Adventitious root formation with IBA and endogenous hormones dynamics in walnut soft-cuttings

供试材料为经复幼处理的核桃品种‘中宁盛’半木质化嫩枝插穗，要求长势一致、无病虫害。

参考宋晓波^[8]方法，试验组用5.0 g·L^-1的IBA溶液速蘸插穗基部10 s，对照组以清水速蘸，扦插枝条50根·处理^-1，并重复3次。扦插基质以V（黄土）:V（牛粪）:V（河沙）＝1:1:1配置混合，扦插前5 d装入营养钵，并用质量浓度为0.5%的高锰酸钾喷淋消毒后备用。插穗制备好后放置数分钟待基部表面溶液挥发后，竖直插于营养钵中，深度5 cm。扦插后浇水，并隔7 d喷洒质量浓度为1.0 g·L^-1的高锰酸钾溶液消毒。保持扦插环境温度为18~35 ℃，相对湿度70%以上。

扦插前0 d和扦插后1，3，5，7，9 d随机采集插穗，3条·处理^-1，重复3次，共取样6次。迅速用蒸馏水将插穗基部冲洗干净并用滤纸擦干，迅速截取穗条基部底端茎段约1 cm，用锡纸包裹放入液氮冷冻保存。样品转移至实验室后，加入液氮快速研磨并冷冻干燥，-80 ℃下保存备用。

扦插后，1次·d^-1观察插穗形态变化，拍照，记录生根进程。扦插至20 d时，检测插穗的生根数量和生根情况，统计生根率。

扦插后每隔1 d取样，重复3次，共取样8次。截取插穗基部1 cm长的茎段用甲醛-醋酸-乙醇固定液（FAA）固定，参照叶宝兴等^[9]的方法并作改动，制作石蜡切片。番红固绿染色，加拿大树胶封片，OLYMPUS光学显微镜观察并拍照。

采用高效液相色谱-四级杆离子阱串联质谱仪（HPLC-MS/MS Q-TRAP）测定。内源激素提取参照贾鹏禹等^[10]方法略作改动，称取冻干粉0.1 g·样本^-1，萃取获得上清液用于激素质量分数（鲜质量）测定。数据用Analyst 1.5数据处理软件（美国Applied Biosystem公司）处理与分析。

应用Excel 2007软件进行数据整理和绘图，使用SPSS 18.0软件进行t检验分析。激素检测值以取平均值±标准差表示。

扦插20 d后，测量核桃复幼插穗生根情况。由表 1可知：试验组生根率高达98.1%，对照完全没有生根，且大部分死亡。说明有无IBA处理，切口愈伤率、植株死亡率和插穗的生根率差异显著。

扦插后3 d，插穗基部部分表皮褐化（图 1A）；扦插后5 d，试验组部分插穗基部膨大，个别皮孔有外凸甚至开裂迹象（图 1B）；扦插后7 d至9 d，试验组插穗基部膨大，切口附近沿茎开裂，开口处有白色絮状组织，不定根开始发生（图 1C）；扦插至15 d时，不定根突破表皮，开始伸长生长（图 1D）。对照组插穗扦插至15 d时，插穗基部表皮褐化，未生根。

Figure 1.  Morphological changes of the soft-wood cuttings base during walnut rooting

相比于对照，经IBA诱导的嫩枝插穗基部组织结构变化明显。图 2为试验组插穗基部横切片，可以发现扦插后3 d，插穗基部形成层开始迅速分裂，并明显增厚（图 2A）；扦插后5 d，部分增厚的形成层细胞进一步发育，在韧皮部形成团状的分生组织（图 2B）；扦插至7 d时，根原基分生组织进一步分裂分化成初始根原基细胞（图 2C），扦插至9 d时，初始根原基细胞在韧皮部发育为圆顶状的根原基（图 2D）；至扦插15 d时，不定根形成并突破表皮（图 2E）。

Figure 2.  Anatomical structure changes of the soft-wood cuttings base during walnut rooting

嫩枝扦插后插穗中IAA质量分数迅速上升。由图 3A可知：对照组在1 d时，IAA质量分数达到峰值，为857.0 ng·g^-1，此后下降。试验组IAA质量分数在扦插5 d时升到峰值，为1 395.0 ng·g^-1；此时，插穗基部增粗，出现开裂，说明诱导不定根原基生成。

Figure 3.  Dynamic changes of endogenous hormonesin the rooting process of walnut soft-wood cuttings

嫩枝扦插后插穗中ABA质量分数变化如图 3B所示。扦插后插穗的内源ABA质量分数迅速下降，但对照组在3 d时开始回升，并在之后一直保持上升趋势；试验组则持续下降，至5 d时达到最低之后迅速上升，并在7 d时达到峰值56.6 ng·g^-1，至9 d后逐渐下降。

扦插后7 d插穗的内源GA₃质量分数变化趋势大体呈“升高—降低”趋势（图 3C），并在5 d时达到峰值，试验组最高为17.1 ng·g^-1，对照组最高为11.1 ng·g^-1。不同的是试验组在7 d后GA₃质量分数再次上升，而对照则持续下降。

ZT质量分数的变化图 3D所示。扦插后3 d，试验组和对照组内源ZT质量分数变化不明显；3 d后试验组ZT质量分数开始上升，9 d时达到298.5 ng·g^-1，而对照组一直无明显变化，只在7 d后略微升高，9 d时仅达到30.9 ng·g^-1。

由图 4A可知：试验组w_IAA/w_ABA比值在扦插后升高，至5 d时达129.1，之后急剧下降，但7 d后又缓慢上升；对照组w_IAA/w_ABA比值在扦插后1 d时达到最高值为43.5，而后持续下降。

Figure 4.  Change of the endogenous hormone ratio during rooting process of walnut soft-wood cuttings

由图 4B可知：试验组w_IAA/w_GA3比值呈现“M”型变化趋势，并在3 d时达第1个峰值为103.9，7 d达第2个峰值为108.5。与试验组相比，对照组w_IAA/w_GA3比值在扦插后1 d时达到最高值为119.7，此后迅速下降，至3 d时后下降速度放缓。

从图 4C可以看出：试验组w_IAA/w_ZT呈现先升高后降低变化趋势，扦插后3 d时w_IAA/w_ZT达峰值为60.1，之后至9 d时持续下降。对照组w_IAA/w_ZT比值也呈现同样的变化趋势，不同之处在扦插后1 d时即达到峰值42.4，后转为下降。

外源生长素的诱导可以调节内源激素的水平，间接影响不定根的形成及根系的形成和发育^[11-12]；而内源激素水平的高低则直接与插穗生根能力密切相关^[13]，同时多激素的相互作用也是调控生根的关键^[14]。核桃是难生根树种，早先研究表明：核桃成龄嫩枝扦插几乎不能生根^[7-8]。本研究以经过复幼处理的嫩枝为试材，用外源IBA诱导其生根，发现不定根发生率达到98.1%，而对照生根率为0，表明外源生长素的诱导对核桃嫩枝发根至关重要。

大量试验表明：生长素是促进不定根发生的主要因素^[15-17]，生长素峰值的出现往往会诱导根原基的发生^[16]。本研究结果发现：外源IBA诱导下的插穗在扦插5 d后IAA鲜质量分数出现高峰（图 3A），结合显微观察发现5 d时根分生组织发生（图 2B），7 d时初始根原基细胞团形成（图 2C），9 d时不定根原基产生（图 2D），说明施加外源生长素明显提高了内源IAA的水平，从而促进了不定根原基细胞的形成。

脱落酸通常被认为是不定根发生的抑制剂^[18]，其调控不定根的发生是通过与IAA的平衡共同起作用，较高的w_IAA/w_ABA能促进不定根的形成^[19]。本研究发现无论试验组对照组，受切伤和水分胁迫所致，扦插初期插穗ABA水平较高，扦插后迅速下降，根原基产生后又有所升高；w_IAA/w_ABA峰值出现在根原基发生阶段，说明相对较低水平的脱落酸可以促进不定根的形成。

有研究认为：较高水平内源赤霉素对不定根发生有抑制作用^[20]，赤霉素高表达后可通过影响生长素的运输而抑制不定根发生^[21]。本研究发现：IBA诱导后的插穗自扦插伊始至根原基产生，期间GA₃与IAA呈协同上升的趋势，第3天时达到第1个峰值，此时形成层开始增厚（图 2A），第7天达第2峰值，此时根原基初始细胞开始生长（图 2C）；同时发现两者的比值在不定根发生阶段始终高于对照组（图 3C，图 4D）；由此认为核桃复幼插穗中相对较高水平的w_IAA/w_GA3，可能在不定根形成前期有利于形成层增厚和脱分化，而在后期对不定根原基的细胞生长有促进作用。

关于ZT等细胞分裂素对植物不定根形成的影响，有研究认为其主要作用是抑制根原基的分化和形成，同时促进不定根的发育^[22]。细胞分裂素的作用主要是调控生长素的变化；较高水平的细胞分裂素能抑制生长素极性运输载体PIN1的表达^[23]。因此认为当ZT水平较高时，w_IAA/w_ZT比值上升促进不定根原基的发生。本研究发现：经IBA诱导的插穗在扦插前期ZT质量分数相对较低，根原基开始产生后则迅速上升，与对照组差异显著；w_IAA/w_ZT比值前高后低，至第3天达到高峰，此时正是形成层分裂增厚时期。该结果表明：核桃复幼插穗中ZT质量分数较低，外源生长素的诱导可能对ZT的影响不明显，高比值的w_IAA/w_ZT与形成层分裂有关；而根原基发生后ZT明显增加，此时w_IAA/w_ZT降低，说明比值下降对根的分化和发育起着促进作用。

综上所述，施加外源吲哚丁酸可以诱导核桃复幼嫩枝不定根的发生，同时改变了内源激素的含量。然而，关于外源生长素改变内源激素含量及内源激素对生根的作用机制，还有待进一步的探索和研究。