and 6 kinds of brassinolide solutions with different concentrations[0(ck), 0.050 0, 0.010 0, 0.005 0, 0.001 0, 0.000 5 mg·L−1] were set up through hydroponic culture experiment to compare the differences in the growth characteristics, photosynthetic pigment, photosynthetic characteristics and antioxidant system of the seedlings. Result On the whole, compared with ck, brassinolide with different mass concentrations could promote the growth and development of Ph. edulis seedlings to varying degrees, improve the quality of photosynthetic pigments and photosynthetic capacity, and promote the synthesis of osmotic adjustment substances. Compared with ck, when the mass concentration of brassinolide was 0.005 0 and 0.001 0 mg·L−1, the superoxide dismutase activity of bamboo seedlings increased by 6.7% and 6.1%, respectively, oxidase activity increased by 14.6% and 13.7%, and catalase activity increased by 8.2% and 14.6%, respectively. The mass fraction of soluble protein increased by 31.5% and 31.2%, and the mass fraction of starch increased by 17.3% and 16.9%, respectively. However, compared with 0.005 0 and 0.001 0 mg·L−1 treatment, brassinolide treated with mass concentration of 0.050 0, 0.010 0 and 0.000 5 mg·L−1 had no significant effect on antioxidant capacity and osmotic adjustment ability of Ph. edulis seedlings. Conclusion Brassinolide can improve the photosynthetic capacity and stress resistance of Ph. edulis seedlings, and promote nutrient growth. The best concentration of brassinolide is 0.005 0−0.001 0 mg·L−1.[Ch, 5 tab. 42 ref.] -
Key words:
- Phyllostachys edulis /
- brassinolide /
- nutrient growth /
- photosynthesis /
- antioxidant system
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种子的呼吸作用是指在酶的参与下将种子本身的储藏物质进行一系列的氧化分解,同时释放二氧化碳、水以及能量的过程,是种子萌发过程中不可或缺的能量来源,其变化会直接影响种子的生理现象。种子的呼吸强度又称呼吸速率是衡量其呼吸作用强弱的重要生理指标[1],反映了种子的活力与代谢等生理现象的强弱,与种子的储藏存在密切关系。呼吸代谢途径的顺利启动是种子萌发并健康成长为幼苗的关键因素,对植物的后续生长发育具有重要影响。储藏过程中种子的呼吸作用会改变种子的质量和品质,影响种子活力,能否控制好种子呼吸是关系种子储藏成败的主要问题[2],因此,对种子呼吸过程进行精准检测十分必要。本研究对种子呼吸检测方法及其原理进行了综述,分析了各种检测方法的优点与存在的问题,讨论了种子呼吸检测方法在种子呼吸代谢、种子储藏和种子活力等方面的研究与应用。
1. 种子呼吸检测方法
呼吸强度是种子生命活动最重要的指标之一,有效检测种子呼吸强度是研究种子呼吸作用的重要前提。种子呼吸消耗氧气(O2),释放二氧化碳(CO2),所以氧气消耗量或者CO2释放量可以在一定程度上反映种子的呼吸强度。检测种子呼吸耗氧量的方法有瓦氏微量法、Clark氧电极法和氧传感技术检测法(Q2技术)等;检测种子呼吸CO2释放量的方法有小篮子法、红外线CO2分析仪法和可调谐二极管激光吸收光谱(TDLAS)技术检测法等。种子呼吸检测方法向着检测速度快、效率高、重现性好的方向发展,并将成为研究热点。
1.1 小篮子法
小篮子法主要通过测量种子在密闭容器中呼吸产生CO2增加量来测定种子呼吸的强度。将种子放入小篮子中,密封广口瓶,利用饱和碱液氢氧化钡[Ba(OH)2]吸收种子呼吸过程中产生的CO2。待测试结束后,再用草酸溶液滴定残留的Ba(OH)2,记录消耗的草酸溶液量为V1,另取空白组滴定记录草酸溶液量为V0。根据呼吸过程中Ba(OH)2减少量可定量测出种子在整个检测过程中CO2的增加量。基于小篮子法测定种子呼吸强度的计算公式为:种子呼吸强度(mg·g−1·h−1)=( V0−V1)/(mt),其中:m为种子鲜质量(g),t为测定时间(h)。
在不同激素、药物和生长环境下,种子萌发过程的呼吸作用会出现很大差异,利用小篮子法能够直观地研究种子在不同外界环境下呼吸作用的变化情况。张璇等[3]利用小篮子法观测到适当浓度的赤霉素浸种可以提高香果树Emmenopterys henryi种子的呼吸速率;李佳等[4]利用小篮子法测定经不同浓度赤霉素处理后的杜仲Eucommia ulmoides种子的呼吸强度,发现随着赤霉素浓度上升,种子的呼吸速率下降;方能虎等[5]采用小篮子法对水稻Oryza sativa种子进行呼吸检测,观察到种子萌发初期稀土元素对其呼吸速率动态变化具有影响;杨雪鹏等[6]利用小篮子法研究不同浓度的维生素吡咯喹啉醌对水芹Oenanthe javanica种子萌发的影响。上述研究表明:利用小篮子法测定种子呼吸,能够简单高效地获取不同浸种环境下种子的呼吸变化规律,为不同环境因素对种子萌发生理效应的探索奠定了基础。
小篮子法操作简便,但不能完全反映种子呼吸CO2浓度的动态变化过程,难以避免外界CO2的侵入和干扰,反应不敏感,在一定程度上影响了种子呼吸强度检测的精度,且计算相对复杂。李海霞等[7]对此做了改进,以利于小篮子法的推广。
1.2 瓦氏微量法
瓦氏呼吸仪(Warburg Respirometer)是测定生物因新陈代谢而产生的气压变化所用的装置。其工作原理为在恒温、恒体积的密闭系统中,用氢氧化钾(KOH)溶液吸收CO2使得气体压力降低,利用测压计显示压力值,从而得到种子呼吸过程中O2消耗量。利用瓦氏呼吸仪测量种子呼吸时,首先将种子称量后放入反应瓶中,并将反应瓶放入恒温控制器。实验开始后调节U型测压管底部的旋钮,使右侧闭管内测压液的液面保持在h=150 mm,读取左侧开管液面高度值。关闭三通活塞使压力计与反应瓶相通,待种子呼吸一段时间后,将右侧液面仍调节至原处,并记录左侧液面高度,然后关闭测压管。瓦氏微量法具有微量和多组测定的特点,灵敏度较高,压力计上只要有1 mm的测压液水柱变化就可以进行测定,比小篮子法的灵敏度和精确度好。
吕洪飞等[8]利用瓦氏呼吸仪对杉木Cunninghamia lanceolata不同无性系小孢子叶球的呼吸强度进行了测量,比较不育株与可育株小孢子叶球及其子叶的呼吸强度,并将所测结果与Clark氧电极法进行比较,2种方法所测结果趋势一致。黄真池等[9]参照黄学林等[10]的瓦氏微量法,使用Shw-2型呼吸仪在25 ℃下测定不同活力等级的白菜Brassica pekinensis种子在不同吸水时间下的呼吸速率,发现了高活力种子和中等活力种子在吸水初期(1~12 h)呼吸速率相差不明显,低活力种子的呼吸速率在吸水前4 h明显低于前两者,但随着吸水时间延长,低活力种子的呼吸速率大小与高、中等级活力种子的呼吸速率逐渐接近。王亚文等[11]利用瓦氏呼吸仪测定在暗反应与光反应条件下黑豆Glycine max种子萌发时产生CO2和消耗O2之间的变化关系,发现黑豆种子的呼吸速率变化符合“S”形曲线,存在明显的呼吸滞缓期。
利用瓦氏呼吸仪测定种子呼吸强度在一定程度上提高了测量的灵敏度和准确性。需要注意的是在瓦氏实验过程中需要保持温度恒定,进行温度校准,并尽可能采用小的呼吸室。为了避免瓦氏呼吸仪中压力和温度对呼吸室的容积产生影响,瓦氏微量法要求所取样品体积小,因此,难以用于大粒种子呼吸强度的测量。此外,Gilson差分呼吸仪和Warburg呼吸计根据呼吸作用产生的压力变化测得种子的呼吸速率,也属于瓦氏微量法,但目前Gilson差分呼吸仪在种子呼吸检测领域应用较少。
1.3 Clark氧电极法
Clark氧电极(Clark oxygen electrode)是一种极谱电极,最早用于测定水溶液中溶解氧的含量,在20世纪30年代就有人利用裸露的银-铂电极研究藻类的光合作用。CLARK[12]在1956年提出薄膜氧电极,1983年,日本学者首次采用微机械加工技术将氧电极微型化,使得测氧技术更加简便稳定[13]。Clark氧电极一般是用银作阳极,铂作阴极,加上一层氧分子可以通过但液体不能通过的薄膜以防止电极被污染,充以氯化钾(KCl)作为电解液。2个电极之间加上0.07 V左右的恒定电压,在极化电压及温度恒定的条件下,将扩散电流的大小作为溶解氧定量测定的基础,即电流大小反应溶解氧含量。Clark氧电极具有反应快、灵敏度高、可连续测量、能够记录O2的动态变化过程等优点,因此常用于研究植物根系、芽、种子、果实、叶片等组织的呼吸速率和耗氧情况,分析糖酵解、三羧酸循环等呼吸代谢途径,从而研究植物组织的休眠和休眠解除等变化过程。
线粒体与种子呼吸直接相关,是细胞进行三羧酸循环和生物氧化的场所[14-15]。BENAMAR等[16]在25 ℃下用校准氧电极检测种子碎片和线粒体耗氧量,证实了线粒体功能与种子品质之间具有相关性。王伟青等[17]利用Clark氧电极分别测定黄皮Clausena lansium种子胚轴、子叶和线粒体的耗氧速率,研究黄皮种子的脱水敏感性与种子呼吸速率显著降低的关系。陶宗娅等[18]采用Clark氧电极测定大豆Glycine max和豌豆Pisum sativum种子子叶和去子叶胚的耗氧量,研究低温吸胀对种子呼吸代谢的影响。
Clark氧电极法实现了种子呼吸的连续测量,提高了测量精度和灵敏度,但该方法对温度变化较为敏感,在测定中需要维持温度恒定。除此之外,测定前需要先从种胚中提取和纯化线粒体,操作方法较为繁琐,且需保持良好的线粒体结构不被其他细胞器污染,对操作要求较高。
1.4 红外线CO2分析仪法
20世纪50年代,为了克服传统气体测压方法操作复杂、难以实现自动化等缺点,利用CO2气体能够强烈吸收红外线特定波段能量的特点,设计制造了红外线CO2分析仪(Infrared CO2 Analyzer)[19],其工作原理为:由光源发出的红外线经反射镜分成2束能量相等的平行光束,分别通过参比气室与分析气室2个气室。由于气体吸收红外线能量,使得原来能量相等的2束红外线产生了能量差,被电容检测器接收后转变成1个电信号,从而间接测量出待测CO2的浓度。红外线CO2分析仪具有操作简单,反应灵敏,读数直观,数据可存储等优点,已被国内外学者广泛应用于各种农业和气体监测等领域[20-21]。
诸多学者利用红外线CO2分析仪测定种子呼吸强度,探究种子呼吸与其萌发过程之间的关系,发现了很多重要的呼吸现象。如陈润政等[22]利用FQ-W-002型红外线CO2分析仪对花生Arachis hypogaea种子呼吸强度进行了研究,证实了种子呼吸强度与其生活力的密切相关。陈禅友等[23]使用GXH-3010E型便携式红外线CO2分析仪测定黄秋葵Hibiscus esculentus种子在萌发期间的呼吸速率,发现其呼吸速率变化曲线符合“快—慢—快”的规律,并且发芽率高的种子比发芽率低的种子呼吸速率更高。刘美[24]利用GXH-305型便携式红外线CO2分析仪测量不同温度条件下小麦‘山农17’ Triticum aestivum ‘Shannong 17’种子萌发期间呼吸速率变化,证明了温度对种子的萌发进程具有重要影响,温度过高或过低均不利于种子萌发。
与小篮子法和瓦氏呼吸仪相比,利用红外线CO2分析仪测定种子呼吸强度,精度较高,能够在一定程度上减少人为干涉,提高种子呼吸强度测量的准确度。目前,国内红外线CO2分析仪多是进口仪器,价格较为昂贵,且在测量过程中环境温度变化会影响红外光源的稳定,直接影响测量结果。
1.5 氧传感技术检测法(Q2技术)
氧传感技术(oxygen sensing technology)检测法是在密闭环境中,通过测量种子萌发过程中氧气的消耗情况来检测种子呼吸强度,由荷兰ASTEC Global公司开发。该技术基于荧光猝灭原理,由氧传感检测仪向含有荧光材料的种子萌发试管中释放蓝光,蓝光被荧光物质吸收并发出红光返回传感器。O2分子可以消耗红光能量(即猝灭效应)。当种子萌发消耗氧气时,试管内O2浓度降低,返回的红光随之增强,所以红光的强度与O2分子的浓度成反比。在测量过程中,操作软件会根据O2浓度和时间自动绘制成耗氧曲线,测定种子呼吸时消耗O2的浓度,得到种子呼吸强度。根据耗氧曲线的特征,设定不同的氧代谢值,通过种子萌发启动时间(IMT)、萌发O2消耗速率(OMR)、临界O2压强(COP)、理论萌发时间(RGT)和理论萌发率(RGR)等值,快速区分不同活力种子。
诸多学者对不同植物种子进行测量,分析了氧传感技术测定种子呼吸的原理、测定方法和测定结果,取得了较多研究成果。陈能阜等[25]利用氧传感技术测定了番茄Solanum lycopersicum、辣椒Capsicum annuum、黄瓜Cucumis sativus、茄Solanum melongena、杉木和马尾松Pinus massoniana等6种植物种子耗氧情况,发现不同种类、活力等级相同的种子,其耗氧曲线形状类似。利用耗氧曲线分析了IMT、OMR、COP和RGT等参数,全面分析了种子O2消耗曲线的特征。陈合云[26]选用浙江省主栽的籼稻和粳稻各20个品种,通过室内标准发芽试验、田间出苗试验和氧传感检测试验,确定了适用于常规籼稻种子和粳稻种子最佳氧传感指标分别为RGR和OMR,并且基于氧传感技术研究了经处理后种子活力的变化情况,表明氧传感技术测定种子呼吸可以有效地将老化处理、未处理与引发处理的种子区分开。
氧传感技术是集生物技术与信息技术于一体的自动化测定种子呼吸耗氧能力的新技术,目前已经被应用于多种类型种子的活力水平测定[27-28]。该方法可以测量单粒种子在萌发过程中的呼吸速率,然而该方法需要对种子进行萌发,属于有损检测,检测时间较长,需要每间隔30 min或1 h对种子呼吸耗氧数据进行1次采样,无法展示种子耗氧曲线的细节。
1.6 TDLAS技术检测法
可调谐二极管激光吸收光谱技术(tunable diode laser absorption spectroscopy, TDLAS)利用激光器发出的光被待测气体选择性吸收来测量气体的浓度。HINKLEY[29]和REID等[30]在20世纪中期最早提出通过吸收光谱来检测气体浓度。1981年,REID等[31]利用波长调制技术采集数据,最终得到了和气体浓度成正比的二次谐波表达式,从而推动了TDLAS技术向高精度气体浓度检测的研究方向发展。由于TDLAS技术目前已经能够达到10−9级别甚至10−12级别的检测限,因此,很多学者利用TDLAS技术检测CO2的浓度[32-33]。目前,TDLAS技术在农业领域的研究主要包括:土地排放的气体浓度和通量的检测[34]、植物叶片水分蒸腾速率的测量[35]、农产品运输冷藏车内CO2浓度的检测[36]等方面,而对种子呼吸检测的研究较少。种子代谢产物成为种子活力检测的新思路[37]。
贾良权等[38]基于TDLAS技术自主搭建了一套种子呼吸检测系统。相较于近红外光谱技术、高光谱技术和 X 光谱技术,该系统检测成本较低,能够反演出水稻和玉米Zea mays种子呼吸过程中产生的CO2浓度曲线。通过与发芽试验数据进行相关性分析,证明种子呼吸强度与种子活力等级的之间存在高度相关性。从水稻和玉米等种子呼吸与活力实验结果来看,TDLAS技术可以对种子呼吸强度进行连续实时的监测,检测精度可以达到10−6。通过优化设计光路和选择合适波长,可以进一步提高检测精度,实时监测单粒种子的呼吸情况。可见该方法具有较广阔的发展前景。此外,理论上TDLAS技术既可以检测CO2,也可以检测O2,因此,该方法也可以通过测定耗氧量来检测种子的呼吸强度,但在实际测量时参数选择会直接影响最终检测结果,选择实验参数的依据仍有待完善。
表1归纳了上述几种种子呼吸检测方法的原理及优缺点,小篮子法、瓦氏微量法、Clark氧电极法、红外线CO2分析仪法等由于其检测精度限制,只能检测批量种子的呼吸强度或者长时间累计种子的呼吸强度。新兴技术如氧传感技术检测法和TDLAS技术检测法等在种子呼吸检测领域具有较好的发展潜力。其中,小篮子法、瓦氏微量法、Clark氧电极法等单次最小样本检测量通常为1批或数克,其检测精度取决于溶液或滴定反应沉淀物称量的准确性,检测时间取决于人为操作时间。
表 1 种子呼吸检测方法比较Table 1 Comparison of respiration detection methods for seeds检测方法 检测原理 连续测量/
自动存储优点 缺点 预处理方法 检测时间 最少样本
检测量小篮子法[3] 化学 否 装置简单;应用范围广 易受外界环境干扰;反应
不敏感浸种、萌发 10 ~20 min 1批(约2 g) 瓦氏微量法[10] 化学/物理 否 灵敏度高;可多组同时
测定受温度影响大;难以用于
大粒种子测量浸种、萌发 10~20 min 1批(约1 g) Clark氧电极法[20] 电化学 是 响应快;灵敏度高 对温度敏感;需破碎种子 破碎、吸胀 10~20 min 1批 红外线CO2分析仪法[26] 光学 是 反应灵敏;检测精度高 价格昂贵;温度影响光源
稳定浸种、萌发 约5 s 1批(约1.5 g) 氧传感技术检测法[27] 化学 是 检测氧气,实现单粒种
子和多粒种子同步测量有荧光物质的消耗,无法
实时监测浸种、萌发 约30 min 单粒 TDLAS技术检测法[39] 光学 是 灵敏度高;分辨率高 尚在实验阶段;参数选择
对结果有影响清洗 约0.1 s 单粒 2. 种子呼吸及其应用研究
2.1 种子呼吸与代谢关系研究
呼吸代谢是生命活动的中心,种子内存在多条呼吸代谢途径,最基本的3条途径为糖酵解(EMP)途径、三羧酸(TCA)循环和磷酸戊糖(PPP)途径。不同的代谢途径提供不同的能荷和还原力,在各发育阶段有不同的代谢途径与之相适应。呼吸代谢各途径的强弱与呼吸速率和种子萌发密切相关[40-41],通过探索种子的代谢途径及其各阶段呼吸强度的变化,研究呼吸代谢在种子休眠与萌发中的作用,有助于找到打破种子休眠机制的依据,从而控制种子的休眠与萌发,缩短育种年限,提高育种效率[42]。
在研究种子休眠与萌发过程各呼吸代谢途径的变化规律中,种子的呼吸速率是重要的测定指标[43]。SIMMONDS等[44]在验证PPP途径在种子休眠解除起重要作用的研究中,利用Warburg呼吸仪测量不同后熟期种子0~10 h的呼吸变化。利用此测定方法只能对收集的数据进行回归分析,计算种子呼吸速率,不能实时反映种子呼吸连续变化情况。浦心春等[45]在研究休眠及打破休眠种子的发芽过程中加入了各种呼吸抑制剂,得出各代谢途径呼吸速率占总呼吸速率的比例,分析结果表明:TCA途径及PPP途径没有充分活化是导致休眠种子不能发芽的原因之一。采用小篮子法测定种子呼吸CO2的释放速率,虽操作简便,但受环境影响较大,并且只能人工读取结果,容易造成误差。陈丽培等[46]将培养过程中的油松Pinus tabuliformis种子每隔9 h取出并放入LI-6400光合作用呼吸仪中测量其呼吸速率,获得呈“S”形曲线的呼吸速率变化结果,并结合代谢途径关键酶活性的测定,得出种子在培养初期以EMP途径为主,而中后期由EMP途径转向PPP途径和TCA途径。该研究采用的LI-6400光合作用呼吸仪基于红外线CO2测量原理,可以有效地测定种子呼吸速率,具有测量相对精确、自动化程度高等优点,但该方法需要间隔较长时间(9 h)取出样品进行测量,时间分辨率较低,对获得的呼吸曲线质量有一定影响。
呼吸代谢由EMP/TCA途径转向PPP途径对种子休眠的解除具有重要作用,通过呼吸速率测定可以了解种子各代谢途径的活化程度。为了进一步探究种子休眠与萌发机制,需要综合分析多种因素及其相互作用,结合种子呼吸速率、酶活性和内源激素调控,全面把握种子生理变化,使呼吸代谢的研究具有更大的理论意义和实际效益。种子呼吸检测方法在种子休眠解除与促进萌发的研究中具有关键作用,研究者们采用不同的呼吸代谢检测方法对种子呼吸代谢途径的呼吸速率进行测定。传统方法受环境因素影响较大,灵敏度低,时间分辨率有限,并且由人工读取测量结果容易造成实验误差,合理选取或研究新型高灵敏度且自动化程度高的种子呼吸代谢测定方法有助于提高种子呼吸代谢效率以及结果的准确性。
2.2 种子呼吸与储藏关系研究
种子储藏是种质资源离体保存、年度间用种余缺调剂与应急用种的有效措施[47]。种子的呼吸作用是种子储藏期间的重要生理活动,控制好种子的呼吸作用,减少储藏物质的消耗,保持种子旺盛的生命力,才能达到种子安全储藏的目的[48]。测定种子的呼吸强度可以衡量其呼吸作用的强弱,有利于了解储藏过程中种子生理状态、环境影响因素与种子呼吸强度之间的关系,为改善储藏条件提供必要数据支撑。胡小荣等[49]将储藏12个月的大葱Allium fistulosum和油菜Brassica campestris种子分别存于50、35、20和−18 ℃环境下,并利用GC-7AG气相色谱仪测定种子呼吸速率,研究发现:随着储藏温度的升高,大葱和油菜种子的CO2释放量增大,同一储藏温度下,随着含水量的降低,种子CO2释放量减少。LIU等[50]在常温与低温2种环境下,用小篮子法测定储藏第4年的马尾松种子的呼吸强度,发现在常温开放储藏环境下,种子呼吸旺盛、养分消耗快,易丧失生活力,而采用低温密封法可以较好地保持种子的生活力。可见,在一定范围内,呼吸作用的强度会随温度的上升而增强。在储藏期间,温度变化导致的种子呼吸变化还可能影响种子的感官品质。王道营等[51]将玉米种子在不同温度条件下储藏一段时间后,取出放入密闭玻璃瓶中,通过GXH-3010D型红外CO2分析仪测定一段时间内种子的呼吸变化情况,发现在不同温度下含糖量递减速率随温度的升高而加大,在较低储藏温度下甜玉米含糖量较高,呼吸强度和失水量较低,能够保持较高的食用品质。种子的水分含量与空气成分同样是种子呼吸的重要影响因素。王若兰等[52]取适量预处理后的小麦种子放入SKW-3仪器的呼吸瓶内,测定在不同温度、水分和氧气浓度下小麦种子呼吸速率的变化。结果表明:在一定条件下,小麦种子呼吸作用的强度随着温度或水分的升高而加强,随着氧气浓度的降低而逐渐被抑制。
部分学者指出:种子呼吸作用在储藏期间受温度、湿度及环境中O2、CO2等因素的影响[53],通过降温、干燥、缺氧储藏等手段能够有效抑制种子的呼吸作用[54],使种子处于极微弱的呼吸状态,保持种子品质,延长储藏时间,减少农业生产中的经济损失。然而在不同环境中,部分呼吸检测仪器同样会受到环境因素变化的影响,如小篮子法难以避免外界CO2气体的干扰,且仅能测量取出后储藏种子的呼吸强度,无法及时反映不同储藏环境下种子的呼吸情况;Gilson差分呼吸仪和Warburg呼吸计2种仪器对压强或温度变化都极为敏感,设置不同温度与O2浓度环境,都需要对仪器进行平衡,且耗费时间较长;红外线CO2分析仪和TDLAS技术等方法可以通过调节气室环境来测量不同温度、气体浓度下种子的呼吸作用,能有效避免环境因素对仪器产生的影响。可见,在储藏环境因素对种子呼吸强度影响的研究中,所采用的种子呼吸检测方法不仅要结果精确、自动化程度高,还需尽量减少环境因素干扰,才可以实时反映不同储藏环境下种子的呼吸变化情况。
2.3 种子呼吸与活力关系研究
种子活力作为衡量种子质量的一个重要指标,对农业生产和自然环境等民生问题有着重要影响[55]。种子的呼吸强度与其活力存在一定的正相关性[56-57]。国内外学者尝试采用不同的检测技术对种子呼吸过程中O2的消耗量或产生的CO2量进行检测,研究种子呼吸与活力相关性。在种子活力研究中采用测定耗氧量的方法有:Gilson差分呼吸仪法、瓦氏微量法、Clark氧电极法[58]和氧传感技术检测法等。
WOODSTOCK等[59]将玉米种子置于装有5 mL水的反应瓶中并连接Gilson差分呼吸仪,测量种子吸水开始后2~30 h的耗氧情况,得出在空气环境下种子的呼吸速率与根长、芽长的相关系数分别为0.82和0.79,表明种子呼吸速率与发芽和幼苗生长之间呈显著正相关。赵光武等[37]探讨了氧传感测定指标与杉木种子发芽测定指标之间的相关性,应用氧传感技术软件自动绘制耗氧曲线并计算,得到COP,指出呼吸强度开始降低时O2浓度与发芽率呈显著负相关。钟希琼等[60]在水稻种子萌发进行到80~88 h时,用滴定法(同小篮子法)测定种子呼吸速率,研究发现:其生活力、发芽势、发芽率、发芽指数均与呼吸速率呈显著正相关,相关系数分别为0.847、0.931、0.937和0.870。贾良权等[38]基于TDLAS检测技术选取3个活力等级的甜玉米种子,将预处理后的种子放入基于TDLAS技术的种子呼吸容器中,启动设备自动存储数据并绘制呼吸产生的CO2浓度曲线图,计算得到第3~8小时各时刻种子的呼吸强度与活力指数的相关系数均大于0.900。这表明种子的呼吸强度可以快速反映种子的活力水平。
上述研究结果表明:玉米、水稻、杉木等种子的呼吸强度与其发芽率、发芽势、发芽指数等呈现一定的正相关性。但目前还存在一些科学问题尚未解决,如在同一遗传品系内部种子呼吸强度与种子活力的定量关系,以及不同遗传品系间种子的活力与呼吸强度相关度等具体问题。针对上述问题,可通过种子呼吸检测及发芽试验,定量研究种子呼吸强度与种子活力之间的相关关系,以期通过呼吸强度的检测来准确判定种子活力的高低,从而提高制种效率。氧传感技术与TDLAS技术在种子呼吸检测领域的应用,使得种子活力检测向着快速、准确且自动化程度高的方向发展。相比发芽、田间出苗等试验,氧传感技术与TDLAS技术操作更加简便、耗时较短、效率更高,可将呼吸强度作为鉴定种子活力的生理指标,并在种子选择、检验、储藏等领域广泛应用。
3. 展望
种子呼吸强度的检测可以用于研究种子休眠解除过程中各代谢途径,了解种子的活力情况及收获后的生理状态,指导选用和生产高活力种子,在研究种子呼吸代谢、种子活力和种子储藏等方面具有重要的意义与价值。结合目前种子呼吸检测方法和应用领域的研究进展,笔者认为应着力从以下几个方面开展进一步研究:①小篮子法、瓦氏微量法等目前常用的种子呼吸检测方法多数存在不能实时反映种子呼吸变化等缺陷且属于有损检测。新型技术如红外线CO2分析仪法、氧传感技术法等近年得到了较好的应用与发展,这些方法能够获得种子呼吸检测的变化曲线,然而这些方法多针对批量种子长时间呼吸积累量进行检测,对单粒种子以及种子萌发前的呼吸检测尚无能为力,因此具有一定的应用局限。总体种子呼吸检测方法的研究进展缓慢,对种子生理生化的深入研究产生了一定的影响。以TDLAS技术为代表的新型光学检测方法具有高灵敏度、快速检测等优点,其检测精度能够达10−6以下,通过选用强吸收线的激光器光源并配合长光程种子吸收池,种子呼吸CO2检测精度甚至可以达到10−9,种子呼吸消耗O2检测精度达10−6级别。可见,TDLAS技术是一种颇具前途的种子呼吸检测方法,能够有效地避免上述问题,且TDLAS技术可以进行CO2和O2等多种气体的同步监测,能够全面掌握种子呼吸代谢过程变化情况。因此,随着种子呼吸与生理生化、储藏环境等相关领域的研究进展,基于TDLAS等光学检测技术的研究,同时开展呼吸代谢中CO2和O2的同步监测,研究出灵敏度更高、操作更为简单的种子呼吸检测方法及装备具有可行性。②目前,种子呼吸研究主要集中在种子呼吸代谢与休眠、萌发、代谢途径等相关领域。随着技术手段的提升,可以进一步加强种子休眠、种子早期萌发机制以及盐碱、温度等环境胁迫与种子呼吸代谢关系研究,深入分析种子呼吸代谢及其影响因素的关系,从而完善种子呼吸代谢相关理论。③保持种子储藏活力的关键因素之一在于降低种子的呼吸强度和减缓劣变进程。在种子储藏仓库中除了设置测温仪、水分测定仪、发芽箱等设备,还应该增加呼吸检测仪器,监测储藏过程中种子的呼吸强度,及时了解种子的生理活动状态。开展低成本种子储藏呼吸CO2在线气体监测系统研制具有重要价值。④目前种子呼吸与种子活力的研究主要为定性研究,定量研究还相对较少。两者定量关系模型的研究和建立可为利用种子呼吸进行种子活力检测提供重要的理论支撑。此外,在种子呼吸与种子活力关系研究中,应将种子呼吸指标和种子活力参数(种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数)以及种子发育过程中内含物的变化情况相结合,全面分析种子呼吸强度与种子活力的定量关系,并以此为依据,探寻能够将种子呼吸强度作为有效判定种子活力的方法,特别应加强种子萌发前的呼吸与活力相关指标的研究。
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表 1 不同质量浓度油菜素内酯处理毛竹实生苗生长指标
Table 1. Effect of different concentration BR on growth index of Ph. edulis seedlings
处理 株高/cm 根长/cm 叶面积/cm2 总干质量/g 地上部分干质量/g 地下部分干质量/g 根冠比 ck 27.69±1.39 c 29.83±0.85 c 11.58±0.22 c 1.38±0.09 c 0.91±0.09 c 0.47±0.03 b 0.52±0.07 a E1 29.93±1.78 ab 29.07±1.22 c 11.98±0.30 bc 1.50±0.12 bc 1.03±0.11 bc 0.48±0.04 b 0.47±0.06 ab E2 30.19±1.48 ab 29.81±0.74 c 13.39±0.57 a 1.71±0.21 a 1.20±0.19 ab 0.51±0.03 ab 0.43±0.05 b E3 30.24±1.95 ab 30.21±1.13 bc 13.68±0.27 a 1.73±0.15 a 1.22±0.15 a 0.50±0.05 ab 0.42±0.08 b E4 30.60±1.88 a 33.84±1.20 a 13.32±0.71 a 1.74±0.20 a 1.21±0.18 ab 0.54±0.04 a 0.45±0.07 ab E5 28.51±1.45 bc 31.10±1.24 b 12.88±0.42 ab 1.64±0.18 ab 1.11±0.19 ab 0.52±0.03 a 0.49±0.11 ab 说明:同列比较,不同字母表示处理间差异显著(P<0.05), 相同字母表示处理间差异不显著(P>0.05) 表 2 不同质量浓度油菜素内酯处理毛竹实生苗光合色素质量分数
Table 2. Effect of different concentration BR on photosynthetic pigment content of Ph. edulis seedlings
处理 叶绿素a/(mg·g−1) 叶绿素b/(mg·g−1) 总叶绿素/(mg·g−1) 类胡萝卜素/(mg·g−1) ck 2.28±0.08 c 0.88±0.04 b 3.17±0.12 b 0.92±0.04 b E1 2.50±0.08 ab 1.01±0.06 a 3.51±0.14 a 1.06±0.04 a E2 2.41±0.11 b 0.96±0.08 ab 3.37±0.19 a 1.01±0.06 a E3 2.55±0.08 a 1.03±0.06 a 3.58±0.14 a 1.05±0.07 a E4 2.50±0.10 ab 1.03±0.07 a 3.53±0.17 a 1.07±0.05 a E5 2.50±0.08 ab 1.00±0.06 a 3.51±0.14 a 1.06±0.04 a 说明:同列比较,不同字母表示处理间差异显著(P<0.05),相同字母表示处理间差异不显著(P>0.05) 表 3 不同质量浓度油菜素内酯处理毛竹实生苗光合参数
Table 3. Effect of different concentration BR on photosynthetic parameters of Ph. edulis seedlings
处理 净光合速率/(µmol·m−2·s−1) 气孔导度/(mol·m−2·s−1) 胞间二氧化碳摩尔分数/(µmol·mol−1) 蒸腾速率/(mmol·m−2·s−1) ck 6.87±0.21 c 0.051±0.005 d 211.47±15.86 c 1.36±0.08 c E1 7.07±0.21 c 0.069±0.005 c 231.57±13.77 ab 1.48±0.13 bc E2 7.53±0.32 b 0.074±0.005 bc 223.91±17.69 bc 1.56±0.16 b E3 8.70±0.33 a 0.082±0.004 a 241.37±10.34 ab 1.75±0.08 a E4 8.42±0.33 a 0.077±0.003 ab 245.53±9.62 a 1.66±0.13 ab E5 7.49±0.41 b 0.074±0.006 bc 234.66±11.15 ab 1.59±0.15 ab 说明:同列比较,不同字母表示处理间差异显著(P<0.05),相同字母表示处理间差异不显著(P>0.05) 表 4 不同质量浓度油菜素内酯处理毛竹实生苗可溶性蛋白质、可溶性糖和淀粉质量分数
Table 4. Effect of different concentration BR on soluble protein,soluble sugar and amylum content of Ph. edulis seedlings
处理 可溶性蛋白质/(mg·g−1) 可溶性糖/(mg·g−1) 淀粉/(mg·g−1) 处理 可溶性蛋白质/(mg·g−1) 可溶性糖/(mg·g−1) 淀粉/(mg·g−1) ck 4.02±0.20 d 5.08±0.11 c 1.37±0.03 c E3 5.29±0.14 a 5.64±0.15 a 1.61±0.06 a E1 4.21±0.06 c 5.32±0.13 b 1.52±0.08 a E4 5.28±0.13 ab 5.17±0.20 bc 1.60±0.07 a E2 4.26±0.06 c 5.04±0.20 c 1.51±0.02 ab E5 5.10±0.08 ab 5.35±0.20 b 1.42±0.02 b 说明:同列比较,不同字母表示处理间差异显著(P<0.05),相同字母表示处理间差异不显著(P>0.05) 表 5 不同质量浓度油菜素内酯处理毛竹实生苗抗氧化酶活性
Table 5. Effect of different concentration BR on antioxidant enzyme activities of bamboo seedlings
组别 超氧化物歧化酶/
(×16.67 nkat·g−1)过氧化物酶/
(×16.67 nkat·g−1)过氧化氢酶/
(×16.67 nkat·g−1)组别 超氧化物歧化酶/
(×16.67 nkat·g−1)过氧化物酶/
(×16.67 nkat·g−1)过氧化氢酶/
(×16.67 nkat·g−1)ck 3 018.58±80.60 bc 43 031.11±2 231.96 c 46.81±1.47 c E3 3 219.58±106.30 a 49 306.67±1 573.26 ab 50.67±0.73 ab E1 2 978.00±102.19 c 46 871.11±1 625.14 b 46.96±2.57 c E4 3 202.99±99.55 a 48 937.78±2 994.76 ab 53.63±2.00 a E2 3 159.32±111.30 ab 46 404.44±1 779.30 b 48.44±0.73 bc E5 3 187.05±118.30 a 51 733.33±2 538.05 a 46.37±0.91 c 说明:同列比较,不同字母表示处理间差异显著(P<0.05),相同字母表示处理间差异不显著(P>0.05) -
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200161