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血淋巴是昆虫循环和免疫系统的重要组成。血淋巴的大量采集和冷冻保存是昆虫生理生化研究的常用方法,以解决某一虫态活动时间较短,而分析测试又需经常进行的矛盾。昆虫种类繁多。种类不同往往其血淋巴的功能也有所差异。在一些昆虫血淋巴内存在凝集素或包囊血细胞(或凝结血细胞),可引起血淋巴凝结[1-3]。血淋巴凝结是昆虫细胞免疫的组成部分,但此作用却妨碍了对血淋巴生理、生化特性及其他功能的研究。使用凝结抑制剂是解决该类问题的主要方法。目前,有关人类、兽类和鼠类抗凝血剂的研究报道较多,但针对昆虫血淋巴凝结抑制剂的研究少见报道[4-7]。向离体血淋巴中添加柠檬酸、柠檬酸钠、草酸钾或使用大量任氏液、PBS液对离体血淋巴进行稀释,在不同昆虫血淋巴中起到抗凝结作用[8-11]。采集桑天牛Apriona germari成虫血淋巴离体观察,发现血淋巴凝结而形成大的结块。因此,根据前人的研究资料[12],选取8种药剂进行了不同条件下桑天牛成虫血淋巴抗凝结试验,为桑天牛血淋巴生理生化功能的深入研究奠定基础。
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冷冻血淋巴溶解时按V(血淋巴):V[抑制剂(或蒸馏水)]:V(苯基硫脲)=1 : 1 : 1和1 : 2 : 2的用量加入抑制剂后,充分混匀,4 ℃冰箱中静置2 min和6 h后,分别观察,2次重复的综合结果记录于表 1~5中。在所试药剂中,10 g·kg-1
肉眼检查 显微镜镜检 凝结物 标准 颗粒状沉淀 标准 上清液 标准 血细胞 标准 颗粒状沉淀 标准 其他标准 无 - 无 - 清,透明 - 卵形、梭形、圆形细胞可见2种以上,数量多 - 无 - 无 - 管底及壁上附一圈胶状凝结物 + 极少量 + 较清透明 + 卵形、梭形、圆形细胞可见1种,数量多 + 极少量,极细小粒状,分散 + 细胞砕片,少量.未见块状凝结 + 胶状凝结成块 ++ 极少量 ++ 混浊 ++ 卵形、梭形、圆形细胞可见1种,数量少 ++ 大量,粒状,分散 ++ 少量,块状凝结,少量 ++ 凝结成块,黑化 +++ 大量 +++ 混浊黑化 +++ 无 +++ 大量,粒状,集中分布 +++ 块状凝结,大量 +++ Table 1. Hemolymph coagulation degree judgement standard
药剂 肉眼检查 镜检 凝结物 颗粒状沉淀 上清液 血细胞 颗粒状沉淀 其他 10g·kg-1柠檬酸钠 - + - + + + 10-1 mol·L-1塞孢霉素 + +++ + +++ ++ +++ 10-1mol·L-1硫酸新霉素 + +++ + +++ +++ +++ pH7.0柠檬酸-磷酸氢钠缓冲液 - +++ ++ +++ +++ ++ 10-1 mol·L-1秋水仙碱 - +++ + +++ +++ +++ 任氏液 - +++ + ++ +++ +++ 0.2mol·L-1,pH7.0磷酸缓冲液 - +++ + ++ +++ + 2g·kg-1草酸钾 - +++ ++ +++ +++ ++ 蒸馏水 ++ ++ ++ +++ +++ +++ 说明:表中的“-” “+” “++”“+++”所代表意义详见表 1。 Table 2. Inhibitory effect of clotting inhibitor to cold hemolymph treated 2 min[V(hemolymph): V(inhibitor): V(phenyl thiourea)=1:1:1 ]
药剂 肉眼检查 镜检 凝结物 颗粒状沉淀 上清液 血细胞 颗粒状沉淀 其他 10g·kg-1柠檬酸钠 + ++ + ++ + ++ 10-1 mol·L-1塞孢霉素 ++ +++ +++ +++ +++ +++ 10-1mol·L-1硫酸新霉素 ++ +++ ++ +++ +++ +++ pH7.0柠檬酸-磷酸氢钠缓冲液 ++ +++ ++ +++ +++ +++ 10-1 mol·L-1秋水仙碱 ++ +++ +++ +++ +++ +++ 任氏液 ++ +++ + +++ +++ +++ 0.2mol·L-1,pH7.0磷酸缓冲液 ++ +++ + +++ +++ +++ 2g·kg-1草酸钾 ++ +++ ++ +++ +++ +++ 蒸馏水 +++ +++ ++ +++ +++ +++ 说明:表中的“-” “+” “++”“+++”所代表意义详见表 1。 Table 3. Inhibitory effect of clotting inhibitor to cold hemolymph treated 6 h[V(hemolymph): V(inhibitor): V(phenyl thiourea)=1:1:1 ]
药剂 肉眼检查 镜检 凝结物 颗粒状沉淀 上清液 血细胞 颗粒状沉淀 其他 10g·kg-1柠檬酸钠 - + - + + + 10-1 mol·L-1塞孢霉素 + +++ + ++ +++ ++ 10-1mol·L-1硫酸新霉素 + +++ + ++ +++ ++ pH7.0柠檬酸-磷酸氢钠缓冲液 - +++ ++ +++ +++ ++ 10-1 mol·L-1秋水仙碱 - +++ + +++ +++ ++ 任氏液 - +++ + + +++ ++ 0.2mol·L-1,pH7.0磷酸缓冲液 - +++ ++ + +++ ++ 2g·kg-1草酸钾 - +++ ++ +++ +++ ++ 蒸馏水 ++ ++ ++ +++ +++ +++ 说明:表中的“-” “+” “++”“+++”所代表意义详见表 1。 Table 4. Inhibitory effect of clotting inhibitor to cold hemolymph treated 2 min[V(hemolymph): V(inhibitor): V(phenyl thiourea)=1:2:2 ]
药剂 肉眼检查 镜检 凝结物 颗粒状沉淀 上清液 血细胞 颗粒状沉淀 其他 10g·kg-1柠檬酸钠 + ++ - + + + 10-1 mol·L-1塞孢霉素 ++ +++ ++ ++ ++ +++ 10-1mol·L-1硫酸新霉素 ++ +++ ++ ++ ++ +++ pH7.0柠檬酸-磷酸氢钠缓冲液 - +++ + +++ ++ ++ 10-1 mol·L-1秋水仙碱 - +++ + +++ ++ ++ 任氏液 - +++ + + ++ ++ 0.2mol·L-1,pH7.0磷酸缓冲液 - +++ + + ++ ++ 2g·kg-1草酸钾 - +++ ++ +++ ++ +++ 蒸馏水 +++ ++ ++ +++ ++ +++ 说明:表中的“-” “+” “++”“+++”所代表意义详见表 1。 Table 5. Inhibitory effect of clotting inhibitor to cold hemolymph treated 6 h[V(hemolymph): V(inhibitor): V(phenyl thiourea)=1:2:2 ]
柠檬酸钠对冷藏血淋巴解冻时凝结抑制效果最好,在2种用量下均可使冷冻血淋巴完全解冻而不形成较大凝块,仅在其管底有极少量沉淀。镜检发现细胞碎片若干,有极少量颗粒状沉淀,是所试药剂中颗粒状沉淀最少的。在1 : 1 : 1的处理中,初查时发现有棱柱状晶体存在,6 h后再查时,有血凝块出现,而在1 : 2 : 2的处理中未见上述情况出现。这表明:按1 : 2 : 2的用量加入10 g·kg-1柠檬酸钠,可有效抑制冷藏血淋巴解冻时的凝结。
塞孢霉素、硫酸新霉素2种用量的处理中,均于管底和管壁形成附着性胶状凝结,其上部液体初查时较清,6 h后再查时,混浊,镜检除发现有大量颗粒状沉淀外,还有由血细胞组成的大型块状凝结物,与对照组凝结现象相似,表明这2种药剂对桑天牛成虫血淋巴凝结的抑制作用极小。
静置2 min后,柠檬酸-磷酸二氢钠溶液、草酸钾、秋水仙碱、任氏液、磷酸缓冲液等处理的血淋巴中,均未出现与对照相似的附着性胶状凝结,但均有沉淀出现。柠檬酸-磷酸二氢钠、草酸钾处理的血淋巴明显混浊,其他均较清。镜下观察,此2种药剂处理的血淋巴中均充满颗粒状沉淀,同时存在着数量不等的血细胞碎片及凝块。静置6 h后,上述5种药剂的1 : 1 : 1处理中,除磷酸缓冲液处理外,均出现血淋巴凝块。在柠檬酸-磷酸氢钠溶液、草酸钾的处理中还发现了结晶体,而1 : 2 : 2用量的处理中,均未见凝块出现。这些情况表明:此5种药剂均对桑天牛血淋巴有一定的抗凝作用,在1 : 2 : 2的用量下可有效抑制大凝块的形成。
在V(血淋巴):V(抑制剂):V(苯基硫脲)=1 : 2 : 2的试验中,柠檬酸钠(10 g·kg-1),任氏液、磷酸缓冲液、硫酸新霉素、塞孢霉素等的处理血淋巴中,均查到有完整的血细胞贴附于玻片上,有的呈卵圆形、有的呈梭形,而对照及其他处理中均未见。这说明用这几种药剂溶解血淋巴,其中有部分较稳定的血细胞可完整保存。
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选用8种抑制剂按V(血淋巴):V(抑制剂):V(苯基硫脲)=1 : 2 : 2的用量,处理新采的血淋巴,4 ℃分别静置2 min后和6 h后综合观察结果为(表 6和表 7):蒸馏水稀释的血淋巴,2 min后观察即出现大量沉淀、混浊;6 h后,沉淀更多,有凝块形成。所试抑制剂中2 min后观察:10 g·kg-1柠檬酸钠处理的血淋巴无沉淀产生,有大量卵圆形和不规则状的血细胞存在;任氏液、磷酸缓冲液处理的血淋巴液清澈均匀,有极少量沉淀,完整血细胞数量也较多,同时有由血细胞形成的凝结物,其血细胞形状清晰可辨。柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液处理的血淋巴,液体较清,有少量沉淀,发现少量完整血细胞和少量颗粒状沉淀;其余4种抑制剂处理的血淋巴均有大量沉淀产生,除塞孢霉素的血淋巴液较清外,其他均混浊;除草酸钾处理外,均有少数完整细胞存在,且这4种处理的血淋巴中均有大量颗粒状沉淀,有少量凝结物出现,或为颗粒组成的团块状,或为膜状凝结。因此,10 g·kg-1柠檬酸钠是8种抑制剂中凝结抑制效果最好的,6 h后的观察,更加说明了这一点:10 g·kg-1柠檬酸钠处理的血淋巴中仅出现极少量沉淀,可见大量卵圆形血细胞和少量细胞碎片;其他处理均有大量沉淀产生,镜检中可见大量凝结物形成。以上说明,10 g·kg-1柠檬酸钠按V(血淋巴):V(抑制剂):V(苯基硫脲)=1 : 2 : 2的用量处理桑天牛成虫新鲜血淋巴,可有效抑制血淋巴的凝结。
药剂 肉眼检查 镜检 凝结物 颗粒状沉淀 上清液 血细胞 颗粒状沉淀 其他 10g·kg-1柠檬酸钠 - - - + - - 10-1 mol·L-1塞孢霉素 - ++ + ++ ++ ++ 10-1mol·L-1硫酸新霉素 - ++ ++ ++ +++ ++ pH7.0柠檬酸-磷酸氢钠缓冲液 - ++ + ++ + ++ 10-1 mol·L-1秋水仙碱 - +++ ++ ++ ++ + 任氏液 - - - + - ++ 0.2mol·L-1,pH7.0磷酸缓冲液 - + - + - + 2g·kg-1草酸钾 - ++ ++ +++ +++ + 蒸馏水 + +++ ++ ++ +++ +++ 说明:表中的“-” “+” “++”“+++”所代表意义详见表 1。 Table 6. Inhibitory effect of clotting inhibitor to fresh hemolymph treated 2 min[V(hemolymph): V(inhibitor): V(phenyl thiourea)=1:2:2 ]
药剂 肉眼检查 镜检 凝结物 颗粒状沉淀 上清液 血细胞 颗粒状沉淀 其他 10g·kg-1柠檬酸钠 - + - + - + 10-1 mol·L-1塞孢霉素 - +++ ++ ++ +++ +++ 10-1mol·L-1硫酸新霉素 - +++ ++ ++ +++ +++ pH7.0柠檬酸-磷酸氢钠缓冲液 - +++ ++ +++ +++ +++ 10-1 mol·L-1秋水仙碱 - +++ ++ +++ +++ +++ 任氏液 - +++ + + +++ ++ 0.2mol·L-1,pH7.0磷酸缓冲液 + +++ + + +++ ++ 2g·kg-1草酸钾 - +++ ++ +++ +++ +++ 蒸馏水 ++ +++ ++ +++ +++ +++ 说明:表中的“-” “+” “++”“+++”所代表意义详见表 1。 Table 7. Inhibitory effect of clotting inhibitor to fresh hemolymph treated 6 h[V(hemolymph): V(inhibitor): V(phenyl thiourea)=1:2:2 ]