Cutting propagation technology and rooting of Clematis finetiana

试验插条选自浙江农林大学铁线莲种质资源圃，选取母株长势旺盛，腋芽饱满，无病害的1年生枝条中上部作为插穗。剪取插条长为5~6 cm，含芽1对·插条^-1，保留1~2片叶子，上切口距芽1 cm，下切口距芽约4~5 cm。采集插条后浸泡在清水中，避免失水，随后根据试验要求进行扦插处理。

采用4因素3水平的L₉（3⁴）正交试验，研究植物生长调节物质种类和质量浓度、处理时间和扦插基质对山木通扦插生根的影响。通过多重比较分析，筛选出最适宜山木扦插生根的组合。具体因素和水平见表 1，插穗20个·处理^-1，重复3次。扦插试验于2015年5月22日在浙江农林大学温室内进行，白天25~29 ℃，晚间23~25 ℃，白天用75%遮阳网遮阳。扦插后每天早晚各喷水1次以保持基质和枝条湿润，喷水约10 min·次^-1，插穗生根后适当减少喷水次数和时间。

于2016年5月19日在浙江农林大学温室内进行扦插生根机制试验，设置对照与处理2组试验，插穗200个·组^-1，以清水作为对照。自扦插之日起隔10 d取样1次，共6次，取样部位为插穗基部2~3 cm茎段，同年7月8日结束取样。采样后用冰桶迅速带回实验室，清水冲洗并置于-79 ℃低温冰箱内保存备用。

剪取0.5~1.0 cm长茎段，用体积分数为70%的甲醛-乙醇-醋酸混合固定液（FAA）固定，常规石蜡切片法制片，番红-固绿对染，Axio lmager A2正置荧光显微镜观察拍照。

剪取插穗基部2~3 cm茎段0.2 g，3次重复。可溶性糖和淀粉的测定采用蒽酮比色法^[7]，可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝G-250染色法^[7]，过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法^[7]，多酚氧化酶（PPO）活性测定采用邻苯二酚比色法^[8]，吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性测定采用二氯酚比色法^[9]。

采用Microsoft Excel和SPSS 19.0统计软件进行数据分析，用Origin作图软件进行绘图。

山木通扦插各处理生根情况见表 2。从生根率来看，处理3、处理8与其他组处理差异极显著，处理3与处理8之间也存在极显著差异（P＜0.01），以处理8生根率效果最好；平均根长以处理1，处理2和处理3为最好，与其他处理差异极显著（P＜0.01），处理8次之；处理8平均根数与其他处理组差异极显著（P＜0.01），根数量最多，处理9次之。综合3项生根指标，处理8扦插生根效果最好，生根率达21.67%，平均根长为2.63 cm，平均生根数量达10条。方差分析（表 3）表明，不同植物生长调节物质种类、植物生长调节物质浓度、外源植物生长调节物质的处理时间及扦插基质对山木通扦插生根率具有极显著影响（P＜0.01）。

表 4多重比较分析表明：在不同质量浓度IBA与ABT处理生根率无显著差异，但与NAA+IBA形成极显著差异（P＜0.01），生根率仅为IBA处理的29.5%；植物生长调节物质质量浓度以100 mg·L^-1效果最好，与300，0 mg·L^-1形成极显著差异，生根率较后2种处理高4.82%~5.00%；插穗浸泡时间以2 h为宜，扦插基质以为河沙最佳，与其他2种基质形成极显著差异（P＜0.01），约为2种基质的2倍，说明山木通扦插以透水性好、质地疏松的基质为宜。因此，山木通最佳扦插生根方案为处理8，即扦插基质为河沙，100 mg·L^-1 IBA处理2 h，生根率可达21.67%。

山木通扦插生根过程中，处理8（100 mg·L^-1 IBA处理2 h，扦插基质为河沙）与对照插穗可溶性糖质量分数变化规律一致，均呈现“下降—上升—下降—上升”趋势，但处理8插穗变化幅度较对照组显著（图 1A）。处理8和对照前10 d可溶性糖质量分数缓慢下降，10~20 d显著下降并达到谷值，分别为33.48 mg·L^-1，59.90 mg·L^-1。10~20 d处于不定根诱导期，插穗内代谢旺盛，营养物质被大量消耗；对照组可溶性糖质量分数约为处理组的2倍，说明IBA处理能够促进插穗对可溶性糖的利用。20~30 d可溶性糖质量分数稍有回升，可能是由于可溶性糖的急剧降低，促使插穗内淀粉酶活性增强，淀粉加速水解，增加了可溶性质量分数；随着淀粉质量分数的持续降低，转化为可溶性糖的量减少，此时根系突破皮层进入伸长生长阶段需消耗大量养分，导致可溶性糖质量分数再次下降。40 d后插穗逐步具备产生营养物质的能力，可溶性糖质量分数又回升。

Figure 1.  Changes of physiological index during rooting cuttings of Clematis finetiana

图 1B显示，处理8与对照的淀粉质量分数持续下降，前期下降较快，后期缓慢，但处理8插穗内淀粉质量分数下降速度大于对照，说明IBA处理能够促进插穗淀粉降解。扦插前期，不定根发育和愈伤组织的形成需消耗大量的可溶性糖，淀粉下降速度快，随着淀粉的大量消耗，下降速度减缓。

处理8与对照可溶性蛋白质量分数呈现“下降—上升”的趋势（图 1C）。前30 d处理8可溶性蛋白质量分数低于对照组，40 d后，处理8高于对照，且对照降到谷值的时间较处理8晚10 d，处理8与对照达到谷值时的可溶性蛋白质量分数分别为12.33，15.00 mg·g^-1。综合山木通扦插生根外部形态观察可知，前30 d为插穗不定根诱导与表达期，同时伴随着愈伤组织的形成，需消耗大量的营养物质，可溶性蛋白质量分数大幅下降。不定根形成后，由于水分、营养的供应及光合作用的进行，可溶性蛋白质量分数逐渐上升，对照组可溶性蛋白质量分数的变化滞后于处理组，说明IBA处理促进了不定根的提前表达。

由图 1D可见：处理8与对照插穗POD活性均在扦插前期升高，处理8在20 d达到峰值，对照在30 d达到峰值，之后开始下降。扦插前期，POD活性高有助于消除植物体内多余的氧化氢及酚类物质，降低IAA质量浓度，利于根源基的诱导。随着根系伸出和愈伤的形成，POD活性显著下降，IAA质量浓度升高，有利于根系突破皮层。与对照相比，处理8插穗POD活性达到峰值时间早于对照，且活性高于对照，说明IBA处理提高了POD的活性，对生根有一定的促进作用。

在扦插生根过程中，处理8与对照IAAO酶活性呈先上升后下降的趋势，处理8到达峰值时间较对照组早10 d，且峰值较对照高说明处理组生根较对照早（图 1E）。在不定根表达期，插穗IAAO活性虽有下降，但下降幅度较小，仍维持在较高水平，这可能是抑制山木通插穗生根的原因之一。生长期IAAO活性降低幅度大，此时根系已突破皮层，利于根系的发育与生长。

由图 1F可见：山木通扦插生根过程中，PPO活性与POD和IAAO活性的变化规律基本相同，处理8与对照的PPO活性变化均呈现“上升—下降”的趋势，在不定根形成期达到峰值。处理8插穗PPO活性在20 d达到峰值，对照在30 d达到峰值，且处理8活性高于对照，说明外源植物生长调节物质处理提高了PPO的活性，对插穗生根起到促进作用。在愈伤组织与根源基形成时期，PPO活性升高，有利于催化酚类物质与IAA结合，形成“IAA-酚酸复合物”，促进不定根的发生。20 d后根系伸出体外，PPO活性下降，IAA质量浓度升高，有助于根系伸长生长。

扦插后20 d，处理组大多数插穗基部切口处凸起，少数皮部出现白色小凸起；扦插后30 d，处理组多数插穗已生根，约3~5条，均着生在插穗基部2~3 cm处（图 2A），对照组生根数量较少，且根系较短（图 2B）。插穗的大量生根期，即生根表达期，伴随着愈伤组织的大量形成（图 2C，2D），且形成愈伤组织的插穗未有根系长出。与对照生根插穗相比，处理8插穗根系数量多，根系长，生根质量明显优于对照（图 2E，2F）。50 d时处理组插穗已有叶片长出（图 2G）。

Figure 2.  Morphological observation of C. finetiana's rooting process

扦插后20 d对插穗基部膨大处横切面进行观察，发现膨大的插穗基部有根源基细胞的出现（图 3A），根源基细胞较其他细胞染色较深。随着根源基细胞的不断发育分裂，将周围细胞挤向外端（图 3B），并进行伸长生长，迫使插条皮部开裂，不定根伸出体外（图 3C，3D）。扦插后30 d，对愈伤组织进行横切面观察，发现山木通插穗虽能形成愈伤组织（图 3E），但在愈伤组织中未发现根原始体。

Figure 3.  Anatomical features of Clematis finetiana rooting process

本研究结果表明：外源植物生长调节物质及其质量浓度、处理时间、扦插基质等4个因素对山木通扦插生根率的影响达到极显著差异（P＜0.01），100 mg·L^-1 IBA浸泡2 h后扦插于河沙中为山木通扦插生根的最佳处理组合，生根效果最好，生根率可达22.67%。外源植物生长调节物质以IBA生根质量最好，ABT次之，NAA+IBA最差。这可能是由于IBA被植物吸收后不易转移，存留在插穗基部促进生根。植物生长调节物质质量浓度和插穗浸泡时间对生根的影响是相互的，当质量浓度大于100 mg·L^-1时，山木通的生根质量随质量浓度的增加而降低，当质量浓度低于100 mg·L^-1时，其生根品质随质量浓度的升高而增加；处理时间长于2 h时，高质量浓度植物生长调节物质抑制生长，山木通生根质量下降，短于2 h时，低质量浓度植物生长调节物质浸泡不充分，生根质量欠佳。基质在扦插过程中除对植物起到支持和固定作用外，还为植物提高一个稳定的生根环境^[10]。本研究中，河沙进行山木通扦插生根质量最佳，河沙+泥炭+蛭石次之，泥炭+珍珠岩生根质量最差，这可能与基质的通气性、透水性有关。目前，对铁线莲属植物扦插繁殖技术也有一定的研究，如对粗齿铁线莲Clematis grandi-dentata扦插研究表明：400 mg·L^-1NAA处理插穗10 min，生根效果最佳^[11]；6-BA较NAA能更好地促进圆锥铁线莲Clematis terniflora生根，以50 mg·L^-1 6-BA效果最好^[12]。本试验植物生长调节物质种类与质量浓度仅有3个水平，对不同植物生长调节物质下更多质量浓度对山木通扦插生根质量的影响还有待进一步研究。

营养物质是插穗生根的必要条件之一，也是插穗维持机体平衡的重要能源，早有研究发现母株的营养水平对插穗生根及产生新梢具有显著影响。本试验研究表明：山木通插穗可溶性糖质量分数虽有波动，但整体变化趋势与可溶性蛋白质量分数一致，均在生根诱导和形成期下降明显，消耗的糖类和蛋白质一方面用于维持插穗的生活力和物质转化的能量，一方面用于根源基的发生。不定根形成后插穗吸收营养物质的能力增强，伴随着新叶的长出，插穗自身能够合成营养物质，糖和蛋白质质量分数回升。此结论与梁文斌等^[13]对短梗大参Macropanax rosthornii生根理化性质分析的结果一致。插穗中淀粉质量分数则呈持续下降趋势，淀粉只有水解为糖类才能被植物体吸收，是插穗内可溶性糖的补充来源。经100 mg·L^-1IBA处理的山木通插穗可溶性糖、淀粉及可溶性蛋白质量分数变化幅度均较对照组大，说明IBA处理有利于插穗中可溶性糖和蛋白质质量分数的积累，提高营养物质利用率，对山木通扦插生根有一定的促进作用，这与柚木Tectona grandis嫩枝扦插研究中IBA处理插穗的可溶性糖质量分数显著增加^[14]相符合。另外，本研究中发现山木通扦插生根过程中伴随愈伤组织的形成，且形成愈伤组织的插穗未有根系长出，同时皮部生根也会受到影响，这可能是因为愈伤组织形成与不定根发生之间存在竞争关系，养分的供应难以支撑两者的同时发生，因此，形成愈伤的插穗皮部生根不会发生或很少发生，进而导致山木通插穗生根率低。且有研究表明，插穗愈伤组织的形成及发育对不定根的产生有抑制作用。

POD，PPO和IAAO酶通过调节插穗体内生长素IAA的含量参与山木通扦插生根过程，但作用机制各不相同，三者通过相互作用影响插穗生根。POD作用的某些产物可能是不定根发生所必须的辅助因子，促进不定根的形成^[15]。在山木通扦插生根过程中，POD活性在不定根诱导期上升，生根期逐渐下降，这是因为高活性的POD氧化较多的内源IAA，利于根源基的诱导，低活性的POD减少IAA的分解，促进不定根的形成。这与宋丽红等^[15]的研究结论相一致。PPO能够催化酚类物质和IAA形成“酚酸复合物”，同时增强插穗呼吸作用，使插穗生理状态活跃，促进不定根的发生^[16]。在本研究中，PPO在生根诱导期活性升高，大量生根期即生根表达期达到峰值，与前人的研究结论一致^[17]。生根后期活性下降，IAA质量浓度增加，利于根系的伸长生长。IBA处理使插穗中PPO活性较对照组高，生根效果也较对照组好，这一结果与刘玉民等^[18]对马尾松Pinus massoniana扦插所得的结论基本一致。离体生根过程中，高活性的IAAO使内源IAA水平降低是生根诱导期的特点之一，质量浓度低的IAA利于不定根的诱导，IAAO活性升高，高质量浓度的IAA利于根系的萌发与生长，IAAO活性下降。这与本研究中不定根诱导期和表达期插穗表现出高的IAAO活性，不定根生长期插穗IAAO活性下降的结论基本一致。另外，本研究发现山木通插穗内IAAO活性变化不显著，与其他生根率较高的插穗相比^[19-20]，山木通插穗内IAAO在不定根诱导期上升幅度较小，酶活状态不活跃可能是导致山木通插穗生根率低的另一原因。由于实验本身的局限性，山木通插穗生根特性与酶活性变化的关系还有待进一步研究。