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土壤微生物是陆地生态系统的重要组分，是连接植物和土壤的重要因子，在获取资源构建自身生物量的同时，驱动生态系统物质循环和能量流动，调控碳和养分在土壤-植物-大气连续体之间的循环，对生态系统的结构和功能有重要影响[1-2]。土壤微生物生物量能够指示生态系统功能的变化，被用于评价土壤质量和反映微生物群落状态与功能变化[3]。生态化学计量学是研究生物系统能量平衡和多重化学元素平衡的科学，是生物地球化学循环与食物网结构和过程之间的内在联系，对于探索不同生态系统不同层次组分之间的相互联系和内在机制具有重要意义，因而被广泛应用到微生物驱动的生态过程研究中[4]。研究表明，土壤微生物群落组成随植物年龄及发育阶段而发生变化[5-6]，由林龄引起的林分环境和土壤环境的变异会间接影响土壤微生物参与养分循环[7-10]。养分状况的差异会对土壤微生物形成不同程度的养分限制，影响微生物群落结构及酶活性，对养分在根系、土壤和微生物之间的循环和转化同样会产生不确定的影响，进而影响土壤生态系统的结构与功能[11]。因此，研究土壤养分与土壤微生物生物量及其生态化学计量特征间的相互作用关系对理解陆地生态系统养分循环十分重要。另外，土壤微生物对碳氮磷循环的调控机制也是生物地球化学循环研究的重要内容之一。桉树Eucalyptus spp. 是世界三大速生丰产树种之一，因具有良好的经济、生态和社会效益而被广泛引种和种植，截至2015年底，中国桉树人工林面积已达4.5×106 hm2[12]。非科学的经营措施(如超短轮伐期、连栽等)造成的地力衰退等问题[13]，成为制约人工林生产力的主要原因[14]。目前，对桉树人工林生态化学计量特征研究主要集中在器官、凋落物和土壤等尺度[12, 15-16]，对土壤-微生物生态化学计量特征研究较少。本研究以雷州半岛不同生长阶段尾巨桉E. urophylla × E. grandis人工林为研究对象，探讨其土壤-微生物碳、氮、磷化学计量特征，以期为桉树高效可持续经营养分管理提供数据支持。
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本研究样地雷州半岛北部广东湛江桉树人工林生态系统定位研究站(21°15′53.5″N，110°05′39.2″E)，地处北热带湿润大区雷琼区北缘，为海洋性季风气候。最高海拔220.8 m，最低海拔80.0 m。年平均气温23.1 ℃，最热月(7月)平均气温28.8 ℃，最冷月(1月)平均气温15.6 ℃，≥10 ℃的活动积温8 373.0 ℃。年平均降水量1 567 mm，年相对湿度80.4%，年均日照时数1 937 h。样地土壤类型为玄武岩发育的砖红壤，土壤肥力中等，土层厚度达84 cm。
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依据国家林业和草原局2017年发布的林业行业标准《主要树种龄级与龄组》，将南方山地丘陵区桉树工业原料林划分为：幼龄林(1~2 a)、中龄林(3~4 a)、近熟林(5 a)、成熟林(6~7 a)和过熟林(≥8 a)，2017年7月以空间换时间的方法在研究区选取立地条件、土壤类型较一致的幼龄林(2 a)、成熟林(6 a)、过熟林(9 a)等3个尾巨桉人工林，各林龄林分内随机设置20 m×20 m样地，每个样地3个重复，进行每木检尺调查。样地基本概况见表1。
表 1 样地基本概况
Table 1. Basic situation of sample plots
龄级 样地 林龄/a 海拔/m 平均胸
径/cm平均树
高/m林分密度/
(株·hm−2)叶面积
指数0~60 cm土壤
容重/(g·cm−3)pH 幼龄林 1 2 116 8.06 12.20 1575 0.829 1.05 4.6 2 2 120 7.85 11.93 1450 0.732 0.96 5.0 3 2 117 8.14 12.33 1586 0.916 1.03 5.2 成熟林 1 6 104 14.63 12.48 857 0.793 1.08 4.8 2 6 108 13.97 15.37 986 1.039 1.07 4.8 3 6 103 11.97 15.15 1174 1.184 1.08 5.0 过熟林 1 9 113 22.84 25.40 725 1.117 1.07 4.5 2 9 119 20.14 24.97 714 1.101 1.04 4.7 3 9 125 19.74 22.58 675 0.884 0.97 4.7 -
2018年6月在各样地内随机设置5个样点，分别挖取土壤剖面(距离树干100 cm以外)，环刀法(100 cm3)采集0~20、20~40和40~60 cm层次土壤；同层土壤混合均匀装袋标记后置于含冰袋的保温箱中，带回实验室。一部分风干，研磨，过筛，用于测定土壤有机碳、全氮、全磷质量分数，另一部分置于4 ℃冰箱中冷藏保存，用于测定土壤微生物生物量碳、氮、磷质量分数[17]。土壤有机碳采用高温外热重铬酸钾氧化-容量法测定，土壤全氮采用凯氏定氮法测定，土壤全磷采用氢氧化钠熔融，钼锑抗比色法测定[18]；微生物碳采用三氯甲烷熏蒸-重铬酸钾容量法测定[19]，微生物氮采用三氯甲烷熏蒸-蒸馏-盐酸(HCl)滴定法测定[20]，微生物磷采用三氯甲烷熏蒸-全磷法测定[21]。
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采用SPSS 19.0进行数据处理与分析。采用单因素方差法(one-way ANOVA)对不同生长阶段土壤有机碳、全氮、全磷和微生物碳、氮、磷质量分数及碳氮比(C/N)、碳磷比(C/P)、氮磷比(N/P)进行方差分析和显著性检验(P＜0.05)。Pearson相关检验分析土壤有机碳、全氮、全磷和微生物碳、氮、磷质量分数及C/N、C/P、N/P关系。采用Canoco 5进行冗余分析(RDA)。采用SigmaPlot 14.0制作图形。
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由图1所示：从碳、氮、磷的平均质量分数看，幼龄林土壤分别为17.88、1.32、0.72 g·kg−1，土壤微生物分别为493.04、52.45、13.54 mg·kg−1；成熟林土壤分别为14.99、1.45、0.78 g·kg−1，土壤微生物分别为436.41、49.83、10.62 mg·kg−1；过熟林土壤分别为20.15、1.47、0.88 g·kg−1，土壤微生物分别为583.09、55.20、28.03 mg·kg−1。不同生长阶段尾巨桉林同一土层土壤碳(Csoil)质量分数从大到小依次为过熟林、幼龄林、成熟林，成熟林的0~20和20~40 cm土层显著低于其他生长阶段(P＜0.05)，垂直分布均为随土层加深而递减，各土层间差异显著(P＜0.05)。土壤氮(Nsoil)质量分数在不同生长阶段无明显差异，垂直分布表现与碳垂直分布一致。土壤磷(Psoil)质量分数从大到小依次为过熟林、成熟林、幼龄林，不同生长阶段差异显著(P＜0.05)，不同土层间无明显差异。
图 1 不同生长阶段土壤与土壤微生物碳、氮、磷质量分数
Figure 1. Carbon, nitrogen and phosphorus contents of soil and soil microbial biomass in different growth stages
土壤微生物碳(Cmic)质量分数在0~20 cm土层表现为成熟林显著低于幼龄林和过熟林(P＜0.05)，20~40 cm土层过熟林Cmic质量分数显著高于幼龄林和成熟林(P＜0.05)。土壤微生物氮(Nmic)质量分数在0~20 cm土层均表现为过熟林、幼龄林显著高于成熟林(P＜0.05)。土壤微生物磷(Pmic)质量分数各土层均表现为过熟林显著高于其他阶段(P＜0.05)。幼龄林Cmic质量分数随土层加深递减，各土层间差异显著(P＜0.05)。过熟林中0~20 cm土层Cmic质量分数显著高于40~60 cm土层(P＜0.05)。幼龄林、成熟林不同土层间Nmic质量分数无显著差异，过熟林中0~20 cm土层显著高于其他土层(P＜0.05)。幼龄林、成熟林中Pmic质量分数0~20 cm土层显著高于其他土层(P＜0.05)，过熟林中各土层间无显著差异。
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由图2所示：从碳氮比(C/N)、碳磷比(C/P)、氮磷比(N/P)均值看，幼龄林土壤分别为13.51、24.87、1.84，土壤微生物分别为9.42、41.89、4.85；成熟林土壤分别为10.52、19.25、1.86，土壤微生物分别为9.21、46.37、5.48；过熟林土壤分别为13.63、22.83、1.68，土壤微生物分别为10.97、21.25、2.00。Csoil/Nsoil以成熟林最小，幼龄林和过熟林仅在20~40 cm土层差异显著(P＜0.05)。Csoil/Psoil在0~20和20~40 cm土层从大到小依次为幼龄林、过熟林、成熟林。同一生长阶段Csoil/Psoil随土层加深递减，两两之间差异显著(P＜0.05)。Nsoil/Psoil仅过熟林的0~20 cm土层显著低于幼龄林和成熟林(P＜0.05)，其他无显著差异。Cmic/Nmic在20~40 cm土层均表现为过熟林显著高于其他阶段(P＜0.05)，40~60 cm土层表现为过熟林显著高于幼龄林(P＜0.05)，与成熟林无显著差异。Cmic/Pmic在0~20 cm和40~60 cm表现为过熟林显著低于幼龄林和成熟林(P＜0.05)。Nmic/Pmic在0~20 cm无显著差异，20~40和40~60 cm均以过熟林最小。
图 2 不同生长阶段土壤与土壤微生物碳、氮、磷化学计量比
Figure 2. Carbon, nitrogen and phosphorus stoichiometric ratios of soil and soil microbial biomass with different growth stages
不同生长阶段Cmic/Csoil、Nmic/Nsoil、Pmic/Psoil分别为2.58%~3.40%、2.44%~4.61%、0.97%~3.72% (图3)。不同阶段和不同土层Cmic/Csoil均无显著差异。过熟林0~20 cm土层Nmic/Nsoil显著高于其他阶段(P＜0.05)。各土层的Pmic/Psoil均以过熟林最大，仅0~20 cm土层与幼龄林差异不显著，其他均具有显著差异(P＜0.05)。
图 3 不同生长阶段土壤微生物与土壤碳、氮、磷之比
Figure 3. Carbon, nitrogen and phosphorus stoichiometric ratios of soil and soil microbial biomass with different growth stages
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由图4可知：幼龄林第1轴和第2轴的解释变量分别为99.08%和0.65%，Csoil、Csoil/Psoil、Nsoil、Nsoil/Psoil和Pmic/Psoil是土壤微生物及其化学计量比的显著影响因子；成熟林第1轴和第2轴的解释变量分别为91.68%和6.36%，Csoil/Psoil是土壤微生物的主要影响因子；过熟林第1轴和第2轴的解释变量分别为99.07%和0.72%，Nsoil、Nsoil/Psoil、Csoil/Psoil、Csoil和Pmic/Psoil是土壤微生物及其化学计量比的显著影响因子。说明在林分不同生长阶段，土壤微生物生物量的主要影响因子及其影响程度具有差异。相比之下，成熟林阶段土壤化学性质对微生物影响较小，对于3个阶段平均而言，第1轴和第2轴的解释变量分别为96.97%和1.29%，Csoil、Csoil/Psoil、Pmic/Psoil、Nsoil、Nsoil/Psoil、Psoil和Csoil/Nsoil是尾巨桉人工林土壤微生物的显著影响因子。
图 4 不同生长阶段土壤与土壤微生物碳、氮、磷及化学计量比的冗余分析
Figure 4. Carbon, nitrogen and phosphorus contents and stoichiometric ratios of soil and soil microbial biomass with different growth stages
由相关性分析(表2)可知：幼龄林的Cmic、Pmic、Cmic/Nmic受土壤养分及其化学计量比的影响较为一致，均与Csoil、Nsoil、Csoil/Psoil、Nsoil/Psoil、Pmic/Psoil呈显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关。成熟林中仅Pmic与土壤养分关系较为密切，Pmic与Csoil、Nsoil、Csoil/Psoil、Nsoil/Psoil、Pmic/Psoil呈显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关。过熟林中各指标与土壤化学性质及其化学计量比的关系表现差异较大，Cmic与Csoil、Nsoil、Csoil/Psoil 、Nsoil/Psoil呈极显著(P＜0.01)正相关性，与Pmic/Psoil呈显著(P＜0.05)正相关；Nmic与Csoil、Nsoil、Psoil、Csoil/Psoil、Nmic/Nsoil存在显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关；Cmic/Nmic与Psoil、Csoil/Nsoil、Nmic/Nsoil呈极显著(P＜0.01)负相关。
表 2 土壤和土壤微生物碳、氮、磷及化学计量比的相关性
Table 2. Correlation of soil and microbe biomass C, N, P content and their stoichiometry
阶段 指标 Csoil Nsoil Psoil Csoil/Nsoil Csoil/Psoil Nsoil/Psoil Cmic/Csoil Nmic/Nsoil Pmic/Psoil 幼龄林 Cmic 0.969** 0.941** 0.383 0.290 0.960** 0.923** 0.314 −0.324 0.825** Nmic 0.581 0.610 0.101 0.102 0.595 0.623 0.746* 0.330 0.432 Pmic 0.853** 0.854** 0.271 0.202 0.863** 0.856** 0.137 −0.445 0.995** Cmic/Nmic 0.785** 0.710* 0.341 0.327 0.775* 0.689* −0.361 −0.842** 0.743* Cmic/Pmic −0.308 −0.290 −0.099 −0.130 −0.302 −0.294 0.071 0.148 −0.681* Nmic/Pmic −0.611 −0.497 −0.291 −0.411 −0.606 −0.475 0.375 0.508 −0.753* 成熟林 Cmic 0.580 0.417 0.072 0.741 0.615 0.435 0.363 0.191 0.532 Nmic −0.009 0.040 −0.001 −0.096 −0.018 0.034 0.455 0.738* −0.098 Pmic 0.810** 0.744* 0.374 −0.119 0.830** 0.753* −0.336 −0.544 0.997** Cmic/Nmic 0.419 0.347 0.108 0.073 0.444 0.363 −0.274 −0.719* 0.450 Cmic/Pmic −0.402 −0.553 −0.188 0.440 −0.418 −0.573 0.434 0.664 −0.790* Nmic/Pmic −0.437 −0.498 −0.122 0.260 −0.467 −0.524 0.445 0.795* −0.785* 过熟林 Cmic 0.812** 0.906** 0.458 0.226 0.833** 0.850** 0.274 0.565 0.751* Nmic 0.922** 0.785* 0.776* 0.630 0.882** 0.605 −0.163 0.882** 0.463 Pmic 0.645 0.653 0.350 0.263 0.658 0.607 0.226 0.389 0.977** Cmic/Nmic −0.578 −0.224 −0.864** −0.805** −0.458 0.050 0.595 −0.846** 0.146 Cmic/Pmic 0.001 0.120 0.050 −0.140 0.002 0.118 0.003 0.083 −0.612 Nmic/Pmic 0.465 0.293 0.571 0.501 0.409 0.128 −0.410 0.675* −0.404 说明：*表示显著相关(P＜0.05)；**表示极显著相关(P＜0.01) -
按照中国第2次土壤普查养分分级标准[22]，本研究中0~60 cm土层Csoil质量分数均值，幼龄林(17.88 g·kg−1)和成熟林(14.99 g·kg−1)达到中下(4级)水平，过熟林(20.15 g·kg−1)达到中上(3级)水平；Nsoil质量分数均值，幼龄林(1.32 g·kg−1)、成熟林(1.45 g·kg−1)和过熟林(1.47 g·kg−1)均达到中上(3级)水平；Psoil质量分数，幼龄林(0.72 g·kg−1)和成熟林(0.78 g·kg−1)达到中上(3级)水平，成熟林(0.88 g·kg−1)达到高(2级)水平。本研究中，尾巨桉人工林Csoil质量分数从大到小依次为过熟林、幼龄林、成熟林，与以往研究相同[23]。这可能是由于成熟林阶段属桉树人工林速生生长阶段，林木生长需要消耗大量养分，原有有机质的分解大于外界输入，从而使土壤有机碳质量分数下降；当进入过熟林阶段后，林木生长趋缓，对养分吸收减少，而凋落物和植物根系不断积累，分解产生有机碳输入土壤，使得土壤有机碳质量分数升高。土壤Nsoil和Psoil质量分数均为从幼龄林、成熟林到过熟林增加的趋势，与XU等[23]研究结果一致。可能是随着林龄的增加，林分郁闭度降低，林下植被生物多样性增加，凋落物分解速度加快[24]，使得土壤养分在过熟林阶段得到积累。
土壤微生物生物量既是土壤有机质和土壤养分转化与循环的动力，又可作为土壤中植物有效养分的储备库，在土壤肥力和植物营养中具有重要作用。本研究中，土壤微生物Cmic、Nmic、Pmic质量分数(504.18、52.49、17.40 mg·kg−1)均低于全球土壤(680.4、105.0、40.3 mg·kg−1)和森林土壤(629、98、32 mg·kg−1)的平均水平。可能原因是短轮伐期人工林土壤扰动频繁，对土壤微生物群落结构产生较大影响[25-26]，不利于土壤微生物繁殖和生长，具体影响机制有待进一步研究。本研究中，微生物Cmic、Nmic、Pmic质量分数均值均以过熟林最高，与时伟伟等[27]研究结果一致。易桂田等[28]对1、6、11 a生尾叶桉E. urophylla人工林的研究发现：土壤微生物碳质量分数随林龄降低，11 a生植株中仅为56.912 mg·kg−1；这与本研究结果不同。可能原因是①桉树人工林土壤微生物主要集中在0~20 cm土层[29]，本研究对0~60 cm土层进行了取样分析，相比于0~10 cm土层取样更具代表性；②研究区桉树过熟林凋落物量积累较大，具有较高的养分归还量[30]，土壤养分含量也处于3个阶段的最高水平，使得土壤微生物可利用底物含量较高，因而生物量增加；③土壤微生物碳、氮、磷化学计量具有环境可塑性，会因土壤资源状况、气候条件、植被组成、土壤理化性质等的不同而产生差异[31-33]。
3个生长阶段土壤Csoil和Nsoil质量分数随土层加深递减，且差异显著。原因是土壤碳、氮主要来源于土壤表面枯落物的分解归还，在土壤表层积累后经淋溶作用向下迁移，从而被植物吸收利用。Psoil主要集中在0~20 cm土层，随土层变化幅度较小，呈“表层聚集性”特点[34]；可能是由于林分凋落物周转较快，分解的林下凋落物、死亡的植物和腐败的枯草向表层土壤补充大量养分所致[35]；此外，土壤磷主要来源于土壤母质风化，而风化是一个漫长的过程，风化程度在0~60 cm土层中无明显差异，因而土壤磷在土壤剖面上的变化幅度较小。土壤微生物Cmic、Nmic、Pmic质量分数基本表现为表层土壤高于深层土壤，这与前人研究结果相符[9, 36]。表层土壤富集了大多数功能根系，有利于提高微生物生物量[37]，其微生物活性显著高于深层土壤[38]；而深层土壤生境条件较差，抑制微生物活性，因此生物量也较低。
土壤微生物主要由异养型的细菌和真菌组成，土壤中可利用养分资源是调节土壤微生物生物量增长的驱动因子，因此微生物生物量通常与土壤养分变化趋势基本一致[39]。本研究中过熟林Cmic、Nmic与土壤Csoil、Nsoil均表现出显著或极显著相关性，幼龄林Cmic与Csoil、Nsoil表现出极显著相关性，与以往研究结果一致[7, 36]。幼龄林Nmic及成熟林Cmic、Nmic与Csoil、Nsoil未表现出显著相关性，与王薪琪等[9]和LITTON等[40]发现：土壤微生物碳、氮与土壤有机碳、氮相关性不显著的结果相近。可能原因是①植物(草本和木本)根系的生理活性或土壤有机质的活性组分(轻组碳)对微生物生物量碳的影响较大[41]；②成熟林处于速生生长期，地上生物量随林龄增加趋势明显[42-43]，地上植被的生长与土壤微生物碳的固定可能存在竞争关系。
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土壤碳氮磷比值是土壤有机质组成和质量程度的一个重要指标。TIAN等[44]研究发现中国土壤Csoil/Nsoil、Csoil/Psoil、Nsoil/Psoil均值分别为11.9、61.0、5.2。本研究中，Csoil/Nsoil、Csoil/Psoil、Nsoil/Psoil的均值分别为12.55、22.32、1.79；较高的Csoil/Nsoil表明本研究土壤有机质矿化作用较慢，较低的Csoil/Psoil说明微生物在矿化土壤有机质释放磷的潜力较大[45]，提示研究地Psoil质量分数处于较高水平。
XU等[46]研究表明：全球土壤微生物Cmic/Nmic、Cmic/Pmic、Nmic/Pmic的均值分别为7.6、42.4、5.6；李品等[47]发现：亚热带阔叶林分别为5.8、53.4、9.1。本研究中，Cmic/Nmic、Cmic/Pmic、Nmic/Pmic的均值分别为9.87、36.50、4.11，其中Cmic/Nmic高于全球和亚热带阔叶林均值，Cmic/Pmic、Nmic/Pmic低于全球土壤和亚热带阔叶林均值，结合研究区土壤理化性质发现：Nsoil质量分数处于中上水平，而低的土壤氮素有效性会影响微生物的利用。研究[48]表明：土壤微生物碳氮比、碳磷比与土壤有机质质量相关，土壤中有效氮、有效磷越丰富，则土壤微生物碳氮比、碳磷比值越低。本研究过熟林Cmic/Nmic高于幼龄林和成熟林，而Cmic/Pmic低于幼龄林和成熟林，表明随着森林植物生长和土壤环境条件的改变，土壤中有效养分资源对土壤微生物生长限制程度也在改变。相关研究[49]表明：土壤微生物C/N可以反映土壤微生物种类和区系，细菌和真菌的C/N一般为3~5和4~15，土壤中Cmic/Nmic越大，真菌比例越高[50]。本研究中过熟林Cmic/Nmic最大，说明过熟林土壤真菌含量相对丰富。相关性分析表明：幼龄林中Cmic/Nmic与Csoil/Nsoil相关系数为0.327，成熟林中为0.073，过熟林中为−0.805，表明Cmic/Nmic随着Csoil/Nsoil的改变是微生物适应土壤养分变化的重要机制[51]。
Cmic/Csoil、Nmic/Nsoil、Pmic/Psoil可以反映土壤养分向微生物的转化效率和土壤养分的流失状况，比单独使用微生物生物量或土壤养分来表征土壤质量变化更加有效[52-53]。本研究中，3个阶段Cmic/Csoil无显著差异，Cmic与Cmic/Csoil均无显著相关性，说明土壤微生物Cmic的周转速度在3个阶段差异可能并不明显。0~20 cm 土层的Nmic/Nsoil、Pmic/Psoil均表现为成熟林最高，且分别与Nmic、Pmic存在极显著正相关，可能是由于过熟林土壤微生物Nmic、Pmic比幼龄林和成熟林具有更快的周转速度，其增加幅度高于Nsoil、Psoil，这与吴建平等[54]研究结果类似。
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尾巨桉人工林土壤和微生物碳、氮、磷质量分数均为过熟林最高，垂直变化呈现出“表层聚集性”特征。土壤微生物生物量与土壤化学性质关系密切，在林分的不同生长阶段土壤微生物受土壤影响的指标和程度具有差异性，幼龄林、成熟林和过熟林土壤微生物的主要影响因子分别为Csoil、Csoi/Psoil和Nsoil。土壤Csoi/Nsoil和微生物Cmic/Nmic偏高，Csoi/Psoil、Nsoi/Psoil及Cmic/Pmic、Nmic/Pmic均处于较低水平，Psoil质量分数充足，表明尾巨桉人工林土壤微生物可能存在氮素有效性限制，生长后期应注重养分有效性对土壤微生物生长繁殖的影响。
Soil-microbial stoichiometry of Eucalyptus urophylla × E. grandis plantation at different growth stages
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摘要:
目的 研究幼龄林、成熟林和过熟林阶段尾巨桉Eucalyptus urophylla × E. grandis人工林土壤化学性质及土壤微生物化学计量特征，以丰富桉树林生态系统生态化学计量学领域的基础研究。 方法 以雷州半岛3个处于不同生长阶段的尾巨桉人工林为研究对象，测定0~20、20~40和40~60 cm土层土壤化学性质及土壤微生物碳、氮、磷质量分数，分析土壤及微生物化学计量关系特征。 结果 尾巨桉人工林土壤有机碳、全氮、全磷和土壤微生物碳、氮、磷质量分数均值均以过熟林最高，分别为20.15、1.47、0.88 g·kg−1和583.09、55.20、28.03 mg·kg−1，不同生长阶段差异性特征并不一致。土壤有机碳、全氮、全磷和土壤微生物碳、氮、磷质量分数的垂直变化呈现“表层聚集性”特征，不同生长阶段的土层间差异性元素类别表现不一。成熟林土壤碳氮比(Csoil/Nsoil)和碳磷比(Csoil/Psoil)均值分别为10.52和19.25，显著低于幼龄林和过熟林(P＜0.05)；过熟林氮磷比(Nsoil/Psoil)均值为1.67，显著低于幼龄林和成熟林(P＜0.05)。过熟林土壤微生物碳磷比(Cmic/Pmic)、氮磷比(Nmic/Pmic)均值分别为21.25、2.00，均显著低于其他2个阶段(P＜0.05)。不同生长阶段土壤微生物碳与土壤有机碳比值(Cmic/Csoil)无显著差异，土壤微生物氮与土壤全氮比(Nmic/Nsoil)和土壤微生物磷与土壤全磷比(Pmic/Psoil)均为过熟林显著低于其他阶段(P＜0.05)。冗余分析表明：幼龄林、成熟林和过熟林土壤微生物的首要影响因子分别为Csoil、Csoil/Psoil和Nsoil。 结论 尾巨桉人工林土壤微生物生物量在过熟林阶段最高，土壤微生物生物量与土壤化学性质关系密切，林分不同生长阶段土壤微生物受土壤影响的指标和程度具有差异性，生长后期应注重养分有效性对土壤微生物生长繁殖的影响。图4表2参54 Abstract:Objective The present study aims to investigate the soil-microbial stoichiometry of Eucalyptus urophylla × E. grandis plantation at young, mature, and overmature stages in order to enrich the basic research in the field of ecological stoichiometry of Eucalyptus plantation ecosystem. Method Three E. urophylla × E. grandis plantations at different growth stages in Leizhou Peninsula were selected as the research objects. Soil samples were collected from 0−20, 20−40, 40−60 cm soil layers respectively for measuring soil organic carbon (Csoil), total nitrogen (Nsoil), total phosphorus (Psoil), soil microbial biomass carbon (Cmic), nitrogen (Nmic), and phosphorus (Pmic), and the ratio among them was estimated to analyze the relationship between soil and microbial biomass. Result The mean values of soil organic carbon, total nitrogen, total phosphorus and soil microbial carbon, nitrogen and phosphorus were the highest in overmature forest, which were 20.15, 1.47, 0.88 g·kg−1 and 583.09, 55.20, and 28.03 mg·kg−1, respectively. The differences in different stages were not consistent. The vertical changes of soil organic carbon, total nitrogen, total phosphorus and microbial biomass carbon, nitrogen and phosphorus showed the characteristics of "surface aggregation", and the differences among soil layers in different growth stages were different due to different element types. The average values of Csoil/Nsoil and Csoil/Psoil in mature forest were 10.52 and 19.25, respectively, which were significantly lower than those in young and overmature forests (P＜0.05). The mean value of Nsoil/Psoil in overmature forest was 1.67, which was significantly lower than that in young and mature forests (P＜0.05). The average values of Cmic/Pmic and Nmic/Pmic on overmature stage were 21.25 and 2.00, which were significantly lower than those in other two stages (P＜0.05). The ratio of soil microbial biomass carbon to soil organic carbon (Cmic/Csoil) had no significant difference at three stages. The ratio of soil microbial biomass nitrogen to soil total nitrogen (Nmic/Nsoil) and the ratio of microbial biomass phosphorus to soil total phosphorus (Pmic/Psoil) in overmature forest were significantly lower than those in other two stages (P＜0.05). Redundancy analysis showed that Csoil, Csoil/Psoil and Nsoil were the primary influencing factors of soil microbe in young forest, mature forest and overmature forest, respectively. Conclusion The soil microbial biomass of E. urophylla × E. grandis plantation is the highest in the overmature forest stage, and is closely related to the soil chemical properties. The index and degree of soil microbes affected by the soil are different at different growth stages of the stand. The effect of nutrient availability on the growth and reproduction of soil microbe should be paid attention to at the later growth stage. [Ch, 4 fig. 2 tab. 54 ref.] -
植物内生固氮菌是指定殖在健康植物体内、与宿主植物进行联合固氮活动的一类原核微生物，是植物微生态系统的天然组分[1]。研究发现[2]：因为存在固氮菌，某些亚热带地区稻田可以连续百年不施氮肥而土壤氮水平不下降。固氮微生物一般分为3类：自生固氮菌、与植物共生固氮的微生物、与植物联合固氮的微生物。共生固氮微生物常见于豆科Leguminosae植物中[3]，其固氮机制、菌肥开发等研究已相当成熟。联合固氮微生物最早由DÖBEREINER [4]从热带禾木科Gramineae牧草雀裨Paspalum thunbergii根际中分离获得，这种被命名为雀裨固氮菌Azotobacter paspali的微生物被认为是存在于根际的自由生活的固氮菌。它们可以部分入侵植物表层组织，依靠根系分泌物生存繁殖，不与宿主形成特异分化结构，因而固氮能力不及共生固氮菌，但这类固氮菌与植物关系密切。BARRAQUIO等[5]通过建立有效的水稻Oryza sativa内生固氮菌分离方法，测得水稻内生固氮菌数量为105~108 CFU·g−1；袁梅等[6]从湖南桂阳农田水稻分离出19株内生固氮菌，其中13株可抑制水稻苗期对镉的吸收；谭志远等[7]从青香茅Cymbopogon caesius与五节芒Miscanthus floridulus中分离出66株内生固氮菌共10个类群；BALDANI等[8]发现玉米Zea mays茎内存在内生固氮菌肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae，后者具有促进植物生长的作用。作为同属禾本科的木本植物，竹子内生固氮菌的报道较少。竹子是喜氮植物，对氮素要求较高；调查发现许多自然竹林没有氮肥补充但生长良好，提示竹子可能存在某种固氮菌，且后者具有较强的固氮潜能。顾小平等[9]从浙江淡竹Phyllostachys glauca根际分离到3株活性较高的固氮菌，从毛竹Phyllostachys edulis根表面分离到36株固氮菌，分别为多黏芽孢杆菌Bacillus polymyxa和地衣芽孢杆菌Baclicus lincheniformis [10]；侯伟等[11]从簕竹Bambusa blumeana中分离到40株高效固氮酶活性菌株，分别属固氮螺菌属Azosprillum、大肠埃希氏菌属Escherichias、绿脓杆菌属Pseudomonas和水螺旋菌属Aquaspirillum；同时从簕竹[12]中分离到5株内生固氮菌，具有活性高、生长强势、可以通过自身代谢作用来适应环境酸碱性变化等特征。目前，国内关于竹子内生固氮菌的研究甚少。本研究以毛竹 (散生)、孝顺竹Bambusa multiplex (丛生)和狭叶青苦竹Pleioblastus chino (混生)为研究对象，利用分子生物技术研究不同生长型竹子根部及叶部的内生固氮菌、定殖土壤固氮菌的多样性和结构特征，探究不同竹种和不同器官间内生固氮菌多样性，探讨植株与定殖土壤内固氮菌多样性的关系，为竹子培育管理提供指导，也为开发有潜力的高效固氮菌，减少化学氮肥施用量、解决因化肥使用过度所造成的环境污染问题提供参考。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
狭叶青苦竹、孝顺竹栽植于浙江农林大学竹种园内，毛竹栽植于浙江农林大学后山。所有林相均为纯林，所有土壤均为红黄壤。采集竹叶、细根及不同竹种根部定植土壤。被选植株要求生长力旺盛，远离边缘地带，未受到病虫害感染。每种竹子选取3株间隔约15 m的不同植株作为重复。土壤样品采自所选竹子根周，深度为0~30 cm。所有样品放入4 ℃冰箱保存备用。
1.2 土壤基本化学性质测定
经风干、磨细、过筛后，测定土样土壤化学性质。具体参考鲍士旦[13]的方法，测定土壤含水量、pH、有机质、有效氮、速效磷、速效钾等指标。由表1可知：3种竹子定植土壤的pH、有机质、有效氮、速效钾、速效磷等指标均未表现出显著性差异(P＞0.05)，说明土壤样品的化学性质差异不影响固氮菌种类。
表 1 3种土壤的基本化学性质Table 1 Basic chemical properties of three soil种类 pH 有机质/(g·kg−1) 有效氮/(mg·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 毛竹 4.32±0.24 a 33.01±7.04 a 58.20±16.46 a 5.40±0.85 a 79.00±8.80 a 孝顺竹 4.64±0.27 a 36.85±10.81 a 66.14±14.46 a 4.99±0.61 a 69.33±17.02 a 狭叶青苦竹 4.72±0.54 a 37.67±9.16 a 57.34±15.63 a 4.65±0.94 a 70.67±4.50 a 说明：同列相同字母表示差异不显著(P＞0.05) 1.3 竹子内生微生物DNA提取
竹子叶与根的预处理参考谭致远等[7]方法。叶与根灭菌消毒后，剪碎放入无菌研钵。用液氮充分研磨破碎植物样品，参考高志民等[14]改良后的CTAB法提取植物内生微生物DNA，−40 ℃冰箱保存备用。
1.4 土壤微生物DNA提取
土壤样品过20目筛，按Mobio土壤微生物DNA试剂盒(Powersoil kit，美国)提取土壤微生物DNA。
1.5 固氮酶nifH基因扩增
固氮酶nifH基因采用聚合酶链式反应方法(PCR)扩增。第1轮正向引物FGPH19：5′-TACGGCAARGGTGGNATHG-3′，反向引物polR：5′-ATSGCATCATYTCRCCGGA-3′；第2轮正向引物AQER：5′-GACGATGTAGATYTCCTG-3′，反向引物polF-GC：5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3′。扩增程序参考DIALLO等[15]。
1.6 固氮酶nifH基因的变性梯度凝胶电泳(DGGE)
使用DCodeTM Universal Mutation Detection System (Bio-Rad，美国)对PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，用GelDocTM EQ凝胶成像系统 (Bio-Rad，美国)拍照保存。
1.7 固氮酶nifH基因的随机克隆
用polF(不含GC)与AQER引物扩增各竹种叶部、根部DNA，PCR产物用纯化试剂盒(Takara)纯化后与pEASY-T3 Vector(全金式生物技术公司，中国，北京)连接，转化到Trans1-T1感受态细胞中，涂在含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB琼脂平板上进行蓝白斑筛选，用菌落PCR方法检测阳性克隆子。阳性克隆菌液送上海生工生物技术公司进行测序，序列通过NCBI进行Blast比对分析，获取相近典型菌株序列[16]。
1.8 数据分析
利用Quantity one软件对DGGE电泳图进行指纹图谱分析，根据条带对比结果，通过未加权算术平均法进行聚类分析；计算Shannon多样性指数，使用SPSS软件进行单因素方差分析与两两比较(Ducan法)；使用Mega 5.0，采用邻接法进行系统发育树分析。
2. 结果与分析
2.1 不同来源固氮菌PCR产物
对土壤微生物、植物内生微生物DNA分别进行2轮巢氏PCR，获得土壤和植物固氮菌的nifH基因。由图1A和图1B可见：400~500 bp出现了一系列较为明亮的条带，即为目标nifH基因。
图 1 土壤固氮菌(A)与植物固氮菌(B)nifH基因扩增Figure 1 nifH gene’s PCR products of soil azotobacteria (A) and plant endophytic diazotrophs (B)2.2 土壤固氮菌DGGE分析
DGGE图谱中，条带数量代表样品所含固氮菌种类、多样性的丰富程度，条带粗细代表该种菌的生物量的大小(图2A)。使用Quantity one软件识别DGGE图中条带信息，以毛竹土壤3号为基准进行相似度分析，共识别出17个条带，且不同土壤样品之间出现一定数量的共有条带。这表明不同竹子定植的土壤存在着一定数量相同种类的固氮菌。
图 2 土壤固氮菌nifH基因片段DGGE指纹图谱(A)与聚类分析树(B)Figure 2 The nifH gene DGGE fingerprint(A) and clustering analysis tree (B) of soil azotobacteria聚类分析中各样品之间的分支点数值代表植物内生固氮微生物之间亲缘关系的远近，数值越大越相似。由图2B可知：不同竹种之间、同一竹种重复样品间土壤固氮菌相似度不高。一般认为相似度达到0.60及以上时说明群体间相似性好[17]。本研究中孝顺竹3个土壤样品重复聚在一起，但整体相似度也仅为0.57，说明土壤中固氮菌群落的变异性较大。对于土壤微生物而言，复杂的物质组成和空间结构导致微生物的变异性增加。虽然3种土壤的理化性质没有显著差异(表1)，但土壤的固氮菌仍然存在较大差异。
2.3 竹子根部与叶部内生固氮菌DGGE分析
不同竹种、不同器官的内生固氮菌nifH基因DGGE指纹图谱如图3A所示。以毛竹土壤3号为参照，毛竹叶与根、狭叶青苦竹叶、孝顺竹叶与根等9个样品出现了明亮且粗大的条带，这些条带丰度较大，为优势固氮菌种。研究发现[18]：不同菌在组织内占有不同生态位，它们相互作用建立一种生态平衡，分离频率高的为植物体内数量大的优势种群，相反则为稀有种群。图3中，竹根的条带数明显多于竹叶，说明根部内生固氮菌种类多于叶部。刘丽辉等[19]发现普通野生稻Oryza rufipogon内生固氮菌在水稻根部分布最多，茎叶中偏少，呈自下而上逐级递减规律，与本研究一致。且竹根部内生固氮菌种类远多于土壤，说明竹子根部固氮菌不仅来源于土壤，还通过其他途径进入植株，如KLUEPFEL等[20]认为细菌是通过植物自然开口(水孔、气孔、皮孔和蜜腺等)和伤口(根磨损、动物摄食及收割多年植物等)进入植物体内的。
图 3 竹子叶与根内生固氮菌nifH基因DGGE指纹图谱(A)与聚类分析树(B)Figure 3 DGGE fingerprint of nifH gene endophytic diazotroph(A) and clustering analysis tree (B) in bamboo’s leaves and roots聚类分析结果(图3B)表明：不同植物样品整体相似度不高，但大部分叶与根的样品明显区分，竹子叶与根分别聚在不同组，表明竹子器官差异是影响内生固氮定殖的重要因素。毛竹土壤样品(MT3)和根部样品聚集，但相似值仅有0.48，进一步说明了植株内生固氮菌仅有部分通过土壤进入，且大多定殖在根部，少部分扩散到叶部。以相似度大于0.60为群体间相似性很好的标准判断[17]，同一品种同部位重复样品间的相似度均不高，除狭叶苦青竹1号与狭叶苦青竹2相似值达0.77外，其他样品3个重复都未能聚集，说明内生固氮菌种类与植物种类关系不大，遗传因子没有起到决定性作用。植物内生固氮菌的捕获具有一定的偶然性。
2.4 不同来源固氮菌Shannon多样性指数分析
以指纹图谱信息为依据计算各个样品的Shannon多样性指数可以评价群落多样性。如表2所示：狭叶青苦竹根部内生固氮菌多样性最为丰富，显著高于叶部与土壤(P＜0.05)。毛竹固氮菌多样性依次为根部(2.98)、土壤(2.75)、叶部(2.30)，毛竹根部和土壤间无显著差异，但两者显著大于毛竹叶部(P＜0.05)，说明土壤固氮菌与根部内生固氮菌多样性都比叶部要丰富。孝顺竹叶部、根部内生固氮菌、土壤固氮菌间多样性差异不显著(P＞0.05)。不同竹种不同部位固氮菌多样性不同，狭叶青苦竹和毛竹以叶部最低，孝顺竹叶部最高，这可能与竹子的生长繁殖方法有关；孝顺竹为丛生竹，竹子在某一个固定位置生长更新，根部和土壤中的固氮菌容易进入叶子；毛竹为散生竹，狭叶青苦竹虽然是混合型竹子，但以散生的居多，随着地下鞭的延伸更新，这些竹子不断改变着生地点，其本身的固氮菌可能也少，通过地下鞭和地上部分的通道到达叶子中的固氮菌便更少。
表 2 不同来源固氮菌Shannon多样性分析Table 2 Shannon indexes of the three bamboos’ leaves, roots and soil种类 叶部 根部 土壤 狭叶青苦竹 2.43±0.30 Bb 2.89±0.12 ABa 2.36±0.09 Bb 毛竹 2.30±0.28 Bb 2.98±0.19 Aa 2.75±0.17 Aa 孝顺竹 2.73±0.10 Aa 2.53±0.26 Ba 2.70±0.15 Aa 说明：大写字母表示同列间差异显著(P＜0.05)，小写字母 表示同行间差异显著(P＜0.05) 对不同竹种相同部位内生菌多样性分析发现：孝顺竹叶部内生菌多样性显著高于狭叶青苦竹和毛竹(P＜0.05)，根部则显著低于狭叶青苦竹和毛竹(P＜0.05)；毛竹和孝顺竹土壤固氮菌多样性显著高于狭叶青苦竹(P＜0.05)；说明对于毛竹与狭叶青苦竹而言，固氮菌群落更偏爱在根部定殖，对于孝顺竹而言，固氮菌群落更喜爱在叶内定殖。
2.5 竹子根部与叶部内生固氮菌的随机克隆
对不同竹种根部/叶部的内生固氮菌DNA作随机克隆并测序(表3)，在培养基上共得到484个蓝色斑点，经验阳后送测121个，序列经BLAST数据库对比，得到83株菌株，其中12株为可培养固氮菌，归属于8种菌属，其余71株为不可培养固氮菌(来源于毛竹叶8株，毛竹根14株，孝顺竹叶7株，孝顺竹根14株，狭叶青苦竹叶8株，狭叶青苦竹竹根20株)，尚未被命名，不可培养的比例高达86%；推测原因可能是不可培养固氮菌在竹子内生固氮菌中处于优势地位，也可能是竹子中某些可培养的内生固氮菌尚未在其他植物中被分离鉴定，这也进一步说明了该类固氮菌的特殊性。12株可培养的固氮菌大部分为根组织内生菌(表4)，除Immundisolibacter和红长命菌属Rubrivivax外，均已报道具有固氮基因[19，21-28]。8个菌属中，慢生根瘤菌属Bradyrhizobium出现频率最高，一般是从大豆Glycine max根部分离得到，如XU等[21]从大豆和野大豆Glycine soja根瘤中分离出了与大豆结瘤的超慢生辽宁大豆根瘤菌Bradyrhizobium liaoninggense。固氮螺菌属Azospirillum具有明显的固氮功能，在植物根、茎、叶中广泛存在[19]；此外，翟超男[22]，周建娇[23]分别从海滨雀稗Paspalum vaginatum和白菜Brassica pekinensis根发现具有固氮功能的肠杆菌Enterobacter sp.；李洁琼等[24]从玉米根际中分离出具有促生作用的Kosakonia radicincitans strain YD4同样具有固氮功能，而Kosakonia是从肠杆菌属Enterobacter中分离出来的新属。TAN等[25]通过南方杂交法与乙炔还原法发现Dechlorosoma suillum中具有nifH基因；唐凯等[26]在研究浑善达克沙地苔藓Bryophyta结皮下层土壤细菌时发现Azohydromonas具有固氮功能。红长命菌可以氨为氮源，是目前发现的唯一能分泌蛋白酶的光合细菌[27]，Immundisolibacter是变形杆菌的一种新细菌，具有降解多环芳香烃的功能[28]。本研究从毛竹根部和孝顺竹根部鉴定出的红长命菌和Immundisolibacter中存在固氮基因，推测此2种菌很可能是具有固氮能力的新种。
表 3 基于nifH序列的不可培养固氮菌分布情况(相似度98%以上)Table 3 Distribution of unculturable bacteria based on nifH gene (The similarity is more than 98%)样品来源 相似菌种基因 毛竹叶 HP-46 nitrogenase (nifH) gene、HP-76 nitrogenase (nifH) gene、nifH gene for nitrogenase iron protein、nitrogen-
fixingbacteriumcloneb1 -HA3-1nitrogenase iron protein (nifH) gene、isolate DGGE gel band 5 nitrogenase iron protein (nifH)
gene、J19I(16) nitrogenase (nifH) gene、HP-12 nitrogenase (nifH) gene、TNO_elv_99f12 dinitrogenase reductase (nifH) gene毛竹根 nifH gene for nitrogenase iron protein、HP-27 nitrogenase (nifH) gene、HP-84 nitrogenase
(nifH) gene、HP-84 nitrogenase (nifH) gene、CI(12) nitrogenase (nifH) gene、HP-14 nitrogenase (nifH) gene、TII(5) nitrogenase
(nifH) gene、HP-48 nitrogenase (nifH) gene、HP-75 nitrogenase (nifH) gene、J19I(12) nitrogenase (nifH) gene、TNO_elv_81h1
dinitrogenase reductase (nifH) gene、TNO_elv_81h1 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-46 nitrogenase (nifH) gene、HP-75
nitrogenase (nifH) gene孝顺竹叶 HP-215 nitrogenase (nifH) gene、HP-5 nitrogenase (nifH) gene、HP-218 nitrogenase (nifH) gene、CY1-01 nitrogenase iron
protein (nifH) gene、HP-56 nitrogenase (nifH) gene、HP-226 nitrogenase (nifH) gene、HP-157 nitrogenase (nifH) gene孝顺竹根 isolate DGGE gel band 18 nitrogenase iron protein (nifH) gene、isolate DGGE gel band 12 nitrogenase iron protein (nifH) gene、
HP-226 nitrogenase (nifH) gene、partial nifH gene for dinitrogenase reductase、HP-90 nitrogenase (nifH) gene、partial nifH
gene for dinitrogenase reductase、HP-237 nitrogenase (nifH) gene、HP-246 nitrogenase (nifH) gene、HP-246 nitrogenase
(nifH) gene、HP-51 nitrogenase (nifH) gene、C13L7NH26 dinitrogenase reductase (nifH) gene、isolate DGGE gel band 20
nitrogenase iron protein (nifH) gene、b1-HA3-1 nitrogenase iron protein (nifH) gene、431 nitrogenase iron protein (nifH) gene狭叶青苦竹叶 TC30 NifH (nifH) gene、C12L6CK9 dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L6NH2 dinitrogenase reductase (nifH) gene、
C12L7NH35 dinitrogenase reductase (nifH) gene、nifH gene for nitrogenase iron protein(partial cds)、C13L10NH15
dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L8CK17 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-75 nitrogenase (nifH) gene狭叶青苦竹根 isolate DGGE gel band 14 nitrogenase iron protein (nifH) gene、Rb3_NifH_48 nitrogenase gene、C12L8CK4 dinitrogenase
reductase (nifH) gene、WK-A5 nitrogenase iron protein (nifH) gene、486 nitrogenase iron protein (nifH) gene、C13L8NL22
dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L6CK40 dinitrogenase reductase (nifH) gene、99 nitrogenase iron protein (nifH)
gene、HP-201 nitrogenase (nifH) gene、HP-2 nitrogenase (nifH) gene、243 nitrogenase iron protein (nifH) gene、
C12L10NL20 dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L10NL22 dinitrogenase reductase (nifH) gene、isolate DGGE gel band
11 nitrogenase iron protein (nifH) gene、C12L7CK25 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-159 nitrogenase (nifH) gene、
HP-215 nitrogenase (nifH) gene、HP-90 nitrogenase (nifH) gene、C12L7NH35 dinitrogenase reductase (nifH) gene、
b1-HA3-1 nitrogenase iron protein (nifH) gene表 4 基于nifH序列的可培养固氮菌分布情况Table 4 Distribution of culturable bacteria of nifH gene类群 样品来源 NCBI中最相近菌种(登录号) 序列相似性/% 慢生根瘤菌属 Bradyrhizobium MG38 Bradyrhizobium sp.(KC356360.1) 98 QG11 Bradyrhizobium sp.(AB079616.1) 99 QG255 Bradyrhizobium sp.(LT859959.1) 99 XG32 Bradyrhizobium sp.(CU234118.1) 99 Dechlorosoma MG31 Dechlorosoma suillum(CP003153.1) 98 固氮螺菌属 Azospirillum XG434 Azospirillum canadense strain(GU256446.1) 99 肠杆菌属 Enterobacter XY47 Enterobacter sp.(KC989924.1) 99 Kosakonia MG6 Kosakonia sacchari strain(KR075981.1) 99 XG52 Kosakonia sacchari strain(KR075959.1) 99 变形杆菌属 Gammaproteobacteria XG255 Immundisolibacter cernigliae strain (CP014671.1) 99 红长菌属 Rubrivivax MG16 Rubrivivax gelatinosus strain(KF800058.1) 98 Azohydromonas XG66 Azohydromonas australica(AB188121.1) 100 孙建光等[29]从小麦Triticum aestivum、水稻、白菜、玉米、芹菜Apium sp.等5种农作物中分离到25个属的内生固氮菌。本研究选取伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp. strain STM678、假单胞菌Pseudomonas corrugata、芽孢杆菌Bacillus aryabhattai strain B8W22和克雷伯氏菌Klebsiella variicola等4个优势种作为参照，与3种竹子中筛选出的克隆序列构建系统发育树。由图4可见，除1株来源于狭叶青苦竹的菌株(不可培养)与伯克霍尔德氏菌聚在一起外，其他菌株均远离参照菌株。具体来看，慢生根瘤菌属位于发育树中部位置，红长命菌属、Kosakonia、肠杆菌属、脱氯菌属Dechlorosoma、固氮螺菌属亲缘关系接近，Immundisolibacter cernigliae位于发育树的偏顶端位置，亲缘关系远离以上5个属。牛艳芳[30]对内蒙古植被主要建群植物的根际固氮菌进行分离时发现：6个地区的固氮菌类群存在显著差异，有些固氮菌分布具有区域性。推测这种大区域环境差异造成的固氮菌类群差异，可能也是竹子内生固氮菌与其他作物内生固氮菌存在较大区别的原因。
图 4 邻接法构建的内生固氮菌序列系统发育树Figure 4 System phylogenetic tree of endophytic diazotrophs by using neighbor-joining method3. 结论
不同竹种定植的土壤中存在着一定数量的同种固氮菌，但整体区系的相似度不高。同一竹种不同器官(根与叶)之间、不同竹种相同器官之间、土壤与植物之间的固氮菌群落结构差异显著；同种竹叶部或根部的重复样品相似度均不高。3种竹子根部内生固氮菌种类总体显著多于叶部，土壤固氮菌群落结构与根部内生固氮菌相似度高于叶部；不同竹种、不同器官之间固氮菌群落Shannon多样性指数差异显著，孝顺竹叶部与土壤大于根部，狭叶青苦竹和毛竹根部大于叶部和土壤。植物样品随机克隆测序BLAST对比得到83株固氮菌，其中12株为可培养固氮菌株，分别属于慢生根瘤菌属、Dechlorosoma、固氮螺菌属、肠杆菌属、Kosakonia、变形杆菌属、红长菌属、Azohydromonas等8个属，与已报道对竹子内生固氮菌研究相比，仅与侯伟等[12]从簕竹中分离得到了相同的固氮螺菌，但未发现其他相同种属。系统发育树结果表明3种竹子内生固氮菌显著不同于其他植物中分离得到的内生固氮菌。
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图 1 不同生长阶段土壤与土壤微生物碳、氮、磷质量分数
Figure 1 Carbon, nitrogen and phosphorus contents of soil and soil microbial biomass in different growth stages
图 2 不同生长阶段土壤与土壤微生物碳、氮、磷化学计量比
Figure 2 Carbon, nitrogen and phosphorus stoichiometric ratios of soil and soil microbial biomass with different growth stages
图 3 不同生长阶段土壤微生物与土壤碳、氮、磷之比
Figure 3 Carbon, nitrogen and phosphorus stoichiometric ratios of soil and soil microbial biomass with different growth stages
图 4 不同生长阶段土壤与土壤微生物碳、氮、磷及化学计量比的冗余分析
Figure 4 Carbon, nitrogen and phosphorus contents and stoichiometric ratios of soil and soil microbial biomass with different growth stages
表 1 样地基本概况
Table 1. Basic situation of sample plots
龄级 样地 林龄/a 海拔/m 平均胸
径/cm平均树
高/m林分密度/
(株·hm−2)叶面积
指数0~60 cm土壤
容重/(g·cm−3)pH 幼龄林 1 2 116 8.06 12.20 1575 0.829 1.05 4.6 2 2 120 7.85 11.93 1450 0.732 0.96 5.0 3 2 117 8.14 12.33 1586 0.916 1.03 5.2 成熟林 1 6 104 14.63 12.48 857 0.793 1.08 4.8 2 6 108 13.97 15.37 986 1.039 1.07 4.8 3 6 103 11.97 15.15 1174 1.184 1.08 5.0 过熟林 1 9 113 22.84 25.40 725 1.117 1.07 4.5 2 9 119 20.14 24.97 714 1.101 1.04 4.7 3 9 125 19.74 22.58 675 0.884 0.97 4.7 
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表 2 土壤和土壤微生物碳、氮、磷及化学计量比的相关性
Table 2. Correlation of soil and microbe biomass C, N, P content and their stoichiometry
阶段 指标 Csoil Nsoil Psoil Csoil/Nsoil Csoil/Psoil Nsoil/Psoil Cmic/Csoil Nmic/Nsoil Pmic/Psoil 幼龄林 Cmic 0.969** 0.941** 0.383 0.290 0.960** 0.923** 0.314 −0.324 0.825** Nmic 0.581 0.610 0.101 0.102 0.595 0.623 0.746* 0.330 0.432 Pmic 0.853** 0.854** 0.271 0.202 0.863** 0.856** 0.137 −0.445 0.995** Cmic/Nmic 0.785** 0.710* 0.341 0.327 0.775* 0.689* −0.361 −0.842** 0.743* Cmic/Pmic −0.308 −0.290 −0.099 −0.130 −0.302 −0.294 0.071 0.148 −0.681* Nmic/Pmic −0.611 −0.497 −0.291 −0.411 −0.606 −0.475 0.375 0.508 −0.753* 成熟林 Cmic 0.580 0.417 0.072 0.741 0.615 0.435 0.363 0.191 0.532 Nmic −0.009 0.040 −0.001 −0.096 −0.018 0.034 0.455 0.738* −0.098 Pmic 0.810** 0.744* 0.374 −0.119 0.830** 0.753* −0.336 −0.544 0.997** Cmic/Nmic 0.419 0.347 0.108 0.073 0.444 0.363 −0.274 −0.719* 0.450 Cmic/Pmic −0.402 −0.553 −0.188 0.440 −0.418 −0.573 0.434 0.664 −0.790* Nmic/Pmic −0.437 −0.498 −0.122 0.260 −0.467 −0.524 0.445 0.795* −0.785* 过熟林 Cmic 0.812** 0.906** 0.458 0.226 0.833** 0.850** 0.274 0.565 0.751* Nmic 0.922** 0.785* 0.776* 0.630 0.882** 0.605 −0.163 0.882** 0.463 Pmic 0.645 0.653 0.350 0.263 0.658 0.607 0.226 0.389 0.977** Cmic/Nmic −0.578 −0.224 −0.864** −0.805** −0.458 0.050 0.595 −0.846** 0.146 Cmic/Pmic 0.001 0.120 0.050 −0.140 0.002 0.118 0.003 0.083 −0.612 Nmic/Pmic 0.465 0.293 0.571 0.501 0.409 0.128 −0.410 0.675* −0.404 说明：*表示显著相关(P＜0.05)；**表示极显著相关(P＜0.01)
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