Bioinformatic analysis and differential expression of auxin response factor (ARF) gene in Phyllostachys edulis

毛竹开花实验地位于广西壮族自治区桂林市南岭山系的西南部。该毛竹林属于自然生长状态，基本无人为干扰。以毛竹的花器官为材料，进行解剖，分离出花芽、苞片、颖片、稃片、雄蕊、雌蕊和幼胚以及未开花的成熟叶片，建立8个样本进行转录组高通量测序。

从拟南芥基因组数据库（http://www.arabidopsis.org/）和水稻基因组数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.html）中分别检索拟南芥和水稻中ARF蛋白序列；毛竹ARF相关蛋白序列从毛竹基因组数据库（http://www.bamboogdb.org/index.jsp）中获得。毛竹PheARF家族蛋白的序列号，开放阅读框的长度、氨基酸数目、分子质量和等电点在表 1中提供。毛竹ARF分子量及等电点数据通过ExPASY（http://web.expasy.org/compute_pi/）获得。

用ClustalX 1.83（http://www.clustal.org/）^[15]软件对蛋白全长的多序列比对进行分析，进化树分析前去掉比对序列的差异和不明确序列。用no-rooted neighbor-joining方法通过MEGA 6.0（http://www.megasoftware.net/mega.html）^[16]构建系统进化树。

MEME version 4.11.2（http://meme-suite.org/）^[17]在线工具鉴定候选蛋白序列的保守区域，公式为any，maximum number of motifs = 20，minimum width≥ 6和maximum width ≤ 200。

将花芽、苞片、颖片、稃片、雄蕊、雌蕊和幼胚以及未开花的成熟叶片的FPKM值输入到Cluster 3.0，用Java TreeView生成热点图^[18]。

通过23个拟南芥和25个水稻ARF蛋白序列检索毛竹基因组数据库，共得到44个ARF蛋白（表 1）。从表 1可以看出，ARF家族的蛋白的等电点为5.22~9.23，蛋白序列的长度为192~1 257个氨基酸，分子量的大小为31.70 ~139.07 kD。

系统进化结果显示：44个基因之间相似性比较高（图 1）。将44个毛竹的ARF蛋白列同23个拟南芥和25个水稻的蛋白序列同时比对，发现可以将这3个物种的ARF分为三大类，分别为Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ。其中有13个基因分布在Ⅰ类，17个基因分布在Ⅱ类，还有14个基因属于Ⅲ类。大部分的PheARFs包含3个经典的结构域：DBD，结构域Ⅱ和AUX/IAA家族结构域。有11个与水稻的同源关系较近的基因对：osAR25/PheARF30（Ⅱ），OsARF16/PheARF40（Ⅱ），OsARF19/PheARF31（Ⅱ），OsARF15/PheARF37（Ⅲ），OsARF2/PheARF14（Ⅲ），OsARF14/PheARF39（Ⅲ），OsARF3/PheARF26（Ⅲ），OsARF13/PheARF38（Ⅲ），OsARF8/PheARF16（Ⅲ），OsARF10/PheARF10（Ⅲ）和OsARF18/PheARF18（Ⅲ）。这些基因大部分出现在Ⅱ类和Ⅲ类中，说明这2类的基因相对比较保守。

Figure 1.  Phylogenetic analyses of the ARF proteins in Phyllostachys edulis, Oryza sativa and Arabidopsis thaliana

为了进一步了解毛竹ARF保守区域的结构，通过MEME在线工具构建基序分析图，结果如图 2所示。毛竹ARF成员含有的基序结构不一，大概有20个不同的基序组成。其中每个基因都包含不同种类的基序，大部分的基序为4~17个。大部分的PheARF基因都包含Motif1~8，Motif10，Motif11，Motif14，Motif18和Motif20等，这些基序出现的次数较多，而Motif13，Motif16和Motif17等基序在这些基因中不常见。从进化角度来看，同源关系较近的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ类的基因在基序的长度和种类较为相似，比如Ⅰ类的PheARF4，PheARF9和PheARF32等，Ⅱ类的PheARF22，PheARF31和PheARF33等，Ⅲ类的PheARF17，PheARF18和PheARF37等。以上结果说明大部分的毛竹ARF家族基因是相当保守的。

Figure 2.  Distribution of conserved motifs in Phylloastachys edulis ARF proteins identified using MEME search tool

为了研究毛竹PheARF基因在花器官发育中的作用和调控机制，进一步分析PheARF基因在花芽、苞片、颖片、稃片、雌蕊、雄蕊、幼胚和未开花的叶中表达分析。结果表明：PheARF12，PheARF13，PheARF14，PheARF15，PheARF24，PheARF35，PheARF43，PheARF23和PheARF32在花芽中高量表达，说明这些ARF基因可能在开花初期起着重要的调控作用（图 3）。在雄蕊中，PheARF9，PheARF29，PheARF31，PheARF10，PheARF4，PheARF22，PheARF11，PheARF25，PheARF40，PheARF8，PheARF39，PheARF1，PheARF44，PheARF45，PheARF42和PheARF41高量表达，但是这些基因在幼胚中表达量极低。PheARF2，PheARF30，PheARF14，PheARF13，PheARF35，PheARF7，PheARF37和PheARF38在雌蕊中表达量较高，同时在幼胚中也高量表达，说明这些基因同时调控毛竹雌蕊形成和幼胚的发育。PheARF13，PheARF14和PheARF35同时在花芽、雌蕊和幼胚中高表达，这3个基因可能既调控开花又能控制花的发育。此外，PheARF5，PheARF18，PheARF27，PheARF10和PheARF4在颖片和稃片中都高量表达，可能调节稃片和颖片的发育。

Figure 3.  Expression analysis of PheARF genes among different flower organs of Phyllostachys edulis

生长素是植物器官发育和模式形态形成和发育非常重要的信号分子。生长素转导途径中最重要的2类家族分别为ARFs和Aux/IAAs^[19]。在发育过程中，ARFs能直接地调控下游靶基因的表达^{[6, 20]}，但大部分的ARF和Aux/IAA都是以家族的形式存在，所以它们在植物体内的调控机制是相当复杂的^[21-23]。ARFs基因也参与生殖过程^[24]。木瓜Carica papaya和番茄Solanum lycopersicum的ARFs基因家族的分析和鉴定揭示了该家族基因在花和果实的发育过程中具有调控作用^[25-26]。在本研究中，通过生物信息学工具，检索44个毛竹的ARF基因。在拟南芥和水稻中的ARF基因分别为23和25个。ARF基因家族在不同植物中成员数量不同，这可能与植物体内的基因组复制有关^[27]，而基因数量多少由该基因复制事件的频率决定。毛竹基因组为2 G左右^[28]，大于水稻和拟南芥的基因组。以上分析表明：毛竹ARF基因复制事件的频繁发生有可能导致毛竹ARF家族成员数量增多。通过系统进化分析，毛竹ARF家族基因大致分为3个亚组（图 1），亚组内的基因相似性比较高，但是亚组之间相似性不高，或许在基因功能上也有差异。毛竹与拟南芥和水稻的ARF家族的系统进化关系表明，毛竹与水稻之间有11对同源基因对，这些基因对都属于Ⅱ类和Ⅲ类，一方面说明毛竹的ARF家族与水稻有很高的同源性（图 1），另一方面说明毛竹ARF家族Ⅱ类和Ⅲ类的基因保守性很高。

研究人员对水稻和拟南芥的ARF基因进行了广泛地研究^[29-31]。ARF基因在花和种子发育中起着非常重要的作用，为研究毛竹的开花及种子发育提供了许多有用的信息。据报道，拟南芥的AtARF3和AtARF4参与花的发育，在花中高量表达^[32]。与AtARF3和AtARF4同源的毛竹PheARF14和PheARF37在幼胚和雌蕊中都高量表达，说明2个毛竹ARF基因可能与AtARF3和AtARF4基因功能相似，推测它们在毛竹花和种子发育过程中起着关键的作用。