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种子萌发是高等植物生命周期新的开始，它始于吸水止于胚根突出，经历一系列复杂的生物学过程。一般情况，种子萌发可划分为3个发育阶段：3 h内种子迅速吸水膨胀(阶段Ⅰ)，随后储藏物动员(阶段Ⅱ)，最后胚根突出完成萌发(阶段Ⅲ)[1]。种子萌发完成后将进入幼苗发育阶段，其中胚根向下生长逐渐发育为植物的根，而胚轴和胚芽向上生长发育为植物的茎和叶。在深层土壤中，光很少参与种子萌发的调控。因此，研究黑暗条件下种子萌发的分子调控网络，不仅有助于揭示种子暗萌发的分子机制，而且对于指导作物播种也具有重要意义。
经过长期自然选择，高等植物已进化出多种光感受器，以适应复杂多变的自然环境。在拟南芥Arabidopsis thaliana中，至今已发现3类光受体，即红光/远红光受体光敏色素、蓝光受体隐花色素以及紫外光受体。在调节种子萌发方面，以光敏色素(PHY)研究较为深入。在黑暗中，PHY失活，其靶标蛋白光敏色素互作因子(PIF1)积累，抑制赤霉素(GA)信号和激发脱落酸(ABA)信号，从而抑制种子萌发；在红光或远红光下，光敏色素B (PHYB) 或光敏色素A (PHYA)被激活促进PIF1降解，减除 PIF1 对GA信号的抑制和ABA信号的激发，从而促进种子萌发[2−4]。
不同物种光调控种子萌发的机制存在一定差异。如光促进拟南芥种子萌发，而抑制番茄Solanum lycopersicum种子萌发。在拟南芥中，PHYA 和 PHYB 分别感知远红光和红光调控种子萌发[5−6]，然而，在番茄中红光或远红光下PHYA均抑制种子萌发[7]。DONG等[8]对244份烟草Nicotiana tabacum种质资源进行研究，根据萌发对光的敏感性将烟草种子划分为浅光休眠种子和深度光休眠种子，浅光休眠种子在光下萌发率＞90%，暗光下萌发率＞50%；而深度光休眠种子在光下萌发率＞90%，暗光下萌发率＜20%。本研究以浅光休眠种子类群中暗萌发率较高的代表野生型烟草Y85为材料，对萌发前后的种子样本进行转录组和蛋白组测序，通过联合分析挖掘黑暗下浅光休眠种子萌发的调控网络。
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野生型烟草Y85种子由贵州省烟草科学研究院提供。为避免光休眠、成熟度和后熟期差异对实验结果造成影响，种子均为授粉后40 d收获，在40 ℃机械烘干36 h脱粒。
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采用质量分数为0.5%硫酸铜溶液进行种子消毒处理；15 min后，用蒸馏水反复冲洗已消毒的种子；最后用滤纸吸附种子表面水分待用。配置质量分数为0.8%的琼脂溶液，进行高压灭菌，将灭菌液倒入直径为9 cm的培养皿中制作琼脂发芽床。每个处理设3次重复，每次重复100粒种子，以10×10模式均匀点播在琼脂床表面，然后将培养皿放置在人工气候箱中(江南仪器RXZ-36C)，设置人工气候箱的温度为25 ℃，光照强度为0 lx，相对湿度为80%，进行种子萌发实验。
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分别收集暗萌发第2天和第4天的种子作为转录组测序的样本。使用TRIzol试剂(Tiagen Biochemical)提取种子的总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Science)评估纯度和定量，同时使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies)评估RNA的完整性。使用TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina)构建基因库。转录物测序和分析由APTBIO生物技术有限公司(中国上海)完成。文库在Illumina HiSeq X Ten平台上进行测序，产生150 bp的成对末端读数。使用Trimomatic[9]处理FASTQ格式的原始读数，并为每个样品生成原始读数。通过从原始数据中去除低质量的读数和poly-N的读数，获得准确的读数用于深入分析。使用HISAT2[10]将处理后的读数映射到野生型烟草Y85基因组上。使用Cufflinks[11]计算每个基因的每千碱基转录每百万映射读取的片段值[12]，使用HTSeq-Coun获得每个基因的读数。差异表达分析使用DESeq (2012)R[13]进行。P＜0.05和差异倍数(FC)＞2.0或＜0.5被用作差异表达的阈值。对差异表达基因(DEGs)进行了层次聚类分析，以探索基因表达模式。随后，应用数学模型对转录组数据进行分析。首先，筛选出在2和4 d发芽的DEGs，根据超几何分布，使用R软件包对DEGs进行了基因本体(GO)富集及京都基因和基因组百科全书(KEGG)路径富集分析。
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将种子样品在液氮中磨成细粉，用3 mL含有1 mm 苯甲基磺酰氟的提取缓冲液[50 mmol·L−1 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，pH 8.0，0.1 mol·L−1 氯化钾(KCl)，5 mmol·L−1 EDTA，质量分数为30%蔗糖]提取500 mg样品，持续2 h。在13 000 r·min−1下离心15 min后，将上清液转移到新的试管中。在上清液中加入5倍体积的体积分数为10%冷TCA丙酮，在20 ℃下保存2 h，然后以13 000 r·min−1离心15 min。用体积分数为90%的冷丙酮冲洗，在20 ℃下放置30 min，然后以13 000 r·min−1离心5 min。这个步骤重复3次。
冻干后，最终的颗粒在80 ℃下储存或立即进行分析。将蛋白质样品加入0.5 mL标准缓冲液(质量分数为4%十二烷基硫酸钠，1 mmol·L−1 二硫苏糖醇，150 mmol·L−1 Tris-HCl，pH 8.0)，在沸水中孵育5 min，然后超声处理10次(持续时间为5 min，时间间隔为5 min)。
在13 000 r·min−1下离心40 min后，用聚氰基丙烯酸正丁酯法测定蛋白质浓度。用200 μL 尿酸缓冲液(8 mol·L−1尿素，150 mmol·L−1 Tris-HCl，pH 8.0)稀释约200 μg蛋白质样品，在14 000 r·min−1下离心30 min，然后加入200 μL UA缓冲液(50 mmol·L−1碘乙酰胺)。加入100 μL UA缓冲液，在黑暗中孵化30 min，离心20 min，重复2次。加入100 μL的溴酚蓝缓冲液(50 mmol·L−1三乙基碳酸铵，pH 8.5)，离心20 min。此步骤重复2次，然后加入40 μL胰蛋白酶溶液(在40 μL DS缓冲液中加入2 μg Pro mega的胰蛋白酶)。样品在37 ℃下培养约17 h，并通过离心收集多肽。用BCA法测定多肽含量。光密度[D(280)]为1.1，表示1 g·L−1。使用iTRAQ (Applied Biosystems) 4plex试剂盒的标准方案对每个样品约100 μg多肽分别进行标记[14]。
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使用TIANGEN RNA Prep Pure植物总RNA提取试剂盒(离心柱型)提取总RNA。使用NanoDrop-2000测定RNA的浓度和纯度。使用TaKaRaPrimeScript™ II First Strand cDNA Synthesis Kit将提取的RNA进行逆转录。使用TaKaRaTBGreen®Premix Ex Taq™ II (TliRNaseH Plus), Batch Fluorescence Quantification Kit 20 µL反应系统进行RT-PCR：10 µL TB Green Premix Ex Taq(2×) (TliRNaseH Plus)，0.4 µL ROX参考染料(50×)，2 µL稀释至40 mg·L−1的cDNA，0.8 µL上游和下游引物，其余用水补足。RT-PCR反应的条件是在95 ℃下预变性0.5 min，95 ℃循环5 s，58 ℃循环30 s。使用Step One Plus实时PCR仪测定每个基因的相对表达水平，每个样品重复3次。根据LIVAK等[15]的方法计算相对表达水平[15]。
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结果(图1和图2)发现：胚根突出前后种子的差异表达mRNA与蛋白可划分为16个象限，包括5种类型。其中，转录和翻译两者同时无差异的蛋白(基因)最多；其次为仅在蛋白或者mRNA一种水平下差异表达的蛋白(基因)；再次为同时下调的差异蛋白(基因)，有24个；再次为同时上调的差异蛋白(基因)，有15个；而表达趋势相反的差异蛋白(基因)最少，仅为3个。上述结果说明：黑暗条件在转录和翻译水平同时上调或者下调的蛋白(基因)数量相对较少，而更多的基因是在转录或者翻译单一水平表达参与调控胚根突出。
图 1 差异表达基因和差异表达蛋白象限图
Figure 1. Quadrant map of differentially expressed genes and differentially expressed proteins
图 2 共上调(下调)差异表达基因(蛋白)维恩分析示意图
Figure 2. Schematic diagram of Wien analysis of co-upregulated (co-downregulated) differentially expressed genes (proteins)
本研究重点关注了胚根突出后转录和翻译共同上调或者下调的蛋白(基因)，共同上调表达的蛋白(基因)有β-葡糖苷酶(BoGH3B)、内甘露聚糖-1,4-β-甘露糖苷酶1 (MAN1)、甲基转移酶 PMT21 (ERD3)、MLP-like protein 31 (MLP31)、脂肪酸结合蛋白1 (FAP1)、非特异性脂质转移蛋白C、60伴侣蛋白2β亚基、叶绿体(CPN60B2)、线粒体解偶联蛋白1 (PUMP1)、豇豆球蛋白(CYSEP)、过氧化物酶24 (PER24)、B8网状内皮素蛋白(RTNLB8)等(图2和表1)。而共同下调表达的蛋白(基因)有坏死稳定素1 (NEC1)、母体植株开花时间调控蛋白(MFT)、胚胎晚期丰度蛋白63 (ECP63)、Peroxygenase (SOP1)、跨膜蛋白205 (TMEM205)、胚胎晚期丰度蛋白25 (LE25)、种子维生素内含蛋白(SBP65)、应激蛋白(At3g01520)、莨菪碱6-双加氧酶(H6H)、聚二磷酸腺苷核糖聚合酶3 (PARP3)等(图2和表1)。
表 1 差异表达基因和差异表达蛋白联合分析
Table 1. Combined analysis of differentially expressed genes and differentially expressed proteins
登录号 转录差异 翻译差异 基因名称 上下调基因/蛋白 倍数 P 倍数 P Nitab4.5_0000010g0130.1 3.325 5 0.001 7 3.853 8 0.000 4 BoGH3B 上调 Nitab4.5_0000023g0130.1 20.474 7 0.000 0 2.071 3 0.000 9 MAN1 上调 Nitab4.5_0000108g0440.1 2.120 7 0.001 4 2.171 9 0.014 5 ERD3 上调 Nitab4.5_0001238g0070.1 6.056 6 0.009 8 2.218 9 0.005 6 MLP31 上调 Nitab4.5_0001550g0100.1 3.766 1 0.000 0 2.421 4 0.000 4 FAP1 上调 Nitab4.5_0006538g0070.1 2.239 3 0.031 9 2.485 4 0.010 9 CPN60B2 上调 Nitab4.5_0008198g0010.1 2.110 4 0.001 6 2.014 6 0.034 4 PUMP1 上调 Nitab4.5_0010931g0010.1 20.901 6 0.000 0 2.461 1 0.001 5 CYSEP 上调 Nitab4.5_0014169g0010.1 6.893 3 0.016 7 2.187 9 0.003 1 PER24 上调 Nitab4.5_0014487g0010.1 3.953 8 0.000 0 2.362 0 0.011 5 RTNLB8 上调 Nitab4.5_0000541g0010.1 0.064 3 0.000 0 0.381 9 0.006 4 NEC1 下调 Nitab4.5_0000649g0080.1 0.095 6 0.046 2 0.459 1 0.018 2 MFT 下调 Nitab4.5_0000680g0110.1 0.196 4 0.000 0 0.450 5 0.031 1 ECP63 下调 Nitab4.5_0001051g0080.1 0.159 4 0.001 4 0.498 9 0.009 4 SOP1 下调 Nitab4.5_0001378g0010.1 0.155 3 0.000 0 0.460 8 0.026 6 TMEM205 下调 Nitab4.5_0001538g0010.1 0.107 0 0.009 4 0.151 8 0.014 4 LE25 下调 Nitab4.5_0002674g0020.1 0.149 6 0.000 1 0.430 3 0.007 4 SBP65 下调 Nitab4.5_0003715g0060.1 0.151 4 0.033 7 0.470 9 0.000 1 At3g01520 下调 Nitab4.5_0004232g0030.1 0.095 5 0.000 0 0.435 2 0.001 6 H6H 下调 Nitab4.5_0005388g0040.1 0.104 5 0.001 0 0.437 4 0.034 1 At3g06035 下调 Nitab4.5_0017202g0010.1 0.122 7 0.000 0 0.475 3 0.001 9 PARP3 下调 -
对同时上调或下调的蛋白(基因)进行GO和KEGG富集，富集到的信号通路主要包括果糖和甘露糖代谢、甘露聚糖分解、内甘露聚糖-1,4-β-甘露糖苷酶活性等，发生功能的细胞成分包括细胞外区域、线粒体、膜的组成部分和叶绿体等(图3)。说明在黑暗下种子萌发可能依赖于甘露聚糖分解代谢，而线粒体和叶绿体2个细胞器在种子暗萌发中可能均具有一定的作用。
图 3 共上调(下调)的差异表达基因(蛋白)的信号富集通路图
Figure 3. Signal enrichment pathway diagram of co-up-regulated (down-regulated) differentially expressed genes (proteins)
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对差异蛋白和差异mRNA/基因进行非监督层次聚类(图4)表明：转录组和蛋白组测序样品的重复性较好。同一处理样品可以通过聚类出现在同一个簇中，聚在同一个簇中的差异蛋白或基因可能具有相似的生物学功能。通过 RT-PCR进一步验证了转录组测序的准确性。由图4可知：第2天转录组测序结果与RT-PCR结果的皮尔逊相关系数为0.44，而第4天转录组测序结果与RT-PCR测序的皮尔逊相关系数为0.96，但随机挑选的10个基因RT-PCR验证结果与转录组测序结果表达趋势一致(图5)，因此认为测序结果是可靠的。
图 4 mRNA与蛋白的表达聚类分析
Figure 4. Clustering analysis of mRNA and protein expression
图 5 RT-PCR验证转录组测序结果
Figure 5. Validation of transcriptome sequencing results by RT-PCR
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光照是调控种子萌发的重要环境信号，对于嗜光性种子，未完成后熟其种子萌发依赖于光照，如拟南芥、生菜Lactuca sativa和烟草种子等；对于厌光性种子，其萌发被光照所抑制，如番茄和岩芥菜Brassica juncea种子等；对于光中性种子，光照与否种子均可萌发，如玉米Zea mays、水稻Oryza sativa、小麦Triticum aestivum等主要粮食作物种子[16]。DONG等[8]研究发现烟草种子萌发普遍对光比较敏感，新采收种子暗发芽率普遍＜50%。宋碧清等[17]也表明：烟草种子萌发存在光敏感类型，但不敏感品种居多，这可能是由于栽培环境差异导致。DONG等[8]研究发现：烟草种子萌发光敏感型不仅存在基因型差异，而且存在强烈的母体环境效应，在遮阴环境下成熟的浅光休眠烟草种子萌发率显著提高。与光中性种子类似，浅光休眠烟草种子在光和暗环境下均可萌发，但光可以提高萌发比率和加快萌发速度[18]。本研究也发现：浅光休眠烟草种子在暗下可萌发，发芽率达50%以上，这与上述研究结果一致。
光通过影响ABA和GA信号和水平来控制种子萌发。在拟南芥中，黑暗条件下PIF1强烈抑制种子萌发。光照下，PHYA和(或)PHYB被光激活，进而促进PIF1的降解，导致GA/ABA升高，GA信号被激发，促进种子萌发[19−20]。本研究未发现光敏色素协同植物激素ABA和GA信号通路基因(蛋白)参与调控烟草种子暗萌发。2个阶段差异表达基因达到数千个，而差异蛋白仅数百个，且前人在拟南芥种子萌发时研究表明：光主要在转录层面调控ABA和GA代谢和信号基因表达[19−20]。因此，本研究对转录组数据进行单独分析，但也未富集到光介导的ABA和GA信号通路。说明浅光休眠烟草种子暗萌发可能存在一种新的调控机制。
在种子暗萌发前后多个基因和蛋白表达水平发生了共表达。LEA 广泛参与种子成熟脱水的调控，在种子萌发期间迅速消失[21]。本研究发现：ECP63、LE25和SBP65等3类胚胎晚期丰度蛋白(基因)在烟草种子萌发后表达量显著下调。MFT (MOTHER-OF-FT-AND-TFL 1)抑制拟南芥种子萌发[22]。而本研究也发现：MFT抑制烟草种子萌发，这与拟南芥种子研究结果一致。β-1,3-葡聚糖酶是烟草种子萌发时胚乳破裂的关键酶，它的表达介于种皮破裂后和胚乳破裂前[23]。番茄种子萌发过程中胚根突破种皮需要水解酶软化胚乳帽，与此过程有关的蛋白是 expansion和内β-甘露聚糖酶[24]。本研究发现：水解酶MAN1无论是转录还是翻译水平在胚乳破裂前显著上调表达，这与上述研究结果类似，说明水解酶亦参与调控黑暗条件下的烟草种子萌发。此外，本研究还筛选到烟草种子暗萌发的正调控因子BoGH3B、ERD3、MLP31、FAP1、CPN60B2、PUMP1、CYSEP、PER24、RTNLB8等和负调控因子NEC1、SOP1、TMEM205、At3g01520、H6H、PARP3等，关于这些基因(蛋白)调控种子萌发的功能还未见报道，可通过遗传学实验进一步证实。
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本研究通过整合转录组和蛋白组数据，发现烟草萌发前后蛋白和mRNA表达差异存在5种类型，其中共同上调表达的蛋白(基因)有BoGH3B、MAN1、ERD3、 MLP31、FAP1等，共同下调表达的蛋白(基因)有NEC1、MFT、ECP63、SOP1、LE25、SBP65等。基因富集分析和调控网络预测表明：在黑暗下，种子萌发依赖于甘露聚糖分解代谢，线粒体和叶绿体2个细胞器在种子暗萌发中具有关键作用。
Analysis of molecular networks for dark germination of shallow photodormant Nicotiana tabacum seeds based on transcriptomic and proteomic data
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摘要:
目的 旨在挖掘浅光休眠烟草Nicotiana tabacum种子在黑暗下的调控基因和分子网络。 方法 以浅光休眠烟草Y85种子为实验材料，通过整合转录组和蛋白组数据，挖掘其暗萌发的分子网络。 结果 胚根突出前后蛋白和(或) mRNA表达差异存在5种差异类型，其中共同上调表达的蛋白(基因)有BoGH3B、MAN1、ERD3、MLP31、FAP1等，共同下调表达的蛋白(基因)有NEC1、MFT、ECP63、SOP1、LE25、SBP65等。上述差异蛋白(基因)富集的信号通路包括果糖和甘露糖代谢、甘露聚糖分解、内甘露聚糖-1,4-β-甘露糖苷酶活性；而发生功能的细胞成分包括线粒体、膜组成部分和叶绿体。 结论 通过整合转录组和蛋白组数据初步构建了浅光休眠烟草Y85种子的暗萌发调控网络。图5表1参24 Abstract:Objective This study aims to explore the regulatory genes and molecular network for shallow photodormant Nicotiana tabacum in the dark. Method Shallow photodormant N. tabacum Y85 seeds were used as experimental materials, and the molecular network of dark germination was studied by integrating transcriptome and proteome data. Result There were five types of differences in the expression of protein or mRNA expression before and after radicle protrusion, among which the jointly up-regulated proteins (genes) were BoGH3B, MAN1, ERD3, MLP31, FAP1, etc., and the jointly down-regulated proteins (genes) were NEC1, MFT, ECP63, SOP1, LE25, SBP65, and so on. The signal pathways enriched by the above proteins (genes) included fructose and mannose metabolism, mannan decomposition, endomannan-1,4-β-mannosidase activity. Functional cellular components included mitochondria, membrane components and chloroplasts. Conclusion By integrating transcriptomic and proteomic data, the dark germination regulatory network for shallow photodormant Y85 seeds was preliminarily constructed. [Ch, 5 fig. 1 tab. 24 ref.] -
Key words:
- Nicotiana tabacum /
- photodormant seed /
- dark germination /
- transcriptome /
- proteome /
- joint analysis
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近年来，人们发现农业生态系统中的碳库是全球碳库中最活跃的部分。在人类活动的影响下，农田土壤碳库正在迅速变化。农田碳平衡主要从2个方面研究：碳汇（系统固定碳）与碳源（系统释放碳）。现今农田碳汇多采用最大收获法（生物量法）来计算，该方法与调查森林地上植被碳蓄积量方法类似。如罗怀良[1]长期观测中丘陵地区农田植被碳储量，刘允芬等[2]对青藏高原农田植被碳蓄积进行了测算，丁晓叶[3]在对崇明岛人工林与农田碳储量研究时都用到生物量法。此外，还有赵荣钦等[4]的模型法，其主要是将作物有机碳含量与经济产量、经济系数相结合，粗略估算植被碳储量。农田碳源侧重土壤呼吸碳源研究，国内使用较多的是静态气室法和动态气室法[5]。农田系统存在特殊的人工管理投入碳排放。管理活动碳源主要包括投入农用化学品的能源碳源和农田人工管理活动（机耕、灌溉、收获）碳源。当前越来越多的学者把注意力投到农用化学品、灌溉和机耕活动碳源上，但对收获活动带来的碳源的关注较少。一直以来关于农田生态系统究竟是碳源还是碳汇的问题存在争议。一些学者如Lal等[6]认为：农田碳汇量巨大，全球耕地总的固碳潜力为0.75~1.0 Pg·a-1；而韩冰等[7]针对中国农业措施，提出中国农田固碳潜力为182.1 Tg·a-1；赵荣钦等[4]研究发现，中国沿海地区农田碳吸收总量为22 482.4万t，属于明显碳汇。而有部分学者则认为农田主要是一种碳源，如孙艳丽等[8]对华北平原冬小麦Triticum aesticuml（-1.98 t·hm-2），玉米Zea mays（-1.38 t·hm-2）轮作农田碳平衡进行测定，指出农田属于碳源，而Bouwman[9]也认为农业活动是重要的温室气体排放源。本研究运用生物量法，对上海乃至全国第1个“低碳农业园”崇明现代农业园区主要种植的花菜Brassica oleracea var. botrytis田，从植被动态含碳率和固碳量、土壤呼吸碳源释放及人工管理碳源几个方面定量分析花菜田系统碳平衡特征，通过估算判断其是碳汇还是碳源，并根据碳平衡特征探讨增汇减排技术，旨在为今后低碳农业园的建立提供理论指导与数据支持。
1. 研究区概况
崇明岛位于31°27′00″~31°51′15″N，121°09′30″~121°54′00″E，处于北亚热带南缘，气候温和湿润，夏季湿热，冬季干冷，四季分明，具有明显的亚热带海洋性季风性气候。岛内常年平均气温为15.3 ℃，1月份最低，7-8月份气温最高，全岛东部年平均温度略高于西部。崇明岛年平均降水量为1 055.6 mm，降水主要集中于汛期。岛上土壤类型主要为冲积母质上发育而成的滨海盐碱土，此外还有淋溶土和半水成土。全年平均日照2 104 h，日照百分率为47％，2月日照时数最少，为131.1 h。11月至2月多刮北风和西北风[10]。实验时间为2011年9月初到2012月年1月中旬，地点位于陈家镇现代农业园内，地处崇明东部，以园区中花菜田为研究对象，花菜生育期从种植到收获历时140 d左右。实验样地表层土壤氮质量分数为1.83 g·kg-1，磷1.35 g·kg-1，有机碳为12.71 mg·kg-1。
2. 材料与方法
根据现有研究结论[11]，农田碳平衡研究公式为净生产力=净第一生产力-土壤异养呼吸碳源。广义的农田碳平衡还包括人工管理投入碳源。由于花菜生长期间凋落物生物量几乎为0，所以在本研究中忽略不计。本研究的土壤呼吸碳源采用土壤异氧呼吸碳释放量计算，忽略作物根呼吸的影响，因为在计算根的碳储量时，直接是扣除呼吸作用消耗的碳以后的碳储量，因此，在计算作物生物量时将作物地上部分与地下部分统一计算。
2.1 样地设置
在花菜种植期间，选择相邻的3块20 m × 20 m的田块作为实验样地，每块样地随机设置3块1 m × 1 m的小样方，隔15 d在样方内用收获法收割花菜植株，封装后带回实验室测定。
2.2 植被含碳率与碳储量测定
将每次采集的花菜样品封装带回实验室保存，最后将所有采集的样品在粉碎前均放入85 ℃的恒温箱中烘至恒量，再经粉碎、碾磨、过筛后，采用重铬酸外加热法[12]测定植被含碳率，再结合植被生物量计算碳储量。C=B×O。其中：C为碳储量（t·hm-2），B为生物量（t·hm-2），O为含碳率。
2.3 土壤有机碳储量测定
选择样点3个·样地-1，随机设置3个重复·样点-1。由于农田基本在土壤表层耕作，不如林地对低层土壤影响作用大，所以研究时土壤剖面挖60 cm深，按0~5，5~10，10~20，20~40，40~60 cm分层取样，相同层次混合，同时用环刀法[13]测定土壤容重。采集的土样在室内自然风干后过2 mm 筛，用重铬酸钾氧化-外加热法[13]测定土壤有机质质量分数，进而计算土壤有机碳储量[14]：C0 =∑0.1HiBiOi。其中: C0为土壤有机碳储量（t·hm-2）； 0.1 为单位换算系数；Hi为第i 层土壤厚度（cm）；Bi为第i 层土壤的容重（g·cm-3）；Oi是第i 层土壤有机碳质量分数（g·kg-1）。
2.4 土壤呼吸测定
在1 m × 1 m样方内随机设置3个重复，采用Li-6400便携式光合作用仪测量，安装09土壤呼吸叶室测定土壤呼吸。在测定前1天将标准规格的聚氯乙烯土壤隔离圈打入土中1~2 cm深，保证每个月的测定都在同一地点进行，免除测定点移位带来的干扰。每次测定的前1天，在不破坏土壤的情况下彻底剪除隔离圈内的地表植被，从而减少土壤扰动及根系损伤对测量结果的影响。测定时间为6: 00-18: 00，2 h测定1次，每个土壤隔离圈重复3次。
土壤异氧呼吸采用开沟法测定，在小样方四周挖掘70~100 cm深、50 cm宽的壕沟，沟中放入玻璃纤维薄片以阻止根向样方内生长，排除根系呼吸的干扰，然后把沟填平再测定，所测得的土壤呼吸即为土壤异养呼吸。
2.5 农田管理碳排放测
管理碳排放主要包括能耗碳排放、灌溉碳排放和人工碳排放。能耗碳排放包括杀虫剂和肥料生产的碳排放。灌溉碳排放估算：Ci=Vi × w ×h × ni。其中：Vi为煤电的碳强度系数（0.92 kg·kW-1·h-1）；w为灌溉所用的电机功率（kW）；h为每次灌溉工作时数；ni为灌溉次数。人工投入碳排放估算：Cr=Vr × N。其中：Vr为成人（60 kg体质量）每天呼出的二氧化碳容积；N为1个作物生长季投入的人工总数（人·d-1）。
根据现有中国生产肥料的化石能源碳排放研究：生产1 t杀虫剂排放碳 4 931.93 kg·Mg-1；生产1 t氮肥排放1.74 t 碳； 1 t钾肥排放120.28 kg碳，1 t 磷肥排放165.09 kg碳。
3. 结果与分析
3.1 花菜含碳率变化
实验测得含碳率数据如图 1所示。花菜生长期含碳率波动范围为30%~40%，生长初期最小，为25.73%，生长旺期最大，为41.61%，平均含碳率为35.12%。花菜只有在生长旺期才达到中国主要农作物平均含碳率水平[15]（水稻Oryza sativa为41.45%，玉米为47.09%，大豆Glycine soja为 45.00%，小麦为48.53%等）。
图 1 花菜生育期内含碳率动态变化Figure 1. Dynamics of carbon content of Brassica oleracea var.botrytis in one growth period3.2 花菜碳储量
将每次采集的花菜样品经烘干称量测得生物量，结合含碳率测得花菜碳储量如图 2所示。花菜在生长初期生长缓慢，生物量基本无变化，此时的碳储量（0.279 4 t·hm-2）与移栽前（0.307 3 t·hm-2）相比略有降低，而在第4次测定时，也就是生长1个半月时花菜碳储量有明显增加，通过测定第4次到第8次之间为生长旺期，生物量增速最快，含碳率也相对较高，从而测得生长期最大碳储量为0.684 9 t·hm-2，一般收割均在生长末期之前，生长末期碳储量逐渐减少，但变化不大。综合计算花菜1个生育期固碳量为5.18 t·hm-2。
图 2 花菜生长期间碳储量动态变化Figure 2. Dynamics of carbon storage of Brassica oleracea var.botrytis in one growth period3.3 土壤有机碳储量及分布
如表 1所示：花菜田0~5 cm土壤有机碳最高为15.77 g·kg-1，是底层土壤8.59 g·kg-1的1.84倍。土壤总碳储量为84.74 t·hm-2，其中表层土（0~20 cm）总碳储量为31.25 t·hm-2，占总碳储量的36.88%。这可能与表层土壤经常翻耕，大部分化肥等原料停留在表层有关。
表 1 花菜田各土壤层有机碳储量Table 1. Organic carbon storage of the Brassica oleracea var.botrytis soil layer土壤深度/cm 有机碳/(g·kg-1) 碳储量/(t·hm-2) 总计/(t·hm-2) 0~5 12.77±0.053 9.36 5~10 13.48±0.147 8.16 10~20 10.85±0.103 13.73 20~40 10.43±0.037 28.82 40~60 8.59±0.064 24.67 84.74 3.4 土壤呼吸月变化
从图 3可以看出：花菜生长初期土壤呼吸速率普遍较高，第4次测得最高总呼吸速率为5.46 μmol·m-2·s-1，此时花菜开始进入生长旺期。之后随着花菜的生长，总呼吸速率反而降低，逐渐减弱直至收割时最低为0.47 μmol·m-2·s-1，生育期内总呼吸平均呼吸速率为3.16 μmol·m-2·s-1。
图 3 花菜田土壤总呼吸与异养呼吸月变化Figure 3. Month dynamics of soil total and heterotrophic respiration for Brassica oleracea var.botrytis farmland花菜田异养呼吸速率动态变化与总呼吸基本一致，也是生长旺期开始时最高，成熟后逐渐降低，收获时最低，异养呼吸速率变化范围为0.43~2.84 μmol·m-2 ·s-1，平均值为1.72 μmol·m-2 ·s-1。
土壤异养呼吸主要受土壤温度、湿度等环境因子及微生物活动的影响，将它与自养呼吸分开讨论，对于研究未来全球碳动态变化具有十分重要的意义。
3.5 花菜田管理碳源
据统计，花菜种植期间施农药0.043 t·hm-2，化肥9.000 t·hm-2，其中磷肥2.000 t·hm-2，钾肥3.000 t·hm-2，氮肥4.000 t·hm-2，计算得能源总碳排放为0.790 t·hm-2；栽植期间共灌溉3次，6 h·次-1，收获时雇佣17人以人工方式收割，无机耕活动，计算得人工管理活动碳排放为1.02 t·hm-2。统计得花菜1个生育期内管理碳排放为1.81 t·hm-2。
3.6 花菜田碳平衡计算
由于花菜生育期内凋落物量几乎为0，所以在计算中忽略不计。通过对各子系统碳汇源计算发现，花菜1个生育期内植被固碳量为5.18 t·hm-2，花菜田土壤释放碳量为2.38 t·hm-2，农田管理碳排放量为1.81 t·hm-2，花菜田表现为弱碳汇，测得净碳汇为0.99 t·hm-2，相当于固定二氧化碳4.01 t·hm-2。
4. 讨论
实验测得花菜含碳率基本为30%~40%，平均值为35.12%，结合生物量计算得花菜植被生育期内固碳量为5.18 t·hm-2。与前人研究相比，低于河南1997年平均固碳量（5.65 t·hm-2）和2007年平均固碳量（9.77 t·hm-2）[4]，但高于江西2003年和2007年平均固碳量（1.12 t·hm-2和1.51 t·hm-2）[16]，同时介于李洁静等[17]测算的太湖地区水稻（4.7 t·hm-2）和油菜（8.0 t·hm-2）固碳量之间。花菜含碳率较低，固碳能力较弱，但花菜植被固碳是花菜田系统的主要碳汇方式，因此，增加植被碳储量是最好的碳增汇措施，而要增加碳储量主要是通过增加花菜产量实现。由于崇明岛地区土壤盐碱化较严重、土地贫瘠，目前，最适宜的增汇方式就是增加有机肥配施，但有机肥施用也不能无限制增加，如何找到一个最利于作物生长的比例还需要长期实验研究。此外，还可以在同一块田地上进行轮作，通过不同品种的更替减缓土壤流失，增加土壤碳储量，从而促进作物生长。
花菜田1个生育期内异养呼吸碳排放量为2.38 t·hm-2。呼吸作用是农田最主要碳源，因此，要增加花菜田碳汇能力就要减少碳源释放，也就是减小土壤呼吸作用。农田土壤异养呼吸速率一般比人工林土壤异养呼吸速率大，因为农田郁闭度相对较低，阳光能更多的到达地面，从而引起农田土温快速上升，再加上农田施用肥料，使得土壤微生物活性较强，进而释放出更多二氧化碳。针对这一特点，在构建低碳园区时可以采取农林间作的方式，降低农田郁闭度，进而降低土壤表面温度，以减弱农田土壤呼吸。
花菜在1个生育期内管理碳源总排放量为1.81 t·hm-2。由于农田对管理的特殊依赖性，人工管理碳源也是碳释放的重要途径，要减少人工管理碳源就要求园区进行不断管理改革，改变农田管理方式，减少人员或机械投入，或者引进节能机器等从而减少人工管理碳源。
花菜田生育期净碳汇为0.99 t·hm-2，表现为弱碳汇。这一数值与中国其他学者关于农田碳汇研究结果相比，低于朱咏莉等[18]测得的亚热带稻田净固定碳量，但与郝庆菊等[5]测定的水旱轮作农田的净碳汇值相当。本研究主要根据现今崇明岛农业园区耕作方式，选择园区主要种植品种花菜进行研究，虽然园区目前已将部分田地退田还林，但人工林种植面积相对于农田较小，且种植时间较短，固碳能力较弱。园区主要碳流动载体依然以农田为主，如何根据农田碳流动方式采取碳增汇减排措施是当前最主要问题，也是构建低碳农业园区最主要环节。
研究中将作物生长期的生物产量作为碳吸收，实际上已包括了作物凋落物所带来的碳，并扣除了作物呼吸作用消耗的碳。如果需要进一步细化不同时期的碳流动方式，还需进一步测定各时期作物光合作用与呼吸作用对碳变化量的影响，再结合土壤呼吸与根呼吸释放碳量进行分析。本研究中对人工管理活动碳排放的计算只适用于崇明地区，因为不同地区、不同耕作方式所需要的人力物力不同，从而计算结果也会有所不同。其次是燃料标准，由于目前对燃料没有较为严格的要求和规范，所以在计算时也存在一定的不确定性。同一种燃料碳的含量可能有很大差别，而在选择碳排放系数时，还要根据生产化肥、杀虫剂的过程不同，以及灌溉耗电对化石燃料的利用不同来进行选取。
5. 结论
研究表明：崇明农业园区花菜田生态系统表现出微弱碳汇能力，花菜田系统固碳主要是通过植被固碳，主要碳释放途径为土壤呼吸与人工管理碳释放。现阶段关于崇明岛农业园区农田碳增汇减排技术最可行的措施就是改善施肥制度，比如等氮投入、不同氮源施肥、有机-无机肥配施处理等。建议通过不同配比实验，寻找最适合当地土壤条件的有机肥配施标准，提高作物生物量，并最大限度地减少土壤碳排放，在耕作强度很大的农田，最有效的办法是提高土壤中稳定态氮含量及比例。
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图 1 差异表达基因和差异表达蛋白象限图
Figure 1 Quadrant map of differentially expressed genes and differentially expressed proteins
图 2 共上调(下调)差异表达基因(蛋白)维恩分析示意图
Figure 2 Schematic diagram of Wien analysis of co-upregulated (co-downregulated) differentially expressed genes (proteins)
图 3 共上调(下调)的差异表达基因(蛋白)的信号富集通路图
Figure 3 Signal enrichment pathway diagram of co-up-regulated (down-regulated) differentially expressed genes (proteins)
表 1 差异表达基因和差异表达蛋白联合分析
Table 1. Combined analysis of differentially expressed genes and differentially expressed proteins
登录号 转录差异 翻译差异 基因名称 上下调基因/蛋白 倍数 P 倍数 P Nitab4.5_0000010g0130.1 3.325 5 0.001 7 3.853 8 0.000 4 BoGH3B 上调 Nitab4.5_0000023g0130.1 20.474 7 0.000 0 2.071 3 0.000 9 MAN1 上调 Nitab4.5_0000108g0440.1 2.120 7 0.001 4 2.171 9 0.014 5 ERD3 上调 Nitab4.5_0001238g0070.1 6.056 6 0.009 8 2.218 9 0.005 6 MLP31 上调 Nitab4.5_0001550g0100.1 3.766 1 0.000 0 2.421 4 0.000 4 FAP1 上调 Nitab4.5_0006538g0070.1 2.239 3 0.031 9 2.485 4 0.010 9 CPN60B2 上调 Nitab4.5_0008198g0010.1 2.110 4 0.001 6 2.014 6 0.034 4 PUMP1 上调 Nitab4.5_0010931g0010.1 20.901 6 0.000 0 2.461 1 0.001 5 CYSEP 上调 Nitab4.5_0014169g0010.1 6.893 3 0.016 7 2.187 9 0.003 1 PER24 上调 Nitab4.5_0014487g0010.1 3.953 8 0.000 0 2.362 0 0.011 5 RTNLB8 上调 Nitab4.5_0000541g0010.1 0.064 3 0.000 0 0.381 9 0.006 4 NEC1 下调 Nitab4.5_0000649g0080.1 0.095 6 0.046 2 0.459 1 0.018 2 MFT 下调 Nitab4.5_0000680g0110.1 0.196 4 0.000 0 0.450 5 0.031 1 ECP63 下调 Nitab4.5_0001051g0080.1 0.159 4 0.001 4 0.498 9 0.009 4 SOP1 下调 Nitab4.5_0001378g0010.1 0.155 3 0.000 0 0.460 8 0.026 6 TMEM205 下调 Nitab4.5_0001538g0010.1 0.107 0 0.009 4 0.151 8 0.014 4 LE25 下调 Nitab4.5_0002674g0020.1 0.149 6 0.000 1 0.430 3 0.007 4 SBP65 下调 Nitab4.5_0003715g0060.1 0.151 4 0.033 7 0.470 9 0.000 1 At3g01520 下调 Nitab4.5_0004232g0030.1 0.095 5 0.000 0 0.435 2 0.001 6 H6H 下调 Nitab4.5_0005388g0040.1 0.104 5 0.001 0 0.437 4 0.034 1 At3g06035 下调 Nitab4.5_0017202g0010.1 0.122 7 0.000 0 0.475 3 0.001 9 PARP3 下调 
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