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毛竹Phyllostachys edulis是中国亚热带地区分布最广泛的竹种，约占中国竹林种植面积的73.76%，具有极高的生态价值和经济价值。但在非生物胁迫下，毛竹林的种植面积显著减少[1]。毛竹在生长发育过程中经历多种胁迫后会引发一系列生理生化变化，最终影响毛竹的正常生长[2]。
毛竹基因组由超过63.24%的转座子(TE)组成[3]。TE可以通过2种主要机制在基因组内移动：复制-粘贴和剪切-粘贴。反转录转座子(Ⅰ类)通过RNA中间体利用复制-粘贴机制，而DNA转座子(Ⅱ类)直接作为DNA片段利用剪切-粘贴或复制-粘贴机制在基因组内移动[4−5]。TE是真核生物基因组的动态组成部分，可以被激活或沉默。TE受表观遗传变化的影响较大[6−7]，可以通过塑造表观基因组促进植物对非生物胁迫的适应性反应。对水稻Oryza sativa研究表明：高盐和低温胁迫可诱导基因转录起始位点100 bp内插入TE[8]。转座子受逆境胁迫更容易发生转录[9]。大麦Hordeum vulgare基因组中的BARE-1反转录转座子具有转录活性，拷贝数与基因组大小、温度、水分、土壤类型、海拔等呈正相关[10]。
不确定编码潜力转录本(TUCP)[11]是一类具有明显组织特异性，与基因间长链非编码RNA表达模式相似，但序列保守性明显更高的一种转录本[12]。TUCP可以作为非编码调节因子，翻译成小肽或在转录调节、细胞分化等多种生物活动中发挥作用[13]。越来越多的真核生物基因组TUCP被高通量测序鉴定出来，如棉花Gossypium spp.[14]、人类Homo sapiens [15]、罗非鱼Oreochromis mossambicus[16]、山羊Capra hircus[17]和杜仲Eucommia ulmoides[18]等。在拟南芥Arabidopsis thaliana、水稻和玉米Zea mays中，TE衍生的TUCP参与低温和盐的胁迫反应，并影响种子发芽和幼苗绿化率[19]。棉花中TUCP参与光合作用并影响生长发育过程[14]。高温胁迫影响TUCP转录从而使红枣Ziziphus jujuba基因表达产生了整体性改变[20]。
目前，对毛竹转座子衍生TUCP (TE-TUCP)表达的综合分析尚未见报道。鉴于此，本研究调查非生物胁迫下毛竹幼苗TE-TUCP活性的变化及附近基因的差异表达情况，以期为转座子参与毛竹抗逆分子机制提供参考。
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采用单株母竹的毛竹种子进行水培育苗，每盆1株毛竹幼苗，每组3盆，培养至毛竹幼苗五叶一心期。处理过程如下：首先，在25 ℃暗培养箱中培养幼苗3 d，以避免可见光下紫外线的影响。接着，对第1组幼苗进行冷胁迫处理(C4)，即在4 ℃下处理16 h；对第2组幼苗进行热应激处理(H42)，即在42 ℃下处理4 h；对第3组幼苗进行紫外线胁迫处理(UV)，在30 W紫外线下处理2 h；第4组幼苗未经以上任何胁迫处理，作为对照组(ck)；对第5组幼苗进行盐胁迫处理(Sa)，水培培养基中配置浓度为200 mmol·L−1氯化钠溶液培育幼苗3 d；对第6组幼苗多次浇水，保持与第5组等体积的水培培养基，培育幼苗3 d，作为盐胁迫处理的对照组(wa)。所有样品均在当天10:00采集后在液氮中冷冻保存。
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利用DING等[21]对毛竹幼苗4个胁迫处理(低温、高温、高盐、紫外照射)的全转录组数据(登录号：PRJNA826540)，分析和鉴定基因表达水平。
用Trimmomatic[22]软件进行质量控制；使用Hisat 2[23]软件将质控后获得的干净数据(clean reads)与毛竹参考基因组[3]进行序列比对获得bam类型文件；利用featureCounts软件[24]计数，得到每个基因在各个样本中的原始计数(raw counts，RC)。将原始计数导入R中，利用DESeq 2[25]进行差异表达分析。在读取计数值后，对表达值进行归一化，并计算差异倍数(FC)。根据log2|FC|＞0和P＜0.05选择差异表达基因。
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利用相同的全转录组测序数据，分析和鉴定TUCP表达水平。具体步骤如下：①数据预处理。首先使用Cuffmerge软件[26]，对各样品拼接得到的转录本进行合并，去掉其中链方向不确定的转录本，得到本次测序完整的转录组信息。之后，对合并的转录本集合进行TE-TUCP的筛选。②转录本外显子(exon)个数筛选。过滤转录本拼接结果中大量低表达量、低可信度的单外显子转录本，选择exon≥2个的转录本。③转录本长度筛选。选择长度＞200 bp的转录本。④mRNA剔除。通过Cuffcompare软件，筛除具有编码能力的mRNA，将余下的拼接转录本中，与毛竹基因组编码基因exon区域有重叠的转录本作为后续分析的RNA。⑤转录本表达量筛选。通过Cuffquant计算每条转录本的表达量，选择RC≥1的转录本。⑥针对拼接得到的转录本，剔除mRNA转录本后，综合CNCI[27]、PFAM[28]、CPC2[29]等编码潜能分析方法，进行RNA编码能力分析，将3个软件均表明无编码能力的转录本定义为lncRNA (long non-coding RNA)；其余有部分编码能力，且至少包含1个开放阅读框(ORF)且非lncRNA转录本的即为TUCP。
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利用ZHOU等[30]鉴定的毛竹基因组转座子，使用RepeatMasker[31]鉴定毛竹参考基因组[3]中的转座子，分析已鉴定的转座子在毛竹基因组中的分布和含量。
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使用bedtools (
https://github.com/arq5x/bedtools2 )[32]分析TE和TUCP关系，以确定TE是否与TUCP重叠。与TE序列重叠超过60%的TUCP被鉴定为TE衍生的，简称为TE-TUCP。为了评估TE-TUCP的表达模式，使用StringTie[33]的合并函数组装TE转录本，合并至少1 bp的重叠区域，直到没有交集。随后，使用Gffcompare评估组装TE转录本的质量[34]，最后估计TE-TUCP的表达丰度。将组装后的数据利用featureCounts软件对bam类型的输入文件进行计数，得到表达矩阵。使用tximport R包[35]将featureCounts输出的表达矩阵转换为DESeq2所需的格式。然后使用DESeq2[25]识别差异表达的TE-TUCP。P＜0.05且log2|FC|＞0为显著差异表达的TE-TUCP。将能转录出至少1个TE-TUCP的转座子定义为TUCP-TE；否则，定义为nonTUCP-TE。 -
使用perl脚本check_GCbG_PlusForTE.pl程序分别筛选TUCP-TE和nonTUCP-TE附近5 000 bp差异表达基因。使用OmicShare (https://www.omicshare.com/tools/)上的Gogsea对差异表达基因进行基因本体(GO)富集分析。组间样本基因表达差异筛选标准为：log2|FC|＞0且P＜0.05。保留前30条GO条目，通过矩阵点图显示结果。
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为了验证转录组测序结果的准确性，使用天根生化科技有限公司的RNA提取试剂盒(DP441)提取总RNA。利用TaKaRa Bio公司的反转录试剂盒(RR047A)合成cDNA，用RT-qPCR检测相对转录水平。从鉴定的差异表达TE-TUCP中随机挑选4个TE-TUCP及其附近基因，利用PrimerPremier 6设计RT-qPCR引物，使用翌圣生物科技股份有限公司的Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)(11201ES)进行RT-qPCR试验，反应体系和程序参照试剂说明书，以毛竹肌动蛋白(Actin)作为内参基因。每个RT-qPCR设置3个生物重复和3个技术重复。采用2−∆∆Ct计算相对基因表达水平[36]。使用Graphpad可视化绘图。
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毛竹幼苗全转录组测序数据共获得1 749 524个转录本。在这些转录本的基础上使用Cuffmerge进行数据预处理，保留1 008 312个转录本。通过表达量筛选，获得567 404个表达量至少为1的转录本。
如图1所示：CPC2预测出6 434个TUCP，CNCI预测出73 035个TUCP，PFAM预测出26 040个TUCP，共预测出87 409个TUCP。对TUCP的结构分析表明：TUCP的平均长度为759.73 bp，比mRNA的平均长度短，但比lncRNA的平均长度(241.02 bp)长。
图 1 TUCP筛选结果
Figure 1. Results of TUCP screening
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通过RepeatMasker对毛竹参考基因组注释，共得到991 865条转座子。根据上述鉴定的87 409个TUCP在基因组的位置和转座子在基因组的位置，共有57 627个TUCP与TE序列重叠超过60%，命名为TE-TUCP。其中来源反转录转座子(RE)的TE-TUCP非常丰富，占73.60%。
如表1所示：鉴定的转座子中，TE-TUCP中有17 265个来源于LTR/Copia超家族，23 980个来源于LTR/Gypsy超家族。LTR/Copia和LTR/Gypsy来源的TUCP数量占所有TE-TUCP的71.57%，说明LTR-TE-TUCP含量丰富，可能与LTR/Copia和LTR/Gypsy在毛竹基因组含量丰富(54.97%)[37]有关。DNA-TE-TUCP占所有转座子来源的TUCP的20.75%。其中DNA/CMC-EnSpm类型转座子(66.39%)和DNA/MULE-MuDR类型转座子(55.56%)在TUCP-TE中增加，可能是非生物胁迫导致。
表 1 毛竹TE-TUCP转座子来源
Table 1. Sources of TE-TUCP transposons in Ph. edulis
转座子来源分类 TUCP-TE/
个nonTUCP-TE/
个数量合
计/个DNA 45 115 160 DNA/CMC-EnSpm 2 994 1 516 4 510 DNA/hAT 4 18 22 DNA/hAT-Ac 745 907 1 652 DNA/hAT-Tag1 17 26 43 DNA/hAT-Tip100 228 209 437 DNA/MULE-MuDR 2 368 1 894 4 262 DNA/PIF-Harbinger 112 154 266 DNA/TcMar-Stowaway 153 452 605 LINE/L1 1 040 1 050 2 090 Low_complexity 4 9 13 LTR 68 1058 1126 LTR/Caulimovirus 6 39 45 LTR/Copia 8 456 8 809 17 265 LTR/Gypsy 10 662 13 318 23 980 Other/centromeric 2 2 4 RC/Helitron 241 427 668 Simple_repeat 112 341 453 SINE/L1 6 6 12 SINE 2 2 未知 12 12 合计 27 263 30 364 57 627 -
从图2可见：C4与ck处理组共筛选出261个上调TE-TUCP，246个下调TE-TUCP (图2A)。H42与ck处理组共筛选出199个上调TE-TUCP，127个下调TE-TUCP (图2B)。UV与ck处理组共筛选出270个上调TE-TUCP，178个下调TE-TUCP(图2C)。Sa与wa处理组共筛选出97个上调TE-TUCP，66个下调TE-TUCP (图2D)。TE-TUCP表现出胁迫特异性表达模式，在冷、盐胁迫下下调个数多于上调个数，在热和紫外胁迫下上调个数多于下调个数。
图 2 毛竹TE-TUCP表达模式分析
Figure 2. Analysis of TE-TUCP expression pattern in Ph. edulis
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对TUCP-TE附近4 646个基因研究发现：C4与ck处理组共筛选出758个上调基因，833个下调基因(图3A)，差异表达基因占所有附近基因的34.24%。H42与ck处理组共筛选出358个上调基因，334个下调基因(图3B)，差异表达基因占所有附近基因的14.89%。UV与ck处理组共筛选出739个上调基因，596个下调基因(图3C)，差异表达基因占所有附近基因的28.73%。Sa与wa处理组共筛选出320个上调基因，201个下调基因(图3D)，差异表达基因占所有附近基因的11.21%。
图 3 毛竹TUCP-TE附近基因表达模式分析
Figure 3. Analysis of gene expression patterns in the vicinity of Ph. edulis TUCP-TE
对nonTUCP-TE附近2 456个基因研究发现：C4与ck处理组共筛选出474个上调基因，496个下调基因(图4A)，差异表达基因占所有附近基因的39.50%。H42与ck处理组共筛选出287个上调基因，225个下调基因(图4B)，差异表达基因占所有附近基因的20.85%。UV与ck处理组共筛选出475个上调基因，383个下调基因(图4C)，差异表达基因占所有附近基因的34.93%。Sa与wa处理组共筛选出217个上调基因，130个下调基因(图4D)，差异表达基因占所有附近基因的14.13%。可见，除了低温处理外，高温、高盐、紫外照射处理组TUCP-TE附近5 000 bp距离内基因差异表达数量均比nonTUCP-TE高，表明高温、高盐、紫外照射可以促进TUCP-TE附近差异基因表达，但是低温会抑制TUCP-TE附近差异基因表达。
图 4 毛竹nonTUCP-TE附近基因表达模式分析
Figure 4. Analysis of gene expression patterns in the vicinity of Ph. edulis nonTUCP-TE
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在附近5 000 bp距离内，分别取TUCP-TE和nonTUCP-TE差异表达基因合集2 592、1 591个基因进行GO富集分析。如图5所示：与nonTUCP-TE相比，非生物胁迫下，TUCP-TE附近5 000 bp距离内差异表达基因，除了共同显著富集在细胞、细胞组分、细胞内、细胞内组分、代谢过程外，还额外显著富集在与非生物胁迫相关的催化活性、水解酶活性、对辐射反应、对光刺激反应、对渗透胁迫的反应等方面。表明非生物胁迫可以促进毛竹TUCP-TE附近相关基因的表达。
图 5 GO富集分析
Figure 5. GO enrichment analysis
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如图6所示：nonTUCP-TE附近1 500 bp内的差异表达基因比TUCP-TE相同距离内差异表达基因的数量多，且在越靠近nonTUCP-TE的位置，差异表达基因集中。在附近1 500 bp内，TUCP-TE附近越靠近TUCP，差异表达基因就数量越少，而在距离2 000~3 000 bp内，TUCP-TE附近差异表达基因数量较多。说明基因的表达潜能与邻近TE-TUCP的表达潜能互相抑制。2 000~3 000 bp是TE-TUCP对基因影响较明显的范围。同时，TUCP-TE附近差异表达基因平均表达量为757.1，低于nonTUCP-TE (1 245.5)。TUCP-TE附近差异表达基因表达水平与nonTUCP-TE相比，整体水平上表达峰更低，说明非生物胁迫可能会抑制TE-TUCP附近基因的整体表达水平。
图 6 TE-TUCP与基因距离、基因表达水平统计散点图
Figure 6. Scatterplot of TE-TUCP versus gene distance and gene expression level statistics
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为了验证转录组测序数据分析结果的准确性，从鉴定的差异表达TE-TUCP中随机挑选4个TE-TUCP及其附近基因，分别是TE-TUCP1和PH02Gene02823、TE-TUCP2和PH02Gene14564、TE-TUCP3和PH02Gene16722，以及TE-TUCP4和PH02Gene25649。引物见表2。如图7所示：TE-TUCP和邻近基因的RT-qPCR结果与转录组分析结果一致，说明转录组测序数据分析结果是可靠的。
表 2 引物序列信息
Table 2. Primer sequence information
引物名称 序列(5′→3′) 引物名称 序列(5′→3′) TE-TUCP1-F AACAAGGCAGCGCAGCAGAC TE-TUCP3-R AACTAATGGAAGCGGACGCACG TE-TUCP1-R TTGGCGGCACCTTAGGCTGA PH02Gene16722-F CGAATGGCAGGAGGAGCAGAGA PH02Gene02823-F CTCCACGCCCATCAACACCAAG PH02Gene16722-R TCTTGCCCTTGCCGAAGTGGA PH02Gene02823-R ACTGAGGAGGGAGGAGGCAACT TE-TUCP4-F AGGCAGATTCCGCAGGTGGTT TE-TUCP2-F ATGGTGTTGGTGGTGTGCGTG TE-TUCP4-R ATTCACCAGCATCCAGCTTGGC TE-TUCP2-R CGGCAGATTGCGTGCGTACATA PH02Gene25649-F AATTGCACCTGCCTGCTGGATG PH02Gene14564-F GGAAGGTCAGGCACCAACGATG PH02Gene25649-R ACCTCCCGTCACTGGTCCTTTG PH02Gene14564-R AGCCACCACTGCTACCGTAGTC Actin-F ATACGCTTCCTCACGCTATTCTT TE-TUCP3-F AGCCACGGATTCAGCAACAAGG Actin-R CCGAGCTTCTCCTTTATGTCCCT 
图 7 4个TE-TUCP及其邻近4个基因的RT-qPCR表达分析
Figure 7. RT-qPCR expression analysis of 4 TE-TUCP and four nearby genes
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植物基因组中转座子含量丰富，毛竹基因组共鉴定出TE序列991 865条，占基因组大小的63%[3]。在桑树Morus alba基因组共检测到TE序列286 122条，占基因组大小的32%[38]，玉米基因组中转座子占比70%[39]，高粱Sorghum bicolor基因组中转座子占比55%[40]，水稻基因组中转座子占比26%[41]。可见，TE在植物基因组中占比较高。
本研究表明：毛竹共鉴定出87 409个TUCP，它们的平均长度比mRNA的平均长度短，但比lncRNA的平均长度长。TUCP、mRNA和lncRNA之间的ORF长度具有相同的规律。这与其他植物研究结果相似[14, 17]。
含有应激响应顺式调控元件的TE通过表观遗传修饰对环境胁迫表现出快速反应。例如，番茄Solanum lycopersicum基因组中属于Ty1/Copia超家族的反转录转座子在干旱胁迫和脱落酸(ABA)作用下被激活[42]。番茄和烟草Nicotiana tabacum中的TE可被低温特异性触发和激活[43]。以上研究表明：TE衍生的TUCP能在非生物胁迫下调控自身转录和附近基因的表达。毛竹57 627个TE-TUCP，65.9%来自TE。TE-TUCP主要来源于Ty1/Copia和Ty3/Gypsy超家族。TE-TUCP表现出胁迫特异性表达模式，在冷、盐胁迫下下调数量大于上调数量，在热胁迫和紫外胁迫下上调数量大于下调数量。
本研究发现：低温胁迫抑制TUCP-TE附近基因差异表达，高盐胁迫促进TUCP-TE附近基因差异表达，TE-TUCP与附近基因的表达潜能互相抑制，这与之前拟南芥中TUCP与附近基因转录水平呈负相关结果一致[19]。另外，高温胁迫也能促进TUCP-TE附近基因差异表达。红枣转录组研究表明：TUCP改变了附近基因表达以适应高温环境[20]。本研究还发现：紫外胁迫下，TE-TUCP促进光刺激反应相关基因差异表达。棉花中TUCP参与光合作用并影响生长发育过程[14]。GO富集分析结果显示：TE-TUCP通过调控关键基因在非生物胁迫反应中发挥重要作用。这与TE在非生物胁迫下可重新激活转录从而应对环境条件变化的结论相一致[44]。
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本研究在4种胁迫处理的转录组数据中，共识别出57 627个毛竹TE-TUCP。这些TE-TUCP在面对不同的非生物胁迫时，展现出了各自独特的表达模式。它们主要源自Ty1/Copia和Ty3/Gypsy这2个超家族。基因自身的表达潜力与邻近的TE-TUCP的表达潜力之间存在着一种相互抑制的现象。此外，非生物胁迫还会通过调控TE-TUCP的转录情况，来影响周边基因的表达，从而帮助毛竹适应这些胁迫条件。
Effects of abiotic stress treatments on the transcriptional activity of transposable element-derived TUCP in Phyllostachys edulis
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摘要:
目的 转座子(TE)是真核细胞基因组的重要组成部分，在毛竹Phyllostachys edulis基因组超过63%时，易受胁迫诱导激活。分析非生物胁迫下，来源于转座子的不确定编码潜力转录本(TUCP)的表达模式，为转座子参与毛竹抗逆分子机制提供参考。 方法 采用生物信息学技术和手段，在低温、高温、高盐、紫外照射等4种胁迫处理下，研究毛竹TE-TUCPs及转座子邻近基因的转录特性和转录模式。通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)验证转录组来源的TE-TUCPs差异表达数据的可靠性。 结果 在毛竹4个胁迫处理转录本中，共鉴定出57 627个TE-TUCPs。TE-TUCPs应对不同非生物胁迫表现出特异性表达模式。高温、高盐、紫外照射处理可以促进具有转录活性的TE-TUCPs附近基因差异表达，但是低温会抑制具有转录活性的TE-TUCPs附近基因差异表达。 结论 TE-TUCPs主要来源于Ty1/Copia和Ty3/Gypsy超家族。基因的表达潜能与近距离的TE-TUCPs表达潜能互相抑制。TE-TUCPs转录情况会受到非生物胁迫作用来调控附近基因的表达以适应胁迫影响。图7表2参44 -
关键词:
- 毛竹 /
- 转座子(TE) /
- 不确定编码潜力转录本(TUCP) /
- 非生物胁迫
Abstract:Objective Transposable elements (TE), an essential component of eukaryotic genomes are prone to activation under stress when they account for over 63% of the Phyllostachys edulis genome. This study, with an analysis of the expression patterns of transcripts of uncertain coding potential (TUCP) from transposable elements under abiotic stress, is aimed to provide insights into the molecular mechanisms of TEs in stress resistance in Ph. edulis. Method First, bioinformatics techniques were employed to investigate the transcriptional characteristics and patterns of TE-TUCPs, and neighboring genes in Ph. edulis under 4 stress treatments: low temperature, high temperature, high salinity, and UV irradiation. Then the reliability of the differentially expressed TE-TUCPs, data derived from the transcriptome was validated using RT-qPCR. Result A total of 57 627 TE-TUCPs were identified from the transcripts of Ph. edulis under 4 stress treatments. These TE-TUCPs exhibited specific expression patterns in response to different abiotic stresses. High temperature, high salinity, and UV irradiation promoted differential expression of genes neighboring TE-TUCPs with transcriptional activity, whereas low temperature suppressed such differential expression. Conclusion TE-TUCPs were primarily derived from the Ty1/Copia and Ty3/Gypsy superfamilies. The expression potential of genes and that of nearby TE-TUCPs were mutually inhibitory and the transcription of TE-TUCPs was regulated by abiotic stress to modulate the expression of neighboring genes in response to stress. [Ch, 7 fig. 2 tab. 44 ref.] -
Wuschel-related homeobox (WOX)是植物特有的新型转录因子，属于Homepbox (HOX)超家族，包含由60~65个氨基酸组成的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋的保守结构域。WOX家族基因分为3个独立进化支，即现代进化支(modern clade，WUS)，中间进化支(intermediate clade)和远古进化支(ancient clade)[1-3]，其中WUS是最早发现的WOX家族成员[4]。WOXs蛋白在植物胚胎形成[5]、干细胞维持[6]和花发育[7]等方面发挥重要作用。拟南芥Arabidopsis thaliana中WOX家族有15个成员，分别是AtWUS和AtWOX1~AtWOX14[4]，其中，AtWOX10、AtWOX13和AtWOX14蛋白属于远古进化分支，AtWUS和AtWOX1~7等8个蛋白质属于WUS分支，AtWOX8、AtWOX9、AtWOX11和AtWOX12蛋白属于中间进化分支。AtWUS在胚珠、花药和茎尖分生组织中表达，是维持中央分生组织的关键基因，AtWOX11和AtWOX12参与新生根器官发生，在顶端分生组织发育阶段，AtWUS参与干细胞稳态维持[8]。超表达AtWUS促进棉花Gossypium hirsutum体细胞胚胎发育和器官发生[9]。水稻Oryza sativa中，OsWOX11激活冠根的萌发和生长，过表达OsWOX11可促进雌蕊增加[10]；OsWOX3A参与水稻叶片、小穗、分蘖和侧根的发育[11]；在茎顶端分生组织和腋分生组织中OsWOX4正调控干细胞[12]。超表达WOX11 (PeWOX11a和PeWOX11b)或WOX11/12a增加转基因植株不定根数量[13-14]。在小麦Triticum aestivum中超表达TaWUS影响外花轮状器官发育，TaWOX9促进转基因拟南芥根的发育[15]。
WOXs转录因子不仅调控植物生长发育，而且参与胁迫响应。在水稻中OsWOX12A和OsWOX12B等基因的表达受干旱、寒冷和盐胁迫差异调控，超表达OsWOX11通过促进根毛生长发育提高转基因植株干旱胁迫耐受性[16-17]。84K杨树Populus alba×P. glandulosa中，干旱胁迫诱导PagWOX11/12a基因强烈表达，促进根系伸长和生物量生长，上游调控因子PagERF35激活PagWOX11/12a表达[18]，PagWOX11/12a通过调控PagCYP736A12基因表达，调节活性氧(reactive oxygen species，ROS )清除，提高杨树耐盐性[19]。
杜仲Ecommia ulmoides是杜仲科Eucommiaceae杜仲属Eucommia的落叶乔木，为中国二级保护植物，叶片、树皮和果皮中富含杜仲胶，是重要的胶用和药用经济树种，具有极高的开发利用价值[20]。杜仲叶片中含有绿原酸、黄酮类、木脂素类、环烯醚萜类、α-亚麻酸等药用成分，具有抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力等重要作用[21-22]。鉴于WOX基因在拟南芥、水稻、玉米Zea mays、杨树、油菜Brassica napus、铁皮石斛Dendrobium officinale等中的作用，推测WOX家族基因可能在杜仲叶芽的形成和激活过程中起关键作用。本研究以杜仲基因组数据为基础，对杜仲WOX家族基因进行了全基因组鉴定和生物信息学分析，基于转录组分析WOX在杜仲叶片不同发育时期以及杜仲胶形成中的表达模式，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测杜仲WOX基因(EuWOXs)在‘紫叶’杜仲‘Ziye’叶片发育中的表达水平，以期为EuWOXs功能的深入研究奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
自西北农林科技大学苗圃(陕西杨凌)，取生长正常长势一致的2年生‘紫叶’杜仲幼苗的叶芽(茎尖)、生长叶(3 cm长叶片)、幼叶(完全展开的新叶)，用液氮迅速处理，置于−80 ℃冰箱保存。
1.2 方法
1.2.1 杜仲WOX蛋白(EuWOXs)的鉴定及理化性质分析
拟南芥WOX蛋白序列下载于TAIR数据库(
https://www.arabidopsis.org/index.jsp )，根据Pfam号(PF00046)在杜仲基因组数据库中筛选出WOX家族基因候选序列，利用美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的保守结构域搜索服务(Conserved Domain Search Service，CD Search)检测蛋白质保守结构域，筛选出具有完整WOX结构域的蛋白质作为EuWOX家族成员，利用生物信息学方法[23]分析EuWOXs的理化性质。1.2.2 杜仲WOX家族基因染色体定位及系统进化分析
通过杜仲基因组数据库搜索WOX基因在染色体上的位置及每条染色体长度，利用MapGene2Chromosome v2 (
http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/ )软件绘制WOX家族基因染色体定位。利用DNAMAN进行蛋白序列比对，通过Clustal X 1.83对杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白进行多序列比对，利用MEGA 6.0邻接法(neighbor-joining)，重复次数设置为1 000次[24]，构建系统发育树，根据拟南芥同源基因对EuWOXs蛋白命名。1.2.3 EuWOXs的结构、基序及启动子分析
利用GSDS (
http://gsds.gao-lab.org/index.php )软件分析EuWOXs的内含子和外显子分布。利用MEME (http://meme-suite.org/ )软件分析EuWOXs基序，参数设置为：any number of Repetitions，maximum number of Motifs=20，minimum width≥6，and maximum width≤50。分离EuWOXs启动子(ATG)上游2 000 bp序列，利用Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/ )分析EuWOXs启动子顺式作用元件。1.2.4 EuWOXs的表达模式分析
从NCBI的Short Read Arshive (SRA)数据库中下载‘秦仲1号’‘Qinzhong No.1’叶片不同发育时期(叶芽、初生叶、幼叶、老叶)(版本号：SRP218063)[25]及高产胶杜仲品种‘秦仲2号’‘Qinzhong No.2’、低产胶杜仲品种‘小叶’‘Xiaoye’(版本号：SRP158357)[26]的转录组数据，使用每1百万个映射上的碱基中映射到外显子的每1千个碱基上的碱基个数(fragments per kilobase million，FPKM)值表示EuWOXs相对表达丰度，取对数(log2)进行统计分析，利用TBtools工具绘制基因表达图谱[27]。
使用Trizol(天根DP424)提取RNA，反转录成cDNA，通过Primer 3.0软件设计EuWOXs特异性引物(引物序列见表1)，通过Quant Studio 6(新加坡Life Technologies公司)，All-in-One SYBR Premix EX TaqTM kit(美国Gene Copoeia公司)进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应，10 μL反应体系：2× mix 5.00 μL、正向引物/反向引物各0.25 μL、cDNA 2.00 μL、ROX 0.20 μL、双蒸水2.30 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45个循环。以UBCE2为内参基因[26]，通过$2^{-\Delta \Delta C_t} $法对3次生物学重复进行数据分析。
表 1 引物序列Table 1 Primer sequences基因名 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) EuWOX1 ATGGTGGGTGACCAGCTTAG TTCTCTGGCCTTGTGGTTCT EuWOX2 ACCGTACCCCAACCTACTCC ACTTCCCGTTGGATGAAGTG EuWOX4-1 GGAACCCTACGCAAGAACAG GCGCTTCTGCTTTTGTCTCT EuWOX4-2 TAGAGCAGATCACGGCACAG CTAGGGTCGGATGTTGGAGA EuWOX5 GACGGAGCAAGTGAGAGTCC TCTCCCGTGCCTTATGATTC EuWOX11 ACTCGAGTTTTGTGGCCTGT AATTGGAGGCATCTGGATTG EuWOX13-1 GGTCTGAGGGCATGTGTTTT TTGGAGATATGGGTGGTGGT EuWOX13-2 GGGTTGTTCGTCAAGGTCAT GTTGGAATCCACCGTTGTCT UBCE2 AGTGGGTGGTGCTGTAGTCC AACTCCCGTTTCGTTTGTTG 1.2.5 EuWOXs蛋白互作关系分析
通过STRING软件(
https://string-db.org/ )上传EuWOXs蛋白质序列，利用拟南芥数据库，根据拟南芥WOXs蛋白已知互作关系，预测EuWOXs互作蛋白，通过Cytoscape 3.7.0软件对EuWOXs蛋白质互作信息进行评估和预测[28]。2. 结果与分析
2.1 杜仲WOX家族基因鉴定及其蛋白质理化性质
由表2可知：从杜仲基因组中共鉴定到8个EuWOXs，分布在8条染色体上(图1)；均含有HD保守结构域，其中EuWOX1序列最长，编码352个氨基酸，EuWOX13-2序列最短，编码191个氨基酸。EuWOXs分子量为22.12~40.36 kDa，EuWOX11等电点最小，为5.62，EuWOX4-1等电点最大，为9.04；亚细胞定位预测结果显示：EuWOXs均定位在细胞核中，均为亲水性蛋白。
表 2 EuWOXs蛋白质序列特征及亚细胞定位Table 2 Sequence characteristics and subcellular location of E. ulmoides WOX proteins基因号 基因名 拟南芥
同源基因染色体 位置 CDS长度/
bp氨基酸数/
个分子量/
kDa等电点 亚细胞
定位EUC13591-RA EuWOX1 AT3G18010.1 Super-Scaffold_235 3540694-3544292 1059 352 40.36 5.78 细胞核 EUC12552-RA EuWOX2 AT5G59340.1 Scaffold912_obj 156744-159059 810 269 30.16 8.11 细胞核 EUC15721-RA EuWOX4-1 AT1G46480.1 Super-Scaffold_242 604979-606289 618 205 23.48 9.04 细胞核 EUC21176-RA EuWOX4-2 AT1G46480.1 Scaffold272_obj 37477-39280 642 213 24.31 8.82 细胞核 EUC18832-RA EuWOX5 AT3G11260.1 Super-Scaffold_117 336319-340482 549 182 20.70 6.92 细胞核 EUC00362-RA EuWOX11 AT3G03660.1 Super-Scaffold_154 68808-70507 765 254 27.67 5.62 细胞核 EUC00756-RA EuWOX13-1 AT4G35550.1 Super-Scaffold_233 319468-325733 810 269 30.42 6.22 细胞核 EUC02503-RA EuWOX13-2 AT4G35550.1 Super-Scaffold_71 6332599-6364092 576 191 22.11 6.54 细胞核 2.2 EuWOXs的保守结构域
利用DNAMAN软件对8个EuWOXs及12个拟南芥WOXs蛋白(AtWOXs)保守结构域进行序列分析。结果(图2)显示：WOXs蛋白质HD结构域氨基酸及其分布具有显著的相似性，均包含由60个氨基酸组成的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋，螺旋较环和转角保守。谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)和脯氨酸(Pro)是螺旋Ⅰ (Helix Ⅰ)结构域的保守氨基酸，脯氨酸、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸是螺旋Ⅱ (Helix Ⅱ)结构域的保守氨基酸，相比之下，螺旋Ⅲ (Helix Ⅲ)结构域最为保守，其中保守氨基酸有天冬酰胺(N)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、谷氨酰胺、天冬酰胺和精氨酸(R)。EAR-like仅存在于EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX4-2和EuWOX5中，属于WUS，暗示EuWOXs在进化过程中具有保守性。
图 2 拟南芥和杜仲WOXs的蛋白质同源结构域序列分析Figure 2 Sequence analysis of WOX proteins homeo domain in A. thaliana and E. ulmoides2.3 不同物种WOX家族蛋白的系统发育树
对8个杜仲EuWOXs、15个拟南芥AtWOXs、18个毛果杨Populus trichocarpa WOX蛋白(PotriWOXs)、13个水稻OsWOXs、20个玉米ZmWOXs的蛋白质序列进行多重比对，构建无根系统发育树。结果如 图3所示：74个WOXs蛋白共分为3组[远古进化支、中间进化支和现代进化支(WUS)]，其中远古进化支含有12个WOXs蛋白，中间进化支含22个WOXs蛋白，现代进化支包含的蛋白数量最多，共有40个。8个EuWOXs中，EuWOX13-1和EuWOX13-2属于远古进化支，EuWOX11属于中间进化支，EuWOX1、EuWOX2、EuWOX5、EuWOX4-1和EuWOX4-2等5个蛋白质属于WUS。进化结果显示：杜仲与毛果杨亲缘关系最近。
图 3 杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白系统发育树Figure 3 WOX proteins phylogenetic trees of E. ulmoides, A. thaliana, P. trichocar, O. sativa and Z. mays2.4 EuWOXs基因结构及蛋白质的保守结构域
利用GSDS软件构建EuWOXs基因内含子-外显子结构图，结果如图4显示：EuWOXs含有1~3个内含子，EuWOX13-2、EuWOX2和EuWOX5基因含有2个外显子，EuWOX11、EuWOX13-1、EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3个外显子，EuWOX1含有4个外显子。不同进化分支基因结构差异显著，同一分支基因结构也存在差异。属于中间进化支的EuWOX11含有3个外显子，同属远古进化支的EuWOX13-1和EuWOX13-2分别含有3个和2个外显子，在WUS中，EuWOX2和EuWOX5含有2个外显子，EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3个外显子，而EuWOX1含有4个外显子。
蛋白质保守基序分析显示：EuWOXs含有10个保守基序，分别命名为Motif 1~Motif 10 (图5)，其中Motif 1和Motif 2最为保守，是WOX的核心基序，存在于所有EuWOXs中。Motif 6较为保守，存在于4个EuWOXs蛋白质(EuWOX4-2、EuWOX2、EuWOX1和EuWOX5)中。相同分支EuWOXs含有相似的保守基序，不同分支EuWOXs基序之间存在显著差异，Motif 4~Motif 10只存在于现代进化分支，Motif 3只在EuWOX13-1和EuWOX13-2蛋白质中存在。
2.5 杜仲EuWOXs启动子顺式作用元件分析
顺式作用元件分析结果(图6)显示：EuWOXs启动子中主要包括脱落酸(ABRE)和水杨酸反应元件(TCA-element)、厌氧响应元件(ARE)、光响应元件(Box 4)及玉米蛋白代谢调节元件(O2-site)。所有顺式作用元件中光响应元件最多，达77个，其中Box 4元件有26个，所占比例是34%；G-box和GT1-motif元件均有9个，占比为12%，表明EuWOXs基因表达可能与光合作用有关。EuWOXs共含有46个激素响应元件，32个胁迫响应元件，其中ABRE和ARE元件数量最多，均含有14个，所占比例分别为31%和44%，暗示EuWOXs参与杜仲激素及胁迫响应。此外EuWOXs共含有12个生长发育调控相关元件，其中O2-site有6个，占50%。
2.6 EuWOXs基因表达模式分析
利用‘秦仲1号’叶片不同发育时期转录组数据对EuWOXs基因的表达模式进行分析。结果(图7)可见：EuWOXs在叶片不同发育时期表达丰度存在显著差异，EuWOX11和EuWOX2在杜仲叶芽、初生叶、幼叶、老叶时期均不表达，EuWOX5仅在叶芽和老叶中低表达，EuWOX13-2在4个时期中的FPKM值均大于20，推测EuWOX13-2参与杜仲叶片的整个发育过程；EuWOX13-1和EuWOX4-1在叶芽中表达丰度最高，随着叶片发育表达水平逐渐降低，表明EuWOX13-1和EuWOX4-1主要在叶芽中发挥作用；EuWOX1在生长叶中表达量相对较高，其余EuWOXs基因表达丰度较低，FPKM值小于5。
图 7 EuWOXs在杜仲叶片不同发育阶段的表达模式Figure 7 Expression patterns of EuWOXs at different developmental stages in E. ulmoides leaves利用RT-qPCR检测EuWOXs在‘紫叶’杜仲叶片不同发育阶段(叶芽、生长叶、幼叶)的表达水平。结果(图8)可见：EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX5和EuWOX13-2在生长叶中表达量最高，随着叶片发育表达水平呈先升高后降低趋势，EuWOX4-2在幼叶中表达量最高，EuWOX13-1在叶芽中表达量最高，随着叶片发育，表达量逐渐降低，暗示EuWOX13-1在叶片发育的起始阶段发挥重要作用。EuWOX1、EuWOX13-1和EuWOX13-2在‘紫叶’杜仲叶片中的表达趋势与‘秦仲1号’一致。
图 8 杜仲EuWOXs基因在杜仲叶片不同发育时期的表达模式Figure 8 Expression pattern of EuWOX genes in E. ulmoides leaves at different developmental stages利用‘秦仲2号’和‘小叶’杜仲成熟叶片转录组数据检测EuWOXs的表达模式。由如图9可见：大部分EuWOXs转录水平较低，其中有6个EuWOXs基因几乎不表达，EuWOX13-2表达水平最高，FPKM值＞40，不同胶含量样品之间无显著差异，推测EuWOXs在杜仲胶形成过程中发挥作用较小。
图 9 EuWOXs在杜仲胶形成中的表达模式Figure 9 Expression patterns of EuWOX genes in the form of Eu-rubber2.7 EuWOXs蛋白互作网络预测分析
植物WOXs蛋白由多基因家族编码，蛋白质之间可能存在相互作用。利用STRING数据库，构建EuWOXs蛋白相互作用网络。图10显示：该网络包含21个节点(互作蛋白)和82条边(相互作用组合)。EuWOX4-1可与20个蛋白质互作，其中包含干细胞分化抑制因子(CLE41和CLE44)，细胞增殖和愈伤组织形成蛋白(CLV1、CLV3和ACT7)，胚胎发育相关蛋白(TPL、BBM和APM1)，维管组织发育蛋白(PXY、HB-8、ATHB-15、MOL和RUL1)，细胞程序化死亡调控因子(LOL1)，参与DNA的复制和延伸(MCM1、POLD2)以及信号转导蛋白(F14K14)，花药发育关键调控因子(RPK2)，参与DNA的复制植物发育相关转录因子GRAS(HAM3和SCL27)等，推测EuWOXs全面参与了杜仲的生长发育。
图 10 EuWOXs蛋白互作网络预测Figure 10 Prediction of interaction network between EuWOX proteins3. 讨论
WOX蛋白是植物特有的高度保守的一类转录因子，广泛参与植物的生长发育、干细胞维持、组织器官发生和形成等多种生物学过程。到目前为止，WOX家族基因已在多个物种进行了研究报道，如拟南芥中含有15个、毛果杨18个、水稻中有13个、玉米中有20个、毛竹Phyllostachys edulis 中存在27个[29]，小麦中有26个[30]、茶树Camellia sinensis中包含18个[31]，黄瓜Cucumis sativus中有11个[3]，陆地棉Gossypium hirsutum中含有38个[32]。小麦(17 Gb)[33]、玉米(2 300 Mb)[34]和毛竹(2 021 Mb)[35]基因组大于杜仲(1.2 Gb)[36]，拟南芥(164 Mb)[37]、水稻(441 Mb) [38]和毛果杨(392.3 Mb)[39]基因组小于杜仲。杜仲WOX数量低于拟南芥、毛果杨、水稻、玉米、小麦和毛竹，表明WOXs基因的丰富程度与基因组大小无关，这可能与基因重复有关。
杜仲基因组中共鉴定出8个EuWOXs，分布在8条染色体上。EuWOXs均为核定位蛋白，在现代进化支(WUS)、中间进化支和远古进化支分别含有5、1和2个成员，其系统发育模式与拟南芥、水稻、陆地棉等类似[29，31-32]。EuWOXs基因启动子中含有多种生长发育、激素响应、非生物胁迫以及光周期响应元件。在水稻中，WUS的OsWOX5和中间进化支的OsWOX11、OsWOX12A和OsWOX12B基因表达受生长素、细胞分裂素和赤霉素调节，超表达OsWOX11可提高水稻抗旱性[16-17]。细胞分裂素强烈促进苹果Malus pumila WOX1和WOX3基因表达，生长素诱导黄瓜CsWOX1b和CsWOX3基因表达[3]。在拟南芥中，生长素反应因子5 (AUXIN RESPONSE FACTOR，ARF5)上调AtWOX1和PRS (AtWOX3)基因的表达，ARF2、ARF3和ARF4抑制AtWOX1和PRS的表达[40]。OsWOX3A参与水稻器官发育、叶片横向轴伸长、颖花外稃形态发生以及分蘖和侧根发育[10]，MtWOX1的同源基因STENOFOLIA是蒺藜苜蓿Medicago truncatula叶片生长和维管组织形成的必须基因[41]，PttWOX4在杨树形成层中特异表达，PttWOX4a/b RNAi干扰后导致维管形成层宽度缩小，次生生长减弱[42]。推测EuWOXs可能在杜仲生长发育、激素和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。
WOX家族基因参与叶片发育。属于中间支的AtWOX9/STIMPY过表达导致拟南芥叶缘波浪化[43]，SlLAM1主要在番茄Solanum lycopersicum叶片、花和果实中表达，SlLAM1缺失导致叶片变窄，次生小叶数量减少[44]，超表达黄瓜CsWOX9导致转基因拟南芥角果变短，莲座叶和分枝数目增加[3]。来源于WUS的AtWOX3是拟南芥侧托叶发育的必需基因，Atwox1和Atwox3缺失突变体导致叶片和花器官变窄，影响叶片横向扩张和花瓣融合[45-46]；GhWOX9_At，GhWUSa_At和GhWUSb_Dt主要在棉花幼叶中高量表达[47]。远古进化分支中的OsWOX13在水稻叶、茎、根维管组织中表现为空间表达调控，在花和发育中的种子中是时间表达调控[48]。在杜仲中，EuWOX13-1在叶芽中表达量最高，随着叶片发育，转录水平逐渐降低，暗示EuWOX13-1主要在杜仲叶片发育的早期阶段发挥作用。EuWOX13-2在生长叶中表达量较高，在叶片发育过程中呈现先升高后降低的趋势。EuWOX13-1和EuWOX13-2是一对重复基因，其表达水平的差异可能与基因结构不同有关，也可能是EuWOX13-1和EuWOX13-2在重复后发生了功能分化。在甘蓝型油菜Brassica napus中，BnCWOX13a与BnCWOX13c互为同源基因，然而它们的表达趋势完全不同[49]，在拟南芥中，AtWOX13在初生根、侧根、雌蕊和胚发育中动态表达，而AtWOX13的直系同源基因AtWOX14只在侧根形成的早期阶段和发育的花药中特异表达[50]，由此推测EuWOX13-2可能只获得了EuWOX13-1基因的部分功能，具体功能还需要进一步研究。
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图 3 毛竹TUCP-TE附近基因表达模式分析
Figure 3 Analysis of gene expression patterns in the vicinity of Ph. edulis TUCP-TE
图 4 毛竹nonTUCP-TE附近基因表达模式分析
Figure 4 Analysis of gene expression patterns in the vicinity of Ph. edulis nonTUCP-TE
图 6 TE-TUCP与基因距离、基因表达水平统计散点图
Figure 6 Scatterplot of TE-TUCP versus gene distance and gene expression level statistics
图 7 4个TE-TUCP及其邻近4个基因的RT-qPCR表达分析
Figure 7 RT-qPCR expression analysis of 4 TE-TUCP and four nearby genes
表 1 毛竹TE-TUCP转座子来源
Table 1. Sources of TE-TUCP transposons in Ph. edulis
转座子来源分类 TUCP-TE/
个nonTUCP-TE/
个数量合
计/个DNA 45 115 160 DNA/CMC-EnSpm 2 994 1 516 4 510 DNA/hAT 4 18 22 DNA/hAT-Ac 745 907 1 652 DNA/hAT-Tag1 17 26 43 DNA/hAT-Tip100 228 209 437 DNA/MULE-MuDR 2 368 1 894 4 262 DNA/PIF-Harbinger 112 154 266 DNA/TcMar-Stowaway 153 452 605 LINE/L1 1 040 1 050 2 090 Low_complexity 4 9 13 LTR 68 1058 1126 LTR/Caulimovirus 6 39 45 LTR/Copia 8 456 8 809 17 265 LTR/Gypsy 10 662 13 318 23 980 Other/centromeric 2 2 4 RC/Helitron 241 427 668 Simple_repeat 112 341 453 SINE/L1 6 6 12 SINE 2 2 未知 12 12 合计 27 263 30 364 57 627 
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表 2 引物序列信息
Table 2. Primer sequence information
引物名称 序列(5′→3′) 引物名称 序列(5′→3′) TE-TUCP1-F AACAAGGCAGCGCAGCAGAC TE-TUCP3-R AACTAATGGAAGCGGACGCACG TE-TUCP1-R TTGGCGGCACCTTAGGCTGA PH02Gene16722-F CGAATGGCAGGAGGAGCAGAGA PH02Gene02823-F CTCCACGCCCATCAACACCAAG PH02Gene16722-R TCTTGCCCTTGCCGAAGTGGA PH02Gene02823-R ACTGAGGAGGGAGGAGGCAACT TE-TUCP4-F AGGCAGATTCCGCAGGTGGTT TE-TUCP2-F ATGGTGTTGGTGGTGTGCGTG TE-TUCP4-R ATTCACCAGCATCCAGCTTGGC TE-TUCP2-R CGGCAGATTGCGTGCGTACATA PH02Gene25649-F AATTGCACCTGCCTGCTGGATG PH02Gene14564-F GGAAGGTCAGGCACCAACGATG PH02Gene25649-R ACCTCCCGTCACTGGTCCTTTG PH02Gene14564-R AGCCACCACTGCTACCGTAGTC Actin-F ATACGCTTCCTCACGCTATTCTT TE-TUCP3-F AGCCACGGATTCAGCAACAAGG Actin-R CCGAGCTTCTCCTTTATGTCCCT
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