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叶用芥菜 Brassica juncea var. foliosa为十字花科Brassicaceae芸薹属Brassica 1~2年生草本植物,其营养丰富,鲜食、加工均宜,深受广大人民群众喜爱,是中国栽培最为普遍的芥菜类蔬菜。目前,生产上叶用芥菜仍以常规品种为主[1],传统育种获得纯系及性状稳定后代需要多代自交和后代性状选择,所需年限较长[2]。利用游离小孢子培养技术获得纯合系,从而缩短杂交育种年限,提高选择效力,加快优良性状转移是当前叶用芥菜育种的重要技术方法和理想途径,目前已在甘蓝型油菜Brassica napus,白菜Brassica campestris ssp. chinensis,青花菜Brassica oleracea var. italica,甘蓝Brassica oleracea等芸薹属蔬菜作物育种中得到广泛应用[3-7]。与芸薹属其他蔬菜相比,芥菜种Brassica juncea蔬菜游离小孢子培养建立困难,相关研究报道不多。目前,在叶用芥菜小孢子离体培养技术体系方面,也仅在金丝芥Brassica juncea var. multisecta,雪里蕻Brassica juncea var. multiceps,结球芥Brassica juncea var. capitata、独山大叶青Brassica juncea var. rugosa等部分品种上有少量研究报道[8-13]。小孢子诱导分化困难、成胚率低,仍然是当前叶用芥菜游离小孢子培养技术体系建立的主要问题。本试验以5个不同叶用芥菜品种为材料,研究了不同遗传背景、低温预处理、高温热击、培养基更新及加液、秋水仙碱处理对小孢子胚状体发生及发育的影响,以期为叶用芥菜小孢子培养技术的有效利用提供参考。
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小孢子培养过程中,细胞学观察发现,刚游离的小孢子(图 1-Ⅰ)经高温热激处理后部分小孢子先是体积膨大(图 1-Ⅱ),之后少数膨大小孢子发生1次细胞分裂(图 1-Ⅲ),后经多次细胞分裂(图 1-Ⅳ),继续发育形成球形胚,心型胚(图 1-Ⅴ)和鱼雷型胚(图 1-Ⅵ)等,将光照条件下培养转绿的子叶型胚(图 -Ⅶ1,1-Ⅷ)转入固体培养基进行胚萌发、分化、生根后获得再生植株(图 1-Ⅸ)。
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由表 1可知:供试品种游离小孢子经33 ℃高温处理24 h,有‘上海金丝芥’‘特选九心芥’‘花叶香芥菜’3个品种产生胚状体。不同基因型材料间胚状体产量差异显著,同时还发现产胚数量多的材料,子叶胚所占比例也相应较高。‘特选九心芥’出胚总数最多,平均产胚2.20个·蕾-1,子叶胚比例也高达50.0%;‘花叶香芥菜’获得胚状体数量最少,平均产胚0.22个·蕾-1,子叶胚比例仅为34.7%;而‘四季客家芥’‘温州芥菜’未能诱导出胚,经33 ℃热激培养4 h后,显微镜下观察到上述两品种有少量小孢子膨大现象,但之后未见有进一步的细胞分裂。
品种 接种蕾数/个 接种皿数 出胚数/(个•雷-1) 子叶胚比例/% ‘四季客家芥’ 30 10 0.00 d 0 ‘上海金丝芥’ 30 9 0.54 b 40.6 ‘温州芥菜’ 30 9 0.00 d 0 ‘特选九心芥’ 30 8 2.20 a 50.0 ‘花叶香芥菜’ 30 9 0.22 c 34.7 说明:Duncan’s新复极差测验,不同小写字母为差异表达水平(P<0.05)。 Table 1. Differences of microspore embryogenesis in different genotypes of Brassica juncea var. foliosa
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从表 2可以看出:低温处理24~48 h条件下供试材料产胚数量较高。‘上海金丝芥’最佳低温预处理时间为48 h,平均出胚0.88个·蕾-1,为对照的1.5倍;‘特选九心芥’经24~48 h低温预处理胚状体发生能力明显提高,但随着时间延长至72 h,出胚数由2.57个·蕾-1减少至1.59个·蕾-1,产胚能力明显下降;与对照相比,‘花叶香芥菜’低温预处理胚状体数量差异不明显。
t/h 出胚数/(个•蕾-1) 子叶胚比例/% ‘ 四季客家芥’ ‘ 上海金丝芥’ ‘ 温州芥菜’ ‘特选九心芥’ ‘花叶香芥菜’ ‘ 四季客家芥’ ‘上海金丝芥’ ‘ 温州芥菜’ ‘ 特选九心芥’ ‘花叶香芥菜’ 0 0 0.56 b 0 2.12 b 0.22 a 0 39.7 0 49.6 35.4 24 0 0.80 a 0 2.57 a 0.28 a 0 42.9 0 52.4 37.4 48 0 0.88 a 0 2.46 a 0.24 a 0 45.7 0 52.1 33.6 72 0 0.75 a 0 1.59 c 0.18 a 0 39.4 0 48.8 30.6 说明:Duncan’s新复极差测验,不同小写字母为差异表达水平(P<0.05#。 Table 2. Effect of low temperature pretreatment on microspore embryogenesis of Brassica juncea var. foliosa
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由表 3可知:不同热激处理温度和时间,供试材料小孢子产胚量差异显著。33~34 ℃高温热激处理能显著提高大部分材料胚状体发生频率,35 ℃处理的胚状体的发生数量则明显减少。此外,高温热激处理时间亦对小孢子产胚量有一定影响,33~34 ℃条件下处理24~48 h小孢子胚状体诱导率较高;‘特选九心芥’在33 ℃热激处理48 h条件下出胚量最高,平均产胚2.71个·蕾-1,随着热激处理时间延长至72 h,产胚量明显下降;‘上海金丝芥’则以34 ℃处理24 h最佳,‘花叶香芥菜’以34 ℃处理48 h效果最佳。对照处理5个基因型材料则均未诱导出胚状体。
T/℃ t/h 出胚数/(个•蕾-1) 子叶胚比例/% ‘ 四季客家芥’ ‘ 上海金丝芥’ ‘ 温州芥菜’ ‘特选九心芥’ ‘花叶香芥菜’ ‘ 四季客家芥’ ‘上海金丝芥’ ‘ 温州芥菜’ ‘ 特选九心芥’ ‘花叶香芥菜’ 25 - 0.00 e 0 0.00 f 0.00 d 0 0 0 0 0 33 24 0 0.79 b 0 2.42 b 0.28 bc 0 40.7 0 50 35.6 48 0 0.82 b 0 2.71 a 0.34 b 0 42 0 53.7 38.3 72 0 0.42 cd 0 0.71 e 0.00 d 0 32.7 0 41 0 34 24 0 1.11 a 0 2.36 b 0.37 b 0 45.3 0 47.7 36.7 48 0 1.01 a 0 1.54 c 0.70 a 0 48.3 0 46.3 41.7 72 0 0.29 d 0 0.03 f 0.21 c 0 39.7 0 0 34.3 35 24 0 0.74 b 0 0.97 d 0.00 d 0 39.3 0 42.7 0 48 0 0.46 c 0 0.57 e 0.00 d 0 31 0 43 0 72 0 0.00 e 0 0.00 f 0.00 d 0 0 0 0 0 Table 3. Effect of high temperature on microspore embryogenesis of Brassica juncea var. foliosa
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从表 4可以看出:在6个处理中,质量浓度为17%的蔗糖起始培养后添加等量的90.0 g·L-1蔗糖培养基培养效果最好。该处理能显著提高‘上海金丝芥’‘特选九心芥’‘花叶香芥菜’胚状体发生频率;170.0 g·L-1蔗糖培养基培养48 h,重新离心更换130.0 g·L-1蔗糖培养基亦能显著提高‘上海金丝芥’‘花叶香芥菜’产胚能力;而170.0 g·L-1蔗糖持续培养则严重抑制小孢子胚状体发育,所有供试材料均无法获得胚状体。130.0 g·L-1蔗糖起始培养后更新或加液等处理对小孢子胚状体诱导的影响则因材料不同而效果不尽相同。
起始培养基 更换培养基 添加培养基 出胚数/(个•蕾-1) 子叶胚比例/% ‘ 四季客家芥’ ‘ 上海金丝芥’ ‘ 温州芥菜’ ‘特选九心芥’ ‘花叶香芥菜’ ‘ 四季客家芥’ ‘上海金丝芥’ ‘ 温州芥菜’ ‘ 特选九心芥’ ‘花叶香芥菜’ NLN-13 - - 0.81 b 0 2.69 b 0.29 d 0 38.3 0 49.2 35.8 NLN-13 - NLN-13 0 0.92 b 0 2.72 b 0.54 c 0 41.5 0 50.1 40.4 NLN-13 NLN-13 - 0 0.93 b 0 2.46 c 0.49 c 0 39.9 0 49.3 38.5 NLN-17 - - 0 0.00 c 0 0.00 d 0.00 e 0 0 0 0 0 NLN-17 - NLN-9 0 1.21 a 0 2.96 a 0.94 a 0 43.9 0 51.5 42.5 NLN-17 NLN-13 - 0 1.17a 0 2.74 bc 0.71 b 0 44.7 0 50.3 42 说明: Duncan’s新复极差测验,不同小写字母为差异表达水平(P<0.05)。 Table 4. Eifect of adding and replacing medium on microspore embryogenesis of Brassica juncea var. foliosa
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由表 5结果可以看出:适宜的秋水仙碱质量浓度及其时间处理能够有效促进小孢子胚胎发生。试验中,1.0~10.0 mg·L-1低质量浓度秋水仙碱处理能显著提高大部分材料产胚量,随着质量浓度提高,100.0 mg·L-1秋水仙碱处理则明显抑制胚状体的产生。1.0 mg·L-1秋水仙碱处理24~48 h,能显著提高‘特选九心芥’出胚量,最高达3.16个·蕾-1;10.0 mg·L-1秋水仙碱处理24~48 h,则显著提高‘花叶香芥菜’胚产量;10.0 mg·L-1秋水仙碱处理 48 h比24 h不仅显著增加胚产量,子叶胚比例亦提高5.7%。‘上海金丝芥’最佳处理条件为50.0 mg·L-1处理24 h,出胚量最高达1.68个·蕾-1,处理时间延长为48 h,出胚量则迅速降低仅为0.99个·蕾-1。可见较低质量浓度秋水仙碱及适宜时间组合有助于促进胚状体产生,高质量浓度秋水仙碱及长时间处理则会造成毒害。
pl(mg·L-1) t/h 出胚数/(个•蕾-1) 子叶胚比例/% ‘ 四季客家芥’ ‘ 上海金丝芥’ ‘ 温州芥菜’ ‘特选九心芥’ ‘花叶香芥菜’ ‘ 四季客家芥’ ‘上海金丝芥’ ‘ 温州芥菜’ ‘ 特选九心芥’ ‘花叶香芥菜’ 0 24 0 0.78 d 0.00 e 2.40 b 0.26 e 0 41.3 0 50.5 36.6 48 0 0.79 d 0.00 e 2.48 b 0.41 d 0 40.7 0 52.2 43.5 1 24 0 0.81 d 0.00 e 3.03 a 0.41 d 0 43.7 0 54.2 43.3 48 0 0.89 cd 0.17 d 3.16 a 0.63 c 0 43.9 38.7 50.7 45.5 10 24 0 1.12 b 0.44 b 2.52 b 1.02 a 0 44.7 39.5 46.8 47.8 48 0 1.60 a 0.73 a 1.62 c 0.93 b 0 46.4 45.2 45 46.3 50 24 0 1.68 a 0.31 c 0.38 d 0.36 d 0 42.9 38.8 43.2 43.3 48 0 0.99 c 0.00 e 0.00 e 0.18 e 0 39.2 0 0 39.5 100 24 0 0.38 e 0.00 e 0.00 e 0.00 f 0 37.8 0 0 0 48 0 0.00 f 0.00 e 0.00 e 0.00 f 0 0 0 0 0 说明: Luncan’s新复极差测验,不同小写字母为差异表达水平(P<0.05)。 Table 5. Effect of colchicine treatment on microspore embryogenesis of Brassica juncea var. foliosa