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H+-ATPase是广泛存在于植物质膜和各种内膜系统中的一种功能蛋白,在细胞代谢过程中起非常关键的作用[1]。目前,被报道的H+-ATPase按结构可分为P型、F型和V型。其中F型H+-ATPase位于叶绿体内囊体膜和线粒体内膜上,V型H+-ATPase定位于液泡膜上,质膜H+-ATPase属于P型ATPase[2]。质膜H+-ATPase能够通过水解三磷酸腺苷(ATP)产生能量,将细胞质中的氢离子(H+)逆浓度泵出细胞(也称为质膜质子泵),其功能主要是在细胞膜两侧产生氢离子(H+)浓度梯度和膜电位,为一系列次级转运体和通道蛋白跨质膜转运各种离子和小分子代谢产物提供驱动力和能量[3]。一系列的实验结果证明:植物质膜H+-ATPase能够参与胞内酸碱度的调节、离子平衡、细胞的伸长生长、气孔的开闭等多种生理过程[4]。植物中的质膜H+-ATPase几乎都是由一个多基因家族所编码,且不同的成员在表达上具有一定的特异性和部分重叠性[5]。例如,在模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana中共鉴定到11个编码质膜H+-ATPase的同源基因(AHA1~11)[6]。其中,AHA1和AHA2在所有的组织器官中都有表达,其表达模式趋向于组成型[7];AHA3主要在维管组织和生殖器官中表达[8];AHA6,AHA8和AHA9几乎只在花器官中表达[9];AHA10主要在发育中的种子种皮的内膜上表达[10]。这些结果暗示了在长期的进化过程中,不同的质膜H+-ATPase基因在植物发育的不同阶段所分化形成的相对保守性和/或特异性的生理功能。植物质膜H+-ATPase活性在基因表达水平的调节还受到激素(如吲哚-3-乙酸等)和环境(如盐害、病菌侵染、菌根真菌共生)因素的影响[11]。番茄Solanum lycopersicum作为茄科Solanaceae作物中的一员,不仅是一种重要的经济作物,而且由于其基因组相对比较简单(大部分品种都为二倍体),以及全基因组测序和组装工作已经接近完成,也已经成为生物学和遗传学研究的一个理想的模式作物[12]。根据前期研究关于Southern印记杂交的结果推测,番茄中可能存在着至少7个编码质膜H+-ATPase的基因LHA1~7[13]。现有研究仅对其中的3个基因(LHA1,LHA2和LHA4)进行了全长cDNA序列的克隆和表达调控分析,而其他4个可能的LHA基因只报道了约200 bp的DNA序列[14]。本研究通过对番茄全基因组序列文库和EST/cDNA文库进行检索,共获得了8个具有完整编码区的质膜H+-ATPase基因LHA1~8,其中LHA8为从未报道过的新基因。对这8个基因的序列结构特征、进化关系以及组织表达模式做进一步分析,可为将来深入研究番茄质膜H+-ATPase基因家族的生物学功能奠定工作基础。
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番茄微型模式品种Solanum lycopersicum ‘Micro-Tom’,成熟期为70~80 d,株高约为15 cm。
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番茄种子用体积分数为10%的过氧化氢溶液表面消毒10 min,自来水冲洗后置灭过菌的石英沙于25 ℃培养箱中萌发至真叶完全展开,用1/2浓度的营养液和完全浓度的营养液各培养1周后移栽进行后续实验处理。营养液的配方及浓度为:1.00 mmol·L-1硝酸铵(NH4NO3),2.00 mmol·L-1硝酸钾(KNO3),0.50 mmol·L-1硝酸钙(Ca(NO3)2),1.00 mmol·L-1磷酸二氢钠(NaH2PO4),0.25 mmol·L-1氯化钙(CaCl2),0.50 mmol·L-1硫酸镁(MgSO4),20.00 μmol·L-1乙二胺四乙酸铁钠(Fe-EDTA),9.00 μmol·L-1氯化锰(MnCl2),46.00 μmol·L-1硼酸(H3BO3),8.00 μmol·L-1硫酸锌(ZnSO4),3.00 μmol·L-1硫酸铜(CuSO4),0.03 μmol·L-1钼酸铵((NH4)6Mo7O24)。pH值调至pH 5.8。
养分缺乏和高盐处理:试验共设计4个养分缺乏(氮、磷、钾和镁)和1个高盐(氯化钠)胁迫处理。对照处理为完全营养液培养;养分缺乏处理中的磷、钾和镁的浓度分别降低到对照处理的1/20,其他养分元素浓度不变;高盐处理为在完全营养液中额外加入200 mmol·L-1的氯化钠。生物学重复3个·处理-1。
接种菌根真菌盆栽试验:试验前将洗净的石英砂灭菌后装到3 L的塑料盆中,种番茄小苗3株·盆-1,苗根部接入2.0 g·株-1左右的丛枝菌根真菌Rhizophagus irregularis孢子菌剂,共设3个生物学重复。
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取约2 μg的植物组织样品的总RNA,严格按照Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit With cDNA Eraser反转录试剂盒的操作说明进行cDNA合成及后续的实时荧光定量PCR分析(ABI plus real-time PCR system。表 1)。内参基因为组成型表达的Actin基因[15]。
基因 上游引物序列(5'→3') 下游引物序列(5'→3') LHA1 CGCGAGCTTCAATGGGCACA GCTCCCATCACGACACCAACAGT LHA2 GGGCTGCAAGTTCCTGACACC TCTTCATTCTATCACCCACTCACCAG LHA3 GCCAAACGTCGTGCTGAAGT CGTAAGGAAGGGAAAGAGGGAAC LHA4 CCGGGAACTGTCTGAAATTGCTG CTGCCATTCCCTTTTCTTGTGTGTA LHA5 GGGAACTGTCTGAGATTGCTGAAC TCATCCAACAACATGCCAGCAGC LHA6 TGGTTCCTCTTGATAAATTATTGACA AGCCATGATAGCAGCACACTCC LHA7 CCACGACAAGAACTACAGGGAATT TTTCAGCATGTTCCTTTTAGAGTGTA LHA8 AGCAAAAAGGCGCGCAGATAT AAGGCGAAAAACTCCACAAATGA Actin TTCCGTTGCCCAGAGGTCCT TCGCCCTTTGAAATCCACATC Table 1. Gene-specific primers used for real-time RT-PCR amplification of tomato LHA and Actin genes
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HA蛋白序列的比对分析和系统进化树的绘制分别由ClustalX 1.83和MEGA 4.0软件完成。构建进化树的算法采用邻接法(Neighbor-Joining)。
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根据LHA8起始密码子ATG上游的启动子序列,设计5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ的正向引物(aagcttagaatccatcattggatcact)和反向引物(ggatccggtagctcaattgattgaaccc),以番茄基因组DNA为模板,进行PCR扩增,将扩增得到的2 669 bp的启动子片段克隆到pEASY-Blunt载体(北京全式金公司产品)。测序验证后用HindⅢ和BamHⅠ将启动子片段从克隆载体中切下,回收。同样将双元表达载体pBI121用HindⅢ和BamHⅠ将35S启动子片段切下并回收剩余的线性化的片段,与从克隆载体上切下的目的基因启动子片段通过T4 DNA Ligase定向连接。将重组后的表达载体质粒用电击法转化至根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens感受态细胞(EHA105)中备用。
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采用根癌农杆菌介导的烟草遗传转化方法(叶盘法)[16]。
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剪取不同转基因株系的根系浸入Magenta-GUS染液中,37 ℃反应6 h后在FAA固定液[V(甲醛):V(冰醋酸):V(70%乙醇)=1:1:18混合配制而成]中脱色固定10 h,镜检成像(BX50 OLYPUS显微镜)。
1.1. 供试材料
1.2. 试验设计
1.3. 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析
1.4. 进化树分析
1.5. 启动子片段融合pBI121表达载体的构建
1.6. 烟草Nicotiana tabacum转基因
1.7. GUS染色
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为了确认番茄质膜H+-ATPase基因家族中的成员数目,我们以已报道的3个番茄质膜H+-ATPase基因LHA1,LHA2和LHA4的全长编码序列(CDS)作为查询序列,采用BLASTN和TBLASTN程序分别在番茄基因组数据库和EST/cDNA数据库中进行同源序列搜索。通过对所获得的序列进行相似性和结构域分析,最终筛选到8个具有完整编码区的LHA基因,其中7个与之前报道的LHA1~7序列完全一致,而另外一个(本研究中命名为LHA8)为从未报道过的新基因。序列分析显示,这8个LHA基因具有相近大小的开放阅读框(ORF),且编码的氨基酸序列之间具有很高的相似性(表 2)。其中,LHA1和LHA2以及LHA5和LHA6之间的氨基酸序列相似性分别高达91.5%和98.3%。
基因 氨基酸序列相似性/% 开放阅读框大小/bp LHA1 LHA2 LHA3 LHA4 LHA5 LHA6 LHA7 LHA8 LHA1 100 2 871 LHA2 91.5 100 2 871 LHA3 78.0 78 0 100 2 865 LHA4 74.6 76 3 79 7 100 2 859 LHA5 81.4 79 7 79 7 72 9 100 2 856 LHA6 79.7 78 0 78 0 71 2 98 3 100 2 856 LHA7 79.7 78 0 78 0 74 6 86 4 84 7 100 2 775 LHA8 84.7 84 7 74 6 74 6 79.7 79 7 72.9 100 2 901 Table 2. Similarity matrix for the predicted amino acid sequences of the eight tomato LHAgenes
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将8个LHA基因的编码序列(CDS)和DNA序列比对后分析发现,这些基因的编码区中都包含有多个内含子(图 1)。其中LHA1,LHA2和LHA8含有的内含子最多,为20个;而LHA4含有的内含子最少,只有10个。对内含子在LHA基因中的分布位置进一步分析发现,这8个LHA基因具有较为保守的内含子/外显子结构特征,即各LHA基因中的不同内含子相对于外显子的位置较为一致。从图 1中还可以得知,LHA基因在进化过程中存在着多处较为明显的内含子丢失(intron loss)现象,如LHA5,LHA6和LHA7相对于LHA1,LHA2和LHA8这3个基因而言在第5个和第7个内含子处出现了丢失,导致了相应位置的外显子发生了序列合并。
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对番茄LHA基因以及其他模式植物中同源基因序列进行的系统进化分析发现,植物质膜H+-ATPase基因家族可以大致分为5个亚家族(图 2),与之前其他课题组所报道的结果类似。除了番茄LHA3孤立于这5个亚家族之外,其他7个LHA基因分布于4个亚家族中,其中LHA1和LHA2分布在第I亚家族,且聚在同一进化分枝的末端,暗示了LHA1和LHA2的进化关系较近,复制产生这2个同源基因的事件发生在茄科植物与其他双子叶植物分化之后。与此类似的是,聚集在第Ⅳ亚家族的LHA5,LHA6和LHA7的进化关系也非常近。由于LHA5和LHA6之间的序列相似性非常高(表 1),且外显子/内含子的结构完全一致(图 1),暗示LHA5和LHA6可能是来源于同一个基因的复制,因此推测这2个基因可能具有相似的表达调控模式或行使相似的生物学功能。LHA4和LHA8分别处于第Ⅱ和第Ⅴ亚家族,与来自于其他双子叶和单子叶植物中的同源基因具有相对较近的进化关系,暗示了LHA4和LHA8的进化起源较早,至少出现在双子叶植物和单子叶植物分化之前。值得注意的是,番茄LHA基因的内含子/外显子结构特征能够很好地反应这些基因之间的进化关系,即在进化上具有较近关系的LHA同源基因,其内含子/外显子的结构特征也较为接近。
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图 3显示为番茄LHA基因的组织表达特征。结果显示:在正常培养条件下,除了LHA8在所有被分析的组织中都检测不到表达信号外,其他7个LHA基因都能在某些或某个组织中被检测到较为明显的表达。具体而言,LHA1,LHA2和LHA4在所有的组织中都有表达,但在果实中的表达都相对较低,其中LHA2在所有组织中的表达丰度相对较高。尽管LHA3在所有被检测的组织中也都有表达,但除了在花中有相对较高的表达之外,在其他组织中的表达都很微弱。LHA5,LHA6和LHA7这3个基因的表达模式比较特异,几乎只在花中有表达,其中LHA5和LHA6的表达尤为强烈(图 3)。
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鉴于LHA8为新报道的基因,且在正常培养的番茄中不能被检测到表达。为了验证该基因的表达是否受到其他环境因素调控,本研究检测了LHA8在不同养分(氮、磷、钾和镁)缺乏、高盐(氯化钠)胁迫以及接种菌根真菌处理条件下番茄根系中的表达水平(图 4)。结果表明:LHA8在养分缺乏和高盐处理的番茄根系中也都检测不到表达,但是在接种菌根真菌处理的番茄根系中能够检测到强烈的表达(图 4)。
为了更直观地证实LHA8在被菌根真菌侵染根系中的表达部位,我们构建了LHA8启动子片段(命名为pLHA8)融合GUS报告基因的双元表达载体pLHA8-GUS,并通过农杆菌介导的转基因方法转化到了烟草中。对阳性转基因烟草植株的GUS染色分析发现,LHA8的启动子能够驱动GUS报告基因在被菌根真菌侵染的根系中特异性表达,且表达部位主要集中在被菌根真菌菌丝侵入形成丛枝的细胞中表达,在未被菌丝侵染的细胞中检测不到GUS表达(图 5)。