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楠木是一类珍贵用材树种，包括樟科Lauraceae润楠属Machilus和楠属Phoebe植物及一些近缘类群，部分种类为国家二级重点保护野生植物。长期的人为破坏[1]，以及其自身天然更新不良等因素，中国楠木数量锐减。楠木零星散生于各类天然林，少有成片分布。天然林保护是在一定的生命周期和范畴内，为使资源继续顺应生态循环生长，同时能够保持资源价值不断提高的情况下，对各种森林资源进行持续的利用[2]。种间联结是植物群落重要的数量和结构特征之一，群落的种间关系能反映群落的稳定性。种间关系一般被划分为正联结、负联结和无关联。正联结是由于物种选择相同的生境或者2种物种相互依赖形成的，负联结是由于2种物种存在资源上的竞争或者根系中存在物理或化学因素的相互影响而形成的[3]。随着演替，森林群落结构趋于复杂和稳定[4]，群落内物种种间关系越来越复杂，生态位分化越合理，种间关系趋于正联结[5]。但森林群落的演替并不是一味向着正关联的方向进行的[6]。对群落种间联结的相关研究展现的多是种间竞争的结果或群落的现状[7]，关于群落种间联结的动态报道较少。目前，有关楠木的相关研究多在生态生理特征方面，如木材、育苗、叶片特征，而关于群落结构、种间关系等的相关研究较多的针对红楠Machilus thunbergii和紫楠Phoebe sheareri群落[8-9]，缺少楠木天然林群落动态特征和种间关系研究。浙江省建德市寿昌林场绿荷塘林区内存有亚洲最大的天然楠木林，其主要种类有红楠、紫楠、刨花润楠Machilus pauhoi、薄叶润楠Machilus leptophylla等，是研究天然林群落楠木发育和演替的理想场所。本研究分别以楠木作为优势树种和伴生树种的天然林样地作为对象，对调查样地内的楠木在不同林分条件下的乔木层、灌木层、草本层种间联结性进行了定量分析，揭示它们在天然林群落发育和演替过程中种间关联性动态变化规律，为楠木天然林的科学管理提供理论依据。
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研究区位于浙江省建德市寿昌林场绿荷塘林区内(29°25′45″~29°27′01″N，119°08′45″~119°11′0″E)，属千里岗山脉，地貌为低山丘陵，坡度为25°~45°，海拔200~700 m，顶峰海拔804 m。该林区面积约450 hm2，分布约370 hm2的天然常绿阔叶林，有木本植物30科300余种。该地区属亚热带季风气候，温暖湿润，四季分明，雨量充足。年平均气温为17.6 ℃，极端最低温−13.9 ℃，极端最高温42.2 ℃。年降水量1 700 mm，集中在4−6月，平均相对湿度为82%，年日照时数为1 762 h，全年无霜期265 d。土壤以黄壤为主，局部为侵蚀性红壤。土层厚度30~80 cm，呈酸性。
如图1所示：在以楠木为优势种的林内建立100 m×100 m样地(A)，并在相距1.35 km生境相似的地区，在以楠木为伴生种的林内建立样地(B)，由于场地限制，样地面积为100 m×40 m。2013年对楠木优势林(样地A)进行了1次割灌处理，对非目标树种的灌木进行伐除。对楠木伴生林样地B未采取任何经营管理措施。
图 1 样地设置
Figure 1. Sample plots for shrub layer survey
参照中国林业科学研究院多功能森林经营样地监测方法开展样地植被调查工作。将每个样地划分为20 m×20 m的乔木样方，标定所有样方内胸径≥5.0 cm的乔木。每个样地按照图1的方法在涂黑的乔木样方右下角设置1个5 m×5 m 的灌木层小样方，记录胸径＜5.0 cm，树高≥1.5 m 的木本植物，记录树种名称、胸径、树高。在每个灌木层小样方沿对角线设置3个1 m×1 m的草本层小样方，对树高＜1.5 m的幼苗和草本植物进行调查，调查指标包括植物种类、盖度、丛(株)数、平均高度等。为了方便计算，将楠木幼树划分至灌木层，幼苗划分至草本层。
利用2015和2019年的2次群落调查数据，分析群落乔木层、灌木层、草本层主要物种的种间关系。
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采用SCHLUTER[10]提出的方差比率法(
$ V_{\rm{R}} $ )检验群落物种间的总体关联性。$$ {V}_{{\rm{R}}}={S}_{{\rm{w}}}^{2}/{\delta }_{{\rm{w}}}^{2}\text{。} $$ (1) 式(1)中：VR为方差比率；总样方物种数方差
$S_{\rm{w}}^2 = \dfrac{1}{N}\displaystyle\sum\limits_{j = 1}^N {{{({T_j} - t)}^2}}$ ，$ t=\left({T}_{1}+{T}_{2}+{ \cdots +T}_{N}\right)/N $ ，$ N $ 为总样方数，t为样方物种数平均值，$ {T}_{j} $ 为第$ j $ 个样方物种数；总物种频度方差${\delta }_{{\rm{w}}}^{2}=\displaystyle\sum\limits_{i=1}^{S}{P}_{i}(1-{P}_{i})$ ，$ S $ 为总的物种数，$ {P}_{i} $ 为第$ i $ 个物种出现的样方数($ {n}_{i} $ )占总样方数($ N $ )的比例，$ {P}_{i}={n}_{i}/N $ ，$ {n}_{i} $ 为物种$ i $ 出现的样方数。在独立零假设下，VR期望值为1，表示群落种间整体无关联，VR＞1表示整体正联结，VR＜1表示整体负联结。采用统计量$ \omega $ ($ \omega =V_{\rm{R}} N $ )检验$ V_{\rm{R}} $ 偏离1的显著性，当${\textit{χ}}_{0.95}^{2}\left(N\right) \text{＜} \omega \text{＜}$ $ {\textit{χ}}_{0.05}^{2}\left(N\right) $ 时，认为整体关联不显著[11]。 -
根据物种在样方内是否出现的二元数据矩阵作为原始数据，以χ2检验为基础，结合联结系数(AC)和共同出现百分率(PC)对群落进行种间联结分析。
$ a $ 为2个物种都出现的样方数，$ b $ 、$ c $ 为只出现1个物种的样方数，$ d $ 为2个物种都不出现的样方数，在计算χ2及联结系数时，为避免$ a $ 、$ c $ 、$ d $ 为0，导致χ2及联结系数无法比较关联程度的情况，把$ a $ 、$ c $ 、$ d $ 为0的数值都加权为1[12]。χ2统计量能比较客观准确地判断种对联结的显著性，而共同出现百分率和联结系数却能体现出χ2检验不显著种对的联结性及其大小，同时共同出现百分率还能较准确地反映物种间正联结性的强弱[13]。 -
采用YATES连续矫正公式[14]：
$$ {\textit{χ} }^{2}=\frac{({\left|ad-bc\right|-0.5n)}^{2}n}{(a+b)(a+c)(b+d)(c+d)}\text{。} $$ (2) 若χ2
$ {\text{＜}} 3.841(P {\text{＞}} 0.05) $ 表示种对间无联结性，2种间基本独立；若3.841≤χ2≤6.635(0.01≤P≤0.05) ，表示种对间联结性显著；若χ2$ {\text{＞}} 6.635(P{\text{＜}} 0.01) $ ，表示种对间联结性极显著。 -
$${\text{若}}ad {\text{≥}} bc,\;{\text{则}}{A_{\rm{C}}} = \frac{{ad - bc}}{{(a + d)(b + d)}}\text{；}$$ (3) $${\text{若}}bc {\text{＞}} ad{\text{且}}d {\text{≥}} a,\;{\text{则}}{A_{\rm{C}}} = \frac{{ad - bc}}{{(a + b)(a + c)}}\text{；}$$ (4) $${\text{若}}bc {\text{＞}} ad{\text{且}}d {\text{＜}} a,\;{\text{则}}{A_{\rm{C}}} = \frac{{ad - bc}}{{(c + d)(b + d)}}\text{。}$$ (5) 式(3)~(5)中：AC为联结系数，其值域为[−1, 1]。AC越接近1，物种间正关联越强；越接近−1；物种间负关联越强；为AC=0，则表明物种间完全独立。
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$$ {P}_{{\rm{C}}}=\frac{a}{a+b+c}\text{。} $$ (6) 式(6)中：PC为共同出现百分率，表示物种间的联结程度[15]，可以避免联结系数受d影响太大而造成偏差。其值域为[0, 1]，PC=0时，表明种对无关联；PC=1时，表明种对关联程度最紧密。
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2015和2019年，楠木优势林样地的乔木层均记录到18个种，隶属8科15属，无物种退出或进入；2015年灌木层记录到7个种，隶属5科7属，2019年记录到11个种，隶属8科10属，2个物种退出灌木层，6个物种进入灌木层；2015年草本层记录到12个种，隶属9科11属，2019年记录到5个种，隶属4科5属，7个物种退出草本层。
2015年楠木伴生林样地的乔木层记录到27个种，隶属18科23属，2019年记录到25个种，隶属16科21属，2个物种退出乔木层；2015年灌木层记录到25个种，隶属17科24属，2019年记录到14个种，隶属为7科12属，17个物种退出灌木层，6个物种进入灌木层；2015年草本层记录到6个种，隶属6科6属，2019年记录到5个种，隶属4科4属，3个物种退出草本层，2个物种进入草本层。
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采用重要值[16]筛选群落乔木层的主要物种，只要某物种在2次群落调查中出现过1次，重要值≥1.0%，则把它认作群落中的主要物种。由表1可见：样地A有11个主要物种，2015年楠木个体占总个体数的84.76%，2019年占85.49%。样地B有16个主要物种，2015年楠木个体数占15.61%，2019年占16.10%。
表 1 2015和2019年绿荷塘林区A、B样地主要乔木物种及其重要值
Table 1. Dominant species and importance value of the tree layer of plot A and plot B in 2015 and 2019
楠木优势林(样地A) 楠木伴生林(样地B) 编号 物种 2015年 2019年 2015年 2019年 重要值/
%个体密度/
(株·m−2)重要值/
%个体密度/
(株·m−2)重要值/
%个体密度/
(株·m−2)重要值/
%个体密度/
(株·m−2)1 刨花润楠 Machilus pauhoi 46.98 162 47.93 161 2 紫楠 Phoebe sheareri 22.86 104 22.68 98 1.69 8 1.75 8 3 秀丽锥 Castanopsis jucunda 8.64 24 8.12 22 2.92 23 2.92 20 4 甜槠 Castanopsis eyrei 3.59 9 3.48 8 16.64 145 17.14 143 5 青冈 Cyclobalanopsis glauca 3.12 8 3.19 8 16.67 183 16.93 170 6 红楠 Machilus thunbergii 2.38 5 2.43 5 5.83 50 6.05 50 7 黄檀 Dalbergia hupeana 2.06 4 1.59 3 8 薄叶润楠 Machilus leptophylla 2.65 7 2.70 7 8.51 90 9.05 85 9 樟树 Cinnamomum camphora 1.45 2 1.47 2 10 栾树 Koelreuteria paniculata 1.14 2 1.17 2 11 石栎 Lithocarpus glaber 1.03 1 1.05 1 16.45 165 16.18 148 12 赤杨叶 Alniphyllum fortunei 5.21 45 4.56 38 13 花榈木 Ormosia henryi 1.01 5 1.05 5 14 冬青 Ilex chinensis 1.02 5 1.06 5 15 杉木 Cunninghamia lanceolata 9.79 165 10.13 160 16 厚皮香 Ternstroemia gymnanthera 3.08 35 3.23 35 17 苦槠 Castanopsis sclerophylla 1.90 8 1.98 8 18 八角枫 Alangium chinense 1.00 5 1.03 5 19 老鼠矢 Symplocos stellaris 0.99 5 1.02 5 20 檫木 Sassafras tzumu 1.22 10 0.70 3 -
由表2可见：样地A，2015年灌木层有7个树种，楠木个体数量占比16.13%，2019年有11个树种，楠木个体数量占比7.14%；样地B，2015年灌木层有25个物种，楠木个体数量占比18.35%，2019年有14个物种，楠木个体数量占比0.91%。
表 2 2015和2019年绿荷塘林区A、B样地灌木层物种及其重要值
Table 2. Species and importance value of the shrub layer of plot A and plot B in 2015 and 2019
编号 物种 重要值/% 编号 物种 重要值/% 样地A 样地B 样地A 样地B 2015年 2019年 2015年 2019年 2015年 2019年 2015年 2019年 1 菝葜 Smilax china 1.45 19 毛花连蕊茶 Camellia fraterna 15.04 2 薄叶润楠 Machilus leptophylla 10.90 20 刨花润楠 Machilus pauhoi 7.18 7.02 3 茶 Camellia sinensis 1.61 10.84 21 青冈 Cyclobalanopsis glauca 13.29 1.31 27.80 4 赤楠 Syzygium buxifolium 4.65 22 山矾 Symplocos sumuntia 7.03 2.44 5 赤杨叶 Alniphyllum fortunei 2.75 23 杉木 Cunninghamia lanceolata 4.16 6 豆腐柴 Premna microphylla 2.47 24 石斑木 Rhaphiolepis indica 1.36 7 杜茎山 Maesa japonica 6.78 25 石栎 Lithocarpus glaber 2.89 13.33 8 格药柃 Eurya muricata 25.59 1.87 26 甜槠 Castanopsis eyrei 6.80 9 枸杞 Lycium chinense 1.66 27 乌药 Lindera aggregata 10.19 3.05 10 红楠 Machilus thunbergii 4.50 28 秀丽锥Castanopsis jucunda 29.23 4.12 5.50 7.37 11 厚皮香 Ternstroemia gymnanthera 6.27 3.40 29 野桐 Mallotus japonicus 3.65 0.89 12 花榈木 Ormosia henryi 1.06 30 油茶 Camellia oleifera 25.60 10.05 5.50 13 黄檀 Dalbergia hupeana 6.11 31 油桐 Vernicia fordii 0.89 14 檵木 Loropetalum chinense 6.11 7.24 1.61 32 浙江楠 Phoebe chekiangensis 13.69 4.05 15 荚蒾 Viburnum dilatatum 0.89 33 栀子 Gardenia jasminoides 4.12 3.03 16 矩形叶鼠刺 Itea oblonga 6.51 6.86 3.70 34 朱砂根 Ardisia crenata 4.38 17 老鸦糊 Callicarpa giraldii 1.24 35 紫楠 Phoebe sheareri 12.47 15.25 18 毛冬青 Ilex pubescens 1.19 -
由表3可见：样地A，2015年草本层有12个物种，楠木个体数量占比1.23%；2019年有5个物种，楠木占比29.58%；样地B，2015年草本层有6个物种，楠木个体数量占比21.28%；2019年有5个物种，楠木占比5.54%。
表 3 2015和2019年绿荷塘林区A、B样地草本层物种及其重要值
Table 3. Species and importance value of the herb layer of plot A and plot B in 2015 and 2019
编号 物种 重要值/% 编号 物种 重要值/% 样地A 样地B 样地A 样地B 2015年 2019年 2015年 2019年 2015年 2019年 2015年 2019年 1 白结香 Edgeworthia albiflora 5.31 9 鳞毛蕨 Dryopteris sp. 22.11 2 薄叶润楠 Machilus leptophylla 26.96 4.50 10 蔓赤车 Pellionia scabra 3.95 3 狗脊蕨 Woodwardia unigemmata 25.84 11 刨花润楠 Machilus pauhoi 46.04 12.54 4 寒莓 Rubus buergeri 0.80 1.37 31.22 12 三穗薹草Carex tristachya 5.05 16.97 14.26 5 红楠 Machilus thunbergii 1.03 5.92 13 细柄薯蓣Dioscorea tenuipes 1.09 6 蕨 Pteridium aquilinum var. latiusculum 5.38 14.77 2.60 35.31 14 鱼腥草Houttuynia cordata 0.95 7 紫萁 Osmunda japonica 10.52 15 苎麻Boehmeria nivea 16.95 15.42 8 里白 Hicriopteris glauca 5.51 16 紫楠Phoebe sheareri 2.92 22.02 -
根据表4可知：2015和2019年，楠木优势林样地乔木层种间总体关联性呈显著正联结；灌木层2015和2019年种间总体均呈不显著负联结；草本层2015年呈不显著正联结，2019年呈显著负联结，种间关系由正转负。说明乔木层物种结构相对稳定，灌木层种间关系松散，草本层结构遭到破坏。楠木伴生林样地乔木层2015年种间总体关联性呈不显著正联结，2019年呈不显著负联结；灌木层2015年种间呈不显著正联结，2019年呈不显著负联结；草本层2015呈不显著负联结，2019年呈显著负联结。乔木层和灌木层种间关系由正转负，说明群落稳定性遭到破坏；草本层种间关系松散，结构更加不稳定。
表 4 绿荷塘林区A、B样地2015和2019年种间总体关联性
Table 4. Overall associations of plot A and plot B in 2015 and 2019
样地 层次 年份 方差比率 检验统计量 临界值 结果 楠木优势林(样地A) 乔木层 2015 1.69 42.30 [14.61, 37.65] 显著正联结 2019 1.69 42.25 [14.61, 37.65] 显著正联结 灌木层 2015 0.45 4.05 [3.33, 16.92] 不显著负联结 2019 0.78 7.02 [3.33, 16.92] 不显著负联结 草本层 2015 1.30 35.18 [16.15, 40.11] 不显著正联结 2019 0.22 5.98 [16.15, 40.11] 显著负联结 楠木伴生林(样地B) 乔木层 2015 1.12 11.16 [3.94, 18.31] 不显著正联结 2019 0.99 9.88 [3.94, 18.31] 不显著负联结 灌木层 2015 1.22 6.09 [1.15, 11.07] 不显著正联结 2019 0.41 2.05 [1.15, 11.07] 不显著负联结 草本层 2015 0.80 11.99 [7.26, 25.00] 不显著负联结 2019 0.24 3.57 [7.26, 25.00] 显著负联结 -
从图2可知：2015和2019年无主要树种退出乔木层，11个主要树种组成55个种对。χ2检验结果显示：2015年55个种对均表现为正关联，2019年55个种对均表现为不显著正关联。联结系数(
$ A_{\rm{C}} $ )结果显示：正联结种对减少8对，负联结种对减少7对。共同出现百分率($ P_{\rm{C}} $ )结果显示：2015和2019年，均有2个种对表现为极显著关联，1个种对表现为显著关联。可见，2015和2019年，乔木层中刨花润楠与其他树种负关联增强；红楠与甜槠的正联结减弱，与黄檀、紫楠正联结增强；薄叶润楠与乔木层其他树种的关联性相对稳定；紫楠与其他树种的正负关联比增大，与红楠、青冈、樟树正关联增强。
图 2 楠木优势林样地乔木层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 2. Semi-matrix of inter-specific correlations of the tree layer of plot A
图3显示：灌木层2015年由7个主要树种组成21个种对，2019年由11个主要树种组成55个种对。χ2检验结果显示，2015年21个种对均呈不显著正关联，2019年55个种对均呈不显著正关联。联结系数结果中，2015年，11个种对呈显著正关联；1个种对呈显著负联结。2019年，8个种对呈极显著正关联，16个种对呈显著正关联；1个种对呈显著负关联。共同出现百分率结果显示，2015和2019年，均有1个种对呈不显著关联，其余种对呈无关联。以上结果表明：2015和2019年，灌木层的楠木主要为刨花润楠和紫楠。刨花润楠与其他灌木树种均表现为正关联，其中与檵木、秀丽锥的正联结加强；紫楠与其他灌木树种正关联性加强，但与檵木的联结性由正转负。
图 3 楠木优势林样地灌木层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 3. Semi-matrix of inter-specific correlations of the shrub layer of plot A
从图4可知：草本层中，2015年由12个主要树种组成66个种对，2019年由5个主要树种组成10个种对。χ2检验结果显示：2015年3个种对呈显著正关联，2019年10个种对均呈不显著正关联。联结系数结果中：2015年，13个种对呈显著正关联，18个种对呈显著负关联；2019年，5个种对呈显著正关联，3个呈显著负联结。共同出现百分率结果显示：2015年，2个种对呈极显著关联，1个种对呈显著关联；2019年，10个种对均呈不显著正关联。以上结果表明：2015−2019年，草本层的物种变化较大，2015年主要的楠木树种有红楠、刨花润楠、紫楠，2019年红楠退出草本层。刨花润楠与大部分草本层物种呈负联结，与苎麻、紫楠的负联结增强。紫楠与刨花润楠的负联结加强，与蕨和苎麻的正联结相对稳定。
图 4 楠木优势林样地草本层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 4. Semi-matrix of inter-specific correlations of the herb layer of plot A
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根据图5：2015和2019年，乔木层无主要树种退出，16个主要树种组成120个种对。χ2检验结果显示：2015年，115个种对呈不显著正关联，5个种对呈无关联；2019年，105个种对均呈不显著正关联，15个种对呈无关联。联结系数结果显示：正联结种对6对，负联结种对为44对。共同出现百分率结果显示：2015年，20个种对呈极显著关联，11个种对呈显著正关联；2019年，20个种对呈极显著关联，13个种对呈显著关联。可见，2015和2019年，乔木层中，红楠与其他树种之间的正负关联比大于1，且关联相对稳定；紫楠与其他树种之间的正负关联比增大；薄叶润楠与其他树种的正负关联比2015年大于1，2019年小于1，与秀丽锥、甜槠、老鼠矢、苦槠、花榈木、八角枫的负关联增强。
图 5 楠木伴生林样地乔木层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 5. Semi-matrix of inter-specific correlations of the tree layer of plot B
根据图6：灌木层中，2015年由25个主要树种组成300个种对，2019年由14个主要树种组成91个种对。χ2检验结果显示：2015年46个种对呈显著正关联；2019年，105个种对均呈不显著正关联。联结系数结果显示：2015年161个种对呈显著正关联，62个种对呈显著负关联；2019年47个种对呈显著正关联，13个种对呈显著负关联。共同出现百分率结果显示：2015年，39个种对呈极显著关联；2019年，4个种对呈极显著关联。可见，2015和2019年，灌木层的树种变化较大，2015年灌木层的楠木树种主要为薄叶润楠，2019年主要为红楠。2015年，薄叶润楠与其他树种的正负关联比小于1。2019年，红楠与青冈、石栎、甜槠呈显著负关联，与其余树种呈正关联。
图 6 楠木伴生林样地灌木层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 6. Semi-matrix of inter-specific correlations of the shrub layer of plot B
根据图7：草本层中，2015年由6个主要树种组成15个种对，2019年由5个主要树种组成10个种对。χ2检验结果显示：2015年15个种对均呈不显著正关联；2019年，10个种对均呈不显著正关联。联结系数结果中：2015年6个种对呈显著正关联，1个种对呈显著负关联；2019年8个种对呈显著正关联，2个种对呈显著负关联。共同出现百分率结果显示：2015和2019年所有种对均呈无关联。表明2015和2019年薄叶润楠幼苗与草本层其他的植物正负关联比增加；2019年红楠进入草本层，与其他植物均呈正联结。
图 7 楠木伴生林样地草本层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 7. Semi-matrix of inter-specific correlations of the herb layer of plot B
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经总体关联性检验、χ2检验、联结系数和共同出现百分率的分析，研究区楠木优势林样地和伴生林样地的乔木层、灌木层、草本层均处于不稳定阶段。在天然楠木优势林样地中，薄叶润楠与乔木层其他树种之间的关联性相对稳定，但缺少更新层。红楠在乔木层与其他树种之间的关联性相对稳定，但在灌木层和草本层出现了更新不良的状况，这可能由于其幼苗的存活率依赖于充足的阳光所造成的[17]。紫楠在乔木层与其他树种的正关联关系加强，拥有良好的更新层，可能是由于其幼苗的光补偿点较低，对弱光的利用能力较强，在光强弱的环境下更有利于正常生长[18]。刨花润楠拥有完整的更新层，作为乔木层的优势种，与其他树种负联结增强，其幼苗能在光照强度较弱的环境下正常生长，但在草本层与其他物种之间的负联结明显，可能是由于其幼苗抗旱能力较差，与其他物种竞争土壤水分导致的[19]。
在楠木伴生林样地中，薄叶润楠作为乔木层的优势树种之一，与其他物种负联结增强，在灌木层和草本层也表现出更新不良的状况。红楠在乔木层与其他物种正联结增强，少形成负联结，在进入灌木层和草本层后也与其他物种的呈正联结，可见红楠能够和大多数物种稳定共存，具有良好的更新能力。紫楠在乔木层与其他树种正关联增强，但是缺少更新层。此前也有研究表明：在常绿阔叶林中优势树种的种内竞争比种间竞争激烈，种内竞争最激烈的优势树种与其他优势树种的种间竞争强度也是最高的[18]，和其他物种在空间和资源上竞争激烈[20]。
通过对比2个样地内主要楠木树种与其他树种之间的联结性发现：在楠木优势林样地中形成负联结种对的物种，却在楠木伴生林样地中形成正联结种对。如2015年薄叶润楠与秀丽锥在天然楠木优势林呈负联结，但在天然楠木伴生林样地内呈正联结。这可能是由于群落生境的异质性和微环境的变化，使同一种植物在不同的林分具有不同的生态位，从而影响它与其他物种之间的关系[21]。
种对间的正关联主要是由于2个物种具有相似的环境需要、相似的生物学特征或相似的生态位；负联结主要是由于物种之间存在竞争，相互排斥。林分中下层的植物个体的生长和演替，除了受到土壤、水分等环境因子影响外，还要受到乔木层的影响，常绿阔叶林郁闭度较高，林下光照弱，可能会加剧林分中下层对光照的竞争，从而出现林分断层现象。林分各层次的正关联性越强，群落物种之间的互补性越强，能够更加充分地利用资源，增强群落的稳定性[22]。根据这2个群落种间联结动态变化的特点，在天然楠木林中，将楠木作为目标树种进行管理与保护时，可采用间伐、择伐等抚育方法，保留与楠木有显著正关联的树种，伐除负关联的树种，缓和种间矛盾；疏伐上层高大乔木，增加林窗，以满足林分更新层对光照的需求，保护其更新层，以形成完整的垂直结构。
Interspecific association dynamics of Nanmu natural forest in Jiande, Zhejiang Province
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摘要:
目的 以浙江省建德市寿昌林场绿荷塘林区内楠木优势程度不同的天然林作为研究对象，进行种间关系的分析，揭示楠木在天然林群落发育和演替过程中种间关联性动态变化规律。 方法 分别在2015和2019年，对2个楠木优势程度不同的天然林样地进行调查，基于2×2联列表，通过χ2检验、联结系数、共同出现百分率，研究调查样地内楠木在不同林分条件下，乔木层、灌木层、草本层的种间联结性。 结果 2015和2019年，天然楠木优势林样地乔木层总体种间关联性均呈显著正联结，灌木层和草本层种间总体关联性趋向于负联结；天然楠木伴生林乔木层、灌木层、草本层种间总体关联性趋向于负联结。在这2种天然林中，楠木在乔木层与其他树种之间的联结相对独立，在灌木层和草本层的种间竞争较为激烈，且均有楠木在垂直方向上表现出林分断层现象。 结论 在天然林中，将楠木作为目标树种进行管理与保护时，可采用间伐、择伐等抚育方法，保留与楠木有显著正关联的树种，伐除负关联的树种，缓和种间矛盾；疏伐上层高大乔木，增加林窗，以满足林分更新层对光照的需求，保护其更新层，以形成完整的垂直结构。图7表4参22 Abstract:Objective This study aims to investigate the interspecific relationship of natural forest of Nanmu with different dominant degrees in Shouchang Forest Farm of Jiande City, Zhejiang Province, so as to reveal the dynamic change rules of the interspecific association in the process of community development and succession. Method In 2015 and 2019, two natural forest plots with different dominance of Nanmu were investigated. Based on the 2×2 contingency table, the interspecific association of tree layer, shrub layer and herb layer of Nanmu under different stand conditions was studied by χ2 test, association coefficient, and percentage of co-occurrence. Result In 2015 and 2019, the overall interspecific association of tree layer was significantly positive, while that of shrub layer and herb layer tended to be negative. In the natural stands with Nanmu as associated tree, the correlation among tree layer, shrub layer and herb layer tended to be negative. In both stands, Nanmu showed stand fault phenomenon in vertical direction. In the tree layer, the association between Nanmu and other species was relatively independent, while the interspecific competition between Nanmu and other species in shrub layer and herb layer was intense. Conclusion In natural forests, thinning, selective cutting and other tending methods can be adopted when Nanmu is taken as the target tree species for management and protection. The tree species with significant positive correlation with Nanmu are retained and the tree species with negative correlation are cut down to ease the interspecific contradiction. Thinning tall trees in the upper layer and increasing the forest gap can meet the needs of illumination for renewal layer. Protecting the renewal layer is conducive to the formation of a complete vertical structure. [Ch, 7 fig. 4 tab. 22 ref.] -
Key words:
- Nanmu /
- interspecific association /
- natural forest /
- Jiande of Zhejiang Province
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麸皮是小麦Triticum aestivum加工工业的副产物，约占小麦籽粒质量的26%。小麦麸皮中含有丰富的阿拉伯木聚糖，占小麦麸皮干质量的18.8%~21.4%[1]。虽然小麦麸皮在食品工业中有应用，但是大部分小麦麸皮被用作动物饲料或酿造原料。此外，小麦麸皮未被充分利用及产生的废物也会造成环境问题。
全球范围内，中国的核桃Juglans regia种植量稳居首位。随着核桃产业的迅猛发展，核桃榨油副产物——核桃饼粕数量急剧增加。这些副产品不仅对环境造成了负担，而且在一定程度上阻碍了核桃类产品的进一步开发和利用[2]。为了突破这一瓶颈，利用核桃饼粕生产核桃肽(WP)，是对核桃饼粕的综合利用、实现核桃饼粕的价值增值、开辟核桃饼粕的应用途径，成为核桃加工新的利润增长点，但是制备核桃活性多肽在提高核桃粕工业价值的同时，也会使生产成本大幅提升[3]。
美拉德反应是还原糖的羰基与氨基酸、肽或蛋白质的氨基之间复杂的非酶褐变反应[4−5]，具有绿色、高效、温和等优点，被认为是修饰天然蛋白质结构和功能特性的最有前途的方法之一[6]，可以改善蛋白或肽的乳化性、发泡性；增加溶解度、抗菌活性、抗氧化性、热稳定性；改善食物质地、风味等[7]。目前大多研究集中在大豆肽、鱼肽等肽类与碳水化合物的美拉德反应方面，但有关核桃肽的研究较少。因此，本研究以核桃肽、阿拉伯木聚糖(AX)和低聚木糖(XOS)为原料，研究阿拉伯木聚糖、核桃肽及其美拉德反应产物理化性质的变化以及糖基化对核桃肽功能特性的影响，为核桃肽功能性食品的开发提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
材料主要包括麸皮(徐州宏昌)、核桃粕(长春)、低聚木糖(上海源叶)。
1.2 方法
1.2.1 样品的制备
基于前期研究结果[8]，核桃肽通过酶促水解制备。按质量体积比为9∶100的料液比在核桃粉中加入去离子水，进行15 min超声后，在90 ℃条件下处理15 min，冷却至50 ℃，用1 mol·L−1的氢氧化钠调至pH 9.0，加入7 000 ×16.67 nkat·g−1的碱性蛋白酶，在50 ℃下搅拌2 h，沸水浴15 min以灭活酶，通过4 500 r·min−1离心15 min分离水解物的可溶性和不溶性部分，将核桃肽的可溶性部分冷冻干燥备用。
基于前期研究结果[9]，阿拉伯木聚糖通过碱提醇沉法制备。按质量体积比为1∶20的料液比在麸皮中加入去离子水，加入耐高温的α-淀粉酶，在95 ℃、pH 6.0条件下持续搅拌3 h。冷却至室温后加入糖化酶，然后在37 ℃、pH 4.5条件下搅拌过夜，离心得到沉淀，烘干。沉淀按质量体积比为1∶20的料液比加入0.2 mol·L−1 的氢氧化钠溶液，常温搅拌提取12 h。离心并收集上清液，上清液pH调至4.0。上清液中加入无水乙醇，离心得到粗多糖沉淀，加入适量去离子水复溶沉淀，加入蛋白酶持续搅拌4 h，然后灭活10 min并再次离心去除蛋白。取上清液进行透析后，经离心除去不溶性多糖，收集上清液进行旋蒸浓缩后冻干，得到阿拉伯木聚糖样品，保存备用。
将1 g核桃肽、2 g阿拉伯木聚糖或低聚木糖溶于100 mL去离子水中，之后将样品进行冻干，收集冻干粉末，放置于预热到80 ℃的干燥器中，利用饱和溴化钾溶液控制体系内相对湿度为79%，反应5 h得到核桃肽的糖基化产物。将产物加蒸馏水溶解，进行透析和离心，以去除游离氨基酸和不溶性成分。
1.2.2 理化性质的测定
(1)蛋白质量分数测定参考GB
5009.5 —2016凯氏定氮法[10]，根据标准曲线，采用BCA试剂盒法进行测定。(2)总糖质量分数测定使用苯酚-硫酸法[11]，根据标准曲线，测定波长490 nm处的吸光度。
(3)溶解度测定：称取10 mg的阿拉伯木聚糖、核桃肽或糖基化产物于2 mL离心管中，加入1 mL去离子水，在室温下混合90 min(每30 min摇匀5 s)，9 000 r·min−1离心10 min，去除上清液，将离心管及内部沉淀真空冷冻干燥后称量[12]。每份样品平行测定3次。
(4)根据标准曲线，相对分子量测定采用高效液相色谱仪(HPLC)。①多糖分子量测定[13]：以不同分子量的葡聚糖(分子量分别为10、40、70、500、2 000 kDa)作为标准品。色谱条件如下：Ultrahydrogel Column Linear凝胶色谱柱(10 μm，7.8 mm×300.0 mm)，柱温为40 ℃，流速为0.6 mL·min−1，流动相为0.1 mol·L−1的硝酸钠溶液，进样量为20 μL，运行时间为25 min。②肽分子量测定[14]：以不同分子量的物质作为标准品。色谱条件如下：TSKgel 2000 SWXL色谱柱(5 μm，7.8 mm×300.0 mm)，柱温为30 ℃，流速为0.5 mL·min−1，流动相为V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=450∶550∶1，进样量为20 μL，运行时间为40 min。
(5)单糖组成成分的测定采用气相色谱法测定阿拉伯木聚糖的单糖组成，参考WANG等[15]的方法，并稍作修改。以标准单糖(鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖)做混合标准单糖简称混标。称取5 mg阿拉伯木聚糖或标准品于三氟乙酸中，120 ℃水解4 h后用硼氢化钠还原，再经V(乙酸酐) ∶V(吡啶)=1∶1进行乙酰化，过0.22 μm有机滤膜待测。测定参数如下：HP-5MS色谱柱，进样口温度为250 ℃，进样量为2 μL，流速为1.0 mL·min−1，氮气载气分流体积比为1∶20。
1.2.3 接枝度和游离氨基测定
参考文献[16]的方法测定接枝度。精准称取40 mg的邻苯二甲醛(OPA)溶于1 mL的甲醇中，与质量浓度为20%的十二烷基硫酸钠(SDS) 2.5 mL、0.1 mol·L−1的四硼酸钠25.0 mL以及100.0 μL的β-巯基乙醇混合，然后用蒸馏水定容至50.0 mL，得到OPA试剂，现配现用。测定时，在200 μL样品溶液加入4 mL的OPA试剂，室温避光保存5 min。然后测定波长340 nm处的吸光度。以OPA试剂中加入200 μL蒸馏水的混合物作为空白。同时，用L-亮氨酸标准溶液(0~0.5 g·L−1)校准曲线计算游离氨基质量浓度。
1.2.4 褐变指数测定
糖基化产物用蒸馏水分别稀释至0.05和0.50 g·L−1，以蒸馏水作为空白对照，分别在波长294和420 nm处测定吸光度，重复3次取平均值。波长294 nm处的吸光度表示美拉德反应的中间产物含量；波长420 nm处的吸光度表示反应过程中最终产物含量，例如类黑素[17]。
1.2.5 粒径和Zeta电位分析
粒径是影响肽功能特性的重要因素之一，因此分析糖基化改性前后核桃肽的平均粒径。使用Malvern Mastersizer 2000型激光粒度仪和Hydro 2000S取样装置测定样品的平均粒径。使用乙醇作为分散剂材料来读取样品，每个样品平行测量3次，最后取平均值。Zeta电位是表征分散系稳定性的重要指标之一。使用Malvern Zetasizer Nano-Z设备测量样品的Zeta电位，以2 g·L−1的质量浓度制备样品溶液，在室温下测定溶液的Zeta电位，每个样品平行测量3次，最后取平均值[18]。
1.2.6 扫描电镜分析
将待测样品涂抹于导电胶的表面，喷涂约10 nm的电镀层，在15 kV加速电压下进行电镜扫描，放大500倍[19]，观察阿拉伯木聚糖、低聚木糖、核桃肽以及其糖基化产物的微观形态。
1.2.7 差示扫描量热分析
差示扫描量热法是评估蛋白质、肽等物质热稳定性的常用技术手段，可通过变性温度(Td)和焓值变化(ΔH)来表示稳定性的大小。Td用于描述蛋白的热稳定性，而ΔH则表示克服变性过程中非共价所需的能量。在通氮气条件下，利用差示扫描量热仪对样品的热稳定性进行测定。将5~10 mg样品装入DSC坩埚中，采用铝片进行密封处理。仪器参数设定如下[20]：升温速率为10 ℃·min−1，温度为25~110 ℃，气体流速为50 mL·min−1。以空铝坩埚作为空白对照。
1.2.8 巯基及二硫键测定
在糖基化反应中，游离巯基和二硫键交换在蛋白质交联和聚集中起着重要作用。参考文献[21]，准确称取40 mg 5,5-硫硝基苯甲酸溶于10 mL的Tris-甘氨酸缓冲液(0.086 mol·L−1 Tris，0.090 mol·L−1甘氨酸，4.000 mmol·L−1乙二胺四乙酸，pH 8.0)中，配制成Ellman试剂。用Tris-HCl缓冲液将样品配制成质量浓度为6 g·L−1的溶液，在10 000 r·min−1条件下离心10 min。吸取2 mL离心后的样品，加入 80 μL Ellman试剂混均，反应5 min，测定波长412 nm处的吸光度，即为游离巯基质量摩尔浓度。吸取2 mL样品上清液，加入β-巯基乙醇溶液(体积分数为0.2%)混匀，反应2 h后加入4 mL三氯乙酸溶液(质量浓度为12%)，反应1 h，10 000 r·min−1条件下离心10 min，再用三氯乙酸溶液重复洗涤沉淀，将沉淀用3 mL Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)溶解，测定波长412 nm处的吸光度，即为总巯基质量摩尔浓度。
1.2.9 抗氧化活性测定
2, 2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力测定参考LIU等[22]的方法，2, 2-二苯基-1-苦味肼(DPPH)自由基清除能力测定参考SUN等[23]的方法，羟自由基清除能力测定参考ZHANG等[24]的方法，氧自由基吸收能力(ORAC)测定参考ZHANG等[25]的方法。
1.3 数据分析
采用SPSS 26.0进行t检验和方差分析，结果以平均值±标准差表示，显著水平为0.05。利用Origin 2022作图。
2. 结果与分析
2.1 阿拉伯木聚糖的理化性质分析
通过高效液相色谱图(图1A)可知：信号峰出现在13.56 min时，主要为高相对分子量组分。通过气相色谱图(图1B)可知：混标从左至右出峰顺序为阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)，发现阿拉伯木聚糖主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖组成。从表1可见：阿拉伯木聚糖的蛋白和总糖质量分数分别为0.73%和81.39%，相对分子量为413.45 kDa，阿拉伯糖和木糖的质量分数之和约占整体的90%。
图 1 阿拉伯木聚糖的高效液相色谱图(A)和气相色谱图(B)Figure 1 High performance liquid chromatogram (A) and gas chromatogram (B) of arabinoxylan表 1 阿拉伯木聚糖的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of arabinoxylan样品 相对分子量/kDa 总糖质量分数/% 蛋白质量分数/% 溶解度/% 各单糖质量分数/% 阿拉伯糖 木糖 葡萄糖 半乳糖 阿拉伯木聚糖 413.45±1.98 81.39±2.05 0.73±0.11 72.00±2.65 61.52±2.10 27.27±2.48 8.48±0.45 2.73±0.07 2.2 美拉德反应程度分析
为确定核桃肽-阿拉伯木聚糖的反应产物(WP-AX)和核桃肽-低聚木糖的反应产物(WP-XOS)的美拉德反应程度，对接枝度和褐变程度进行了分析。如图2A所示：WP-AX在美拉德反应前后的游离氨基质量浓度分别为0.10和0.09 g·L−1，WP-XOS在美拉德反应前后的游离氨基质量浓度分别为0.09和0.04 g·L−1，表明游离氨基质量浓度在美拉德反应后有所降低。经计算，WP-AX、WP-XOS的接枝度分别为12.31%±3.52%和54.46%±3.26%，表明核桃肽中分别有12.31%和54.46%的游离氨基在美拉德反应后分别与阿拉伯木聚糖和低聚木糖结合。
图 2 美拉德反应前后对游离氨基(A)、中间产物生成量(B)和褐变程度(C)的影响Figure 2 Effect of Maillard reaction on free amino groups (A), intermediate product formation (B) and browning degree (C)D(294)和D(420)能够分别反映美拉德反应中无色中间体化合物生成量和糖基化产物褐变程度[26]。吸光度越低，褐变程度越小，说明糖基化反应程度越小，反之越大。如图2B所示：WP-AX和WP-XOS的中间产物显著上升(P＜0.05)，而且WP-XOS比WP-AX产生了更多的中间产物——还原酮和高级产物类黑素。如图2C示：WP-XOS的褐变程度具有显著差异(P＜0.05)，且WP-XOS的褐变程度明显高于WP-AX。
2.3 分子量分布分析
核桃肽在美拉德反应后的分子量分布如图3所示。图3A为核桃肽分子量的HPLC洗脱，核桃肽中存在多种大小不一的多肽片段，其分子量主要分布在3 000 Da以下，其中小于2 000 Da的占64.35%，小于1 000 Da的占37.28%，表明核桃肽富含由2~10个氨基酸残基组成的寡肽。图3B为WP-AX分子量的HPLC洗脱，WP-AX小于1 000 Da的占43.59%，相比于核桃肽，WP-AX寡肽部分的含量有一定程度的提高。图3C为WP-XOS分子量的HPLC洗脱，而WP-XOS小于1 000 Da的只占26.30%，但分子量大于3 000 Da部分占40.20%，相对于核桃肽有明显的提高。这2种不同的情况可能是因为肽在美拉德反应过程中存在2种转化方式：①肽直接参与美拉德反应生成产物；②通过热降解形成小分子肽，这些小分子肽再参与美拉德反应生成产物，说明美拉德反应的最佳肽段可能存在原料差异性。
图 3 WP(A)、WP-AX(B)、WP-XOS(C)的高效液相色谱图(HPLC)Figure 3 High performance liquid chromatograms (HPLC) of WP (A), WP-AX (B), and WP-XOS (C)2.4 巯基及二硫键质量摩尔浓度分析
如表2所示：与核桃肽相比，引入碳水化合物进行糖基化后，WP-AX和WP-XOS的游离巯基和总巯基显著增加(P＜0.05)。与WP-AX相比，WP-XOS的二硫键质量摩尔浓度更高(P＜0.05)。因此，可推断出WP-XOS的结构更稳定。
表 2 WP、WP-AX和WP-XOS的巯基及二硫键质量摩尔浓度分析Table 2 Analysis of thiol and disulfide bond content in WP, WP-AX, and WP-XOS样品 总糖质量分数/% 蛋白质量分数/% 溶解度/% 总巯基/(μmol·g−1) 游离巯基/(μmol·g−1) 二硫键/(μmol·g−1) WP 9.96±0.24 c 77.28±0.10 a 99.68±0.55 a 7.49±0.01 c 5.66±0.25 c 0.91±0.12 b WP-AX 36.27±0.77 a 23.82±0.30 c 94.75±1.19 b 24.79±0.02 a 23.01±0.28 a 0.89±0.13 b WP-XOS 19.18±0.75 b 50.15±1.11 b 96.35±1.56 b 10.97±0.03 b 7.18±0.23 b 1.90±0.10 a 说明：WP为核桃肽；WP-AX为核桃肽和阿拉伯木聚糖的美拉德反应产物；WP-XOS为核桃肽和低聚木糖的美拉德反应产物。同列不同小写字母表示不同样品间差异显著(P＜0.05)。 2.5 粒径分布和Zeta电位分析
由图4A可知：未处理的核桃肽颗粒相对较大，经过糖基化反应后，WP-AX和WP-XOS的粒径显著降低(P＜0.05)，分别为66.45和10.93 μm，这可能是核桃肽与碳水化合物共价结合后，其结构发生了变化，从而使原有的片状结构被破坏，形成粒径更小的体系。
图 4 不同样品美拉德反应前后的粒径图(A)和Zeta电位图(B)Figure 4 Particle size plots (A) and Zeta potential plots (B) before and after the Maillard reaction of different samples由图4B可知：WP-AX的Zeta电位绝对值显著低于WP-XOS (P＜0.05)，这可能是引入的阿拉伯木聚糖的Zeta电位绝对值显著低于低聚木糖(P＜0.05)，说明WP-XOS溶液的稳定性比WP-AX好。
2.6 扫描电镜分析
由图5所示：阿拉伯木聚糖呈现丝状的纤维结构，没有规律性；低聚木糖表面光滑，呈相互连接的状态；核桃肽呈现不同大小的片状结构。经过糖基化反应后，WP-AX和WP-XOS呈丝状分支结构，这可能是因为核桃肽分别与阿拉伯木聚糖和低聚木糖发生了共价结合，导致核桃肽的结构遭到破坏，分子充分展开，从而使核桃肽从片状结构变为片状带有丝状分支的结构。因为WP-XOS的接枝程度比WP-AX高，所以表现出更多的丝状无序结构。
图 5 不同样品美拉德反应前后的扫描电镜图Figure 5 Scanning electron microscopy images of different samples before and after Maillard reaction2.7 热稳定性分析
如图6所示：WP、AX和XOS的变性温度(Td)分别为82.18、53.23、48.52 ℃，焓值变化(ΔH)分别为3.11、0.60、9.66 J·g−1，WP-AX和WP-XOS的玻璃化转变温度(Tg)为95.78、83.53 ℃。WP经过糖基化改性后，WP-AX和WP-XOS并未出现热变形峰，而是出现了玻璃化转变峰，热变形峰可能是样品不稳定或者样品结构破坏所导致的，这是不可逆的，但是玻璃化转变是可逆的，说明经糖基化改性后热稳定性增加。
图 6 不同样品美拉德反应前后的热分析图谱Figure 6 Thermal analysis profiles of different samples before and after the Maillard reaction2.8 抗氧化活性分析
如图7A所示：与核桃肽相比，当阿拉伯木聚糖和低聚木糖分别与核桃肽共价结合时，产物的清除能力显著提升(P＜0.05)。与WP-AX相比，WP-XOS表现出了更强的自由基清除能力(P＜0.05)。
图 7 不同样品美拉德反应前后的抗氧化活性比较Figure 7 Comparison of antioxidant activity before and after Maillard reaction of different samples如图7B所示：当阿拉伯木聚糖和低聚木糖分别与核桃肽进行糖基化反应后，其羟自由基清除能力得到了显著提高(P＜0.05)，同时，WP-XOS表现出了更强的自由基清除能力(P＜0.05)。
如图7C所示：由于核桃肽本身的ABTS自由基清除能力已经很高，当阿拉伯木聚糖和低聚木糖分别与核桃肽进行糖基化反应后，WP-AX和WP-XOS并未表现出更强的自由基清除能力。这是因为WP-AX的接枝度较低，引入了清除能力较低的阿拉伯木聚糖，从而导致了WP-AX比核桃肽表现出了更弱的自由基清除能力(P＜0.05)。
如图7D所示：与核桃肽相比，经过糖基化后，WP-AX和WP-XOS的氧自由基吸收能力(ORAC)显著提升(P＜0.05)，其中WP-AX表现出了更强的氧自由基吸收能力(P＜0.05)。
3. 讨论
现阶段大量研究发现：阿拉伯木聚糖具有抗氧化、抗炎和改善记忆等多种生物活性，是蛋白质和多肽等生物活性物质的理想载体[27−29]。低聚木糖生物活性范围较宽，具有抗氧化活性、抗菌、抗感染、抗过敏以及抗炎等特性，能选择性增加细胞活性，进行免疫调节等[30]，是一种理想安全的食品原料[31]。此外核桃肽的生物活性潜力巨大，具有抗氧化、降血压、提高免疫活性、抗疲劳和改善记忆等功效[32]。美拉德反应可以提高蛋白质和肽的抗氧化、乳化等性能[33]。
本研究表明：核桃肽2种不同底物的美拉德反应导致了终产物中肽分子量分布的不同变化，说明小分子肽和碳水化合物的交联作用跟大分子肽的热降解作用有关[34]。核桃肽糖基化后，游离巯基和总巯基质量摩尔浓度都显著增加，一方面，可能是由于核桃肽在糖基化反应过程中，空间结构改变，使得嵌入内部的游离巯基暴露，从而质量摩尔浓度增加[35]；另一方面，可能是糖基化反应导致二硫键断裂，使二硫键转化成新的巯基[36]，游离巯基质量摩尔浓度随着反应的加深而增加，这与现有的研究结果一致[37]。美拉德反应后样品粒径均减小，这是由于核桃肽与碳水化合物的结合改善了肽的热变性，破坏了表面水合层，从而使得粒径下降[38]；也有可能在糖基化反应过程中，肽的表面电荷减少，肽和碳水化合物之间的静电相互作用减少，导致粒径减小[39]。有研究表明：糖基化显著降低了肌源性纤维连接蛋白的粒径，表明共价接枝可以有效抑制加热过程中的蛋白质聚集[40]。通过扫描电镜发现糖基化反应后，出现了纤维结构，缀合物的结构变得更加无序，这与已有的研究结果一致[41]。通过差示扫描热分析发现：美拉德反应能提高肽的热稳定性，缀合物在110 ℃内未出现热变形，这可能得益于疏水的相互作用和氢键的增加[42]。有研究表明：蛋白质与碳水化合物经过糖基化后，变性温度都有不同程度的提高，可见，可通过提供碳水化合物来增加蛋白质的热稳定性或三级构象的稳定性[43]。将核桃肽分别与阿拉伯木聚糖和低聚木糖进行美拉德反应，成功提高了核桃肽的抗氧化活性，这可能与非挥发性美拉德中间产物还原酮和高级阶段产物蛋白黑素具有较强的抗氧化活性有关，同时，也与挥发性含氮、硫的杂环化合物等低分子量物质较强的抗氧化性能有关[44−45]。本研究通过美拉德反应制备的糖肽，在降低肽成本的同时，可提高肽的功能特性，可为以糖肽为原料的保健品或功能食品的应用提供数据支持。
4. 结论
本研究表明：WP-XOS的接枝度和褐变程度都比WP-AX高。核桃肽美拉德产物的平均粒径降低，负电荷降低，活性巯基质量摩尔浓度增大。扫描电镜结果表明：碳水化合物的加入使肽的片状结构更加松散，呈现丝状分支结构。热分析图谱显示：核桃肽的变性温度为82.18 ℃，其美拉德反应产物并未出现热变形的现象。此外，WP-AX、WP-XOS的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和ORAC都比核桃肽显著提高了；而ABTS自由基清除率由于核桃肽本身就拥有较高的清除能力，所以并未得到提高，反而引入了阿拉伯木聚糖且接枝度低，导致WP-AX的ABTS自由基清除率比核桃肽低。综上所述，糖基化改性是提升核桃肽热稳定性和抗氧化活性的有效途径，可为核桃肽在食品工业生产中的应用提供参考依据。
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图 2 楠木优势林样地乔木层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 2 Semi-matrix of inter-specific correlations of the tree layer of plot A
图 3 楠木优势林样地灌木层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 3 Semi-matrix of inter-specific correlations of the shrub layer of plot A
图 4 楠木优势林样地草本层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 4 Semi-matrix of inter-specific correlations of the herb layer of plot A
图 5 楠木伴生林样地乔木层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 5 Semi-matrix of inter-specific correlations of the tree layer of plot B
图 6 楠木伴生林样地灌木层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 6 Semi-matrix of inter-specific correlations of the shrub layer of plot B
图 7 楠木伴生林样地草本层主要树种种间关联半矩阵图
Figure 7 Semi-matrix of inter-specific correlations of the herb layer of plot B
表 1 2015和2019年绿荷塘林区A、B样地主要乔木物种及其重要值
Table 1. Dominant species and importance value of the tree layer of plot A and plot B in 2015 and 2019
楠木优势林(样地A) 楠木伴生林(样地B) 编号 物种 2015年 2019年 2015年 2019年 重要值/
%个体密度/
(株·m−2)重要值/
%个体密度/
(株·m−2)重要值/
%个体密度/
(株·m−2)重要值/
%个体密度/
(株·m−2)1 刨花润楠 Machilus pauhoi 46.98 162 47.93 161 2 紫楠 Phoebe sheareri 22.86 104 22.68 98 1.69 8 1.75 8 3 秀丽锥 Castanopsis jucunda 8.64 24 8.12 22 2.92 23 2.92 20 4 甜槠 Castanopsis eyrei 3.59 9 3.48 8 16.64 145 17.14 143 5 青冈 Cyclobalanopsis glauca 3.12 8 3.19 8 16.67 183 16.93 170 6 红楠 Machilus thunbergii 2.38 5 2.43 5 5.83 50 6.05 50 7 黄檀 Dalbergia hupeana 2.06 4 1.59 3 8 薄叶润楠 Machilus leptophylla 2.65 7 2.70 7 8.51 90 9.05 85 9 樟树 Cinnamomum camphora 1.45 2 1.47 2 10 栾树 Koelreuteria paniculata 1.14 2 1.17 2 11 石栎 Lithocarpus glaber 1.03 1 1.05 1 16.45 165 16.18 148 12 赤杨叶 Alniphyllum fortunei 5.21 45 4.56 38 13 花榈木 Ormosia henryi 1.01 5 1.05 5 14 冬青 Ilex chinensis 1.02 5 1.06 5 15 杉木 Cunninghamia lanceolata 9.79 165 10.13 160 16 厚皮香 Ternstroemia gymnanthera 3.08 35 3.23 35 17 苦槠 Castanopsis sclerophylla 1.90 8 1.98 8 18 八角枫 Alangium chinense 1.00 5 1.03 5 19 老鼠矢 Symplocos stellaris 0.99 5 1.02 5 20 檫木 Sassafras tzumu 1.22 10 0.70 3 
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表 2 2015和2019年绿荷塘林区A、B样地灌木层物种及其重要值
Table 2. Species and importance value of the shrub layer of plot A and plot B in 2015 and 2019
编号 物种 重要值/% 编号 物种 重要值/% 样地A 样地B 样地A 样地B 2015年 2019年 2015年 2019年 2015年 2019年 2015年 2019年 1 菝葜 Smilax china 1.45 19 毛花连蕊茶 Camellia fraterna 15.04 2 薄叶润楠 Machilus leptophylla 10.90 20 刨花润楠 Machilus pauhoi 7.18 7.02 3 茶 Camellia sinensis 1.61 10.84 21 青冈 Cyclobalanopsis glauca 13.29 1.31 27.80 4 赤楠 Syzygium buxifolium 4.65 22 山矾 Symplocos sumuntia 7.03 2.44 5 赤杨叶 Alniphyllum fortunei 2.75 23 杉木 Cunninghamia lanceolata 4.16 6 豆腐柴 Premna microphylla 2.47 24 石斑木 Rhaphiolepis indica 1.36 7 杜茎山 Maesa japonica 6.78 25 石栎 Lithocarpus glaber 2.89 13.33 8 格药柃 Eurya muricata 25.59 1.87 26 甜槠 Castanopsis eyrei 6.80 9 枸杞 Lycium chinense 1.66 27 乌药 Lindera aggregata 10.19 3.05 10 红楠 Machilus thunbergii 4.50 28 秀丽锥Castanopsis jucunda 29.23 4.12 5.50 7.37 11 厚皮香 Ternstroemia gymnanthera 6.27 3.40 29 野桐 Mallotus japonicus 3.65 0.89 12 花榈木 Ormosia henryi 1.06 30 油茶 Camellia oleifera 25.60 10.05 5.50 13 黄檀 Dalbergia hupeana 6.11 31 油桐 Vernicia fordii 0.89 14 檵木 Loropetalum chinense 6.11 7.24 1.61 32 浙江楠 Phoebe chekiangensis 13.69 4.05 15 荚蒾 Viburnum dilatatum 0.89 33 栀子 Gardenia jasminoides 4.12 3.03 16 矩形叶鼠刺 Itea oblonga 6.51 6.86 3.70 34 朱砂根 Ardisia crenata 4.38 17 老鸦糊 Callicarpa giraldii 1.24 35 紫楠 Phoebe sheareri 12.47 15.25 18 毛冬青 Ilex pubescens 1.19
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表 3 2015和2019年绿荷塘林区A、B样地草本层物种及其重要值
Table 3. Species and importance value of the herb layer of plot A and plot B in 2015 and 2019
编号 物种 重要值/% 编号 物种 重要值/% 样地A 样地B 样地A 样地B 2015年 2019年 2015年 2019年 2015年 2019年 2015年 2019年 1 白结香 Edgeworthia albiflora 5.31 9 鳞毛蕨 Dryopteris sp. 22.11 2 薄叶润楠 Machilus leptophylla 26.96 4.50 10 蔓赤车 Pellionia scabra 3.95 3 狗脊蕨 Woodwardia unigemmata 25.84 11 刨花润楠 Machilus pauhoi 46.04 12.54 4 寒莓 Rubus buergeri 0.80 1.37 31.22 12 三穗薹草Carex tristachya 5.05 16.97 14.26 5 红楠 Machilus thunbergii 1.03 5.92 13 细柄薯蓣Dioscorea tenuipes 1.09 6 蕨 Pteridium aquilinum var. latiusculum 5.38 14.77 2.60 35.31 14 鱼腥草Houttuynia cordata 0.95 7 紫萁 Osmunda japonica 10.52 15 苎麻Boehmeria nivea 16.95 15.42 8 里白 Hicriopteris glauca 5.51 16 紫楠Phoebe sheareri 2.92 22.02
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表 4 绿荷塘林区A、B样地2015和2019年种间总体关联性
Table 4. Overall associations of plot A and plot B in 2015 and 2019
样地 层次 年份 方差比率 检验统计量 临界值 结果 楠木优势林(样地A) 乔木层 2015 1.69 42.30 [14.61, 37.65] 显著正联结 2019 1.69 42.25 [14.61, 37.65] 显著正联结 灌木层 2015 0.45 4.05 [3.33, 16.92] 不显著负联结 2019 0.78 7.02 [3.33, 16.92] 不显著负联结 草本层 2015 1.30 35.18 [16.15, 40.11] 不显著正联结 2019 0.22 5.98 [16.15, 40.11] 显著负联结 楠木伴生林(样地B) 乔木层 2015 1.12 11.16 [3.94, 18.31] 不显著正联结 2019 0.99 9.88 [3.94, 18.31] 不显著负联结 灌木层 2015 1.22 6.09 [1.15, 11.07] 不显著正联结 2019 0.41 2.05 [1.15, 11.07] 不显著负联结 草本层 2015 0.80 11.99 [7.26, 25.00] 不显著负联结 2019 0.24 3.57 [7.26, 25.00] 显著负联结
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200565
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