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光照是影响植物生长发育的重要环境因素之一，不仅提供了植物生长和生理活动所需要的能量，还作为一种信号调控植物的生长发育和形态建成[1]。因此，光是植物为了生长发育需要竞争的重要资源，特别是在生长密集的植物群落中。阳光中的红光(red light，R)和蓝光(blue light，B)被位于上层的叶片吸收用于光合作用，大部分的远红光(far red light，FR)被上层植物组织反射和传递给下层植被，导致红光与远红光比例(R/FR)下降、光合有效辐射(photosynthetically active radiation, PAR)减少。研究表明：下层植被感知到的R/FR可从全光照下的1.20降至0.05~0.70[2]。如拟南芥Arabidopsis thaliana单片叶遮盖可以将PAR从1 500 mmol·m−2·s−1减少到120 mmol·m−2·s−1，R/FR从1.20减少到0.20，且增加一片叶遮盖后PAR下降至40 mmol·m−2·s−1，R/FR下降至0.1[3]。
不同植物对光照的敏感程度不同。阳生植物在高光强条件下生长状况良好，但在遮阴或者弱光条件下生长不良，例如向日葵Helianthus annuus和月季Rosa chinensis等；而阴生植物则在长期遮阴条件下可以正常完成生活史，如三七Panax notoginseng和南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei[4−5]。在遮阴条件下，阳生植物感知遮阴信号时会产生一系列避荫反应(shade avoidance response, SAR)以躲避低光，而阴生植物则通过产生一系列耐荫反应使植物获取更多光照来维系植株正常发育。前人对于阳生植物避荫反应的研究甚广，包括从下胚轴伸长、分枝减少[6]、比叶面积(specific leaf area，SLA)[7]增大和叶绿素a/b下降[8]等生理形态变化的研究，到生长素、赤霉素和油菜素甾醇与光信号通路互作共同调节植株避荫反应的分子机制，而对阴生植物耐荫机制的研究却十分匮乏，仅能借鉴个别阳生植物耐荫反应的研究。
本研究综述了荫蔽环境中阳生植物和阴生植物的生理形态、避荫反应和耐荫反应机制的研究进展，旨在为弱光环境下植物光响应机制尤其是阴生植物耐荫机制的研究提供参考依据，同时为提高植物光合效率，培育高产作物新品种，以及森林生态系统中林分调整、林下经济空间多层结构的搭建开辟有效路径。
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植物可以通过感知光合有效辐射及光质的改变相应地调整其生长和发育策略，而阳生植物和阴生植物在遮阴条件下采取的策略大有不同。
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在林冠层，许多阳生植物的光受体在感知到光强变化，主要是R/FR的降低，会出现一系列的避荫反应综合症，包括下胚轴和叶柄伸长、分枝减少和叶片偏下性，严重时还会导致分枝减少和叶面积增加，开花、结实提早[6, 9−10]。植物通过伸长下胚轴、叶柄或茎的长度来增加植物的高度[11]，使照射到叶片的R/FR接近正常，以便获得更多可用的光照。研究表明：油菜Brassica napus和拟南芥在遮阴下会促进特定脂质的生物合成来增强下胚轴的伸长[12]，同时拟南芥莲座叶叶柄也会伸长[13]；由于附近植株的遮挡，光照强度较小，重要粮食作物大豆Glycine max在密植时产生了茎秆伸长等避荫反应特征，导致大豆倒伏，减产22%[14]。由于光合作用环境因素和光合作用产物积累的有限性，植物通过减少分枝来抵御弱光条件。拟南芥在低R/FR 时，constans-like 7 (COL7)抑制其分枝形成[15]。同时由于光照弱，叶片能获得的光照较少，植物通过增加比叶面积以提高获得光源的能力[7]。十字花科Brassicaceae 植物白芥Sinapis alba遮阴叶片比未遮阴叶片表现出较少的干物质和结构性碳水化合物的积累，比叶面积相对增加[16]。此外，由于林冠层下的红光和蓝光均减少，故吸收红光和蓝紫光的叶绿素a和叶绿素b质量分数显著增加，但叶绿素a/b有所下降[13]。
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生长在林下的阴生植物发展出耐荫表型，以应对有限的光环境。关于阴生植物如何适应有限的光照，目前有碳增益、表型可塑性和胁迫耐受性3种假说[17]。
碳增益假说指出：植物能够提高光能利用效率的一切性状特征都可以增加碳的获得，减少呼吸成本，进而增强植物的耐荫性，阴生植物小到植物组织大到整株植物的范围内都有一些特征能促进碳的获得[18]。在叶片层次上，阴生植物通常具有更大的比叶面积以及更长的寿命。在光照强度低的情况下，阴生植物叶片利用较少的光能进行光合作用生成碳水化合物，具有较高的固定碳水化合物的能力。伴随着叶绿素b质量分数的升高，叶绿素a/b降低，以及光化学反应中心Ⅱ和Ⅰ的比例增加，阴生植物可将更多的光能转化为化学能，将碳水化合物存储在植株中[19]。光系统Ⅰ(PS Ⅰ)向光系统Ⅱ(PS Ⅱ)的转变是植物在较低的光照强度下最大限度地提高获取光能的一种方法[20]。研究发现：阴生植物华北蹄盖蕨Athyrium pachyphlebium和金线兰Anoectochilus roxburghii在降低光照时，PS Ⅱ反应中心的非光化学淬灭系数(non-photochemical quenching, NPQ)降低，PS Ⅰ和PS Ⅱ反应中心的光合电子传递速率以及PS Ⅱ反应中心的光化学淬灭系数变高，PS Ⅱ和PS Ⅰ比例增加，光能更高效地转化为化学能[19, 21]。同样，五加科Araliaceae阴生植物也进化出了适应度表型(PS Ⅱ的最大量子产量、低光饱和点和暗呼吸速率)来增加碳的获得，从而应对遮阴生境中的低光照环境[18]。
表型可塑性假说认为：阴生植物在不同光照条件下表现出较低程度的生理和形态可塑性。对木本耐荫物种的70多个性状进行Meta分析表明：木本耐荫植物相比阳生植物在大多数分析性状(如光合能力和生长指标)中具有低水平的可塑性[22]。因此，在遮阴环境下，阳生植物倾向于分配更多的资源来提高表型可塑性，产生避荫反应[18]，而阴生植物并不会最大程度地生长，而是将更多的光合产物分配给植物的种子、叶、茎以及根等部位(图1)，以便于植物在光照强度接近或低于整株植物光补偿点时维持正常生长状态[23−24]。
图 1 阴生植物适应弱光环境的3个假说
Figure 1. Three hypotheses of sciophytes adapt to low-light environments
阴生植物在阴暗、温暖、潮湿的环境中生长，感染真菌病害概率大大增加。胁迫耐受性假说提出：对于阴生植物，最关键是要提高对生物和非生物胁迫的抵抗能力，而不是投入大量能量来促进植物的生长和发育[25]。代谢物作为植物与环境的适应产物，不仅是用于治疗病害的功效成分，还在植物体内参与信号传导、适应调节和机体防御等生物过程[26]。有研究表明：在遮阴环境下，植物的耐荫性及抵抗病原体和疾病的能力呈正相关[25]，这与阴生植物在遮阴环境下防御化合物的高效积累有关。五加科人参属Panax三七和人参Panax ginseng是典型的阴生植物。目前已发现20多种影响五加科植物生长的叶面和根部病害[27]，极大地威胁着三七和人参的质量和产量。在遭受病原体侵袭时，三七β-葡萄糖苷酶通过水解原人参二醇型人参皂苷，产生一系列具有更广谱、更强效抗真菌活性的稀有人参皂苷，确保三七在阴暗、温暖、潮湿环境中的生长发育(图1)。这在人参中也得到了证实[27]。
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植物激素是一种植物自身代谢产生的物质，直接调控植物生长及发育[28]。阳生植物避荫反应相关的生理反应由光信号通路与许多植物激素相互作用来调节，其中主要包括生长素(Auxin)、赤霉素(GA)和油菜素内酯(BR)(图2)。
图 2 阳生植物避荫反应分子机制
Figure 2. The molecular mechanism of SAR in heliophytes
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生长素对植物避荫反应中细胞伸长起主要调节作用。在幼苗中，它主要在子叶中产生，并输送到下胚轴和根中[29]。吲哚-3-乙酸(IAA)是主要的生长素，主要通过TAA1-YUC途径从色氨酸合成。色氨酸氨基转移酶(TAA1)将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸(IPA)，黄素单加氧酶(YUC)负责在限速步骤中将吲哚-3-丙酮酸转化为游离吲哚-3-乙酸[30]。遮阴条件下，低R/FR增强了生长素的响应能力，诱导生长素的生物合成[31]。在这个过程中，光敏色素互作因子(phytochrome interacting factor，PIF)发挥着关键作用。在遮阴环境下，盐过度敏感2 (salt overly sensitive2，SOS2)蛋白激酶能稳定PIF4和PIF5蛋白，而PIF7发生去磷酸化。它们共同作用，在生物合成、物质运输和信号传递过程中上调生长素活性。PIF4/5/7直接参与调控遮阴下黄素单加氧酶的表达。遮阴下PIF7去磷酸化导致黄素单加氧酶表达，使吲哚-3-乙酸增加(图2)，随后通过生长素相关蛋白PIN3/4/7输送到下胚轴，促进植株伸长，发生避荫反应[32]。在正常光照条件下，光活化状态的phyB和CRY1能够与AUX/IAA蛋白相互作用，并抑制AUX/IAAs与生长素受体TIR1的结合，从而阻断生长素通路信号的传递[33]。
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赤霉素是另一种促进避荫反应中茎和叶柄伸长的植物激素。Skp-cullin-F-box (SCF)E3泛素连接酶复合物由SLY1及SNE的F-box亚基组成，并与DELLA蛋白相互作用，以促进其泛素化和降解，并介导GA反应[34−35]。在遮阴条件下，蓝光减少，隐花色素CRY1处于非活跃状态，无法与GA通路中的赤霉素受体(GID1)或DELLA蛋白相互作用，赤霉素触发赤霉素受体与DELLA蛋白的相互作用。之后，SCFSLY1与DELLA蛋白结合，导致DELLA蛋白泛素化并降解[36]，进一步将PIF从DELLA蛋白的抑制中释放出来(图2) ，并与避荫反应相关基因的启动子结合，促进植株伸长[36]。在大豆耐密植品种培育研究中，正常光照条件下，蓝光激活的CRY1增加了bZIP转录因子STF的积累，STF直接上调赤霉素氧化酶GmGA2oxs的转录活性，以降低赤霉素水平。遮阴下，蓝光减少抑制CRY1活性，造成STF蛋白丰度降低，GmGA2oxs的转录水平下降，赤霉素水平升高，促进下胚轴伸长[37]。Constitutive photomorphogenic 1 (COP1)是光形态建成的关键负调节因子，遮阴下R/FR降低，phyB失活促使DELLA降解，释放PIF。同时，COP1阻碍光信号通路上的bZIP转录因子家族的elongated hypocotyl 5(HY5)对避荫反应的抑制作用，促进下胚轴的伸长[38] (图2)。
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油菜素内酯在避荫反应中也发挥了重要作用。油菜素内酯信号通路激活后促进了油菜素内酯信号转录因子(BZR1)的去磷酸化，然后进入细胞核并促进油菜素内酯合成抑制剂(BRZ)下游基因的表达[39]。研究表明：BES1/BZR1通过直接和PIF4相互作用对下游目标基因起到调节作用(图2) ，促进植物下胚轴伸长，产生避荫反应[40]。此外，COP1也参与了油菜素内酯介导的避荫反应，比如COP1能在黑暗中稳定PIF1、PIF3、PIF4和PIF5 [41−42]，COP1/SPA复合物能够抑制糖原合成酶激酶(BIN2)引发的PIF3磷酸化，从而与PIF3相结合并稳定PIF3[43]，增强植物的避荫反应(图2)。
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避荫反应的发生常常是几种激素和光信号通路共同作用的结果。油菜素内酯信号调控因子BZR1与生长素响应因子6 (ARF6)和PIF4一起形成了BAP调节模块(图2)。遮阴条件下，此模块被激活来响应各种生长调控信号[44−45]。BZR1可以直接和生长素生物合成基因PIF4的启动子结合，油菜素内酯和生长素信号通路通过关键的BAP模块相互连接促进避荫反应[46]。DELLA蛋白是BAP调节模块的一个重要负调控因子，在赤霉素的作用下迅速降解[47]。遮阴下phyB受到远红光抑制并同时降低PIF蛋白活性，DELLA蛋白通过阻止PIF4和BZR1与其DNA靶点结合及与ARF6结合，触发生长素介导的避荫反应[39](图2) 。Paclobutrazol resistance 1 (PRE1)是BZR1和PIF4共同的下游基因，该基因由油菜素内酯、赤霉素和生长素共同调节[38]，它们通过和蛋白激酶受体(protease-activated receptor 1, PAR1)形成异二聚体，阻碍PAR1/2及HY5对PIF4的抑制作用[48]，维持PIF蛋白活性，发生避荫反应(图2)。然而，上述3种激素并不是同步对避荫反应进行调控的。对遮阴处理早期拟南芥下胚轴的生长研究表明：生长素和油菜素内酯出现的时间比赤霉素早，基因表达的变化与表型联系更为紧密[49]。
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目前对于耐荫反应的机制研究还相对匮乏。结合耐荫反应分子机制最新研究进展并借鉴阳生植物避荫反应机制，推测阴生植物可能通过抑制避荫反应和增强耐荫反应双重复杂机制来保证荫蔽环境中的正常发育。
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光敏色素phyA是一类典型的阳生植物避荫反应拮抗因子，在抑制阴生植物避荫反应的过程中发挥重要作用。phyA在高远红光下发挥作用[50]，可以抵御由光敏色素phyB介导的植物伸长[2, 51]。在强遮阴下(R/FR为0.1)，野生型拟南芥phyA被显著激活，但其下胚轴并未伸长；相应地，phyA突变体下胚轴出现过度伸长，而COP1的突变完全抑制了其下胚轴的伸长。这表明强遮阴下，拟南芥phyA以COP1依赖的方式抑制避荫反应 [52]。phyA介导的光信号通路还可以通过与油菜素信号通路互作的方式促进耐荫反应[53]。近期研究发现：强遮阴条件下(R/FR为0.1)，拟南芥表现出耐荫反应。活跃状态下的phyA会减少COP1的核定位，导致其下游靶基因HY5表达量升高。HY5可以促进蛋白激酶BIN2的活性，从而使BES1磷酸化，抑制油菜素内酯信号通路，从而抑制下胚轴伸长(图3) 。同时，在强遮阴下COP1会通过干扰BIN2和PIF相互作用而稳定PIF[43]。phyA通过减少COP1核定位，导致COP1/SPA1复合体不能影响BIN2和PIF的互作，PIF4/5发生磷酸化降解，其靶基因油菜素内酯合成基因不能被激活，进一步导致油菜素内酯通路下游与下胚轴伸长相关的木葡聚糖内转葡糖糖基酶/水解酶(XTH)基因表达降低，避荫反应减弱[52]。因此，推测阴生植物的耐荫机制可能与强遮阴下拟南芥的耐荫机制类似，通过phyA-COP1依赖的方式与油菜素内酯通路互作来调控。
图 3 阴生植物耐荫反应分子机制假说
Figure 3. Hypothetical molecular mechanism of STR in sciophytes
另一类拮抗因子是bHLH及bZIP类转录蛋白。在遮阴环境下，植物对病原菌和植食性昆虫的敏感性增强，茉莉酸(JA)通路被诱导，MYC转录因子上调表达，并与HY5直接相互作用，增强其转录活性和HY5蛋白稳定性，从而抑制下胚轴伸长；另外，HY5还可以与BZR1的活性形式直接相互作用，并减弱其转录活性[54]，抑制避荫反应。同时，茉莉酸信号转录抑制因子JAZ (jasmonate ZIM-domain)能够与PAR1/PAR2结合并抑制其表达。茉莉酸的增加导致JAZ蛋白的降解，PAR1/2被释放[55]，PAR1/2通过与PIF形成异源二聚体来阻止PIF激活下游基因的表达， 进而抑制荫蔽环境下植物茎干及叶柄等的过度伸长[56]。
近期研究证实：上述2种避荫反应拮抗因子共同作用参与遮阴环境下植物的耐荫反应。强遮阴下拟南芥phyA促进耐荫反应的发生，PAR1/2会在COP1下游直接影响植物耐荫反应(图3) 。COP1作为E3泛素连接酶发挥作用，介导SAR负调节因子PAR1和HY5的泛素化和降解。强遮阴下，phyA抑制COP1入核，PAR1和HY5蛋白积累，抑制PIF4的表达，发生耐荫反应[38, 57]。
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蓝光受体CRY参与植物生长和发育调节，CRY1和CRY2在蓝光下与SPA蛋白相互作用，以抑制COP1/SPA活性，稳定HY5，抑制植株伸长[6](图3)。研究证明：在蓝光环境中蕨类植物的CRY (5个成员)发生了基因扩增现象，其植株叶片叶绿体更多，对蓝光和二氧化碳不敏感，气孔不会主动关闭，植物通过产生活性氧而让叶片气孔快速打开，使其在低光条件下也能进行高效的光合作用[58−59]。在大豆中，GmCRY1b过表达植株耐荫性显著提高，实现了密植条件下的高产[14]。因此，阴生植物可能通过CRY的扩增或提高CRY的转录活性来增强遮阴环境下的光能利用率。基于上述理论，推测在遮阴下，蓝光减少，但阴生植物可能存在高敏感性CRY家族基因，在低蓝光下仍处于活跃状态，进而调节GA2ox基因的上调表达导致赤霉素减少，同时CRY与DELLA结合，DELLA蛋白积累并且与PIF结合导致生长素减少(图3)，抑制植株伸长[36]，从而使阴生植物在遮阴环境下产生耐荫反应，维持正常生长。
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由于阴生植物与阳生植物在不同光照强度的环境中生长，故2类植物在相同的遮阴环境下会产生不同的变化。阳生植物在遮阴条件下产生的避荫反应依赖于复杂的避荫机制。在遮阴条件下，红光减少，远红光增加，R/FR下降，蓝光减少，光敏色素和隐花色素均可通过促进植株伸长等，使植株适应因遮阴带来的生理和形态变化。阴生植物则生活在光照强度较弱的林下，叶绿素a/b较低[60]，相较于阳生植物有更大的比叶面积，可以最大程度地利用光能进行光合作用，维持植株正常生长并且将碳能储存在植株中。此外，阴生植物在阴暗潮湿的林下也会积累更多次生代谢物来抵御环境带来的病害。但阳生植物在过度遮阴的情况下，下胚轴不会伸长，出现耐荫的性状，故推测在遮阴情况下，阴生植物的耐荫分子机制与阳生植物强遮阴下的反应类似，低R/FR下，phyA减少COP1的核定位和JAZ蛋白的降解致使PAR1和HY5蛋白积累，进而BIN2和PAR1抑制PIF蛋白活性，抑制植物伸长；同时低蓝光下有活跃状态的CRY调节GA2ox基因的上调导致赤霉素减少，并且积累的DELLA与PIF结合导致生长素减少，植株避荫反应基因不表达，出现耐荫性状。
总之，对阳生植物避荫反应研究较多，对分子机制的了解也更为透彻，对阴生植物耐荫机制的深入研究较少。在农业生产中，合理密植和间套作是提高作物单产的重要手段。然而，对于主要栽培作物，这2种栽培模式下光合能力减弱和光质的改变导致光合作用减弱和碳水化合物的合成减少，产量潜力受到限制，从而引起不利的避荫反应综合症，造成作物大幅减产。在此情况下，研究耐荫反应机制对培育高光效率和高产作物新品种(系)具有重要意义。因此，后续需要筛选适合的阴生模式植物并深入研究其光合作用及光信号转导分子机制，阐明阴生植物光能高效利用的调控网络，并利用分子设计育种等策略，尝试改良作物主栽品种，创制高光效种质资源。另外，阴生植物长期生长在病原菌繁多的阴暗潮湿的环境中，在保证自身生长的同时还进化出了出色的防御机制，深入解析阴生植物协同适应遮阴和生物胁迫的分子机制，有助于进一步理解植物环境适应性和发育权衡的调控机制，为培育抗逆、高产的作物新品种提供理论依据和基因靶点。
在森林生态系统中，林分结构影响林木的生长和木材的品质。研究表明：在遮阴环境下耐荫性和木材的密度呈正相关[61]。一些生活在下木层和灌木层的阳生小乔木无法与林冠层的高大乔木竞争光照，因此获得的光能较少，又因其耐荫性差，难以利用下木层和灌木层空间，木材密度较小，经济效益低；而阴生树种的耐荫性能较好，木材密度大，但是生长缓慢，因此短期经济价值较小。所以除了通过阳生树种和阴生树种间作来获得短期和长期的收益外，也可以探寻阳生树种的耐荫性，以期达到既不影响其生长发育又使其木材密度最大化的目的。在种植上层林木的同时，利用林冠层下的林荫及林下土地资源种植阴生植物，不仅有利于调整林分结构，丰富生物多样性，更有助于提高粮食作物和药材的产量，大幅度提升经济效益。近年来，林下经济发展迅速，已成为山区经济发展的优势产业、种植业结构调整的特色产业、农民脱贫致富的支柱产业和大众创业的新兴产业。因此，进一步深入研究植物的弱光响应机制，为林下种植模式中空间多层结构的搭建提供理论指导，对提高森林能量转换率和资源利用率具有重要意义。
Research progress on plant physiological morphology and light response mechanism in shaded environments
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摘要: 光照是影响植物生长发育的重要环境因素之一。在农业生产中利用提高作物光合效率来提升其产量与品质具有重要的科学意义和应用价值。在密集的植物群落中，由于上层植被的遮盖，下层植物所获得的光能较少，所以下层植物需要竞争更多光能来维持生长。植物有2种对策获取更多光能，即避荫反应和耐荫反应。目前，对避荫反应的研究较为透彻，但对耐荫反应还缺乏深入研究。综述了荫蔽环境下阳生植物通过伸长下胚轴、叶柄与茎等生理形态改变来适应较低光照水平，同时阴生植物通过展现出促进碳的获得能力、具有较低的表型可塑性和提高对胁迫的抗逆能力等耐荫特征来应对有限的光照条件。结合阳生植物通过激素与光信号通路相互作用来响应弱光环境的避荫反应机制，探讨了在荫蔽环境下阴生植物一方面通过激活拮抗因子抑制避荫反应，另一方面通过提高耐荫反应基因转录活性来增强弱光适应性的耐荫反应机制，为不同植物响应弱光环境机制的研究提供参考，同时为提高植物光能利用效率、培育高光效优良作物品种及构建高效森林生态系统提供有效途径。图3参61Abstract: Light is a crucial environmental factor affecting plant growth and development. It is of great scientific significance and application value to enhance plant yield and quality in agricultural production by improving its photosynthetic efficiency. In dense plant communities, lower plants receive less light energy due to the coverage of upper vegetation, so lower plants need to compete for more light energy to maintain growth. Plants have two strategies to obtain more light energy: shade avoidance syndrome (SAS) and shade tolerance response (STR). Research on SAS is relatively thorough, but there is a lack of in-depth research on STR. This paper provides an overview of how sunny plants adapt to lower light level by extending hypocotyl, petioles, stems and other physiological morphological changes in shaded environments. At the same time, shade tolerant plants respond to limited light conditions by exhibiting shade resistance characteristics such as promoting carbon acquisition, low phenotypic plasticity ability and improving stress resistance. Combined with the mechanism of shade avoidance response of sunny plants in response to low light environment through the interaction between hormones and light signaling pathways, the shade tolerance response mechanism of shade tolerant plants in shaded environments is studied, which involves both activating antagonistic factors to inhibit shade avoidance syndrome and improving the transcription activity of shade tolerance response genes to enhance low light adaptability. This review provides reference for research on the mechanism of different plants responding to low light environments, and proposes effective ways to improve the efficiency of plant light energy utilization, cultivate crop varieties with high light efficiency, and construct efficient forest ecosystems. [Ch, 3 fig. 61 ref.]
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核桃Juglans regia 为胡桃科Juglandaceae胡桃属Juglans植物[1]，其种仁含油量高，有“木本油料之王”的称号[2]。同时，核桃木材坚实，是良好的硬木材料。作为重要的经济林树种，核桃大多种植于土壤贫瘠的山坡沟坎，不与粮争地[3]。然而，核桃树体高大，与其他果树相比对矿质营养元素需求量较高，大量元素与核桃产量和品质形成紧密相关[4]，因此，提高核桃树体对矿质元素的吸收能力对于提高核桃产量和品质至关重要[5]。研究表明：在核桃树各器官中种仁的氮素质量分数最高，核桃树吸收累积的矿质营养元素中氮素被商品核桃(种仁、硬壳)携走的比例也最高，叶片次之[6]。可见，氮素可能是提高核桃产量和品质的关键营养元素。然而，过量施用氮肥会导致严重的环境问题，因此，提高氮素利用效率是提高核桃产量与品质的重中之重[7]。
土壤中氮素主要分为无机氮和有机氮两大类，植物根系能够吸收利用的主要是无机氮，主要以硝态氮和铵态氮形式存在[8−9]。植物根系对无机氮转运调节途径可分为2种，即高亲和力(HATs)和低亲和力(LATs)的氮转运系统[10]，HATs 在外部铵态氮( ${\rm{NH}}_4^ +$)、硝态氮(${\rm{NO}}^ -_3 $)浓度低于 0.5 mmol·L−1时介导吸收大部分的无机氮，而 LATs 则是在 ${\rm{NH}}_4^ + $、${\rm{NO}}_3^ - $浓度高于 0.5或 1.0 mmol·L−1时介导吸收无机氮[10]。植物对铵态氮和硝态氮的吸收主要由铵转运蛋白和硝酸转运蛋白介导。土壤中同时含有植物可吸收利用的硝态氮和铵态氮时，由于植物吸收硝态氮需要先将其还原成铵态氮后才能进行同化利用，消耗的能量更多，所以植物对铵态氮表现出明显的偏好性，而且当植物受盐胁迫及活性氧的伤害时，铵态氮具有缓解作用，因此，介导植物对铵态氮吸收的铵转运蛋白在植物氮同化中起着重要作用[11]。铵转运蛋白基因主要有两大类族，分为AMT1和AMT2。在已知的铵转运蛋白中大部分 AMT1 家族的转运蛋白属于高亲和转运体[12]，如拟南芥Arabidopsis thaliana中有6个编码铵转运蛋白被鉴定，包括5个AMT1家族基因，1个AMT2家族基因。AMT1家族基因中，AtAMT1.1和AtAMT1.3对拟南芥根系铵态氮吸收的贡献率最高，为30%，AtAMT1.2、AtAMT1.5对拟南芥根系高亲和铵态氮吸收的贡献率略低于AtAMT1.1和AtAMT1.3[13]，AtAMT1.4在花粉中特异性表达[14]，在水稻Oryza sativa铵转运蛋白基因家族中AMT1家族有基因3个，其中OsAMT1.1和OsAMT1.2为高亲和力转运体[15]；而 AMT2 家族以低亲和为主，在拟南芥AMT2家族基因中AtAMT2.1 在低亲和范围内适度促进拟南芥根系对铵态氮吸收，主要在铵从根部到地上部运输中发挥作用[16]。AMT2 型蛋白通常在植物的不同组织中包括根、芽和叶中都有表达，如AtAMT2.1基因在拟南芥各器官中均有表达，主要表达在拟南芥的维管束及上皮层[17]，在拟南芥中AtAMT2.1与AtAMT1s之间还存在协同作用。此外，毛果杨Populus trichocarpa PtAMT2.1主要在叶片中，PtAMT2.2在叶柄中高表达。除此之外，玉米Zea mays[18]、番茄Lycopersicon esculentum [19]、欧洲油菜Brassica napus [20]等高等作物均鉴别出了AMT基因，但到目前为止，研究大多集中于高亲和的铵转运蛋白AMT1基因家族，对低亲和的铵转运蛋白AMT2基因家族的研究较少。因此，阐明AMT2的生物学功能和调控机制，对于提高核桃自身的氮效率和提高肥料利用效率都具有重要意义。
本研究以核桃JrAMT2过表达株系为供试材料，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及生理检测的方法鉴定JrAMT2基因在核桃植株体内的表达模式，进一步对核桃JrAMT2基因进行生物学功能分析，为核桃优良品种选育提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 植物材料
实验材料来自浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室保存的核桃野生型(WT)以及课题组2019年获得的核桃JrAMT2过表达阳性植株 [21]，其中JrAMT2基因构建于PCMBIA1300植物表达载体，载体抗性为卡那霉素(kanmycin，Kan)，利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3103菌株介导将构建好的35S::JrAMT2::GFP过表达载体转化到核桃野生型体细胞胚中，植物筛选标记为潮霉素(hygromycin，Hyg)。本研究所用核桃组培苗为野生型体胚和JrAMT2过表达阳性体胚经脱水萌发获得，温室苗则由上述组培苗经生根、炼苗、驯化获得。
1.2 实验方法
1.2.1 生物信息分析运用
SOPMA(
https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html )网站在线分析JrAMT2蛋白质二级结构，运用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )在线软件对JrAMT2 蛋白进行跨膜结构域的预测，通过 GSDS(http://gsds.gao-lab.org/ )软件在线分析JrAMT2基因结构。1.2.2 植株的培养
同一JrAMT2过表达阳性体胚萌出的植株为1个株系，选取3个核桃JrAMT2阳性株系，命名为JrAMT2-1、JrAMT2-2、JrAMT2-3，每个株系继代培养至50株以上，培养条件：温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养基为Driver&Kunivuki&McGranahan (DKW)培养基。
采用2步生根法获得核桃驯化植株，选取阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗作为实验材料。第1步进行根诱导，5~8 cm长的光生芽，转移到补充有10 mg·L−1吲哚丁酸钾(K-IBA)的DKW固体培养基，在黑暗中培养7 d，诱导根原基的发生；第2步，不定根诱导结束后将其转移到粗蛭石∶DKW培养基比例(体积比)为3∶2的固体培养基中，温度为25 ℃，湿度为75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养时间为21~28 d，形成不定根，获得核桃不同株系生根植株[22]。
核桃苗不定根形成后取出用清水冲洗，多菌灵浸泡，移栽到泥炭∶蛭石∶珍珠岩比例(体积比)为2∶1∶1的混合土中，将移栽驯化成活后获得的核桃再生植株在温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗的条件下培养[23]，获得核桃不同株系温室植株。
1.2.3 核桃JrAMT2基因阳性鉴定
选用阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗进行绿色荧光蛋白(GFP) 检测、PCR及RT-qPCR验证，引物见表1。从再生植株顶芽开始向下截取 1.5 cm，培养14 d 后观察植株表型，每个株系均5个生物学重复。选取植株顶芽、叶片、茎段混样提取DNA及RNA。 PCR 反应程序为：94 ℃预变性 2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火温度 30 s，68 ℃延伸 2 min，共 32 个循环；68 ℃延伸 7 min，PCR 反应产物进行质量分数为1.2%琼脂糖凝胶电泳。使用 The iQ5 Real-Time PCR Detection System 仪器进行RT-qPCR，测定转基因植株中JrAMT2的相对表达量。反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40 个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 15 s。通过 2−ΔΔCt方法计算定量结果[24]。
表 1 引物Table 1 Primers引物 序列(5′→3′) 用途 Actin-F GCCGAACGGGAAATTGTC 内参 Actin-R AGAGATGGCTGGAAGAGG 内参 QJrAMT2-F AGCAAATGGGGTTCCAGGTT 定量 QJrAMT2-R TGTCTCCCGCAGATAGAAGGTA 定量 GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 鉴定 GFP-R TTACTTGTACAGCTCGTCCA 鉴定 JrAMT2-F CATGAATACCACACCGGCCTA 鉴定 取核桃野生型及核桃JrAMT2过表达株系组培苗的根、茎、小叶，根纵切、茎横切临时切片分别放置于体视荧光显微镜(Carl Zeiss Stereo D13covery V12，Axio Cam MRc system)在明场和蓝光(488 nm)激发条件下利用 ZEN lite 成像软件连续拍照[25-26]。
1.2.4 生长参数、铵态氮和硝态氮测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，从顶尖向下剪取1.5 cm茎段，含2~4片复叶，培养14 d，每个株系均5个生物学重复，测量株高及节间数。选取长势相同的核桃野生型及JrAMT2过表达植株采用2步生根法驯化，移栽后用直尺测量统计不同株系生长0、20、40 d的株高、节间长、叶片长度及叶片宽度。
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，培养14 d，采用2步生根法获得核桃生根植株，植株分为地上部分及地下部分2个部分，清洗植株，分别测定地上部分及地下部分鲜质量，于105 ℃下杀青，80 ℃烘干至恒量，称取干质量。使用苏州科铭生物技术有限公司的植物铵态氮(ZATD-1-G)和植物硝态氮(ZXTD-1-G)试剂盒测定地上部分及地下部分铵态氮和硝态氮质量分数，每个株系均5个生物学重复。
1.2.5 植株叶绿体观察、叶绿素质量分数及叶绿素荧光测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，取顶尖向下第2节间处复叶。将该叶片置于0.35 mol·L−1氯化钠中研磨破碎至絮状，取悬液于高倍光学显微镜下观察，找到视野中单个完整的叶肉细胞，观察细胞中的叶绿体, 使用image J软件计算叶绿体表面积与单层细胞表面积比率。每个株系均5个生物学重复。
采用丙酮浸取法测定叶绿素质量分数。分别取0.1 g核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗长势一致的叶片，剪碎，置于15 mL离心管中，加入10 mL体积分数 80%丙酮溶液，于室温黑暗处浸提，直至管内材料褪色变白，以80%丙酮溶液为对照，测定663和646 nm处吸光值，每个株系均5个生物学重复。wt=[(wa+8wb)×Vt×(mFW×1 000)−1]，叶绿素 a 质量分数(wa) =20.3×D(646)，叶绿素 b 质量分数(Cb)=8.04×D(663)。其中：wt为叶绿素质量分数(mg·g−1)，Vt为提取液总体积(mL)，mFW为叶片鲜质量(g)，D(646)和D(663)分别为646和663 nm处的吸光度。
叶绿素荧光测定使用M-PEA(multi-function plant efficiency analyser)多功能植物效率分析仪(英国Hansatech公司)测定。选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系温室苗由上向下第3片叶片暗处理30 min，在饱和脉冲光(5 000 μmol·m−2·s−1) 下进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线) 的测定和绘制。参照SCHANSKE等[27]的方法分析叶绿素荧光诱导动力学参数(JIP-test)。
1.2.6 数据分析
利用SPSS 26软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(邓肯法)，显著性水平为0.05。使用GraphPad Prism 7.0软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 核桃JrAMT2基因生物信息学分析
核桃 JrAMT2基因的全长为 1 464 bp，起始密码子为 ATG，终止密码子为 TGA。经过美国国家生物技术信息中心(NCBI)在线序列比对显示：该基因的序列编码的氨基酸序列属于 Ammonium Transporter Family，编码487个氨基酸(图1)，蛋白分子量为52.458 kD，预测分子式为C2433H3715N601O646S23，含有7 418个原子，理论等电点为7.11，不稳定指数为35.61，脂溶指数为101.56，亲水性平均值为0.472。该段蛋白质中包含20种常见氨基酸：亮氨酸质量分数最高，达到11.7%，其次分别为甘氨酸11.1%，丙氨酸10.9%，缬氨酸8.6%，半胱氨酸质量分数最低，仅为1.0%。JrAMT2蛋白中分别含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys) (表2)。
表 2 JrAMT2基因氨基酸组成Table 2 Composition of JrAMT2 amino acids氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 丙氨酸 53 10.90 组氨酸 9 1.80 苏氨酸 27 5.50 精氨酸 11 2.30 异亮氨酸 25 5.10 色氨酸 18 3.70 天冬酰胺 16 3.30 亮氨酸 57 11.70 酪氨酸 17 3.50 天冬氨酸 15 3.10 赖氨酸 18 3.70 缬氨酸 42 8.60 半胱氨酸 5 1.00 甲硫氨酸 18 3.70 吡咯赖氨酸 0 0.00 谷氨酰胺 11 2.30 苯丙氨酸 24 4.90 晒半胱氨酸 0 0.00 谷氨酸 14 2.90 脯氨酸 24 4.90 甘氨酸 54 11.10 丝氨酸 29 6.00 对核桃JrAMT2蛋白跨膜区的预测结果表明：该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋，跨膜螺旋区段分别位于24~46、59~81、129~151、158~180、195~214、227~244、254~276、288~310、314~333、346~368和398~420，推测JrAMT2属于跨膜蛋白，并在N端存在信号肽(图2A)。
对JrAMT2 蛋白二级结构的预测结果显示：JrAMT2的氨基酸组成中有4种构象，其中 α- 螺旋有 201 个氨基酸，占比 43.12%；延伸链有 93个氨基酸，占比19.10%；β- 转角有 30个氨基酸，占比 6.16%；无规则卷曲有154个氨基酸，占比 31.62%。JrAMT2 铵转运蛋白主要由 α- 螺旋和无规则卷曲组成(图2B)。
对JrAMT2基因结构的分析显示：JrAMT2基因由4个外显子，3个内含子组成。与拟南芥AtAMT2基因相比，拟南芥基因结构多了1个外显子和1个内含子，与山核桃Carya cathayensis CcAMT2基因[28]、栓皮栎Quercus suber QsAMT2基因[29]相比，外显子和内含子数量相同，同源性较高(图2C)。
2.2 核桃JrAMT2过表达植株阳性验证
在成功构建35S::JrAMT2::GFP的过表达载体并通过农杆菌介导转化核桃体胚后，对同一无性系JrAMT2体胚经脱水萌发获得的再生植株进行阳性鉴定。利用PCR技术，以核桃JrAMT2过表达植株3个株系(JrAMT2-1、JrAMT2-2和JrAMT2-3) DNA为模板，进行外源GFP基因(729 bp)的PCR验证，检测到大小约为 750 bp的电泳条带，与GFP基因大小符合(图3A)；进行目的基因JrAMT2加外源GFP基因全长(2193 bp)的PCR验证，检测到大小为2000 bp的电泳条带，与目的基因大小符合(图3B)；以核桃JrAMT2过表达植株3个株系的cDNA为模板，利用实时定量PCR技术对JrAMT2基因表达量进行检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株3个株系JrAMT2基因相对表达量分别为野生型的10.58、12.80和14.94倍，显著上调(图3C)，表明核桃JrAMT2过表达植株中JrAMT2基因稳定表达。
图 3 PCR 和RT-qPCR 对核桃组培苗的JrAMT2基因的检测Figure 3 Detection of JrAMT2 gene in J. regia tissue culture seedlings by PCR and qRT-PCR对获得的过表达株系进行GFP荧光阳性鉴定，分别将核桃过表达及野生型幼苗(图4A)的小叶、茎、根置于荧光体视显微镜下在波长为488 nm蓝光激发下拍摄。结果显示：过表达植株的小叶、茎、根表面呈现均匀的绿色荧光，其中腋芽处荧光更明亮(图4B1~6)，野生型核桃幼苗的小叶、茎、根在荧光下拍摄无绿色荧光激发(图4B7~12)，说明JrAMT2蛋白在腋芽处积累。为进一步研究JrAMT2基因在核桃幼苗中的表达，对过表达株系及野生型组培苗的茎段进行横切，根进行纵切后，进行GFP荧光检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株茎段横切中呈现均匀的绿色荧光，其中在维管组织中荧光更明亮，野生型植株茎段横切面无绿色荧面光(图4B1~12)；核桃JrAMT2过表达植株根段纵切面中呈现均匀的绿色荧光，且在维管组织中荧光更明亮，野生型植株根段纵切面无绿色荧光(图4C1~8)。表明JrAMT2基因在核桃幼苗的根和茎中均可稳定表达，其中JrAMT2蛋白在根和茎的维管束组织中积累。
图 4 铵态氮转蛋白基因JrAMT2在核桃苗中稳定表达Figure 4 Stable expression of ammonium nitrogen transfer protein gene JrAMT2 in J. regia2.3 核桃JrAMT2基因的生物学功能分析
2.3.1 核桃JrAMT2过表达植株生长表型分析
为了进一步研究核桃JrAMT2基因的生物学功能，将3个JrAMT2过表达植株与野生型核桃植株培养14 d。结果表明：与野生型相比，核桃JrAMT2过表达植株均生长旺盛，株高显著增加，节间显著增长(P＜0.05，图5A)。3个JrAMT2过表达株系株高分别为3.87、4.23和4.12 cm，节间长分别为0.33、0.35和0.34 cm，野生型植株株高为3.30 cm，节间长为0.28 cm，与野生型相比，3个JrAMT2过表达株系株高分别增加了17.0%、28.0%和29.0% (图5B)，节间长分别增加了19.0%、25.0%和24.0% (图5C)。综上所述，JrAMT2过表达对核桃幼苗的生长有显著提高作用。
图 5 核桃JrAMT2过表达离体培养植株表型分析Figure 5 Phenotypic analysis of J. regia JrAMT2 overexpression plant in vitro culture对核桃JrAMT2过表达植株进一步驯化培养，成功获得核桃JrAMT2过表达温室苗。对其生长表型进行分析(图6A)，定植后培养40 d，核桃JrAMT2过表达温室苗的株高、节间长、叶片长度、叶片宽度增加显著高于野生型(P＜0.05)。培养至第20天时，与野生型相比，核桃JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加21.9%、26.0%和24.6% (图6B)，节间长分别增加41.2%、27.7%和26.3% (图6C)，叶片长度分别增加18.7%、16%和30.7% (图6D)，叶片宽度分别增加41.3%、48.2%和55.1% (图6E)；培养至第40天时，与野生型相比，JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加53.6%、68.2%和62.1%，节间长分别增加37.2%、50.3%和44.8%，叶片长度分别增加了27.8%、34.1%和49.3%，叶片宽度分别增加24.3%、19.5%和29.2%。综上所述，核桃JrAMT2过表达温室苗与野生型相比，株高、节间长、叶片大小均显著增加，进一步证明JrAMT2基因过表达加快了核桃的生长速度。
图 6 核桃JrAMT2过表达阳性温室苗性状分析Figure 6 Character analysis of J. regia JrAMT2 overexpression positive greenhouse seedlings2.3.2 核桃JrAMT2过表达植株对氮素吸收分析
为探究JrAMT2基因在核桃中是否存在差异表达，将核桃野生型及核桃JrAMT2过表达植株进行2步生根，获得核桃JrAMT2过表达生根植株，将其分为地上部分与地下部分。与野生型相比，核桃JrAMT2过表达生根植株地下部分不定根生长旺盛(图7A)。对核桃JrAMT2过表达植株地上部分及地下部分差异分析，分别提取3个核桃JrAMT2过表达株系生根植株地上部分及地下部分RNA，利用实时定量PCR技术，分析地上部分及地下部分JrAMT2基因表达的差异。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的11.94、12.70和15.06倍，地下部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的19.07、23.34和24.00倍(图7B)。对核桃野生型及3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分进行干质量和鲜质量测定。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分鲜质量和干质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加23.45%、33.67%和56.26%，干质量分别增加23.45%、43.89%和56.26%；3个JrAMT2过表达株系地下部分干质量和鲜质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加222.65%、199.24%和344.38%，干质量分别增加222.65%、199.24%和354.33%(图7C)。
图 7 核桃JrAMT2过表达植株氮素吸收分析Figure 7 Character analysis of the regenerated plants with expression of JrAMT2 in J. regia基于核桃JrAMT2过表达植株表型变化，本研究进一步测定核桃JrAMT2过表达植株对硝态氮及铵态氮吸收。结果表明：与野生型相比，核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分铵态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别增加59.1%、32.3%和55.1%，地下部分别增加68.1%、61.9%和114.1% (图7D)；核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分硝态氮质量分数显著降低(P＜0.05)，地下部分硝态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别降低10.1%、7.1%和13.6%，地下部分别增加63.5%、75.7%和70.3% (图7E)。综上所述，JrAMT2基因主要作用于核桃地下部分，且JrAMT2基因过表达促进植株地下部分对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部到地上部的运输。
2.3.3 核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光特性分析
对核桃JrAMT2过表达植株叶色与叶片细胞叶绿体进行观察。核桃JrAMT2过表达植株叶色与野生型相比颜色较深(图8A)，在显微镜下观察3个核桃JrAMT2过表达植株株系及野生型叶绿体特征发现，3个核桃JrAMT2过表达株系扩张的栅栏叶肉细胞中的叶绿体更致密(图8B)。进一步分析发现：对3个阳性株系进行总叶绿素质量分数测定，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿素质量分数显著高于野生型(P＜0.05)，野生型总叶绿素质量分数为3.53 mg·g−1，核桃JrAMT2过表达阳性植株3个株系总叶绿素质量分数分别为4.64、4.69和6.10 mg·g−1，与野生型相比分别增加了32.6%、34.0%和74.3% (图8C)；JrAMT2过表达株系叶绿体表面积在单层细胞表面积的占比显著高于野生型(P＜0.05)，野生型叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率为0.56，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿体表面积与单层细胞表面积的比值分别为0.67、0.68和0.69，与野生型相比分别增加了19.41%、21.18%和22.94% (图8D)。综上所述，JrAMT2基因过表达提高了叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率及核桃叶肉细胞内叶绿素的积累。
图 8 核桃JrAMT2过表达植株叶绿体及叶绿素质量分数分析Figure 8 Analysis of chloroplast and chlorophyll content in J. regia with JrAMT2 overexpression对3个核桃JrAMT2过表达株系进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线测定。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系的O (Fo点)相、K相降低，J点、I点、P (Fm)及J~P点振幅均提高，OJIP曲线较陡，表明JrAMT2基因一定程度上提高了叶片的活性(图9A)。与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系暗适应后的最大荧光强度(Fm)、最大量子产额(Fv/Fm)均提高，Fm分别提高了47.1%、45.9%、50.2%，Fv/Fm分别提高了15.6%、13.4%、14.7%，表明JrAMT2基因一定程度上提高了光系统Ⅱ(PSⅡ)的光化学效率(图9B)。计算归一化处理的OJIP曲线(Vt)[Vt =(Ft−Fo /(Fm−Fo)，Ft为任意时刻t的荧光值]，并计算相对荧光差异ΔVt[ΔVt = Vt处理−Vt对照，用ΔK、ΔJ值分别显示在300 μs和20 ms处的ΔVt值，表示放氧复活体的活性(OEC)]。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系ΔK、ΔJ值下降且＜0 (图9C)，表明JrAMT2基因一定程度上提升了核桃叶片PSⅡ供体侧及受体侧电子传递效率及放氧复活体的活性。
图 9 铵态氮转运蛋白JrAMT2基因表达对核桃叶绿素荧光的影响Figure 9 Effect of ammonium nitrogen transporter JrAMT2 gene on chlorophyll fluorescence of J. regia用JIP-test参数对OJIP曲线进行定量分析，结果显示：核桃3个JrAMT2过表达株系在t=0时的最大光化学效率(φPo)、反应中心捕获的光能用于${\rm{Q}}_{\rm{A}}^- $下游电子传递的量子产量(ΨEo)、吸收的能量用于电子传递的量子产量(φEo)上升，分别上升了14.62%、44.59%、65.80%；在J点的相对可变荧光强度(VJ)、最小荧光强度与最大荧光强度比值(Fo/Fm)、反应中心关闭净速率(dV/dto)下降，分别下降了31.03%、35.29%、49.34% (图9D)，表明JrAMT2基因一定程度上提高了PS反应中心的量子比率及产额；对单位PS反应中心比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在t=0 时的单位反应中心捕获的用于电子传递的能量(ETo/RC)、在t=0 时的单位反应中心传递到电子链末端的能量(REo/RC)无明显变化，在t=0 时单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、在t=0 时单位反应中心耗散的能量(DIo/RC)、在 t=0 时单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)显著下降，分别为36.43%、58.67%、27.22%，表明JrAMT2基因一定程度提高了核桃叶片反应中心活性和用于电子传递的能量份额，增强了电子传递能力(图9E)；对单位受光截面比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在 t=tFM(暗适应后达到最大荧光强度时间点)时的单位受光截面耗散的能量(DIo/CSm)无明显变化，在 t=tFM时单位受光截面吸收的能量(ABS/CSm)、在t=tFM时单位受光截面捕获的用于还原QA的能量(TRo/CSm)、在 t=tFM时单位受光截面捕获的用于电子传递的能量(ETo/CSm)、在t=tFM时单位受光截面传递到电子链末端的能量(REo/CSm)上升，分别上升了 47.79%、69.39%、145.10%、303.62%(图9F)，表明JrAMT2基因一定程度提高核桃叶片单位受光截面的电子传递的份额及电子传递效率。综上所述，JrAMT2基因过表达促进核桃的光合作用。
3. 讨论
氮素作为植物生长发育必不可少的营养元素，是核酸、蛋白质、酶、叶绿素、植物激素等的重要组成部分[30]。自然界中可供利用的氮素资源有限，作物高产就需要化肥的投入。中国的化肥投入总量逐渐升高，但化肥利用率很低，给自然环境带来极大的负担 [31−32]，因此合理使用化肥，提高作物对氮素的吸收效率是促进农业生态化发展的重要途径。铵转运蛋白基因AMTs是广泛存在于动物、植物、微生物中用于运输${\rm{NH}}_4^+ $的载体蛋白，从分子层面提高植物对氮素的利用具有重要意义。前人研究发现：在拟南芥中，氮饥饿能诱导AtAMT1.1、AtAMT2.1基因上调表达，并且AtAMT2基因的表达水平随着氮饥饿时间的延长而增加[33-34]。在充足或高氮条件下，观察到拟南芥中AtAMT2.1及水稻根中OsAMT1.2基因表达水平仍上调 [35-36]，其中氮素形态对AMT基因转录水平的调控也取决于AMT基因个体和植物物种。
本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行初步的功能验证，对JrAMT2基因进行生物信息学分析表明：JrAMT2蛋白中含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys)。该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋结构域，与李畅[36]预测的OsAMT2.1蛋白结构域特点相同，且与夏金泽等[37]研究的木薯Manihot esculenta MeAMT2.6基因的蛋白结构相似。AMT2 型蛋白通常在植物的各种组织中表达，包括根、芽和叶。前人研究发现：杜梨 Pyrus betulifolia PbAMT2基因在所有器官中均有表达，但在根部表达最高[38]。在拟南芥中发现：AtAMT2.1基因主要在维管组织中表达，在芽中的表达高于根[15]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行绿色荧光观察发现：JrAMT2蛋白在核桃苗整株均有表达，且在芽及根茎的维管束中荧光更明亮，说明与拟南芥相同，核桃JrAMT2蛋白在所有器官中表达，且主要在维管组织中表达。
在植物生长发育重要阶段充足的氮素营养供给可以促进其生长发育，增加产量，对植物外施氮素能增加植株株高及叶面积[39]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株生长性状分析发现：JrAMT2基因在核桃中过表达对植株生长发育有调控作用，主要表现在过表达植株株高、节间长显著增加。对过表达植株生根驯化结果显示：过表达植株生物量显著增加，根系发达。对核桃JrAMT2过表达植株移栽驯化，定植后植株生长速率显著高于野生型，主要表现在节间伸长快，叶面积增加。AMT2是具有铵吸收功能的铵转运蛋白，且在维管组织表达，暗示着该基因可能参与铵向木质部的装载，介导铵在植物中的长距离运输。研究发现：拟南芥AtAMT2.1除了对根吸收氮素有一定贡献外，主要作用于${\rm{NH}}_4^+ $从根部到茎部的运输[40]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株地上部分和地下部分基因表达测定发现：植株地下部分JrAMT2基因表达量显著高于地上部分，且植株地下部分生物量的增加显著高于地下部分，说明核桃JrAMT2基因主要在地下部分表达。对核桃JrAMT2过表达植株对铵态氮和硝态氮吸收测定结果表明：核桃JrAMT2过表达植株地上部分仅对铵态氮的吸收显著上调，地下部分对铵态氮与硝态氮的吸收均显著上调，说明JrAMT2基因促进植株对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部分到地上部分的运输。氮素营养还会通过影响叶绿素合成和叶绿素荧光参数的变化来参与光能的利用和调控[41]。有研究表明：水稻OsAMT2.1基因敲除株系的光合特性与野生型相比出现下降趋势，同样说明了AMT2基因对植物光合作用有调控作用[36]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数变化的测定结果显示：JrAMT2基因显著提高了核桃的叶绿体表面积与单层细胞表面积比率、叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数中叶片放氧复活体活性、量子产额、电子传递效率。
4. 结论
JrAMT2作为铵态氮转运基因，促进核桃对铵态氮和硝态氮的吸收，且介导铵态氮从根部到茎部的运输，对核桃生长发育、光合作用等有积极作用，对研究核桃高效利用氮素及良种的筛选有重要意义。
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图 1 阴生植物适应弱光环境的3个假说
Figure 1 Three hypotheses of sciophytes adapt to low-light environments
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[1] KAMI C, LORRAIN S, HORNITSCHEK P, et al. Light-regulated plant growth and development [J]. Current Topics in Development Biology, 2010, 91: 29 − 66. [2] YANG Chuanwei, XIE Famin, JIANG Yupei, et al. Phytochrome a negatively regulates the shade avoidance response by increasing auxin/indole acidic acid protein stability [J]. Development Cell, 2018, 44(1): 29 − 41. [3] FRANKLIN K A. Shade avoidance [J]. New Phytologist, 2008, 179(4): 930 − 944. [4] 罗宁. 不同遮光度下南方红豆杉生长研究 [J]. 安徽农学通报, 2021, 27(19): 54 − 57. LUO Ning. Research on the growth of Taxus chinensis var. mairei under different shades [J]. Anhui Agricultural Science Bulletin, 2021, 27(19): 54 − 57. [5] 双升普, 张金燕, 寸竹, 等. 光照辐射强度驱动典型阴生植物三七的生理生态响应特征 [J]. 生态学报, 2022, 42(9): 3596 − 3612. SHUANG Shengpu, ZHANG Jinyan, CUN Zhu, et al. Ecophysiological characteristics of a typically shade-tolerant species Panax notoginseng in response to different light intensities [J]. Acta Ecologica Sinica, 2022, 42(9): 3596 − 3612. [6] FIORUCCI A S, FANKHAUSER C. Plant strategies for enhancing access to sunlight [J/OL]. Current Biology, 2017, 27 (17): R931−R940[2024-01-26]. doi: 10.1016/j.cub.2017.05.085. [7] EVANS J R, POORTER H. Photosynthetic acclimation of plants to growth irradiance: the relative importance of specific leaf area and nitrogen partitioning in maximizing carbon gain [J]. Cell Environment, 2001, 24(8): 755 − 767. [8] VANDENBUSSCHE F, PIERIK R, MILLENAAR F F, et al. Reaching out of the shade [J]. Current Opinion in Plant Biology, 2005, 8(5): 462 − 468. [9] NOZUE K, TAT A V, DEVISETTY U K, et al. Shade avoidance components and pathways in adult plants revealed by phenotypic profiling [J/OL]. PLoS Genetics, 2015, 11 : e1004953[2024-01-24]. doi: 10.1371/journal.pgen.1004953. [10] BALLARE C L, PIERIK R. The shade-avoidance syndrome: multiple signals and ecological consequences [J]. Plant Cell and Environment, 2017, 40(11): 2530 − 2543. [11] KASULIN L, AGROFOGLIO Y, BOTTO J F. The receptor-like kinase ERECTA contributes to the shade-avoidance syndrome in a background-dependent manner [J]. Annals of Botany, 2013, 111: 811 − 819. [12] INCE Y Ç, KRAHMER J, FIORUCCI A S, et al. A combination of plasma membrane sterol biosynthesis and autophagy is required for shade-induced hypocotyl elongation [J/OL]. Nature Communications, 2022, 13 : 5659[2024-01-24]. doi: 10.1038/s41467-022-33384-9. [13] CASAL J J. Shade avoidance [J/OL]. Arabidopsis Book, 2012, 10 : e0157[2024-01-23]. doi: 10.1199/tab.0157. [14] LYU Xiangguang, CHENG Qican, QIN Chao, et al. GmCRY1s modulate gibberellin metabolism to regulate soybean shade avoidance in response to reduced blue light [J]. Molecular Plant, 2021, 14(2): 298 − 314. [15] WANG Honggui, ZHANG Zenglin, LI Hongyu, et al. CONSTANS-LIKE 7 regulates branching and shade avoidance response in Arabidopsis [J]. Journal of Experimental Botany, 2013, 64(4): 1017 − 1024. [16] YANOVSKY M J, CASAL J J, SALERNO G L, et al. Are phytochrome-mediated effects on leaf growth, carbon partitioning and extractable sucrose-phosphate synthase activity the mere conse- quence of stem-growth responses in light-grown mustard? [J] Journal of Experimental Botany, 1995, 46 (7): 753 − 757. [17] GIVNISH T J. Adaptation to sun and shade: a whole-plant perspective [J]. Australian Journal of Plant Physiology, 1988, 15: 63 − 92. [18] NIU Yuqian, ZHANG Yuxin, WANG Xinfeng, et al. Phenotypic and transcriptional features of Araliaceae species under distinct light environments [J/OL]. Journal of Systematics and Evolution, 2023[2024-01-24]. doi: 10.1111/jse.13043. [19] HUANG D, WU L, CHEN J R, et al. Morphological plasticity, photosynthesis and chlorophyll fluorescence of Athyrium pachyphlebium at different shade levels [J]. Photosynthetica, 2011, 49(4): 611 − 618. [20] MULLINEAUX C W, EMLYN-JONES D. State transitions: an example of acclimation to low-light stress [J]. Journal of Experimnetal Botany, 2005, 56(411): 389 − 393. [21] SHAO Qingsong, WANG Hongzhen, GUO Haipeng, et al. Effects of shade treatments on photosynthetic characteristics, chloroplast ultrastructure, and physiology of Anoectochilus roxburghii [J/OL]. PLoS One, 2014, 9 (2): e85996[2024-01-24]. doi: 10.1371/journal.pone.0085996. [22] POORTER H, NIINEMETS Ü, NTAGKAS N, et al. A meta-analysis of plant responses to light intensity for 70 traits ranging from molecules to whole plant performance [J]. New Phytologist, 2019, 223(3): 1073 − 1105. [23] CANHAM C D, KOBE R K, LATTY E F, et al. Interspecific and intraspecific variation in tree seedling survival: effects of allocation to roots versus carbohydrate reserves [J]. Oecologia, 1999, 121: 1 − 11. [24] GAUCHER C, GOUGEON S, MAUFFETTE Y, et al. Seasonal variation in biomass and carbohydrate partitioning of understory sugar maple (Acer saccharum) and yellow birch (Betula alleghaniensis) seedlings [J]. Tree Physiology, 2005, 25(1): 93 − 100. [25] AUGSPURGER C K. Light requirements of neotropical tree seedlings: a comparative study of growth and survival [J]. The Journal of Ecology, 1984, 72(3): 777 − 795. [26] BAKER S A, RUTTER J. Metabolites as signalling molecules [J]. Nature Reviews of Molecular Cell Biology, 2023, 24: 355 − 374. [27] MA Lijuan, LIU Xiao, GUO Liwei, et al. Discovery of plant chemical defence mediated by a two-component system involving β-glucosidase in Panax species [J/OL]. Nature Communications, 2024, 15 : 602[2024-01-24]. doi: 10.1038/s41467-024-44854-7. [28] ZHANG Xiaofan, TONG Jianhua, BAI Aining, et al. Phytohormone dynamics in developing endosperm influence rice grain shape and quality [J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2020, 62(10): 1625 − 1637. [29] TAO Yi, FERRER J L, LJUNG K, et al. Rapid synthesis of auxin via a new tryptophan-dependent pathway is required for shade avoidance in plants [J]. Cell, 2008, 133(1): 164 − 176. [30] WON C, SHEN Xianglin, MASHIGUCHI K, et al. Conversion of tryptophan to indole-3-acetic acid by tryptophan aminotransferases of Arabidopsis and Yuccas in Arabidopsis [J]. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 2011, 108(45): 18518 − 18523. [31] XU Feng, HE Shengbo, ZHANG Jingyi, et al. Photoactivated CRY1 and phyB interact directly with AUX/IAA proteins to inhibit auxin signaling in Arabidopsis [J]. Molecular Plant, 2018, 11(4): 523 − 541. [32] IGLESIAS M J, SELLARO R, ZURBRIGGEN M D, et al. Multiple links between shade avoidance and auxin networks [J]. Journal of Experiment Botany, 2018, 69(2): 213 − 228. [33] LIU Yang, JAFARI F, WANG Haiyang. Integration of light and hormone signaling pathways in the regulation of plant shade avoidance syndrome [J]. aBIOTECH, 2021, 2: 131 − 145. [34] DILL A, THOMAS S G, HU Jianhong, et al. The Arabidopsis F-box protein SLEEPY1 targets gibberellin signaling repressors for gibberellin-induced degradation [J]. The Plant Cell, 2004, 16: 1392 − 1405. [35] FU Xiangdong, RICHARDS D E, FLECK B, et al. The Arabidopsis mutant sleepy1gar2-1 protein promotes plant growth by increasing the affinity of the SCFSLY1 E3 ubiquitin ligase for DELLA protein substrates [J]. The Plant Cell, 2004, 16: 1406 − 1418. [36] ZHOU Peng, SONG Meifang, YANG Qinghua, et al. Both PHYTOCHROME RAPIDLY REGULATED1 (PAR1) and PAR2 promote seedling photomorphogenesis in multiple light signaling pathways [J]. Plant Physiology, 2014, 164: 841 − 852. [37] XU Peng, CHEN Huiru, LI Ting, et al. Blue light-dependent interactions of CRY1 with GID1 and DELLA proteins regulate gibberellin signaling and photomorphogenesis in Arabidopsis [J]. The Plant Cell, 2021, 33: 2375 − 2394. [38] XU Huiying, CHEN Peirui, TAO Yi. Understanding the shade tolerance responses through hints from phytochrome a-mediated negative feedback regulation in shade avoiding plants [J/OL]. Frontiers in Plant Science, 2021, 12 : 813092[2024-01-24]. doi: 10.3389/fpls.2021.813092. [39] BOURÉ N, KUMAR S V, ARNAUD N. The BAP module: a multisignal integrator orchestrating growth [J]. Trends in Plant Science, 2019, 24(7): 602 − 610. [40] OH E, ZHU Jiaying, WANG Zhiyong. Interaction between BZR1 and PIF4 integrates brassinosteroid and environmental responses [J]. Nature Cell Biology, 2012, 14: 802 − 809. [41] PHAM V N, KATHARE P K, HUQ E. Dynamic regulation of PIF5 by COP1-SPA complex to optimize photomorphogenesis in Arabidopsis [J]. The Plant Journal, 2018, 96(2): 260 − 273. [42] PHAM V N, KATHARE P K, HUQ E. Phytochromes and phytochrome interacting factors [J]. Plant Physiology, 2018, 176: 1025 − 1038. [43] LING Junjie, LI Jian, ZHU Danmeng, et al. Noncanonical role of Arabidopsis COP1/SPA complex in repressing BIN2-mediated PIF3 phosphorylation and degradation in darkness [J]. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 2017, 114(13): 3539 − 3544. [44] BALLARE C L. Light regulation of plant defense [J]. Annual Reviews of Plant Biology, 2014, 65: 335 − 363. [45] OH E, ZHU Jiaying, BAI Mingyi, et al. Cell elongation is regulated through a central circuit of interacting transcription factors in the Arabidopsis hypocotyl [J/OL]. eLife, 2014, 3 : e03031[2024-01-24]. doi: 10.7554/eLife.03031. [46] IBAÑEZ C, DELKER C, MARTINEZ C, et al. Brassinosteroids dominate hormonal regulation of plant thermomorphogenesis via BZR1 [J]. Current Biology, 2018, 28(2): 303 − 310. [47] de LUCAS M, DAVIERE J M, RODRIGUEZ-FALCON M, et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation [J]. Nature, 2008, 451(7177): 480 − 484. [48] HAO Yaqi, OH E, CHOI G, et al. Interactions between HLH and bHLH factors modulate light-regulated plant development [J]. Molecular Plant, 2012, 5(3): 688 − 697. [49] HUANG Sha, YANG Chuanwei, LI Lin. Unraveling the dynamic integration of auxin, brassinosteroid and gibberellin in early shade-induced hypocotyl elongation [J]. Phenomics, 2022, 2(2): 119 − 129. [50] MARTÍNEZ-GARCIA J F, GALLEMÍ M, MOLINA-CONTRERAS M J, et al. The shade avoidance syndrome in Arabidopsis: the antagonistic role of phytochrome A and B differentiates vegetation proximity and canopy shade [J/OL]. PLoS One, 2014, 9 : e109275[2014-01-24]. doi: 10.1371/journal.pone.0109275. [51] MCCORMAC A, WHITELAM G, SMITH H. Light-grown plants of transgenic tobacco expressing an introduced oat phytochrome A gene under the control of a constitutive viral promoter exhibit persistent growth inhibition by far-red light [J]. Planta, 1992, 188: 173 − 181. [52] SONG Bin, ZHAO Hongli, DONG Kangmei, et al. Phytochrome A inhibits shade avoidance responses under strong shade through repressing the brassinosteroid pathway in Arabidopsis [J]. The Plant Journal, 2020, 104(6): 1520 − 1534. [53] ALABADI D, BLÁZQUEZ M A. Molecular interactions between light and hormone signaling to control plant growth [J]. Plant Molecular Biology, 2009, 69: 409 − 417. [54] LI Qianfeng, HE Junxian. BZR1 interacts with HY5 to mediate brassinosteroid- and light-regulated cotyledon opening in Arabidopsis in darkness [J]. Molecular Plant, 2016, 9(1): 113 − 125. [55] HAN Run, MA Liang, TERZAGHI W, et al. Molecular mechanisms underlying coordinated responses of plants to shade and environmental stresses [J]. The Plant Journal, 2024, 117(6): 1893 − 1913. [56] GALSTYAN A, CIFUENTES-ESQUIVEL N, BOU-TORRENT J, et al. The shade avoidance syndrome in Arabidopsis: a fundamental role for atypical basic helix-loop-helix proteins as transcriptional cofactors [J]. The Plant Journal, 2011, 66(2): 258 − 267. [57] CACKETT L, LUGINBUEHL L H, SCHREIER T B, et al. Chloroplast development in green plant tissues: the interplay between light, hormone, and transcriptional regulation [J]. New Phytologist, 2022, 233(5): 2000 − 2016. [58] BRODRIBB T J, MCADAM S A M, JORDAN G J, et al. Evolution of stomatal responsiveness to CO2 and optimization of water-use efficiency among land plants [J]. New Phytologist, 2009, 183(3): 839 − 847. [59] CAI Shengguan, HUANG Yuqing, CHEN Fei, et al. Evolution of rapid blue-light response linked to explosive diversification of ferns in angiosperm forests [J]. New Phytologist, 2021, 230(3): 1201 − 1213. [60] 胡肖肖, 段玉侠, 金荷仙, 等. 4个杜鹃花品种的耐荫性 [J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(1): 88 − 95. HU Xiaoxiao, DUAN Yuxia, JIN Hexian, et al. Shade tolerance of four Rhododendron cultivars [J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2018, 35(1): 88 − 95. [61] AUGSPURGER C K. Light requirements of neotropical tree seedlings: a comparative study of growth and survival [J/OL]. The Journal of Ecology, 1984, 72 (3): 777[2024-01-24]. doi: 10.2307/2259531. 期刊类型引用(0)
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