Protection enzymes and lipid peroxidation in Phyllostachys edulis seedlings with temperature and water stresses

试验材料为2014年10月份采于广西桂林的毛竹种子。

2014年12月22日将毛竹种子播种在上口直径为10.0 cm，下口直径7.0 cm，高8.0 cm的盆中，基质为m（泥炭）:m（蛭石）:m（珍珠岩）=1 : 1 : 1，pH 5.5~6.0，田间持水量为48.75%。播种6~8粒·盆^-1，15盆为1组，下面放置塑料托盘，防止水分流失，置于浙江农林大学智能实验楼的栽培室中进行培育，日温/夜温为（23±2）℃/（17±2）℃，湿度为45%~70%。播种2个月后追加3.0 g·L^-1的尿素。

培养至2015年10月26日，测得毛竹实生苗株高为25.0~30.0 cm，地径0.2 cm，6~8株·盆^-1。将毛竹实生苗移至三温区培养箱中培育，适应培养箱条件一定时间后，于2015年11月24日开始试验。

试验设2个温度梯度，分别为28 ℃（T₁），40 ℃（T₂）；设2个水分梯度，分别为75%田间持水量（W₁），35%田间持水量（W₂），采用称量法控制土壤水分。采用随机区组试验，共4个处理，分别记作T₁W₁（ck），T₁W₂，T₂W₁，T₂W₂，设重复3个·处理-1，竹苗4盆·重复^-1，共计48盆竹苗。培养箱设置：光照时间为9：00-21：00，适温（T₁）2组设置日温/夜温（28 ℃/22 ℃），高温（T₂）2组9：00-12：00逐渐升温至40 ℃，15：00-21：00逐渐降温至22 ℃，夜温22 ℃。试验处理开始后，每天早、晚观察竹苗生长情况并监测荧光值，于达到萎蔫状态时复水至75%田间持水量。

分别于处理开始后的第7天，及每个处理复水后0（取样后复水），1，3 d上午9：00采集各重复组叶片样品1.0 g。酶液提取方法：称取0.5 g剪碎的叶片样品（去叶脉）于预冷研钵，加入2 mL预冷的磷酸缓冲液（pH 7.8，0.05 mmol·L^-1），冰浴研磨成浆后倒入10 mL离心管，并用磷酸缓冲液冲洗研钵倒入离心管，使最终体积为8 mL，8 500 r·min^-1 4 ℃下离心20 min，取上清液，储藏于0~4 ℃冰箱备用。过氧化氢（H₂O₂）测定采用邹琦^[14]的方法；丙二醛（MDA）测定采用硫代巴比妥酸法^[14]；过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法^[15]；超氧化物岐化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（NBT）法^[14]；过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用紫外吸收法^[14]；抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定参照NAKANO等^[16]的方法。

采用Sigmaplot 12.5进行图形绘制，采用DPS对数据进行方差分析。

如图 1所示：毛竹叶片过氧化氢质量摩尔浓度在3种胁迫处理下均呈显著升高变化趋势，各处理的过氧化氢质量摩尔浓度由高到低依次为T₁W₂＞T₂W₂＞T₂W₁＞T₁W₁，以T₁W₂处理过氧化氢质量摩尔浓度最高，达到278.7 nmol·g^-1，是对照的173.2%，表明毛竹在水分亏缺情况下积累大量活性氧。

Figure 1.  Changes of H₂O₂ content of Phyllostachys edulis leaf under heat and drought stress

由图 2可知：相同的水分条件下，毛竹叶片MDA质量摩尔浓度在T₂处理时均大于T₁处理，且差异显著（P＜0.05），同样，在相同的温度处理下，干旱胁迫处理组的MDA质量摩尔浓度均大于适宜水分处理组，表现为W₂＞W₁。其中MDA质量摩尔浓度的最大值出现在高温+干旱复合胁迫，达68.1 nmol·g^-1，是对照的147.5%，表明高温+干旱复合胁迫下毛竹叶片细胞膜脂过氧化较严重。

Figure 2.  Changes of MDA content Ph.edulis leaf under heat and drought stress

从图 3A可知：在相同的水分条件下，高温胁迫使得SOD活性大幅升高，T₂W₁是T₁W₁的196.7%，T₂W₂是T₁W₂的151.2%，差异达到极显著水平（P＜0.01）；适温条件下，干旱处理的SOD活性较对照组高，表现为W₂＞W₁，高温条件下，W₁和W₂处理的SOD活性无显著差异，SOD活性的最大值出现在T₂W₁，为7 616.5 nkat·g^-1·min^-1。表明SOD是防御高温伤害主要的保护酶。由图 3B可知：在相同水分处理条件下，高温处理POD活性均显著高于适温，分别表现为T₂W₁＞T₁W₁，T₂W₂＞T₁W₂；T₁处理下，干旱胁迫使POD活性显著高于正常水分处理，同样，在T₂处理下，干旱处理的POD活性较正常水分处理的高，且差异显著，POD活性的最大值为T₂W₂处理，达8 273.3 nkat·g^-1·min^-1，分别是T₁W₁，T₁W₂，T₂W₁的150.1%，118.5%，144.9%，表明POD是毛竹适应干旱、高温+干旱复合胁迫的主要抗氧化酶。由图 3C可知：适宜水分（W₁）处理CAT活性，T₂显著高于T₁，且在T₂W₁处理CAT活性出现最大值，是对照的228.0%左右；而在W₂处理下，适温和高温处理的CAT活性没有显著差异。高温处理下，W₂显著小于W₁，这可能是因为毛竹叶片在高温干旱双重胁迫环境下机体受损。表明在一定的范围内，CAT活性受高温胁迫影响显著。从图 3D可以看出：W₁处理下，适温和高温处理的APX活性没有显著的差异，W₂处理下，高温处理APX活性极显著高于适温处理（P＜0.01），表现为T₂＞T₁；在相同的温度条件下，干旱处理（W₂）的APX活性较适宜水分处理组更高，表现为W₂＞W₁。各处理APX活性均大于对照组，以T₂W₂处理最大，达49.3 nkat·g^-1·min^-1，是对照组的261.8%。表明APX在干旱、高温+干旱胁迫下起到重要的防御作用。

Figure 3.  Changes of SOD, POD, CAT and APX activity of Phyllostachys edulis leaf under heat and drought stress

由图 4可以看出：在复水当天，2个处理下过氧化氢质量摩尔浓度均保持在相同水平，没有显著性差异，复水后T₁W₂处理下过氧化氢质量摩尔浓度后先上升后下降，且复水后第3天过氧化氢质量摩尔浓度显著低于复水前，而在T₂W₂处理下，过氧化氢质量摩尔浓度先下降后上升，且差异显著（P＜0.05）。如图 5所示：MDA质量摩尔浓度在复水当天处于较高的水平，复水后，在T₁W₂处理下表现出持续性下降趋势，且差异显著（P＜0.05），然而在T₂W₂处理下，MDA质量摩尔浓度呈现持续上升的趋势，且上升幅度较大，2个处理下的MDA质量摩尔浓度始终存在显著差异（P＜0.05），表明复水并没有使植物受到的胁迫损伤得到恢复。

Figure 4.  Effect of rewatering on H₂O₂ content of Phyllostachys edulis leaf

Figure 5.  Effect of rewatering on MDA content of Phyllostachys edulis leaf

如图 6A所示：在T₁W₂（干旱）处理下，毛竹叶片SOD活性在复水1 d后变化不明显，复水后第3天显著性上升（P＜0.05），T₂W₂处理SOD活性呈持续下降的趋势。由图 6B可知：复水后POD活性在T₁W₂处理下随复水时间的延长呈现先上升后下降的趋势，且差异显著（P＜0.05），而在T₂W₂处理下持续性下降，在复水后第3天下降至接近对照的水平。从图 6C可以看出：2种不同处理下毛竹叶片中CAT活性的变化趋势同POD相似，在T₁W₂表现出先上升后下降，在复水后1 d大幅上升到5 524.4 nkat·g^-1·min^-1，是复水当天的162.6%，随后缓慢下降，而T₂W₂处理下的CAT活性持续下降，在复水后第3天CAT活性仅1 131.9 nkat·g^-1·min^-1，可能是高温干旱叠加胁迫对植物体造成严重损伤而导致酶活性下降，且2个处理间的酶活性均有显著性差异（P＜0.05）。如图 6D所示：毛竹叶片APX活性在2个处理下均表现出先下降后上升的趋势，且差异显著（P＜0.05），T₂W₂处理下的毛竹叶片APX活性始终显著高于T₁W₂处理，在T₁W₂处理下复水后第3天APX活性回升至对照水平。

Figure 6.  Effect of rewatering on SOD, POD, CAT, APX activity of Phyllostachys edulis leaf

植物在正常的生长环境下，体内的自由基活性氧的产生和清除处于平衡的状态，不会对植物造成伤害，逆境胁迫下植物体内活性氧的产生和清除的平衡被打破，活性氧积累，植物自身的抗氧化防御系统启动以适应或抵抗逆境伤害^[18]，植物体内活性氧清除系统主要分为酶促和非酶促两类，酶促清除系统主要包括POD，CAT，SOD，APX等酶类^[19]。本研究结果表明：在高温干旱胁迫下，保护酶活性均表现出不同程度的升高，其中SOD，POD，CAT活性在3种胁迫处理下均有较为显著的上升趋势，APX活性在高温胁迫下没有显著变化，而在干旱胁迫和高温干旱复合胁迫处理有显著的上升。高温胁迫使SOD和CAT上升幅度最大，表明这两种酶对温度最敏感；干旱胁迫下POD上升的幅度最大，其次是CAT，表明POD对水分最敏感；POD和APX等2种酶活性在高温+干旱复合胁迫下上升幅度最大；其中SOD酶活性在3种胁迫下均有显著性升高（P＜0.05），它能将O^2-·歧化成过氧化氢（H₂O₂），随后POD，CAT，APX等抗氧化酶协调作用将过氧化氢（H₂O₂）分解成对细胞无毒害的水（H₂O），以达到清除活性氧物质、保护细胞免受氧化伤害的目的^[20]。这和前人对小麦Triticun aestivum^[21]，沙棘Hippophae rhamnoides等^[22]的研究结果相同。植物在受到胁迫时体内活性氧自由基积累并导致膜脂过氧化，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的主要产物，其积累可以检测细胞膜脂过氧化的程度。过氧化氢和MDA在高温胁迫下较干旱胁迫和高温干旱复合胁迫没有较大幅度的上升，表明SOD，CAT活性的大幅增长有效的将细胞积累的过氧化氢分解成无害的水和分子氧，使得细胞免受氧化伤害，这与谢亚军等^[23]对甘草Glycyrrhiza uralensis的研究结果相似。高温干旱复合胁迫处理下，毛竹叶片中过氧化氢质量摩尔浓度急速上升，引起细胞膜脂过氧化，MDA质量摩尔浓度急速升高，同时SOD，POD，APX酶活性也大幅度升高，这与吴永波等^[24]的研究结果相似。

植物在遭受干旱胁迫后复水处理可以检测植物自身是否有适应干旱胁迫的能力^[25]。周自云等^[26]的研究发现，在对酸枣Zizyphus jujuba var. spinosa进行多次干旱-复水实验后，酸枣具有了更强的适应干旱逆境的能力，植物经历适度干旱胁迫后复水，能够产生补偿或超补偿的正面效应^[27-28]。本研究发现：干旱处理（T₁W₂）复水后第3天，MDA和过氧化氢质量摩尔浓度基本接近对照水平，而过氧化氢质量摩尔浓度则在复水后第1天回升，诱导POD和CAT活性上升，同时，APX活性也先降后升，在复水后第3天达到对照水平，这与崔豫川等^[29]的研究结果相似。T₂W₂处理毛竹叶片保护酶活性在复水后整体上均处于持续性下降的趋势，其中POD和CAT的活性远低于对照及T₁W₂，同时，T₂W₂处理MDA质量摩尔浓度持续上升。

3种胁迫对毛竹实生苗叶片保护酶系统和膜脂过氧化程度的影响不同，CAT在高温胁迫处理起到主要作用，POD对干旱胁迫响应较为敏感，APX和POD是毛竹适应高温干旱复合胁迫的主要抗氧化酶，SOD在3种胁迫处理均起到重要作用，毛竹实生苗通过自身的抗氧化防御系统主动适应逆境胁迫以维持正常生理功能。干旱处理的毛竹在复水3 d后各项指标基本恢复至对照水平，表明毛竹实生苗具有一定的耐旱性，复合胁迫处理的毛竹叶片各指标在复水3 d后均未恢复，这可能是由于高温干旱复合胁迫对毛竹造成了不可逆的损伤，复水处理并未使胁迫得到解除。另外，植物遭受高温干旱胁迫时间的长短及复水时间的长短对植物的恢复情况可能会有不同的效果，需要再进一步研究复水时间与植物恢复情况之间的关系。